CH280317A - Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique. - Google Patents

Description

  Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique.    La, présente invention se rapporte à la  préparation d'un. nouvel antibiotique spéciale  spéciale  ment actif contre les organismes infectieux  ,ment et     propre    à     l'usage    thérapeu  tique.  



  La plupart des antibiotiques connus jus  qu'ici     sont    des     produits    du métabolisme de       moisissures,        telles    que le     Penicillium        notatum.     Le nouvel antibiotique obtenu par le procédé       selon    l'invention, cependant,     est    le produit du       métabolisme    d'une espèce bactérienne.  



       L'espèce    bactérienne utilisée pour la. pro  duction du nouvel antibiotique est le     Bacillus          aerosporus        Greer    [décrit     dans    le     Journal    of  Infections     Diseases,    vol. 42, p. 508 (1928)],  qui est.

   aussi connu sous le nom de     Bacillus          polymyxa        (Prazmowski)        Migula    (décrit dans  le     Bergey's        Manual    of     Determinative        Bact.e-          riology,   <B>5-</B> édition, 1939, p. 701 à 704). Il       s'agit    donc du même bacille sous deux noms  différents.  



  Le bacille employé peut être défini aussi  en se référant à son aspect et à     ses        caracté-          ristiques    biologiques, qui sont. les suivants  L'organisme est un bacille ayant des spores       centrales;

      il est mobile et produit un acide et  un gaz     avec.    le glucose, le     .lactose,        le        saccha-          rose,    la     mannite,    le maltose, le     xylose,        l'a.ra-          binose,    la.     salicine,    le     raffinose,    le lévulose et  l'inuline, mais non avec le sorbitol ou     l'ino-          site;

      il est négatif à     l'indol    et au rouge de  méthyle et donne une réaction de     Voges-Pros-          kauer    positive. Il produit un acide à partir    du lait au tournesol, qu'il coagule; le tourne  sol est réduit, le petit-lait se sépare et le cail  lot se digère. Les     nitrates        sont        réduits,    la géla  tine subit une liquéfaction tardive, .le sérum       coagulé    est liquéfié. Il existe au     moins    deux  variétés de colonies, l'une d'aspect blanchâtre  et l'autre brune ou grise.

   Les colonies des  deux variantes sont      smouth     sur le     pourtour     et.     mucoides.     



  Le bacille en question est largement ré  pandu     dans    la. nature. On le     rencontre    dans  l'air et, en outre, on l'a trouvé     dans    l'eau,       dans    le     sol,    dans le     lait,,    dans     les    fèces et dans  les     végétaux    en décomposition.  



  Le     procédé    selon l'invention est caractérisé  en ce que l'on     inocule    un milieu de culture  nutritif avec l'espèce bactérienne connue sous  les noms      Baeillus        aerosporus        Greer     ou        Bacillus        polymyxa        (Prazmowski)        Migula ,     en ce qu'on fait la culture en aérobiose et en  ce qu'on recueille le produit antibiotique       formé    du mélange.

   De préférence, on choisit  des souches du bacille qui donnent, par leur       métabolisme,    de bonnes     quantités    de l'antibio  tique désiré. Ce choix peut se faire par l'essai  biologique d e cultures :dérivant de colonies de  l'organisme séparées, obtenues par     culture     sur     plaque.     



  Le bacille croît bien sur les milieux de  cultures ordinaires. On a. obtenu .les meilleurs  résultats avec un milieu ,aqueux     contenant     10     11/a    en volume d'un bouillon nutritif avec  addition de 0,002     1/o    de sulfate de manganèse,      3     %        de        glucose        et        0,6        %        @clé        phosphate        .d'am-          monium        bibasique,    ayant un     pII    de 7,4 envi  ron.

   Le bacille étant     un        aérobe,    la. culture  (comme     dans    le cas des autres bacilles     aéro-          bes)    peut se faire en     couches        statiques    peu  profondes, ou en     couches        profondes    dans des  récipients avec aération artificielle.  



  Pour préparer la culture d'inoculation, un  procédé approprié     est    de faire incuber la souche       i    choisie à 37  C pendant 18 à 24     heures.    En  viron 5 ml     !de    la     .culture    d'inoculation sont       ensuite    ajoutés à 100 ml :du milieu de cul  ture décrit     plus    haut,     dans    un flacon plat,  et le tout     est    mis à incuber à     22-28     C peu  ;     dant    3 à 8 jours, ou pendant 20 à 24 heures  dans les .cas où une aération artificielle est.  utilisée.

   Des     échantillons    sont essayés pério  diquement quant à leur teneur en antibio  tique et la charge de la. culture est récoltée       i    quand la teneur en antibiotique     est    pratique  ment à un     maximiun.     



  Pour recueillir     l'antibiotique    du mélange  de culture, on procède avantageusement de la  façon suivante: on     sépare    les     cellules        bacté-          viennes    du liquide métabolique qui s'est formé  dans le mélange, on traite     ensuite    le liquide  métabolique par un charbon activé pour ad  sorber .l'antibiotique. Ce traitement se fait à  un pH     compris    entre 6 et 8 (neutre). Puis on  élimine l'antibiotique adsorbé du charbon en  traitant     @ce,    dernier par un solvant de l'anti  biotique.  



  Du fait que l'antibiotique est absorbé par  des matières filtrantes, le liquide métabolique  doit être séparé     des    cellules     bactériennes    par       centrifugation.        On        peut        ajouter        0,4        %        de          chloroforme    comme préservateur.  



       Les    organismes     récoltés    dans le bol de la.  centrifuge peuvent être soumis à l'autolyse en  les remettant en     suspension    .dans une solution  saline stérile, 1 0!o .de     toluol    étant ajouté, et le  mélange est mis à incuber à 37  C pendant  48 heures. Le liquide surnageant,, contenant  les     produits    de     l'autolyse    des bactéries, est.

    séparé par centrifugation et ajouté au liquide  métabolique     précédemment    séparé, ou traité       subséquemment    .d'une manière similaire à       celui-ci.       Le liquide métabolique préparé comme dé  crit     -ci-dessus    est. de préférence traité comme  suit, pour en extraire l'antibiotique:  Premièrement, on acidifie le liquide mé  tabolique à un pH de -2,0 à 2,5 environ. Les  acides     chlorhydrique    et sulfurique sont em  ployés de préférence. L'acide phosphorique  peut être     utilisé    aussi pour acidifier,     tandis     que l'acide nitrique et d'autres acides oxy  dants, doivent être évités.  



  On traite ensuite ce liquide acidifié par  un charbon activé approprié, pour adsorber  1a plus grande partie de la matière     colorante     ou d'autres impuretés présentes,     mais    non  l'antibiotique. Une quantité appropriée de       de        charbon        est        égale    à     0,5        %        du        poids        de        la     solution.

   Il suffit d'un essai pour voir si un  charbon est approprié ou non, c'est-à-dire s'il  est capable ou non d'adsorber la matière colo  rante et les impuretés,     mais    non l'antibioti  que, .dans un milieu acide. Les charbons acti  vés      Farnell's    N  14  et      Farnell's    L. S. ,  (produits .de marque)     sont    propres à l'emploi  de cette manière.  



  Le charbon     est    ensuite séparé par filtra  tion et rejeté.  



  Le filtrat, contenant l'antibiotique, est en  suite neutralisé (pH de 6,0 à 8,0) par addi  tion d'un alcali, tel que la soude     caustique.     Il est traité à nouveau par un charbon activé  approprié. Cette fois (:en milieu neutre), l'anti  biotique est adsorbé.  



  Le charbon est séparé par filtration et.  l'antibiotique est ensuite libéré par lavage  avec une solution aqueuse d'acétone, d'une  concentration de 40 0/0 en poids     environ,    main  tenue à un pH d'environ 2,5 au moyen  d'acide sulfurique. De cette façon, on obtient  unie solution du sulfate de la base antibio  tique.  



  De l'acétone est ajouté ensuite à la solution       ci-dessas    jusqu'à une concentration en acétone       die        75        %        environ.        Cette        solution        est        alors        re-          froidie    jusqu'à une température de 4  C en  viron, maintenue pendant 16 heures environ.  La matière solide, contenant le sulfate de  l'antibiotique,     est    séparée     par    filtration. Elle  est traitée ensuite par de l'eau à 30      C    envi-      roi.

   Le résidu insoluble est séparé par fil  tration et rejeté.  



  Le filtrat est     ajusté    à un pH de 7 par  addition d'alcali. Il     se    dépose à. nouveau une  matière gélatineuse inactive qui est. séparée  par filtration. La     solution    restante peut être  congelée et séchée dans     le    vide à. l'état con  gelé, donnant le sulfate brut de l'antibiotique  recherché. La. régénération de la base libre de  l'antibiotique se fait par adjonction d'un  alcali. En thérapeutique, l'antibiotique peut  être     utilisé    sous forme d'un sel (chlorhy  drate ou sulfate).  



  Pour recueillir l'antibiotique du milieu de  culture, les modifications suivantes sont pos  sibles:  Ainsi, le charbon sur lequel l'antibiotique  a été adsorbé peut être lavé avec de l'acide  chlorhydrique dilué (pH 2,0 à 2,5)     et/ou    avec  de l'eau pure avant la séparation avec la     solu-          tion        d'acétone    à     40        %.     



  Au lieu de traiter le liquide métabolique  avec     le    charbon en milieu acide, on peut.     aussi     ajouter le     charbon    en milieu neutre. L'anti  biotique et une partie des     impuretés    sont     alors          adsorbés    ensemble sur le     charbon"    qui est alors       lavé        avec        une        solution        d'acétone    à     40        %    à     un     pH de 2,5 environ,

   le liquide étant traité       ensuite    comme     décrit    précédemment.  



  Une autre modification du procédé décrit.  en premier lieu     est    de mettre en suspension  dans de l'éthanol neutre le charbon ayant     ad-          sorbé    l'antibiotique, de séparer le charbon par  filtration et. de le laver avec une nouvelle  quantité d'éthanol. Ensuite, l'antibiotique peut  être séparé du charbon au moyen de méthanol       5ee        contenant        approximativement    3,65     --    de       gaz    chlorhydrique dissous par     litre.    Le char  bon est     séparé    par filtration et le filtrat est.

    dilué immédiatement avec quatre     volumes     d'éther     sec.    Le     chlorhydrate    brut de l'antibio  tique recherché précipite alors, il     est,    séparé  par filtration, et la base libre est régénérée  par l'adjonction d'un alcali.

   Le chlorhydrate       peut    d'abord     aussi    être     redissous        dans    le mé  thanol, précipité par l'éther, séparé par fil  tration, lavé avec une     nouvelle    quantité  d'éther et séché dans le vide,    Une autre modification de la méthode dé  crite en premier lieu plus haut     consiste    à ré  cupérer l'antibiotique de la solution à     4011/o     d'acétone en ajustant celle-ci à     un    pH de 7  et en évaporant ensuite l'acétone sous pres  sion réduite.

   La solution restante clé     l'antibio-          t.iq-ûe    dans l'eau est     brassée    avec du charbon  activé et filtrée. Le filtrat     est    rejeté. L'anti  biotique est séparé du charbon par une solu  tion     aqueuse    d'acétone à -10%     contenant          approximativement    2     %        en        poids        d'acide        sul-          furique.    Le liquide est neutralisé avec du car  bonate de calcium, refroidi à 4  C     environ,

      et  le précipité de     sulfate    de de calcium est éli  miné par filtration. Le filtrat     est    congelé et  séché dans le vide à l'état congelé donnant  le     sulfate    -de     l'antibiotique,    qui est. ensuite       transformé    en la base libre.  



  Après     l'évaporation    de l'acétone, on ,peut  aussi ajouter :de l'acide     picrique    pour préci  piter l'antibiotique     sous    forme de     picrat.e,    en       pure    de sa purification.  



  S'il     est        nécessaire    ou préférable dans     eer-          ta.ins    cas d'entreprendre une nouvelle purifi  cation de l'antibiotique ou d'un de ces     sels,     tel     que    le sulfate, le chlorhydrate ou le pi  crate, ceci peut se faire :

  en     transformant    l'an  tibiotique ou un de ces     sels    en son     hélianthate.     Ce dernier est obtenu en dissolvant un de ces  sels     dans    une solution aqueuse .de méthanol et  en ajoutant une     solution    saturée de     méthyl-          orange.        L'hélianthate    se     sépare    après un re  pos -de 12 heures à 4  C.<B>Il</B> est ensuite     retrans-          formé    en l'antibiotique libre.  



  Si la. quantité de méthylorange ajoutée est       telle        que        80        %        environ        de        l'activité        antibioti-          que    se retrouve dans .le précipité, ce dernier  contient l'antibiotique     sous    forme purifiée,  certaines     impuretés        restant        dans    la.

   liqueur  mère     dans    ces     conditions.    Le précipité peut  être lavé     successivement        avec    de l'eau et. du  méthanol et traité ensuite .avec un acide en       solution    méthylique pour transformer l'anti  biotique en un sel soluble, chlorhydrate o-Li sel  d'un autre acide selon désir, et ce sel peut  être obtenu sous forme solide, par     exemple     par précipitation par de     Vacétone,        puis    traité  pour en libérer la base,      D'une autre manière,

   le     sulfate    brut de  l'antibiotique peut être transformé en     chlor-          hydrate    en traitant le sulfate avec du chlo  rure de calcium et en séparant par filtration  le     sulfate    de     ea.lcium    qui se dépose avec cer  taines impuretés; la base est. ensuite régéné  rée de ce chlorhydrate.

           L'antibiotique    obtenu par le procédé selon  l'invention     est    une base forte, de     structure          peptidique.    Son chlorhydrate est extrêmement  soluble dans l'eau et     moins    facile à manier  que le     sulfate        moins    soluble.     L'hélianthate        est     encore     moins    soluble dans ].'eau. La base est  un solide amorphe blanchâtre. L'antibiotique  est stable pendant     es    périodes assez courtes  en solution aqueuse à des pH de 3 à 8.

   Il est  très     instable    en solutions     alcalines.    Il ne peut  pais être extrait de sa solution     aqueuse    par le  chloroforme. Il .est dissous le plus avantageu  sement.     dans    l'eau ou le méthanol.

      Le nouvel antibiotique a montré,     dans        des          expériences     in vivo , une activité     chimiothé-          rapique    -et assure une     protection    utile contre  les     organismes        pathogènes    suivants:

       Haemo-          phihvs        pertussis,        Haemophilus        influenzae,          Eherthella        typbi,        Escherichia        coli    (y     compris     les     variétés        hémolytiques    associées à la diar  rhée blanche     dee    veaux), et     Brucel:

  la        hronchi-          septica..    On a trouvé qu'il avait  in vitro   une     activité    antibactérienne contre tous les       organismes    mentionnés     ci-dessus    et aussi con  tre toutes les     espèces    de     Salmonella.,        Pseudo-          monas        aertiginosa,        Shigella        dysenteriae,

          Shi-          gella        pa.radysenteriae    et     Shigella        sonnei.     



  Il paraît. être bactéricide et non seulement  bactériostatique vis-à-vis     des    organismes sen  sibles à son activité.

Claims (1)

1. REVENDICATION: Procédé de préparation d'un nouvel anti biotique, caractérisé en ce que l'on inocule lin milieu de culture nutritif avec l'espèce bacté rienne connue sous les noms Bacillus aeros- porus Gréer ou Bacilles polymyxa (Pra.z- mowski) 1ligula , en ce qu'on fait la.

   culture en aérobiose et en ce qu'on recueille le pro duit antibiotique formé du mélange. Le nouvel antibiotique est une base < le structure peptidique, se présentant- sous, forme d'une poudre amorphe blanche. Il est instable en solutions alcalines et peu stable en solu tions aqueuses à des<I>pH de 3 à 8.</I> Son chlor hydrate -est très soluble dans l'eau. SOUS-REVENDICATIONS 1.

   Procédé selon la revendication, carac térisé en ce que, pour -recueillir l'antibiotique du mélange, on sépare les cellules bactériennes du liquide métabolique obtenu après la cul ture, en ce qu'on traite ensuite ce ,liquide par un charbon activé pour adsorber l'antibioti que, à un pH compris entre 6 et 8, et en ce qu'on sépare l'antibiotique du charbon en traitant ce dernier par un solvant de l'anti biotique. 2.

   Procédé selon la revendication et la sous-revendication 1, dans lequel le liquide métabolique, avant d'être traité par le char bon activé à un pH de 6 à 8, est préalable ment traité par un charbon activé à un pH de 2 à 2,5 pour adsorber et éliminer des im pur étés. 3.

   Procédé selon la. revendication et. la sous-revendication 1, dans lequel l'antibiot.i- ,que est séparé du charbon sur lequel il est adsorbé en lavant le charbon avec une sohi- tion aqueuse d'acétone acidifiée par de l'acide sulfurique, et l'antibiotique libre est régé néré @du sulfate ainsi obtenu. 4.

   Procédé ,selon la revendication et. les, sous-revendications 1 et 3, dans lequel le sul fate @de l'antibiotique est. précipité de la. solu tion aqueuse d'acétone par addition d'une nouvelle quantité d'acétone jusqu'à ce que la concentration de cette dernière dans le nié- lange acétone-eau soit approximativement. < le 75 % en poids, le mélan1--e étant, ensuite re froidi. 5.

   Procédé selon la. revendication et le, sous-revendications 1, 3 et 4, dans lequel -le sulfate de l'antibiotique précipité est .purifié par dissolution dans de l'eau chaude et. par filtration. 6. Procédé selon la revendication et. les sous-revendications 1, 3 à. 5, dans lequel la.

   solution du sulfate de l'antibiotique est neu tralisée par un alcali, ce qui élimine de la solution une nouvelle quantité d'impuretés, et est ensuite filtrée, congelée -et. séchée dans le vide à l'état. congelé. 7. Procédé selon la. revendication et. la.

   solndication 1, caractérisé en ce que le charbon activé ayant adsorbé l'antibiotique est, préalablement. à l'extraction de ce der nier, lavé avec de l'acide chlorhydrique clilué. 8. Procédé selon la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce que le ,charbon activé, ayant adsorbé l'antibiotique est, préalablement à l'extraction de ce der nier, lavé avec de l'eau. 9.

   Procédé selon la revendication et la sous-revendication 1, dans lequel l'antibioti que, après adsorption sur le charbon activé, est lavé avec de l'étha.nol neutre, et. est ensuite séparé du charbon par du méthanol sec con tenant. en solution du gaz chlorhydrique, la. solution étant ensuite mélangée avec de l'éther pour précipiter le chlorhydrate de l'antibioti que dont on régénère la, base libre par traite ment. avec un ailcali. 10.

   Procédé selon la revendication, dans lequel, en vue de sa purification, l'antibioti que obtenu est transformé en son chlorhydrate qui est ensuite purifié par dissolution dans le méthanol et nouvelle précipitation par l'éther, puis l'antibiotique est régénéré de son chlor hydrate. 11.

   Procédé selon la. revendication, dans lequel l'antibiotique est purifié par précipi tation avec de l'acide picrique, l'antibiotique étant ensuite régénéré du picrate obtenu. 12. Procédé selon la. revendication, dans lequel l'antibiotique obtenu est purifié par pmécipitatio.n fractionnée avec du méthyl- orange, puis régénération de la base libre. 13. Procédé :selon la revendication et. la sous-revendication 12, dans lequel. on opère de façon que les 80 1/o environ de l'activité antibiotique se retrouvent. clans le précipité. 14.

   Procédé selon la. revendication et les sous-revendications 1 et 3, dans lequel la. solu tion est neutralisée, l'acétone évaporée sous pression réduite, et la solution reetante est traitée par le charbon activé sur lequel l'anti biotique est adsorbé. 15.

   Procédé selon la revendication et les sous-revendications 1 et 3, -dans lequel l'anti biotique est séparé du charbon activé .par une solution aqueuse d'acétone contenant de l'acide sulfurique, le liquide obtenu est neu- tralisé avec du carbonate de calcium et le précipité de sulfate de calcium est éliminé par filtration. 16. Procédé selon la. revendication, dans lequel la souche du bacille employée pour la dite inoculation est choisie sur la. base d'un essai biologique, parmi des colonies séparées de l'organisme, cultivées sur plaque.

   17. Procédé selon la revendication, dans lequel le bacille est cultivé sur un milieu aqueux contenant environ 10 Olo en vol-Lu-ne d'un bouillon nutritif, de petites quantités de glucose et de phosphate d'ammonium bibasi- que et des traces d'un sel de manganèse. 18. Procédé selon la, revendication, dans lequel la culture s'effectue en couehes stati- qu es peu profondes.

   19. Procédé selon la revendication, dans , lequel la culture s'effectue en couches pro fondes, avec une aération artificielle. 20. Procédé selon la revendication, dans lequel la culture est poursuivie pendant 3 à 8 jours, à une température de 22 à 28 C, avec comme seule aération le contact avec l'atmo sphère. 21. Procédé selon la revendication, dans lequel la culture est poursuivie pendant. 20 à 21 heures, à une température de 22 à 28 C, avec .aération artificielle. 22.

   Procédé selon 1a revendication et la sous-revendication 1, dans lequel les cellules bactériennes, après séparation -du liquide mé tabolique, sont soumises à l'autolyse, le pro duit ainsi obtenu étant ajouté au liquide mé- tabolique avant le traitement par le charbon activé. 23. Procédé selon la revendication et les sous-revendications 1 et 22, dans lequel l'auto lyse est effectuée en remettant les cellules.

   bactériennes en suspension dans 1-me solution saline stérile et en laissant incuber le mélange à. 37 C pendant -18 heures environ.