CH292073A - Verfahren zur Oxydation von Steroiden. - Google Patents

Description

  Verfahren zur Oxydation von Steroiden.    t     legenstand    der     vörliegenden    Erfindung ist  ein Verfahren zur Oxydation von     Steroiden.     



       1:s    ist bereits bekannt, auf biologischem  Wege in in 11- und     12-Stellung        unsubsti-          tuierte        Steroide    direkt eine     Oxygruppe    in     11-          Stellung    einzuführen mittels     Perfusion    durch       überlebende    Nebennieren. Für eine technische       Durchführung    kommt jedoch dieses Verfahren  kaum in Frage.  



  Es wurde nun gefunden, dass man in     ein-          faeher    Weise in 11- und     12-Stellung        unsub-          stituierte    Steroide in die entsprechenden     11-          Oxy-steroide    überführen kann, wenn man sie  in     Ge-enwart    von Enzymen mit Sauerstoff  behandelt. und die gebildeten     11-Oxy-steroide     isoliert.  



  Man kann von gesättigten oder zum     Bei-          -;piel    von in 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-,     9-,        11-,        16-          und/oder        1.7-Stellung    Doppelbindungen auf  weisenden     Steroiden    ausgehen.

   Insbesondere       kommen    Steroide der     Androstan-,        Pregnan.-,     Sterin- oder     Sapogeninreihe    in Betracht, die  zum Beispiel in 3-,     14-,    16-, 17-, 20- und     21-          Stellung        substituiert    sind, beispielsweise durch  freie oder funktionell abgewandelte     Oxy-          oder        Oxogruppen,    wie durch     Aeyloxy-,     zum Beispiel     Acetoxy-,        Propionyloxy-,

          Ben-          zoyloxy-    oder     Tosyloxygruppen,    durch Alk  oxy-, zum Beispiel     Methoxy-    oder     -Lithoxy-          gruppen,    durch     enolisierte    oder     acetalisierte          Oxogruppen,    durch freie oder funktionell ab  gewandelte     Carboxyl-,    wie     Nitril-    oder ver  esterte     Carboxylgruppen,    durch     Epoxygrup-          pen    oder durch Halogenatome.

   Die Aus-         gangsstoffe    können von beliebiger     sterischer     Konfiguration sein. Besonders wertvoll sind  zum Beispiel     44-3,20-Diketo-21-oxy-pregnene,     d4-3,20 -     Diketo-17,21-dioxy    -     pregnene,        3f,5a-          oder        -5fü=Androsterone    bzw.

   ihre Ester und  Äther, Cholesterin oder     Diosgenin.    Falls er  forderlich, werden in den     Steroiden    vorhan  dene Doppelbindungen während der Oxyda  tion in an sich bekannter Weise, zum Beispiel  durch     Absättigung    mit     Halogenwasserstoff     oder durch Überführung in     pentacyclische        Iso-          steroide,    intermediär geschützt.  



  Zur Behandlung mit Sauerstoff wird zum  Beispiel Sauerstoff über oder durch das Re  aktionsgemisch geleitet. An Stelle des Sauer  stoffes können auch :Sauerstoff abgebende Mit  tel verwendet werden, zum Beispiel Was  serstoffsuperoxyd oder Wasserstoffsuperoxyd  bildende Verbindungen, zum Beispiel in Ge  genwart von     Katalase.     



  Die Enzyme werden besonders in Form  von Organpräparaten, wie zerkleinerten Or  ganen, Organschnitten,     Organhomogenisaten     von enzymreichen Organen, beispielsweise von  Nebennieren, Nieren oder Lebern oder Mi  schungen derselben, verwendet.  



  Die Enzyme sind natürlich durch Zugabe  geeigneter Substrate und     Innehaltung    entspre  chender     ylilieubedingungen    funktionstüchtig  zu erhalten. Als Substrate kommen insbeson  dere diejenigen des von D. E.     Green    (Journal,  of     Biological        Chemistry,        Vol.   <B>172,</B> Seite 389       [1948])    als      Cyelophorase-System     bezeich  neten Enzymsystems und bzw. oder beim           Kohlehy        dratstoffwechsel    entstehende Säuren  des Krebssehen     Zitronensä.urezyklus        (vgl.     zum Beispiel R.

       Ammon    und     W.        Dirsclrerl     Fermente, Hormone, Vitamine, 1918, S. 173)  oder unter den     Reaktionsbedinb        xngen    in solche       überführbare    Verbindungen in Anwendung,  zum Beispiel Zitronensäure,     Aeonitsäure,        Iso-          ztronensäure,        Oxalbernsteinsä.ure,        a-Ketoglu-          tarsäure,    Bernsteinsäure,     Fumarsäure,        Äpfel-          säure,        Brenztraubensäure,

          Oxalessigsäure,        aber     auch     hlalonsäure,        Glutarsäure,        Adipinsäure,          Glutaminsäure,        Asparaginsäure,    Asparagin,       Alanin,        Glvkokoll,        Serin,    ferner Ascorbin  säure,     Milchsäure,        Dioxy        weinsäure,        Prolin,          Tyrosin,        Tryptophan    bzw. Gemische der  selben.  



  Zur     Innehaltung    entsprechender Milieu  bedingungen arbeitet man am besten in wäs  serigem Medium, dem vorteilhaft Bestand  teile physiologischer Lösungen, wie Kohle  hydrate, anorganische und bzw. oder orga  nische Salze, beispielsweise     Natriumphosphat,          Alkalichloride,        1llagnesirxmsulfat    oder     Na-          triLxmacetat    zugefügt, werden. Mit den Salz  zusätzen sollen insbesondere das     pH    und die       Jonenstärke    der Reaktionslösung während der  Reaktion im optimalen Bereich gehalten wer  den.

   Die Reaktion wird vorzugsweise bei  einem     pH    von 6,5 bis 9,0 und einer Salzkon  zentration von 0,5 bis 0,01     molar        durch1e-          führt.    Dementsprechend lässt sich als Reak  tionsmedium     a.neh    eine physiologische Flüssig  keit, zum Beispiel Plasma, verwenden. In  diesem Fall wird vorteilhaft, ein     Konservie-          rungsmittel,    beispielsweise Penicillin, zuge  fügt.

   Dem Reaktionsmedium kann man auch  Lösungsvermittler, wie     Äthy        lenglykol,        Propy-          lenglykol,    oder     Dispersionsmittel,    zum Bei  spiel     Phospholipoide,    zusetzen.  



  Die Isolierung der     11-Oxy-steroide    aus dem  Oxydationsgemisch kann, je nach den verwen  deten Ausgangsstoffen bzw. Reaktionsmedien,  gemäss an sich bekannten Methoden, zum Bei  spiel unter Durchführung von     Entmischungs-          verfahren,        Chromatographie,    Umkristallisa  tion und dergleichen, erfolgen.  



  In den folgenden Beispielen besteht zwi  schen Gewichtsteil und     Volumteil    die gleiche    Beziehung wie zwischen     Gramnx    und     Kubilz-          zentimeter.    Die Temperaturen sind in Celsius  graden angegeben.  



  <I>Beispiel. 1:</I>  Eine Lösung von 1 Gewichtsteil     Desoxy-          cort-icosterorx    in 20     Volumteilen    Ä     thylenglykol     wird zu 980     Volumteilen    einer Mischung aus  900     Volumteilen    Rinderplasma, welches die  dem     Cyeloplrorase-Systein    angehörenden Ver  bindungen enthält und welchem zuvor Zitro  nensäure und Penicillin zugesetzt worden  war, 80     Volumteilen        ith@-lenglykol    und 1     Ge-          wiclxtsteil    Ascorbinsäure gegeben.

   Das     ZEH    die  ser Lösung wird mit.     0,1.n-Natronlauge    auf das  ursprüngliche     pH    des     Citratplasmas    vor dem       Aseorbinsäurezusatz        zurüekgestellt.    900     Vo-          lumteile    der obigen     Mischung    werden im  Thermostaten auf 37  C erwärmt.

   Dazu gibt  man 60     Gewiehtsteile        friselx    hergestellter Ne  bennierenschnitten ans Nebennieren von frisch       geschlachteten    Rindern.     überdies    werden  60 Gewichtsteile     Rindernebennieren    in kleine  Stücke geschnitten und mit 80     Volumteilen     der obigen     Desoxvcortieosteron-Plasxnalösung     in einem     Homogenisator    2 Minuten homo  genisiert. Der entstehende Brei wird zu der  bereits mit Schnitten     versehenen    Lösung im  Thermostaten gegeben und mit 20     Volumteilen     Plasma nachgespült.

   Die Mischung hält man       1/2        Stunde        unter     schwacher Be  wegung bei 37 C. Nachdem die Temperatur  ausgeglichen ist, werden 100     Volumteile    einer  wässerigen     1,03prozentigen        Wasserstoffsuper-          oxydlösung,        welche        10%        Äthylenglykol        ent-          hält,    innert 2 Stunden zugegeben.

   Nach wei  teren. 21/2 Stunden     wird    auf Zimmertempera  tur abgekühlt und hierauf das Reaktions  gemisch durch einen Tuchfilter     abgepresst.     Die trübe     durchlaufende    Lösung wird durch  einstündiges Zentrifugieren bei 2000 Touren  geklärt. Den durch     Zentrifugieren    erhaltenen       Rückstand        vereixxigt    man mit dem     Rückstaxrd     im Tuchfilter.  



  Die Plasmalösung und der hauptsächlich       aus    den Organteilen bestehende Filterrück  stand werden einzeln mit organischen Lö  sungsmitteln behandelt. Die Plasmalösung      wird mit Essigester extrahiert, bis der Essig  ester farblos erscheint. Diese Extraktions  lösungen werden zur klaren Schichtentrennung  bei 2000 Touren     1/2    Stunde zentrifugiert und  die     Essigesterschichten    jeweils abgehebert. Es  werden auf diese Weise 3,9 Gewichtsteile Ex  trakt gewonnen, welcher durch stufenweise  Verteilung zwischen Methanol und     Heptan     fraktioniert wird.

   Die     Methanolfraktionen,     enthaltend die Steroide, werden nochmals     zwi-          sehen        Heptan    und Methanol verteilt und dann  in     Pyridin    mit     Aeetanhydrid    bei Zimmer  temperatur     acetyliert.    Das so erhaltene Pro  dukt zeigt bei der     papierchromatographischen     Untersuchung ein Gemisch von     Desoxycorti-          costeron-    und     Cortieosteron-acetat    an.

   Zwecks       Auftrennung        chromatographiert    man das Ge  misch an     Silicagel.    Die     Benzol-Äther-Eluate     enthalten zur Hauptsache unverändertes Des  oxveorticosteron. Das Oxydationsprodukt wird  dagegen erst mit.     Äther-Essigester-Gemischen     aus der     Chromatogramm-Säule    abgelöst.

   Nach       Verseifung    mittels     Natriumbicarbonat    in     wäs-          serigalkoholischer    Lösung erhält man daraus  Kristalle, die bei 179 bis 181  C (nach  Sintern) schmelzen, die optische Drehung       lall)    =     -I-    200  (in Alkohol) aufweisen und  mit konzentrierter Schwefelsäure die für     Corti-          eUsteron    charakteristische     Parbreaktion        (grün-          (Yelbe    Fluoreszenz) zeigen.  



  Die aus dem     Reaktionsgemiseh    durch  Abtrennen und Zentrifugieren gewonnenen       Organriiekstände    werden 40 Stunden mit  Aceton extrahiert.. Die     Acetonlösung,    welche  das in den Organen und dem anhaftenden  Plasma befindliche Wasser enthält, wird im       Wasserstrahlvakuum    von Aceton befreit. Der  wässerige Rückstand wird mit Äther mehr  fach ausgeschüttelt. Es werden nach dem Ab  dampfen des Äthers 4,3 Gewichtsteile Äther  extrakt gewonnen. Dieser wird analog wie der       Essigesterextralz-t    des Plasmas weiterbehandelt.  Zunächst folgt eine stufenweise, wiederholte       Verteilung    zwischen     Heptan    und Methanol.

    Die     Methanolfraktionen    werden wieder mit       Acetanhydrid    in     Pyridin        acetyliert    und das       Aeetylierungsgemisch,    nach dem vollständigen  Entfernen des     Pyridins    und überschüssigen         Acetanhydrids    durch     Chromatographie    an       Silicagel    getrennt. Durch     Verseifung    der       Äther-Essigester-Eluate    und     Umkristallisation     erhält man dieselbe Verbindung wie bei der       Aufarbeitung    des Plasmaextraktes.  



  <I>Beispiel 2:</I>  159 Gewichtsteile     feingeschnittener    Rinder  nebennieren werden in einem     Homogenisator     mit 900     Volumteilen    einer wässerigen Lösung  5 Minuten homogenisiert. Die 900     Volumteile     der wässerigen Lösung enthalten 6,4 Gewichts  teile     Natriumfumarat,    36 Gewichtsteile Glu  cose, 7,24 'Gewichtsteile     Natriumchlorid,    3,72  Gewichtsteile     Kaliumchlorid,    7,14 Gewichts  teile sekundäres     Natriumphosphat    und 1,98  Gewichtsteile     Magnesiumsulfat,

      Zu diesem       Homogenisat    gibt man 1 Gewichtsteil     Des-          oxycorticosteron    und homogenisiert nochmals  2 Minuten auf höchster Tourenzahl. Der ent  standene Brei wird mit 20     Volumteilen    ln  Salzsäure auf PH 6,62 gebracht     (pH-Bestim-          mung    mit Glaselektrode) und nochmals 2 Mi  nuten homogenisiert. Das Reaktionsgemisch  wird in ein mit     Rührer    versehenes Gefäss ge  leert und mit 100     Volumteilen    Wasser nach  gespült.

   Das PH der Emulsion wird mit 20     Vo-          lumteilen        In-Salzsäure    auf 6,62 gebracht     (pH-          Bestimmung    mit Glaselektrode). Das Reak  tionsgemisch wird auf 37  C gehalten, und  unter ständigem Umrühren werden 150     Vo-          lumteile    einer 15prozentigen Wasserstoffsuper  oxydlösung im Verlaufe von     21/2    Stunden zu  gegeben.

   Im Verlaufe der nächsten Stunde  werden noch 15     Volumteile    einer 30prozenti  gen     Wasserstoffsuperoxydiösung        zugetropft.          Wenn    die     Sauerstoffentwicklung    nachlässt,  werden nach jeder Stunde 0,05 Gewichtsteile  eines handelsüblichen     Katalasepräparates    zu  gegeben, um nach 4 Stunden die Zersetzung  eventuell noch vorhandenen Wasserstoffsuper  oxyds sicherzustellen.

   Die Lösung wird nach  einer     Totalreaktionszeit    von 4 Stunden mit  30     Volumteilen        ln-Salzsäure    versetzt, das     pH     der mit starker Eiweissfällung versehenen  Mischung beträgt nun 5,10. Nun wird das  Reaktionsgemisch mit 800     Volumteilen    Essig  ester versetzt und bei 37  C 1 Stunde gut     i         gerührt.

   Dann wird die     Mischung        zent.ritu-          giert.    Die überstehende     Essigesterschicht        wird          abgehebert    und die wässerige Phase und der  Niederschlag über Nacht in     gleicher    Weise  mit 500     Voluniteilen    Essigester behandelt.  Diese Extraktion wird noch dreimal während  je ? Stunden. wiederholt, bis die     Essigester-          schieht    farblos ist.

   Die vereinigten Essigester  lösungen werden über wasserfreiem Natrium  sulfat getrocknet und die filtrierte Lösung im  Vakuum zur Trockne     verdampft.    Das zurück  bleibende halbfeste Produkt wird in mit       Heptan        gesättigtem        Methanol        aufgenommen     und in 6 Stufen zwischen einer     Mischung    von  je 100     Volunteilen        Heptan    und     -100        Volum-          teilen        Methanol    verteilt.

   Die     llet.hanollösnn-          gen    der Stufen 1 bis 5 werden     vereinigt;    es  werden daraus 5,82 Gewichtsteile einer halb  festen, gelbbraunen Masse erhalten. Die     pa:          pierehromatographische    Analyse dieses Roh  extraktes zeigt neben     unumgewandeltem    Des  oxv     corticosteron        auch        Corticosteron    an.

   Zur  Isolierung des Oxydationsproduktes wird der  Rohextrakt in bekannter Weise an     Silica-el          chromatographiert.    Die Äther- und     Chloro-          forineluate    enthalten     Desoxvcorticosteron    und  die     Eluate    mit     Cliloroform-Essinester    und  Essigester das     Corticosteron,    welch letzteres  leicht mit der     Schwefelsäurereaktion    (grün  gelbe Fluoreszenz) zu erkennen ist.

   Diese       Corticosteronfraktion    wird in     Pvridin    mit       Acetanhydrid        acetyliert    und nach dem     Um-          kristallisieren    aus     Aceton-Äther    das     Corti-          costeronacetat    vom F. =     113    bis     119     C ge  wonnen.

   Dieses Acetat wird mittels     Kalium-          bicarbonat.    verseift und schliesslich durch     Um-          kristallisieren    das     Coilicosteron    vom F. = 179  bis 182  C und der spezifischen Drehung       [ccIn    =     ??:;     (in Alkohol) in feinen     Kri--          stallen    erhalten.  



  <I>Beispiel 3:</I>  113 Gewichtsteile     feingeschnittener    Rinder  nebennieren werden in einem     Honiogenisator     mit. 250     Volumteilen    einer wässerigen     Lösun-          5    Minuten     homogenisiert.    Die 250     Volumteile     der     wässeriäen    Lösung enthalten 0,574 Ge  wichtsteil     Fumarsäure,        -1,5    Gewichtsteile     GrIu-          eose,        0,97.        (rewielitsteile        Natritunehlorid,    0,

  4 CTe-         wichtsteile        Iialiumclilorid,    0,91 Gewichtsteile  sekundäres     Natriumphosphat,    0,25 Gewichts-,  teile     l@a@@aiesiumsulfat        und    25     Voluniteile        0,1n-          Natronlauge.        Zii    diesem     Iloniogenisat    wird  1     Gewiehtsteil.        Desoxvcorticosteron        gegeben     und     nochmals    '     Minuten    homogenisiert. Das.

         1),i    dieser Emulsion     beträgt    6,78. Sie wird ;  in ein mit.     Rührer    und     Gaseinleitungsrohr    ver  sehenes Gefäss     umgeleert    und unter Rühren  und Einleiten von Sauerstoff 5     Stunden    bei  37  C belassen.

   Mit 50     Volumteilen    Wasser  wird der     Homogenisator        ausgespült.    Die Re- ,       aktionsflüssibkeit        wird    in 1500     Volumteile     Aceton     -e-eben    und mit je 200     Volumteilen     Aceton zweimal     nachgespült,    Die     vereinigten          Acetonlösun-en    werden durch     Abnutschen     vom     Niedeaschl:

  a-        -etrennt.    Der Rückstand  wird dreimal mit je 200     Volunrteilen    heissere  Aceton     ausgewaschen.    Die     vereinigten        Aceton-          lösun--en    werden im     Wasserstrahlvakuum    von  Aceton befreit.

   Die zurückbleibende wässerige       Lösung    wird mit dein beim Abdampfen des  Acetons     ausgefallenen        Niederschlag    und     aus-          sesehiedenem   <B>01</B> mit     -100        Volumteilen    Chloro  form in ein     Extraktionsgefäss        bespült.    Die Ex  traktion der     wässeri;-en    Schicht wird mit je  100     Volumteilen    Chloroform viermal wieder  holt.

   Die     letzten        Chloroforn)extrakte    sind fast  farblos, während die ersten beiden stark gelb  braun     "efärbt    sind. Die     Chloroformextrakte     werden vereinigt, über wasserfreiem Natrium  sulfat     getrocknet    und die filtrierte Lösung  im     Vakuum    zur Trockne verdampft.

   Als     Ein-          dampfunbsrüekstand    verbleiben     1.1,5    Gewichts  teile eines dunkelbraunen     Produktes.    Die     pa-          pierehromatographiselie    Analyse zeigt neben       unverändertem        Desoxveortieosteron    das in     11-          Stellung        oxydierte    Produkt, das     Corticosteron,     an.

   Der Rohextrakt wird in 250     Volumteilen     Äther gelöst und diese Lösung     reit    je 200     Vo-          l.umteilen    einer     gesättigten    Lösung von Na  triumbica.rbonat     arusgesehüttelt.    Die gelbe,       klaretherlösun        \@    wird sofort mit.

   50     Volum-          teilen        O,ln-Salzsäure        versetzt.    und mit je  50     Vol.umteilen    Wasser zweimal     bewaschen.     Die dabei entstehenden Emulsionen     werden     durch     Zugabe    von     5i        Voluinteilen    Methanol  gebrochen und die     Ätherschicht    zur Trockne      verdampft. Als     'Trocl@enrückstand    werden 4,2  Gewichtsteile eines gelbbraunen Breies erhal  ten.

   Dieser wird in bekannter Weise an     Sili-          cagel        chromatographiert.    Die Äther- und       Chloroformeluate    bestehen aus     unumgewan-          deltem        Desoxyeorticosteron.    Die     Chl.oroform-          F.ssigsäureextrakte    liefern nach der papier  chromatischen Analyse eine Mischung von       Desoxy        eorticosteron    und     Corticosteron,    wäh  rend die     Essigestereluate        Corticosteron    und  ein gelb gefärbtes Produkt enthalten.

   Die       Corticosteron    enthaltenden     Fraktionen,    wer  den vereinigt und nochmals an     Silicagel          chromatographiert.    Nach dem     Umkristalli-          sieren    wird     Corticosteron    vom F. 175   gewonnen. Dieses Produkt wird wie im  Beispiel 2     acetyl'iert    und das     Aeetylie-          rnngsprodukt    durch mehrfaches     Umkristalli-          sieren    gereinigt.

   Die Kristalle zeigen den  F. - 140 bis 146  C, die spezifische Drehung       [a1D    = 219  (in Alkohol) und die bekannte  Farbreaktion mit konzentrierter Schwefel  säure. Bei der     papierchromatographischen     Analyse erweist sieh das Produkt. einheitlich  als     Cortieosteronacetat.     



       Beispiel     53 Gewichtsteile (eingeschnittener schlacht  frischer     Rindernebennieren    werden in einem       Homogenisator    mit 100     Volumteilen    einer  wässerigen Lösung 3 Minuten homogenisiert.

    Die 100     Volumteile    der wässerigen Lösung  enthalten 0,232 Gewichtsteile     Fumarsäure,     1,8     (lewiehtsteile    Glucose, 0,362 Gewichtsteile       Natriumchlorid,    0,186 Gewichtsteile Kalium  ehlorid, 0,356 Gewichtsteile sekundäres Na  triumphosphat und 0,099 Gewichtsteile Ma  gnesiumsulfat und sind mit 4     Volumteilen          2n-Natronlauge    auf     p$    7,28 gestellt. Nach dem  Homogenisieren wird das     Homogenisat,    des  sen PH 6,73 beträgt, mit 0,5     Volumteilen        2n-          Natronlauge    auf PH 7,22 gebracht.

   Zu dieser       3lischung    werden 20     Volumteile        Propylen-          glykol    gegeben, 1 Minute homogenisiert und  25     Volumteile        Propylenglykol,    welche 0,1 Ge  wichtsteil Substanz S     (d4-3,20-Diketo-17a,21-          dioxy-pregnen)    gelöst enthalten, zugegeben,  mit 5     Vo'lumteilen        Propylengly        kol    nachge-    waschen und noch     11/2    Minuten homogenisiert.

    Die Emulsion wird in ein mit     Rührer    und       Gaseinleitungsrohr    versehenes Gefäss umge  leert und im Thermostaten bei 37  C unter  Rühren Sauerstoff durchgeleitet. Allzu starke  Schaumentwicklung wird durch Drosselung  der Sauerstoffzufuhr oder durch Zugabe we  niger Tropfen     Octanol    vermieden. Nach 30 Mi  nuten beträgt das     p$    7,27, nach 3 Stunden  7,20. Durch Zugabe von 12     Volumteilen    ln  Salzsäure wird das p$ auf 3,75 gestellt, wobei  eine starke Eiweissfällung und Verfärbung  der bis dahin rotbraun gefärbten. Lösung  nach graubraun erfolgt.  



  Das Reaktionsgemisch wird in 2000     Volum-          teile    Aceton geleert und das Reaktionsgefäss  mit je 100     Volumteilen    Aceton dreimal aus  gewaschen. Die vereinigten     Acetonlösungen     werden 15 Stunden bei Zimmertemperatur  stehengelassen. Die Fällung wird dann durch       Abnutschen    von der gelben Lösung getrennt  und der Rückstand mit je 100     Volumteilen     heissem Aceton dreimal gewaschen. Die verei  nigten     Acetonlösungen    werden im Vakuum  vollständig von Aceton befreit. Die zurück-.

    bleibende wässerige Lösung und die während  des     Eindampfens    ausgeschiedenen Nieder  schläge und Öle werden mit 200     Volumteilen     Essigester in ein Extraktionsgefäss transfe  riert. Die wässerige Phase wird durch Zugabe  von 25 Gewichtsteilen Kochsalz gesättigt und  viermal mit je 100     Volumteilen    Essigester ex  trahiert. Die vereinigten     Essigesterlösungen     werden zweimal mit je 60     Volumteilen    Wasser  gewaschen und zweimal mit je 40     Volumteilen     gesättigter     Natriumbicarbonatlösung    ausge  schüttelt.

   Das Waschwasser und die     Bicar-          bonatlösungen    werden vereinigt und mit  100     Volumteilen    Essigester extrahiert. Die  vereinigten     Essigesterlösungen    werden mit  50     Volumteilen    Wasser, dann mit 50     Volum-          teilen        0,01n-Salzsäure    und anschliessend zwei  mal mit je 50     Volumteilen    Wasser gewaschen.  Die orangegelbe     Essigesterlösung    wird über  wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, fil  triert und im Vakuum zur Trockne verdampft.

    Als     Essigesterextrakt    bleiben 3,4 Gewichtsteile      eines dunkelbraunen,     schmierigen        Kristall-          breies        zurüek.     



  Die     papierehromatographisclie    Analyse die  ses Rohextraktes zeigt neben unveränderter  Substanz S die Substanz F     (d-1-3,20-Diket.o-          17.ss1,17a,21=trioay-preglien)    an. Der dunkel  braune Kristallbrei wird in 10     Volumteilen     einer Lösung von 50     Volumteilen    Benzol und  50     Voluniteilen    Äther gelöst, an     Silicagel    in  bekannter Weise     chromatographiert    und mit  Äther,     Ätlier-Chloroformgemischen,    Chloro  form,     Chloroform-Essigestergemischen,

      Essig  ester und     Essigester-Methanolgemischen        elu-          iert.     



  Aus den     Chloroformeluaten    kristallisiert  nach dem Eindampfen unveränderte Sub  stanz S, und aus den Essigester- und     Essig-          ester-Methanoleluaten    wird die Substanz F  erhalten. Durch mehrfaches     Umkristallisieren     aus einem Gemisch von     Äther-Aceton-Pentan     und anschliessend aus     Äther-Aceton    wird aus  den Fraktionen der     Essigesterelution    in     (,e-          ringer    Menge ein begleitendes, die Kristallisa  tion stark erschwerendes, gelbliches Öl abge  trennt.

   Das     papierchromatographiseh-einheit-          liche,    kristallisierte Produkt schmilzt bei 200  bis 210  C     lind    zeigt in     21isehung    mit     analy        -          tisch    reiner Substanz F keine Depression des  Schmelzpunktes. Die Kristalle lassen sich auch  auf Grund der     Farbreaktion    mit konzentrier  ter Schwefelsäure als Substanz F identifizie  ren und zeigen eine spezifische Drehung von       fall)    = +     15'6     (in Alkohol).

   Die     Chloro-          form-Essigestereluate,    welche neben Substanz  F auch noch Substanz S enthalten, werden  durch nochmalige chromatische Trennung an       Silicagel    in die Komponenten getrennt. Die  übrigen     Efuate    der     Silicagelchromatographie,     in welchen Substanz F und Substanz S ge  mischt vorliegen, werden mit.

   den Mutterlau  gen der oben genannten Umkristallisation ver  einigt und in bekannter     Weise    mit     Acetan-          hydrid    in     Pyridin        acetyliert.    Die     Acetylie-          rungsprodukte    werden an     Silicagel        ehromato-          graphiert    und die Acetate nach Eindampfen  der     Eluierungsmittel    kristallin erhalten. Die  mit konzentrierter Schwefelsäure grüngelb       fluoreszierenden    Kristalle stellen das reine         F-aeetat    vor.

   Sie schmelzen bei 218 bis     225"        r;     und zeigen in     Dioxan    eine spezifische Drehung  von     f    a] D = + 167 .  



  <I>Beispiele 5</I>     his   <I>31:</I>       Beispiele   <I>5</I>     bis.?1:    In     genau    gleicher Weise,  wie im Beispiel     .1    eingehend beschrieben, wird  mit den in den     folgenden    Beispielen angege  benen Substraten die Reaktion und die Auf  arbeitung des     Reaktionsgemisches        durehge-          führt.    Als     enzymhaltiges    Organ werden Rin  dernebennieren und als     Ausgangsstoff    für die       Steroidoxydation    je 0,

  1     Gewichtsteile    Sub  stanz S     (d-1-3,20-Dil,:eto-17a,21-dioxy-pregnell)     verwendet. Das     pH    des     Reaktionsgemisches     wird, wenn nötig, durch Zugabe von     2n-Na-          t-ronlauge    oder     'n-Salzsäiire    in     gewissen        Zeit-          absehnitten    auf das     pli    bei Versuchsbeginn     7u-          rücktitriert.Als    Lösungsvermittler werden je  50     Volumteile        Propylenglykol    in der im Bei  spiel 4 näher 

  ausgeführten Weise zugefügt.  In diesen Beispielen werden als Lösungsmittel  je 100     Volumteile    einer     wässerigen    Lösung  verwendet, welche neben der     Substratsubstanz     noch folgende Zusätze enthalten: 1,8 Gewichts  teile Glucose, 0,362     Gewiehtsteile        Natrium-          ehlorid,    0,356     Gewielitsteile    sekundäres Na  triumphosphat, 0,099 Gewichtsteile     3lagne-          siumsuliat    und so viel Natronlauge, als zur       Titration    auf ein     pH    von<B>7,5</B> notwendig ist.

    Während der Reaktion     wird    immer Sauerstoff  durchgeleitet.  



  <I>Beispiel</I>     25:    Analog der in den Beispielen  bis 21 beschriebenen Reaktionsfolgen und       Aufarbeitungsmethoden    werden in diesem Fall,  als     Lösungsvermittler    an Stelle von     Propylen-          glykol    50     Volumteile        Äthylenglykol.    in genau  gleicher Weise verwendet.  



  <I>Beispiele</I> 96<I>bis 31:</I> Unter sonst gleichen       Versuchsbedingungen,    wie sie in den Beispie  len 4 bis 25 eingehalten werden, wird in den  Beispielen 26 bis 31 auf die Verwendung eines  Lösungsvermittlers verzichtet und dafür statt  nur 100     Volumteile    der     glucosehaltigen    Salz  lösung 150 V     olumteile    als Lösungsmittel ver  wendet. Je 0;1 Gewichtsteile der zu oxydieren  den     Substanz    S     (J-1-3,20-Diketo-17a,21-dioxy-          pregnen)    wird als feines Pulver direkt zum           ioniogenisat    gegeben und das Ganze noch  mals 3 Minuten homogenisiert.

   Dann wird  gemäss dem im Beispiel     -1    eingehend geschil  derten Verfahren unter     Einleitung    von Sauer  stoff reagieren gelassen -Lind das     Reaktions-          gemiseh    analog aufgearbeitet. Schliesslich wird    die     gewünschte    Substanz     P        (d4-2,20-Diketo-          11f,17a,21-trioxy-pregnen)    kristallin erhalten  und     papierchromatographisch    identifiziert.  



  In der folgenden Tabelle sind die für die  Beispiele 5 bis 31 charakterisierten Versuchs- so       daten    zusammenfassend dargestellt.    <I>Beispiele 5 bis</I>     3.1:     
EMI0007.0013     
  
    <I>Oxydation <SEP> von <SEP> Substanz <SEP> S <SEP> zu <SEP> Substanz <SEP> h'.</I>
<tb>  Stunden
<tb>  Beispiel <SEP> Gew.- <SEP> Gew.-Teile <SEP> ?@H <SEP> d. <SEP> Reaktionslösung <SEP> Total <SEP> Essigester  Substrat <SEP> nach <SEP> erhöht <SEP> extrakt
<tb>  Nr.

   <SEP> Teile <SEP> Nebenniere <SEP> Beginn <SEP> Ende <SEP> Reaktions  30' <SEP> auf <SEP> <U>zeit</U> <SEP> Gew.-Teile
<tb>  Zitronensäure <SEP> 0,420 <SEP> 47 <SEP> 6,58 <SEP> 6,81 <SEP> 6,85 <SEP> 7,00 <SEP> 3 <SEP> 2,23
<tb>  6 <SEP> Bernsteinsäure <SEP> 0,236 <SEP> 51 <SEP> 6,58 <SEP> 6,90 <SEP> - <SEP> 6,71 <SEP> 2%z <SEP> 7,11
<tb>  7 <SEP> Funiarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 6,57 <SEP> 6,58 <SEP> - <SEP> 6,55 <SEP> 41/z <SEP> 1,43
<tb>  8 <SEP> <B><I>93</I></B> <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,02 <SEP> 7,10 <SEP> - <SEP> 7,08 <SEP> 3 <SEP> 3,l1
<tb>  9 <SEP> <B>31</B> <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,45 <SEP> 7,45 <SEP> 7,50 <SEP> 7,41 <SEP> 3 <SEP> 3,51
<tb>  10 <SEP> <B>39</B> <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> 7,98 <SEP> 7,70 <SEP> 7,99 <SEP> 7,85 <SEP> 3 <SEP> 1,95
<tb>  11 <SEP> d,l <SEP> Äpfelsäiire <SEP> 0,356 <SEP> 51 <SEP> 6,50 <SEP> 6,52 <SEP> - <SEP> 6,

  57 <SEP> 4i/2 <SEP> 1,2
<tb>  12 <SEP> Malonsäure <SEP> 0,208 <SEP> 50 <SEP> 7,20 <SEP> 7,20 <SEP> - <SEP> 7,10 <SEP> 3%2 <SEP> 1,88
<tb>  13 <SEP> Glütarsäure <SEP> 0,264 <SEP> 50 <SEP> 7,04 <SEP> 7,19 <SEP> - <SEP> 7,09 <SEP> 31/2 <SEP> 1,91
<tb>  14 <SEP> Adipinsäure <SEP> 0,292 <SEP> 50 <SEP> 7,20 <SEP> 7,l5 <SEP> - <SEP> 7,05 <SEP> 31/s <SEP> 1,80
<tb>  15 <SEP> cl,l-C?liitaminsä.ure <SEP> 0,584 <SEP> 54 <SEP> 7,14 <SEP> 7,01 <SEP> - <SEP> 6,91 <SEP> 3 <SEP> 2,71
<tb>  16 <SEP> d-Glutaminsäure <SEP> 0,584 <SEP> 35 <SEP> 7,28 <SEP> 7,12 <SEP> 7,18 <SEP> 7,18 <SEP> 21/z <SEP> 2,27
<tb>  17 <SEP> d,l-Asparaginsäure <SEP> 0,532 <SEP> 54 <SEP> <B>7,18</B> <SEP> 7,05 <SEP> - <SEP> 6,90 <SEP> 3 <SEP> 2,39
<tb>  18 <SEP> d,l-Asparagin <SEP> 0,528 <SEP> 54 <SEP> 7,22 <SEP> 7,11 <SEP> - <SEP> 6,95 <SEP> 3 <SEP> 2,90
<tb>  19 <SEP> d,l-Alanin <SEP> 0,356 <SEP> 54 <SEP> 6,

  92 <SEP> 6,58 <SEP> 7,09 <SEP> 6,99 <SEP> 3 <SEP> l,92
<tb>  20 <SEP> Milchsäure <SEP> 0,180 <SEP> 50 <SEP> 7,17 <SEP> 7,12 <SEP> - <SEP> 7,01 <SEP> 31/z <SEP> 2,29
<tb>  21 <SEP> Dioxyweinsäure <SEP> 0,364 <SEP> 51 <SEP> 7,04 <SEP> 7,02 <SEP> - <SEP> 6,96 <SEP> 31/z <SEP> 1,90
<tb>  22 <SEP> 1-Ascorbinsäure <SEP> 0,352 <SEP> 50 <SEP> 7,03 <SEP> 7,06 <SEP> - <SEP> 6,91 <SEP> 31/2 <SEP> 2,55
<tb>  23 <SEP> Brenztraubensäure <SEP> 0,l66 <SEP> 47 <SEP> 6,49 <SEP> 6,69 <SEP> - <SEP> 6,63 <SEP> 3 <SEP> 2,13
<tb>  24 <SEP> " <SEP> 0,l66 <SEP> 50 <SEP> 7,37 <SEP> 7,15 <SEP> 7,20 <SEP> 7,10 <SEP> 3 <SEP> 3,15
<tb>  25 <SEP> Funiarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 53 <SEP> _ <SEP> 7,29 <SEP> 7,11 <SEP> - <SEP> 7,l1 <SEP> 21/z <SEP> 2,53
<tb>  26 <SEP> eis <SEP> Aconitsäure <SEP> 0,348 <SEP> 47,5 <SEP> 7,38 <SEP> 7,13 <SEP> 7,46 <SEP> 7,22 <SEP> 3 <SEP> 1,

  30
<tb>  27 <SEP> a-hetoglutarsäure <SEP> 0,292 <SEP> 47,5 <SEP> 7,48 <SEP> 7,28 <SEP> 7,45 <SEP> 7,27 <SEP> 3 <SEP> 1,13
<tb>  28 <SEP> Glykokoll <SEP> 0,124 <SEP> 47,5 <SEP> 7,42 <SEP> 7,18 <SEP> 7,52 <SEP> 7,25 <SEP> 21/z <SEP> 1,29
<tb>  29 <SEP> d,l-Serin <SEP> 0,210 <SEP> 47,5 <SEP> 7,42 <SEP> 7,05 <SEP> 7,42 <SEP> 7,28 <SEP> 2i/2 <SEP> l,97
<tb>  30 <SEP> 1-Tryptophan <SEP> 0,408 <SEP> 41 <SEP> 7,50 <SEP> 7,17 <SEP> 7,52 <SEP> 7,30 <SEP> 2 <SEP> 0,74
<tb>  31 <SEP> 1-Tyrosin <SEP> 0,362 <SEP> 41 <SEP> 7,62 <SEP> 7,23 <SEP> 7,60 <SEP> 7,35 <SEP> 2 <SEP> 1,27       <I>Beispiele 32 bis 35:

  </I>    In sonst genau gleicher Weise, wie in den  Beispielen 4 bis 41 angegeben, werden in den  Beispielen 32 bis 35 unter Verwendung von  je 50     Volumteilen        Propylenglvkol    als Lö-         sungsvermittler    je 100     Volumteile        gliicosefreie     Salzlösung als Lösungsmittel verwendet und  die Reaktionszeit gemäss den in der nach  stehenden Tabelle angeführten Versuchsbedin  gungen verändert.

       Aneh    unter der nachge-      nannten Arbeitsweise lässt sich aus Substanz S       (d4-3,20-Diketo-17a,21-dioxi--pregnen)    die  Substanz F     (d-1-3,20-Diketo-11ss,17a,21-trioxy-          pregnen)    kristallin gewinnen. Der Schmelz  punkt nach einmaligem     Umkristallisieren    des       Essigestereluates    des an     Silicagel    ehromato-         graphierten    Rohextraktes liegt bei 185 bis  200  C.

   Die     papierchromatographische    Analyse       Lind    die Farbreaktion mit konzentrierter  Schwefelsäure beweisen die Identität dieser  kristallisierten Fraktion mit der     Substanz    F.    <I>Beispiele</I>     3,)   <I>bis 35:</I>  
EMI0008.0012     
  
    <I>Oxydation <SEP> von <SEP> Sltbstanz <SEP> S <SEP> zu <SEP> SiAsta.nz <SEP> Z'.</I>
<tb>  Neben- <SEP> Lösungsmittel <SEP> p<B>l,</B> <SEP> der <SEP> Reaktions- <SEP> Stunden <SEP> Essigester  Beispiel <SEP> Substrat <SEP> Gew.- <SEP> Liiere <SEP> wie <SEP> in <SEP> den <SEP> vol.- <SEP> Lösung <SEP> Total <SEP> extrakt
<tb>  No. <SEP> Teile <SEP> Gew.- <SEP> Beispielen <SEP> 5-31 <SEP> nach <SEP> Reakt.

    Teile <SEP> jedoch <SEP> Teile <SEP> Beginn <SEP> 30, <SEP> Ende <SEP> Zeit <SEP> @ew.-Teile
<tb>  32 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 51 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> 6,78 <SEP> 6,78 <SEP> 6,78 <SEP> 41/2 <SEP> 1,49
<tb>  33 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 53 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> 7,35 <SEP> 7,25 <SEP> 7,48 <SEP> 21/2 <SEP> 3,14
<tb>  34 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 34 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> 7,32 <SEP> 7,54 <SEP> 7,54 <SEP> 1 <SEP> 1,99
<tb>  35 <SEP> Fumarsäure <SEP> <B>0,232</B> <SEP> 53 <SEP> ohne <SEP> Glucose <SEP> 100 <SEP> <B>7,38 <SEP> 7,56</B> <SEP> 7.49 <SEP> 21/2 <SEP> 3,13
<tb>  { <SEP> ohne <SEP> NgS04 <SEP> }       <I>Beispiel 36:

  </I>  121     Gewiehtsteile    schlachtfrischer, zu Wür  feln geschnittener Kalbslebern werden in  einem     Homogenisator    mit. 100     Volumteilen     einer wässerigen Lösung 3 Minuten homogeni  siert. Die 100     Volumteile    der wässerigen Lö  sung .enthalten 0,232 Gewichtsteile     Fuumar-          säure,    1,8 Gewichtsteile Glucose, 0,362 Ge  wichtsteile     Natriumehlorid,    0,186     Gewiehtsteile          Kaliumchlorid,    0,356     Gewiehtsteile    sekundäres       Natritumphosphat    und 0,099 Gewichtsteile Ma  gnesiumsulfat und sind mit 1,

  2     Volumteilen          Zn-Natronlauge    auf PH 7,42 gestellt. Nach  dem Homogenisieren wird das     Homogenisat,     dessen     pH    6,74 beträgt, mit 1,2     Volumteilen          '>n-Natronlauge    auf PH 7,42 gebracht. Zu die  ser Mischung wird 0,1 Gewichtsteil     Substanz    S       (d4-3,20-Diketo-17a,21-dioxy-pregnen)    zugege  ben. und noch 2 Minuten homogenisiert.

   Die  Emulsion wird in ein mit     Rührer    und     Gasein-          leitungsrohr        versehenes    Gefäss umgeleert und  im Thermostaten bei 37  C unter Rühren  Sauerstoff durchgeleitet.     Allzustarke        Scha.um-          entwieklung    wird durch     Drosselung    der Sauer  stoffzufuhr oder durch Zugabe weniger Trop  fen     Octanol    vermieden. Nach 30 Minuten be  trägt das     pH    7,10.

   Mit 0,2     Volumteilen        'n-          Natronlauge    wird es auf 7,27 eingestellt; nach    120 Minuten werden zur Einstellung des     pF3     von 7,12 nach 7,26 nochmals 0,2     Volumteile          2n-Natronlauge    zugegeben. Nach 3     Stunden     beträgt das     pH    7,20. Durch Zugabe von 30     Vo-          lumteilen        ln-Salzsäure    wird das     pH    auf 3,30  gebracht, wobei eine starke Eiweissfällung und  Verfärbung der bis dahin braungefärbten Lö  sung nach graubraun erfolgt.  



  Das     Reaktionsgemisch    wird in     3000        Vo-          lumteile    Aceton     -eleert    und das Reak  tionsgefäss mit. je 250     Volumteilen    Ace  ton dreimal     ausgewasehen.    Die vereinig  ten     Acetonlösungen    werden 15 Stunden  bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die  Fällung wird dann durch     Abnutschen    von  der gelben     Lösung    getrennt und der Rück  stand mit je 250 V     olumteilen    heissem Aceton  dreimal     gewasehen.    Die vereinigten Aceton  lösungen werden im Vakuum vollständig von  Aceton befreit.

   Die zurückbleibende wässerige  Lösung und die während des     Eindampfens     ausgeschiedenen Niederschläge und Öle wer  den mit 300     Volumteilen    Essigester in ein Ex  traktionsgefäss transferiert. Die wässerige  Phase wird durch Zugabe von 25 Gewichts  teilen Kochsalz gesättigt und viermal mit je  100     Volumteilen    Essigester extrahiert. Die  vereinigten     Essigesterlösungen    werden zweimal      mit je 60     Volumteilen    Wasser gewaschen und  viermal mit je 50     Volumteilen    gesättigter       Natriumbicarbonatlösung    ausgeschüttelt.

   Das  Waschwasser und die     Bicarbonatlösungen     werden vereinigt und mit 100     Volumteilen     Essigester extrahiert. Die vereinigten Essig  esterlösungen werden mit 50     Volumteilen    Was  ser, dann mit 50     Volumteilen        0,1n-Salzsäure     und anschliessend noch dreimal mit je 50     Vo-          lumteilenWasser    gewaschen. Die orangegelbe       Essigesterlösung    wird über wasserfreiem Na  triumsulfat getrocknet, filtriert und im Va  kuum zur Trockne verdampft. Als Essig  esterextrakt bleiben 3,03 Gewichtsteile einer  hellbraunen Gallerte zurück, welche über  Nacht. Kristalle ausscheidet.  



  Die     papierchromatographische    Analyse die  ses Rohextraktes zeigt neben unveränderter  Substanz S die Substanz F     (44-3,20-Diketo-          1.1f,17a,21-trioxy-pregnen)    an. Der hellbraune  Kristallbrei wird in 10     Volumteilen    einer  Lösung von 75     Volumteilen    Benzol und 2'5     Vo-          liimteilen    Äther gelöst und an     Silicagel    in be  kannter     Weise        chromatographiert.    Es wird mit  Ä     Hier,        Äther-Chloroformgemischen,    Chloro  form,     Chloroform-Essigestergemischen,

      Essig  ester und     Essigester-Methanolgemischen        elu-          iert.     



  Aus den Essigester- und     Essigester-Me-          thanoleluaten    kristallisiert die Substanz F.  Durch mehrfaches     Umkristallisieren    aus einem  Gemisch von     Äther-Aceton-Pentan    und an  schliessend aus     Äther-Aceton        wird    aus den  Fraktionen der     Essigesterelution    das     papier-          ehromatographisch    einheitliche, kristallisierte  Produkt erhalten, welches bei 200 bis 210  C  schmilzt.

   Die Kristalle lassen sich auf Grund  der Farbreaktion mit konzentrierter Schwefel  säure als Substanz F (d4-3,20 -     Diketo-          11ss,17a,21-trioxy-pregnen)    identifizieren und  zeigen die spezifische Drehung [a] D = +156   (in Alkohol).

   Die     Eluate    der     Silicagelchro-          matographie,    in welchen Substanz F und S  gemischt vorliegen, werden mit den Mutter  laugen der     obgenannten    Umkristallisation ver  einigt und in bekannter Weise mit Acetan-         hydrid    in     Pyridin        aeetyliert.    Die     Acetylie-          rungsprodukte    werden an     Silicagel        chromato-          graphiert    und die Acetate nach Eindampfen  der     Eluierungsmittel    kristallin erhalten.

   Die  mit konzentrierter Schwefelsäure grüngelb  fluoreszierenden Kristalle schmelzen bei 2,18  bis 225  C und zeigen in     Dioxan    die spezi  fische Drehung [a] D =     +   <B>1670.</B> Sie stellen  somit, das Acetat der Substanz F vor.  



  <I>Beispiele 37 bis</I>     422:     Analog zu den im Beispiel 36 näher be  schriebenen Versuchsbedingungen wird in den  Beispielen 3 7 bis 42 mit den in der nachfol  genden Tabelle angeführten Substraten ge  arbeitet, wobei im Beispiel 37 100     Völumteile     und in den Beispielen 38 bis 42 je 150     Vo-          lumteile    der     glucosehaltigen        Salzlösung    als  Lösungsmittel     verwendet    werden.

   Auch unter  diesen Bedingungen gelingt die Einführung  von Sauerstoff in     11-Stellung    der Substanz S       (d4-3,20-Diketo-17a,21-dioxy-pregnen).    Die ge  mäss Beispiel 36 verwendete     Aufarbeitungs-          methode    führt zur Isolierung der bei 200 bis  210  C schmelzenden Substanz F     (d4-3,20-Di-          keto-11ss,17a,21-trioxy-pregnen).    Die Kristalle  werden durch     papierchromatographische    Ana  lyse und die Farbreaktion mit konzentrierter  Schwefelsäure identifiziert und zeigen in  Äthanol die spezifische Drehung [a] D =     +156 .       <I>Beispiel 37:

  </I> Hier werden, wie im Beispiel  36, 121 Gewichtsteile Kalbsleber homogeni  siert.    <I>Beispiele 38 bis 40:</I> Als Enzymhaltiges  Organ     werden    in diesen Versuchen je 55 Ge  wichtsteile     Kaninchenleber,    in analoger     Weise     wie im Beispiel 36, eingesetzt.  



  <I>Beispiele 41 und 42:</I> Als Enzymquelle wer  den in diesen Versuchen je 83     Gewichtsteile     Kalbsnieren statt Lebern, unter sonst analogen  Bedingungen wie im Beispiel 36, verwendet.    Die den Beispielen 37 bis 42 zugrunde  liegenden übrigen Versuchsdaten sind in der  folgenden Tabelle zusammengestellt.

        <I>Beispiele 37</I>     his   <I>42:</I>  
EMI0010.0002     
  
    <I>Oxydation <SEP> von <SEP> Substanz <SEP> S <SEP> zu <SEP> Substanz <SEP> F.</I>
<tb>  pH <SEP> der <SEP> Reaktionslösung <SEP> Stunden <SEP> Essigester  Beispiel <SEP> Substrat <SEP> Gew' <SEP> nach <SEP> nach <SEP> erhöht <SEP> nach <SEP> erhöht <SEP> Total <SEP> extrakt
<tb>  Nr.

   <SEP> Teile <SEP> Beginn <SEP> 20# <SEP> 40' <SEP> auf <SEP> 70' <SEP> auf <SEP> Ende <SEP> Reakt.- <SEP> Gew.-Teile
<tb>  zeit
<tb>  37 <SEP> Zitronensäure <SEP> 0,420 <SEP> 7,42 <SEP> 7,17 <SEP> 7,15 <SEP> 7,28 <SEP> 7,19 <SEP> 7,30 <SEP> 7,22 <SEP> 3 <SEP> 2,05
<tb>  38 <SEP> Funlarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 7,45 <SEP> 7,32 <SEP> 7,25 <SEP> 7,40 <SEP> 7,33 <SEP> 7,6<B>2</B> <SEP> 7,44 <SEP> 3 <SEP> 1,47
<tb>  39 <SEP> Ascorbinsäure <SEP> 0,352 <SEP> 7,47 <SEP> 7,30 <SEP> 7,22 <SEP> 7,37 <SEP> 7,32 <SEP> 7,52 <SEP> 7,30 <SEP> 3 <SEP> 1,64
<tb>  40 <SEP> d,1-Glutaminsäure <SEP> 0,584 <SEP> 7,44 <SEP> 7,33 <SEP> 7,23 <SEP> 7,38 <SEP> 7,33 <SEP> 7,56 <SEP> 7,44 <SEP> 3 <SEP> 2,65
<tb>  41 <SEP> Fumarsäure <SEP> 0,232 <SEP> 7,30 <SEP> 7,13 <SEP> 7,19 <SEP> - <SEP> 7,16 <SEP> - <SEP> 7,14 <SEP> 3 <SEP> 3,<B>1</B>8
<tb>  42 <SEP> Zitronensäure <SEP> 0,420 <SEP> 7,39 <SEP> 7,

  31 <SEP> 7,38 <SEP> - <SEP> 7,39 <SEP> - <SEP> 7,31 <SEP> 3 <SEP> 3,21

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH; Verfahren zur Herstellung von 11-Oxy- steroiden durch Oxydation von in 11- und 12- Stellung unsubstituierten Steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oxydation mit Sauerstoff unter Mitwirkung von Enzymen durchführt. und die gebildeten 11-Oxy-steroide isoliert. UNTERANSPRÜCHE: 1. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man enzymhaltige Organpräparate verwendet, 2.

   Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Organhomogenisate verwendet. 3. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, dass man ausserdem Organschnitten verwendet. 4. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 bis 3, dadurch ge- kennzeichnet, dass man Organpräparate voll Nebennieren verwendet. 5. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, dass das Enzymsubstrat Sub stanzen enthält, die als Substrate dem Cyclo- phorase-System zugehören. 6.

   Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 bis :5, dadurch ge kennzeichnet, dass das Enzymsubstrat ausser dem dem Zitronensäurezyklus angehörende oder unter den Reaktionsbedingungen in solche überführbare Verbindungen enthält, 7. Verfahren nach Pat.entansprueh und den Unteransprüchen 1 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, dass das Enzymsubstrat. ausser dem Ascorbinsäure enthält. B. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, dass man die Reaktion im plt- Bereich 6,5 bis 9 durchführt.