<B>Procédé</B> pour obtenir, <B>à</B> partir <B>de</B> liquide amniotique, <B>des</B> liquides <B>destinés</B> <B>à des usages</B> techniques. L'invention a pour objet un procédé pour obtenir, à partir de liquide amniotique, des liquides destinés à des usages techniques, tels que conservation ou culture de tissus vivants, culture de microbes ou virus, etc., caractérisé par le fait. qu'on soumet du liquide amnio tique, à froid, à.
une filtration, puis à au moins un traitement de déprotéinisation phy sique, ou fait passer le liquide traité sur un adsorbant pendant un temps suffisant pour que le liquide ne donne plus de précipitation par l'acide sulfosalycilique et dans des condi tions telles qu'il. se maintienne sensiblement au pH physiologique, et on effectue finalement une stérilisation bactériologique à froid.
Les titulaires ont constaté que les liquides obtenus par le procédé selon l'invention ont des propriétés biologiques importantes en ce qui concerne la survie, la culture des tissus vivants, la culture des microbes, des virus, etc.
On a déjà utilisé pour la survie cellulaire des ultra-filtrats ou ultra-centrifugats de sérum sanguin, ces liquides étant équilibrés et dépourvus des substances nocives ou inhibi trices de la croissance.
Mais l'obtention de ces liquides à partir de sérum sanguin par exem ple, par dialyse, ultrafiltration ou ultracen trifugation, se heurte à des difficultés prati ques lorsqu'on cherche à en obtenir des quan tités importantes. De plus, les liquides obtenus conformément à l'invention, à partir du liquide amniotique, ont des propriétés que ne possè- dent pas les sérums sanguins purifiés ultra- filtrés, ou dit déspécifiés ,
et ils ont de ce fait des utilisations différentes et plus éten- dues.
Le liquide amniotique est particulièrement intéressant, du fait qu'il peut être recueilli en grande quantité aux abattoirs où les grands animaux de boucherie sont souvent sacrifiés alors que les femelles portent un f#tus bai gnant dans une quantité importante de liquide amniotique.
Le procédé selon l'invention permet de séparer les éléments colloïdaux et notamment les protéines, les complexes protéiques et di verses autres substances.
Le traitement de déprotéinisation peut être réalisé par moussage du liquide et élimina tion de la mousse qui contient des produits dénaturés et surtout des protéines.
Le moussage est obtenu par barbotage d'un gaz qui peut être par exemple l'air filtré, l'azote, le gaz càrbonique, l'oxygène, etc.
Le moussage peut également être réalisé par agitation mécanique du liquide. La mousse, au lieu d'être éliminée dans sa. totalité, peut être détruite soit par des jets gazeux conve nables, c'est-à-dire par démoussage pneuma tique, soit par l'adjonction de très faibles quantités d'une substance dite antimousse. Les produits dénaturés surnagent et sont éliminés.
Le moussage est fait après une première fitration qui élimine les éléments grossiers. Après déprotéinisation, le liquide est en voyé sur une couche d'un adsorbant. qui peut être par exemple du charbon actif, ou un autre adsorbant végétal, animal, minéral ou organique.
L'adsorption doit. être juste suffisante. C'est. une opération qui doit être conduite avec exactitude, la. vitesse de passage du liquide à travers la. couche adsorbante devant être constamment surveillée. Des prélèvements de liquide purifié sont faits à intervalles ré- guliers à la. sortie du filtre adsorbant, et on. vérifie que chaque fraction prélevée ne pré cipite pas par l'acide s2ilfosalycilique et reste an pH physiologique.
On peut terminer enfin la série d'opéra tions par une filtration stérilisante en faisant passer le liquide sur un filtre retenant les bactéries. Ce filtre peut. être un filtre à pla que d'amiante ou de cellulose, ou un autre filtre bactériologique permettant d'obtenir le même résultat.
La stérilisation peut aussi être pratiquée à froid par d'autres moyens, l'irradiation ultra violette notamment..
On peut également, avant de faire passer le liquide sur un adsorbant, procéder à une congélation, puis à une décongélation frac tionnée, ce qui permet de séparer un liquide dense ou queue de congélation, ayant le point de congélation le plus bas et contenant di verses substances organiques et. minérales dont certaines sont particulièrement intéressantes.
La congélation du liquide peut être faite par exemple dans des boyaux en une matière telle qu'une matière plastique transparente. Après congélation, les boyaux de matière plastique sont enlevés, et les blocs de liquide congelé sont lavés rapidement à l'eau douce pour entraîner certaines parties colorées et denses ayant le plais bas point de congélation.
Selon une variante de réalisation, on peut découper en tranches les blocs de liquide con gelés obtenus, sans même enlever les boyaux qui les renferment. Les tranches situées géné ralement aux extrémités renferment les queues de congélation qui sont séparées de l'ensemble. Il suffit ensuite de décongeler les tranches séparées des queues de congélation, puis de faire passer le liquide obtenu sur un adsor bant.
L'adsorbant est choisi pour que le pH du liquide reste voisin dû pH biologique qui est légèrement supérieur à 7. La ou les couches d'un adsorbant tel que du charbon actif sont réparties sous une épaisseur convenable, sur un ou plusieurs filtres par exemple du type Buchner.
Le liquide ayant traversé le charbon actif dans des conditions de vitesse et. de pH con venables est recueilli puis stérilisé par filtra tion biologique sur filtre Seitz par exemple.
On peut. employer, pour l'adsorption, d'au tres dispositifs tels que couches ou colonnes adsorbantes de produits naturels ou synthéti ques.
Les opérations qui viennent. d'être énumé rées s'effectuent à froid, ce qui laisse au liquide vivant toutes ses propriétés biologi ques.
Le liquide finalement obtenu est limpide et incolore. Il ne contient plus de protéines précipitables par la chaleur et les acides, telles que les acides trichloracétique, sulfosalycilique, nitrique, phénique, ete.
Le liquide est notamment dépourvu de glo bulines. Il contient des glucides réducteurs, il renferme également des matières minérales, par exemple 7,10 g de matières minérales pour 8,82 g de résidus secs par litre.
Il a perdu sa spécificité biologique.
Le liquide préparé pat le procédé qiû a été décrit est. devenu par ses propriétés enzy matiques et biologiques l'équivalent d'iui di- alysat ou d'un ultra-filtrat biologique stérile, un peu alcalin, mails acidifiable par le gaz carbonique.
Le liquide déprotéiné a une composition plus ou moins riche suivant que l'on a. pro cédé ou non aux opérations de congélation et décongélation fractionnées. On peut ainsi pré parer une gamme de liquides riches ou pau vres ayant une concentration moléculaires grande ou petite, voisine si l'on veut de celle du liquide céphalorachidien et s'étendant d'après les résultats- des mesures de cryosco pie, si l'on est parti du liquide amniotique de vache, de d = - 0,58 à d = - 0,31. et. même _ - 0,19 .
Le procédé selon l'invention, grâce à. l'uti lisation comme matière de départ. du liquide amniotique, permet. d'obtenir de grandes quan tités de liquides remplaeant les ultra-filtrats et ultra-centrifugats obtenus en quantités in suffisantes à partir de sérums sanguins.
Le liquide amniotique est. prélevé, non souillé de sang, sur des vaches ou des brebis saines, de préférence an cours du premier tiers de la. gestation. Le liquide amniotique brut, à ce stade de la. gestation, est jaune clair et peu chargé de déchets. Après traitement conformément à l'invention, on obtient un liquide physiologique naturellement équilibré, déprotéiné, sans spécificité biologique, riche en acides aminés libres, en glucides réduc teurs, en éléments minéraux, en oligo-élé- ments, pauvre en urée, légèrement alcalin, stérile.
En outre, les différents constituants miné raux et organiques se trouvent. sous une forme biologique naturelle complexe et s'éqiûlibrent réciproquement en réalisant. un balancement ionique remarquable.
Il est à noter que si l'équilibre naturel d'un tel liquide est rompu par chauffage, on ne peut obtenir à nouveau une solution phy siologique stable de ces divers éléments.
L'analyse du liquide amniotique de vaches ou de brebis traité par le procédé selon l'in vention donne pour 100 cm3 les résultats sui vants à titre d'exemple:
EMI0003.0017
Extrait- <SEP> sec <SEP> environ <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Cendres <SEP> 0,63 <SEP> g
<tb> Azote <SEP> (total) <SEP> environ <SEP> 18 <SEP> mg
<tb> Sodium <SEP> 204 <SEP> mg
<tb> Chlore <SEP> 307,4 <SEP> mg
<tb> Potassium <SEP> 44,6 <SEP> mg
<tb> Calcium <SEP> 9,9 <SEP> mg
<tb> Magnésium <SEP> 4,4 <SEP> mg
<tb> Soufre <SEP> 8,9 <SEP> mg
<tb> Phosphore <SEP> 2,75 <SEP> mg
EMI0003.0018
Fer <SEP> 200 <SEP> gamma
<tb> Cuivre <SEP> 11 <SEP> gamma
<tb> Manganèse <SEP> 1,
2 <SEP> gamma Il a été procédé également à l'analyse mierochroniatographique qualitative sur pa pier après élimination des sels par l'acétone chlorhydrique. On obtient les résultats sui- vants (les croix correspondant à l'abondance des corps, compte-tenu de la sensibilité de la réaction).
EMI0003.0024
Liquide <SEP> Liquide
<tb> amniotique <SEP> amniotique
<tb> déprotéiné <SEP> déprotéiné
<tb> de <SEP> vache <SEP> de <SEP> brebis
<tb> Glycocolle <SEP> -++ <SEP> +++
<tb> Alanine <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Sérine <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Thréonine <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> Valine <SEP> + <SEP> +
<tb> Leucine <SEP> + <SEP> +
<tb> Méthionine <SEP> +
<tb> Cystine <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> Acide <SEP> aspartique <SEP> <SEP> +
<tb> Acide <SEP> glutamique <SEP> ++= <SEP> +++
<tb> Lysine <SEP> + <SEP> +
<tb> Acide <SEP> #aminobutyrique <SEP> + <SEP> + Enfin, l'analyse des sucres réducteurs donne le chiffre important de 1,75 à 2 g par litre. L'analyse mierochromatographique sur papier montre qu'il s'agit uniquement de fructose, à l'exclusion de glucose.
Le taux d'urée est minime, environ 0,12 g par litre.
Le présent procédé, qui ne nécessite pas de traitement à chaud, respecte les différents constituants essentiels du liquide amniotique. On a pu constater en particulier que le taux de fructose est inchangé avant et après le traitement.
Le liquide obtenu est différent du sérum sanguin ultra-filtré; il est naturellement équi libré, il est tamponné, principalement par ses carbonates, il a un pH voisin de 7,6. A l'air libre, le pg est stable pendant plusieurs heures; par la suite, on constate une légère alcalini- sation. Par exemple, au bout de 14 heures, le pH passe environ à 7,85, puis, aii bout de 20 heures, il atteint 7,92.
Le liquide peut faci lement être par la suite acidifié par l'an hydride carbonique.
Par chauffage à 40 C, le liquide donne un précipité minéral, facilement soluble par aci- dification du milieu. II a un bon pouvoir sol vant et peut être enrichi par de nombreuses substances.
Les liquides préparés par le procédé selon l'invention ont des applications biologiques variées ainsi que des applications industrielles.
Ils peuvent servir, seuls ou associés à d'autres substances, de liquides physiologiques standard pour la. conservation de divers tissus vivants ou organismes en survie, pour leur culture, ainsi que pôur la culture de di vers microbes ou virus en vue en particulier de la fabrication de vaccins. On peut d'ailleurs dessécher ces liquides par divers procédés et par exemple par lyophi lisation, c'est-à-dire sublimation dans le vide à basse température.
Le résidu obtenu peut être conservé convenablement en récipients scellés, puis dissous dans une quantité appro priée d'eau distillée stérile.
Les parties concentrées recueillies dans les queues de congélation au cours du traitement se présentent comme un mélange liquide pig menté en jaune foncé, de réaction alcaline.
Ces queues de congélation contiennent comme éléments très importants des hormones que l'analyse a pu reconnaître comme étant toujours des hormones #strogènes actives, non associées à des hormones androgènes.
Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre an moyen d'une installation grou pant certaines opérations.
La figure unique représente schématique ment une telle installation.
Celle-ci comporte un turbofiltre compre nant une cuve 1 et un bol de centrifugation dont les parois verticales 2 sont constituées par une matière filtrante. La cuve 1 est recouverte d'un couvercle 3 traversé par iine arrivée de liquide 4 et une arrivée de gaz 5.
Le liquide arrivant dans le bol de centri fugation est mis en rotation rapide. Ce liquide se trouve ainsi centrifugé, puis filtré à tra vers les parois 2. Il s'écoule alors par un con duit 6 placé à la base de la cuve 1. La sortie du conduit 6 est disposée dans un récipient 7 dans lequel le liquide se rassemble à la partie inférieure et est surmonté d'une mousse abon dante 8 provenant de l'agitation mécanique énergique du liquide dans la centrifugeuse. Cette mousse qui contient la majeure partie des protéines est détruite par des jets gazeux provenant d'ajutages 9 branchés sur une rampe 10 alimentée en gaz par une canali sation 11.
Le couvercle 12 du récipient 7 peut être enlevé périodiquement après destruction de la mousse pour enlever l'écume de protéines sur nageant. On peut également prévoir un con duit 13 formant trop-plein pour l'évacuation de l'écume, dans le cas où les jets gazeux seraient arrêtés.
Le liquide purifié et déprotéiné s'écoule alors dans un récipient 14 dont le fond ren ferme une couche adsorbante 15 constituée par exemple par du charbon actif qui achève la filtration et la déprotéinisation du liquide. L'écoulement vers le récipient 14 est contrôlé par un robinet 16.
Après avoir réglé l'écoulement du liquide par le robinet 16, on le recueille enfin dans une cuve 17 à partir de laquelle on l'envoie sur un filtre bactériologique, avant de le mettre sous ampoules scellées.