BE512864A - - Google Patents

Description

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  PROCEDE DE PREPARATION DE LIQUIDES EQUIVALENTS DE DIALYSATS-OU EQUIVALENTS D ULTRA-FILTRATS BIOLOGIQUES. ET D'EXTRACTION DE FRACTIONS ACTIVES DE CES 
LIQUIDES. 



   L'invention a pour objet un procédé de préparation de liquides équivalents de dialysats ou équivalents d'ultra-filtrats biologiques, permet- tant en outre l'extraction de certaines fractions actives en cours de prépa- ration de ces liquides 
Les liquides sécrétés par les organismes vivants peuvent, après certaines préparations, être utilisés dans différentes applications. 



   Les demandeurs ont constaté que de tels liquides organiques na- turels, après le traitement selon l'invention, ont des propriétés biologiques importantes en ce qui concerne la survie, la culture des tissus vivants, la culture des microbes,des virus, etcooo et surtout la réhydratation des cel- lules et des organismes. 



   On a déjà utilisé pour la survie cellulaire des ultra-filtrats ou   ultra-centrifugats   de sérum sanguin, ces liquides étant équilibrés et dé- pourves de substances nocives ou inhibitrices de la croissance. Mais l'ob- tention de ces liquides à partir de sérum sanguin par exemple, par dialyse, ultra-filtration, ou ultra-centrifugation, se heurte à des difficultés pra- tiques   lorsqu'on   en cherche à obtenir des quantités importantes. De plus les liquides purifiés selon l'invention à partir, en particulier, du liquide amniotique, ont des propriétés que ne possèdent pas les sérums sanguins pu-   r-ifiés     ultraf,iltrés,   ou dit "despécifiés", et ils ont de ce fait des utilisa- tions différentes et plus étendues. 



   L'invention permet d'obtenir des quantités importantes de liqui- des pouvant être utilisés pour la survie, la croissance de tissus vivants, la culture des microbes,des virus et la réhydratation des cellules ou des organismes. Selon l'invention les liquides à partir desquels on part sont les liquides sécrétés par des mammifères, et ils sont traités à froid sans recours à la dialyse ou à l'ultrafiltration ou à l'ultracentrifugation par 

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 une série d'opérations physico-chimiques associées et qui comporte., une pu- rification dégrossissante, au moins un traitement de déprotéinisation phy-   sico-chimique,   et une stérilisation bactériologique à froid. 



   Un liquide particulièrement intéressant qui peut être utilisé est le liquide amniotique des animaux de boucherie. 



   Au cours du traitement des liquides sécrétés par ces animaux on peut séparer des fractions concentrées qui sont susceptibles,lorsqu'elles ont été purifiées, d'avoir elles mêmes au moins pour certaines de leurs par- ties, des applications biologiques, médicales ou industrielles. 



   Comme il a été dit ci-dessus, le liquide amniotique est parti- culièrement intéressant, d'autant plus qu'il peut être recueilli en grande quantité aux abattoirs où les grands animaux de boucherie sont souvent sa- crifiés alors que les femelles portent un foetus baignant dans une quantité importante de liquide amniotique. 



   On peut également provoquer artificiellement une sécrétion asep- tique et abondante de liquides chez certains animaux. Il s'agit par exemple du liquide d'ascite expérimentale, obtenu après injection intrapéritonéale de substances diverses aseptiques et légèrement irritantes, ou du liquide pleural, ou de liquides réactionnels sous cutanés, etc... 



   Le procédé selon l'invention permet de séparer les éléments colloïdaux et notamment les protéines, les complexes protéiques et diverses autres substances. 



   Le traitement de déprotéinisation peut être réalisé par moussage du liquide et élimination de la mousse qui contient des produits dénaturés et surtout des protéines. 



   Le moussage est obtenu par barbottage d'un gaz qui peut d'ail- leurs être choisi d'une façon spéciale pour tenir compte de son action phy- sique et physico-chimique (maintien ou modification du pH, des oxydo-réduc- tions, etc...). On peut utiliser par exemple l'air filtré, l'azote, le gaz carbonique,   l'oxygène?   le carbogène,.   etc...).   



   Le moussage peut également être réalisé par agitation mécanique du liquide. La mousse au lieu d'être éliminée dans sa totalité peut   être-,   détruite soit par des jets gazeux convenables, c'est-à-dire par démoussage' pneumatique,, soit par l'adjonction de très faibles quantités d'une substance dite antimousse. Les produits dénaturés surnagent et sont éliminés, 
Le moussage est de préférence fait après une première filtra- tion qu élimine les éléments grossiers. 



   Après déprotéinisation, le liquide est envoyé sur une couche d'un adsorbant qui peut être par exemple du charbon actif, ou un autre   ad-   sorbant végétal, animal, minéral, ou organique. 



   L'adsorption doit être juste suffisante. C'est une opération qui doit être conduite avec exactitude la vitesse de passage du liquide à travers la couche   adsorbante   devant être constamment surveillée. Des pré- lèvements de liquide purifié sont faits à intervalles réguliers à la sortie du filtre adsorbant, et on vérifie que chaque fraction prélevée.ne précipite pas par l'acide sulfosalicylique par exemple, et reste au pH physiologique. 



   On peut terminer enfin la série d'opérations par une filtra- tion stérilisante en faisant passer le liquide sur un filtre retenant les bactéries. Ce filtre peut être un filtre à plaque d'amiante ou de cellulose, ou un autre filtre bactériologique permettant d'obtenir le même résultat. 



   La stérilisation peut aussi être pratiquée à froid par d'autres procédés, l'irradiation ultra-violette notamment. 



   On peut également, avant de faire passer le liquide sur un adsorbant, procèder à une congélation, puis à une décongélation fractionnée, ce qui permet de séparer un liquide dense ou queue de congélation, ayant le point de congélation le plus bas et contenant diverses substances orga- niques et minérales dont certaines sont particulièrement intéressantes. 

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   La congélation du liquide peut être faite par exemple dans des boyaux en une matière telle qu'une matière plastique transparente. -Après congélation les boyaux de matière plastique sont enlevés, et les blocs de liquide congélé sont lavés rapidement à l'eau douce pour entraîner certaines parties colorées et denses ayant le plus bas point de congélation. 



   Selon une variante de réalisation on peut découper en tranches les- blocs de liquide congelé obtenus, sans même enlever les boyaux qui les renferment. Les tranches situées généralement aux extrémités renferment les queues de congélation qui sont séparées de l'ensemble. 



   Il suffit ensuite de décongeler les tranches séparées des queues de congélation, puis de faire passer le liquide obtenu sur un   adsorbant.   



   L'adsorbant est choisi d'une façon générale pour que le pH du liquide reste voisin du   pH   biologique qui est légèrement supérieur à 7. là où les couches d'un adsorbant tel que du charbon actif sont réparties sous une épaisseur convenable, sur un ou plusieurs filtres par exemple du type   Buchner   
Le liquide ayant traversé le charbon actif dans des conditions de vitessé et de pH convenables est recueilli puis stérilisé par filtration biologique sur filtre Seitz par exemple. 



   On peut employer pour l'adsorption, d'autres dispositifs tels que couches ou colonnes adsorbantes de produits naturels ou synthétiques. 



   Les opérations qui viennent d'être énumérées s'effectuent à froid, ce qui laisse au liquide vivant toutes ses propriétés biologiques. 



   On peut toutefois dans certains cas avoir recours à un chauffage modéré du liquide,, par exemple à 56 ou 60 C, pendant un certain temps, une heure par exemple, de façon à augmenter l'élimination des protéines par coa- gulation 
Le liquide finalement obtenu est limpide et incolore. Il ne contient plus de protéines précipitables par la chaleur et les acides, telles que les acides trichloracétiques,. sulfosalycilique, nitrique, phé- nique, etc.. 



   Le liquide est notamment dépourvu de globulines. Il contient des glucides réducteurs , il renferme également des matières minérales, par exemple   7,la   grs de matières minérales pour 8,82 grs de résidus secs par litre 
Il a perdu sa spécificité biologique. Celle-ci en effet le ren- drait impropre à des injections dans l'organisme d'autres espèces que celles dont il   provient,   
Le liquide préparé par le procédé qui a été décrit est devenu par ses propriétés enzymatiques et biologiques,l'équivalent d'un dialysat ou d'un ultra - filtrat biologique stérile, un peu alcalin, mais acidifiable par le gaz carbonique. 



   Le liquide déprotéiné a une composition plus ou moins riche suivant que l'on a procédé ou non aux opérations de congélation et décongé- lation fractionnées. On peut ainsi préparer une gamme de liquides riches ou pauvres ayant une concentration moléculaire grande ou petite, voisine si l'on veut de celle du liquide céphalorachidien et s'étendant d'après les résultats des mesures de cryoscopie, si l'on est parti du liquide amniotique de vache,   de     -0,58    à   # -   0,31  et même   #   -0,19 . 



   Le procédé selon l'invention utilisant par exemple comme matiè- re de départ, du liquide amniotique, permet d'obtenir de grandes quantités de liquides remplaçant les ultra-filtrats et ultra-centrifugats obtenus en quantité insuffisantes à partir de sérums sanguins. 



   Le liquide amniotique est prélevé, non souillé de sang, sur des vaches ou des brebis saines, de préférence au cours du premier tiers de la gestation. Le liquide amniotique brut, à ce stade de la gestation., est 

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 jaune clair et peu chargé de déchets. Il est recueilli en grande quantité et aussitôt purifié à frois (sans dialyse ou ultra-filtration) par une série de traitements   physico-chimiques.   Il est déprotéiné, passé sur un adsorbant, puis stérilisé par filtration bactériologique avant d'être réparti en ampou- les où il se conserve parfaitement à la température ordinaire. 



   On obtient ainsi un liquide physiologique naturellement équili- bré, préparé à froid,   déprotéiné,,   sans spécificité biologique, riche en acides aminés libres, en glucides réducteurs, en éléments minéraux, en   oligo-éléments,   pauvre en urée, légèrement alcalin., stérile. 



   En outre les différents constituants minéraux et organiques se trouvent sous une forme biologique naturelle' complexe et s'équilibrent ré- ciproquement en réalisant un balancement ionique remarquable. 



   Il est à noter que si l'équilibre naturel d'un tel liquide est rompu par chauffage, on ne peut obtenir à nouveau une solution physiologique stable de ces divers élémentso 
L'analyse du liquide amniotique de vaches ou de brebis traité par le procédé selon l'invention donne pour 100 cc les résultats suivants à titre d'exemple 
 EMI4.1 
 
<tb> extrait <SEP> sec <SEP> environ <SEP> 1 <SEP> gr
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> cendres <SEP> 0, <SEP> gr <SEP> 63
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> azote <SEP> (total) <SEP> environ <SEP> 18 <SEP> mgr
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> sodium <SEP> 204 <SEP> mgr
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> chlore <SEP> 307 <SEP> mgr, <SEP> 4
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> potassium <SEP> 44 <SEP> mgr, <SEP> 6
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> calcium <SEP> 9 <SEP> mgr, <SEP> 9
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> magnésium <SEP> 4 <SEP> mgr,

   <SEP> 4
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> soufre <SEP> 8 <SEP> mgr, <SEP> 9
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> phosphore <SEP> 2 <SEP> mgr, <SEP> 75
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> fer <SEP> 200 <SEP> gamma
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> cuivre <SEP> 11 <SEP> gamma
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> manganèse <SEP> 1,2 <SEP> gamma
<tb> 
 
Il a été procédé également à l'analyse microchromatographique qualitative sur papier après élimination des sels par l'acétone chlorhydri- que.

   On obtient les résultats suivants (les croix correspondent à l'abon- dance des corps, compte-tenu de la sensibilité de la réaction) 
 EMI4.2 
 
<tb> liquide <SEP> amniotique <SEP> liquide <SEP> amniotique
<tb> 
<tb> 
<tb> déprotéiné <SEP> de <SEP> vache <SEP> déprotéiné <SEP> de <SEP> brebis
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Glycocolle <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Alanine <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Sérine <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Thréonine <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Valine <SEP> + <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Leucine <SEP> + <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Méthionine <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Cystine <SEP> ++ <SEP> +++
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Acide <SEP> aspartique <SEP> + <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> 

  
<tb> 
<tb> 
<tb> Acide <SEP> glutamique <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> 
<tb> 
 

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 EMI5.1 
 
<tb> Lysine <SEP> + <SEP> +
<tb> 
<tb> Acide <SEP> [alpha]aminobutyrique <SEP> + <SEP> +
<tb> 
 
Enfin, l'analyse des sucres réducteurs donne le chiffre impor- tant de 1 gr 75 à 2 grs par litre. 



   L'analyse microchromatographique sur papier montre qu'il s'agit uniquement de fructose, à l'exception de glucose. 



   Le taux d'urée est minime, environ 0 gr, 12 par litre. 



   La richesse du liquide en potassium explique l'intérêt de ce liquide en ce qui concerne la réhydratation cellulaire. 



   Le liquide amniotique traité renferme une série d'acides aminés importants précités ci-dessus. 



   Certaines propriétés du liquide amniotique traité selon l'inven- tion,établissent que ce liquide est différent du sérum sanguin ultra filtré. 



   Le procédé utilisé qui ne nécessite pas de traitement   à   chaud, respecte les différents constituants essentiels des liquides sécrétés par les organismes vivants. On a pu constater en particulier que le taux de fructose est inchangé avant et après le   traitemento   
Le liquide amniotique traité est naturellement équilibré, il est tamponné., principalement par ses carbonates, il a un pH voisin de 7,6. 



  A l'air libre, le pH est stable pendant plusieurs heures; par la suite on constate une légère alcalinisationo Par exemple au bout de   14   heures le pH passe environ à   7,85,   puis au bout de 20 heures, il atteint   7,920   Le liquide peut facilement être par la suite acidifié par l'anhydride carboni- que 
Par chauffage à 40 C,le liquide une fois traité donne un préci- pité minéral, facilement soluble par acidification du milieu. Le liquide a un bon pouvoir solvant et peut être enrichi par de nombreuses substances. 



   Les liquides préparés par le procédé selon l'invention ont des applications biologiques variées ainsi que des applications médicales ou industrielles. 



   Ils peuvent servir, seuls ou associés à d'autres substances, de liquides physiologiques standards pour la conservation de divers tissus vivants ou organismes en survie, pour leur culture., ainsi que pour la cul- ture de divers microbes ou virus en vue en particulier de la fabrication de vaccins. 



   Ils peuvent être injectés aux organismes vivants dans des cir- constances variables. Ils peuvent être absorbés par la voie digestive. 



   Le liquide traité ne provoque aucune sensibilisation de l'or-   ganisme,   -ni aucune réaction anaphylactique. Il ne renferme pas de substan- ces pyrogènes selon les tests classiques chez le lapin ou après injection sous cutanée ou intraveineuse chez l'homme. Il est.parfaitement supporté à fortes doses en injections intraveineuses chez l'animal et chez   l'homme..   



   Il a la propriété remarquable de pénétrer très vite à travers la peau et d'être résorbé très vite par l'organisme après injection sous cutanée. Une injection brusque d'au moins 20 cc est résorbée en une à trois minutes sans laisser de traces visibles. Une analyse histologique du tissu cellulaire au lieu d'injection, montre une transformation impor- tante du   collagène.   Les faisceaux s'hydratent,se gonflent et se modifient comme s'ils se dissolvaient., Le liquide fuse très rapidement sans qu'il soit utile de lui adjoindre des enzymes mycolytiques de diffusion. 



   Le liquide est utilisable pour la réhydratation cellulaire mé- dicale ou chirurgicale. 



   On peut d'ailleurs le dessècher par divers procédés et par 

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 exemple par lyophilisation.,   c'est-à-dire   sublimation dans le vide ) basse température. Le résidu obtenu peut être conservé convenablement en récipients scellés-puis dissout dans une quantité appropriée d'eau distillée stérile. 



   Les parties concentrées recueillies dans les queues de congéla- tion au cours du traitement, se présentent comme un mélange liquide   pigmen-   té en jaune foncé, de réaotion alcaline 
Ces queues de congélation contiennent comme éléments très im- portants des hormones que l'analyse a pu reconnaître comme étant toujours des hormones oestrogènes actives, non associées à des hormones androgènes. 



   Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre en réalisant les opérations successives déjà définies. On peut également le mettre en oeuvre au moyen d'une installation groupant certaines opérations. 



   La figure unique représente schématiquement une telle instal- lation 
Cet appareil comporte un turbofiltre comprenant une cuve 1 et un bol de centrifugation dont les parois verticales 2 sont constituées par une matière filtrante. 



   La cuve 1 est recouverte d'un couvercle 3 traversé par une   arri-   vée de liquide 4 et une arrivée de gaz 5. liquide arrivant dans le bol de centrifugation est mis en rotation   ra@  . Ce liquide se trouve ainsi centrifugé puis filtré à tra- vers les parois 2. Il s'écoule alors par un conduit 6 placé à la base de la cuve 1. La sortie du conduit 6 est disposée dans un récipient 7 dans lequel le liquide se rassemble à la partie inférieure et est surmonté d'une mousse abondante 8 provenant de l'agitation mécanique énergique du liquide dans la centrifugeuse. Cette mousse qui contient la majeure partie des protéines est détruite par des jets gazeux provenant d'ajutages 9 branchés sur une ramper 10 alimentée en gaz par une canalisation 11. 



   Le couvercle 12 du récipient 7 peut être enlevé périodiquement après destruction de la mousse pour enlever l'écume de protéines surnageant. 



  On peut également prévoir un conduit 13 formant trop plein pour l'évacuation de l'écumedans le cas où les jets gazeux seraient arrêtés. 



   Le liquide purifié et déprotéiné s'écoule alors dans un récipient 14 dont le fond renferme une couche adsorbante 15 constituée par exemple par du charbon actif qui achève la filtration et la déprotéinisation du liquide. 



    L'écoulement   vers le récipient 14 est   controlé   par un robinet 16. 



   Après avoir réglé l'écoulement du liquide par le robinet 16, on le recueille enfin dans une cuve 17 à partir de laquelle on l'envoie sur un filtre bactériologique,avant de le mettre sous ampoules scellées. 



   REVENDICATIONS 
I/ Procédé de préparation de liquides équivalents de dialysats ou équivalents d'ultra-filtrats biologiques, et d'extraction de fractions actives de ces liquides, caractérisé par le fait qu'il consiste à partir de liquides sécrétés par des mammifères et à traiter ces liquides à froid par une série d'opérations physico-chimiques associés comportant une puri- fication dégrossissante, au moins un traitement de déprotéinisation physi-   co-chimique,   et une stérilisation bactériologique à froid.

Claims (1)

1. 2/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le liquide de départ utilisé est du liquide amniotique.

   3/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'un traitement de déprotéinisation est réalisé par moussage-du liquide au moyen de l'injection d'un gaz, et enlèvement de la mousse produite.

   4/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'un traitement de déprotéinisation est réalisé par moussage du liquide au moyen de l'injection d'un gaz, destruction de la mousse produite et écu- <Desc/Clms Page number 7> mage du liquidée - 5/ Procède'selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'un traitement de déprotéinisation est réalisé par moussage du liquide au moyen d'une agitation et enlèvement de la mousse produiteo 6/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'un traitement de déprotéinisation est réalisé par moussage du liquide au moyen d'une agitations destruction de la mousse produite et écumage du liquide 7/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que la filtration dégrossissante est faite dans une

   centrifugeuse dont les parois sont constituées par une matière filtrante.

   8/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'une congélation et une décongélation fractionnée du liquide sont ef- fectuées avant l'opération d'adsorption.

   9/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que . -les queues de congélation sont séparées du reste du liquide congelé. la/ Procédé selon la.revendication 1 caractérisé par le fait que l'adsorption est faite sur charbon actif.

   11/ Procédé selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le liquide est filtré sur filtre bactériologique. en annexe 1 dessin.