CH313714A - Procédé de préparation d'une substance antibiotique - Google Patents

Description

  Procédé de     préparation    d'une substance     antibiotique       Le présent brevet additionnel concerne la  préparation de la     chlorotétracycline    selon la  revendication du brevet principal, c'est-à-dire  en cultivant le micro-organisme<I>Streptomyces</I>       aureofaciens    dans un milieu nutritif aqueux  sous des conditions de fermentation aérobie.  



  Le but principal de la présente invention  est l'augmentation du rendement en     chloroté-          tracycline    et la diminution de son prix de pro  duction, en cultivant le micro-organisme S.       aureofaciens    dans des conditions telles que  l'on obtienne la     chlorotétracycline    à un prix  plus avantageux.  



  Dans les procédés connus de production  de     chlorotétracycline    par culture du S.     aureo-          faciens    dans un milieu nutritif aqueux, trois  classes de matières sont nécessaires pour la  production maximum de     chlorotétracycline     a) une source d'azote organique telle  qu'une liqueur de macération du maïs ;  b) un hydrate de carbone tel que l'amidon  ou un sucre ;

    c) des sels minéraux donnant des ions am  monium, cobalt, ferreux, magnésium,     manga-          neux,    potassium, zinc, chlorure, phosphate et  sulfate ; en outre, en     quantité'suffisante    pour  précipiter la     chlorotétracycline,    des ions alca  lino-terreux, de préférence sous forme de  carbonate de calcium, lequel stabilise égale  ment le<I>pH</I> dans l'intervalle désiré.    On prépare un milieu de ce genre en mé  langeant avec les sels     fournissant    les ions mi  néraux désirés l'amidon et la     liqueur    de ma  cération du maïs et en     stérilisant    par chauf  fage.  



  Selon la présente invention, on utilise  comme     milieu    nutritif un milieu aqueux cuit  contenant, par litre,. 13 à 80 g d'amidon, 10  à 40 g d'une source d'azote organique, des  composés non     toxiques    qui en solution four  nissent des ions ammonium, calcium, cobalt,  ferreux, magnésium, manganeux, potassium,  zinc, carbonate, chlorure, phosphate et sul  fate, ce milieu contenant également, de préfé  rence depuis le début de la culture, 5 à 30 g  d'au moins un glycéride huileux.  



  Bien que l'on ait antérieurement     utilisé-          l'huile    de lard avec addition d'alcools supé  rieurs dans le but d'inhiber la formation de  mousse, il n'a été indiqué pour cette utilisa  tion que l'addition de petites quantités, ordi  nairement 2 à 3 g d'huile par litre de     milieu,     et cette huile de lard est ajoutée selon les né  cessités pour éviter la formation de mousse,  la plus grande partie étant nécessaire à cet  effet pendant les dernières phases de la fer  mentation.  



  Avec l'amidon comme source de carbone,  les 5 à 30 g de glycéride par litre prévus ici  accroissent le rendement en     chlorotétracycline.     Le ou les glycérides semblent agir partielle-      ment comme source assimilable d'énergie, et il  se trouve qu'en même temps ils aident au con  trôle du<I>pH.</I> Il est commode de les ajouter au  milieu avant sa cuisson, bien que par des pro  cessus aseptiques on puisse les ajouter au mi  lieu par ailleurs complet juste après son ino  culation. Pour obtenir les meilleurs résultats,  on ne doit pas ajouter le ou les glycérides no  tablement après l'inoculation du milieu.

   On  peut y ajouter un alcool supérieur, tel que       l'octadécanol,    et on peut ajouter ultérieure  ment, pour diminuer la formation de mousse,  des quantités supplémentaires du ou des  mêmes glycérides.  



  Comme glycéride huileux, on peut utiliser  notamment l'huile de lard, l'huile de maïs,  l'huile d'arachide, l'huile de coton, l'huile de  soja, l'huile d'olive, l'huile de spermacéti,  l'huile de palme, l'huile de baleine, le     mono-          stéarate    de     glycéryle    et le     mono-oléate    de     gly-          céryle,    qui se scindent partiellement pendant  la fermentation et aident ainsi au contrôle du  <I>pH.</I>  



  Une portion considérable du ou des glycé  rides peut être isolée après la fermentation,  mais ce résidu a des caractéristiques différen  tes de celles du produit qui a été ajouté, appa  remment à cause de l'action enzymatique pen  dant la fermentation.  



  L'amélioration résultant de l'addition du  ou des glycérides à un milieu à base d'amidon  est particulièrement surprenante, car l'addition  du ou des mêmes glycérides en même quan  tité à un milieu à base de sucre n'accroît pas  le rendement en     chlorotétracycline.    Dans une  série d'essais comparatifs par ailleurs identi  ques, on a obtenu un rendement d'environ  1500 mg de     chlorotétracycline    par litre d'un  milieu à base de saccharose. En ajoutant à ce  même milieu 20 g par litre d'huile de lard  avant la fermentation, le rendement est tombé  à environ<B>1.000</B> mg de     chlorotétracycline    par  litre. Avec un milieu à base d'amidon fluidi  fié, on a obtenu un rendement de 2000 mg  de     chlorotétracycline    par litre.

   L'addition de  20 g d'huile de lard par litre à ce dernier mi  lieu a fait augmenter le rendement en     chloro-          tétracycline    jusqu'à 3000 mg par litre.    Il est connu d'utiliser une huile minérale  comme agent     antimousse    avec un sucre  comme hydrate de carbone, sans que cela  provoque une diminution du rendement. De  même, une huile minérale n'a pas d'effet sur  le rendement quand on l'utilise dans un milieu  à base d'amidon.  



  Le tableau suivant montre les effets de  différentes quantités d'huile de lard dans un  milieu du genre envisagé ici, le rendement  sans huile étant indiqué comme contrôle.  
EMI0002.0015     
  
    <I>Huile <SEP> de <SEP> lard, <SEP> Rendement <SEP> relatif</I>
<tb>  <I>g <SEP> par <SEP> litre <SEP> de <SEP> milieu</I>
<tb>  0 <SEP> 100
<tb>  5 <SEP> <B>180</B>
<tb>  10 <SEP> 190
<tb>  15 <SEP> 165
<tb>  20 <SEP> 190
<tb>  25 <SEP> 250
<tb>  30 <SEP> 245       Les rendements les plus élevés obtenus  dans plusieurs milliers de fermentations expé  rimentales avec des centaines de modifications  des ingrédients ont été ceux obtenus avec un  milieu contenant 20 g d'huile de lard et 30 g  d'amidon par litre de milieu.  



  Bien que les résultats obtenus en labora  toire ou avec des réservoirs de fermentation  à petite échelle donnent des indications 'sur  les résultats auxquels on peut s'attendre à  l'échelle industrielle, le seul critère détermi  nant est un essai dans des unités de dimen  sions industrielles. On a également constaté  que dans des réservoirs contenant au moins  378 litres de milieu, on peut obtenir des ré  sultats uniformément supérieurs par utilisa  tion d'un tel milieu à base d'amidon et d'huile  de lard, ce qui montre sans équivoque qu'un  tel milieu accroît la production de     chloro-          tétracycline.     



  On a constaté qu'en utilisant un amidon à  fluidité au moins partiellement modifiée par  un acide, de préférence à raison de 30 à 60 g  par litre de milieu nutritif, il est possible d'as  surer des rendements uniformément élevés en           chlorotétracycline    avec, comme source d'azote,  diverses liqueurs de macération du maïs ; des  économies opératoires sont réalisées en parti  culier dans la stérilisation du milieu nutritif,  ce qui permet une utilisation plus rapide et  plus efficace d'un appareillage de fermenta  tion. L'utilisation d'un amidon à     fluidité    mo  difiée aide également au contrôle de la forma  tion de mousse pendant la fermentation.  



  On peut préparer un amidon à     fluidité     modifiée à partir d'amidon de blé ordinaire  en chauffant celui-ci en présence d'ions chlo  rure ou sulfate, particulièrement en milieu  acide, grâce à quoi l'amidon est partiellement  modifié en un produit plus fluide. On suppose  que l'amidon est partiellement scindé, mais  pas aussi loin que jusqu'au dextrose. Dans le  commerce, on mesure la fluidité en vitesse  d'écoulement dans un viscosimètre, dans les  conditions spécifiées, et on l'indique en nom  bre de     cm3    s'écoulant à travers un orifice dé  terminé. Un amidon brut a une fluidité d'en  viron 1. Pour la présente invention, un ami  don présentant une     fluidité    d'environ 90 est  préférable.

   Comme tel on peut utiliser notam  ment le produit marque       Foxhead    140  , qui  présente une teneur en humidité de 11 %, une       fluidité    de 90, une viscosité Scott de 45 à 60  secondes et un<I>pH</I> de 4,8 à 5, avec une     te-          neur        en        cendres        d'approximativement        0,3        %.     On trouvera une description des procédés  d'analyses des différentes sortes d'amidon  dans un article de W.

   R.     Fetzer          Methods    in  the     Starch    and Dextrose     Industry         ,        Analyti-          cal        Chemistry        24,_    1129-1137 (1952).  



  Comme avantage particulier, l'utilisation  d'amidon     fluidifié    permet la préparation d'un       concentrat    du milieu nutritif que l'on peut  cuire sous forme concentrée, puis refroidir et  diluer. L'amidon ordinaire donne une masse  d'une viscosité si élevée qu'il est impossible  de préparer un     concentrat    de plus de deux fois  environ la concentration finale du milieu et de  la manipuler comme un liquide, tandis qu'en  utilisant de l'amidon fluidifié il est possible de  préparer un concentre au moins quatre fois  plus concentré que le milieu nutritif et de le  cuire sous cette forme.

   Le temps nécessaire    pour chauffer et refroidir la charge d'un     fer-          mentateur    à l'état     dilué    est très long et cer  taines portions de la charge peuvent être loca  lement surchauffées. Quand on cuit la charge  sous forme d'un concentre, on chauffe un vo  lume beaucoup plus petit et il est par suite  possible d'utiliser un appareillage plus petit et  de chauffer et refroidir la charge plus rapide  ment et plus économiquement. Pour la dilu  tion du     concentrat    on utilise de l'eau     stérilisée.     Il est plus économique de stériliser l'eau avant  son addition à la masse que de stériliser la  masse diluée.

   L'utilisation d'amidon     fluidifié     permet donc de traiter davantage de charges  par semaine dans un     fermentateur    donné, avec  un appareillage auxiliaire plus réduit et avec  les avantages opératoires qui en découlent.  



  Dans la mise en pratique de la présente  invention, il est avantageux d'utiliser une sou  che de S.     aureofaciens    donnant un rendement  élevé en     chlorotétracycline.    Par un choix judi  cieux des souches de mutants, naturels ou ar  tificiels, du S.     aureofaciens,    il est possible d'ac  croître encore le rendement en     chlorotétracy-          cline    dans un milieu nutritif particulier.

   Des  procédés de sélection de souches à rendement  élevé sont décrits par Jackson W.     Foster,           Chemical        Activities    of     Fungi         ,        Academic     Press,     Inc.    1949, pages 209 à 250, dans un  chapitre intitulé   Mutations,     Physiological          Genetics    and     Biochemical        Syntheses         .    Ce  texte expose les mutations spontanées et les  mutations provoquées par traitement chimique  ou par irradiation.

   Comme produits chimi  ques on peut utiliser l'acide nitreux, la colchi  cine, le gaz de moutarde<I>(Cl -</I>     CH2CH2)2S    et  ses analogues     'azotés        RN        (CH2CH2CP2,    des  anticorps et autres. L'irradiation peut se faire  par des rayons cathodiques ou radioactifs, par  la lumière ultraviolette, etc.  



  On a aussi utilisé d'autres traitements tels  que le traitement par un agent de     phagolyse     dilué avec d'autres streptomyces, tel que dé  crit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique  No 2585713 intitulé   Procédé de préparation  de A.     Griseus    résistants aux     actinophages    et  de préparation de la streptomycine      .    Beau  coup de ces procédés peuvent être adaptés à      l'obtention d'une souche<I>de S.</I>     aureofaciens     ayant les propriétés désirées.  



  L'invention est illustrée par l'exemple sui  vant  On introduit dans un groupe de     fermenta-          teurs    de taille industrielle un milieu de fer  mentation contenant par litre 30g de liqueur       de        macération        du        maïs        (50        %        de        solides,        qua-          lité    pour pénicilline), 30 g d'amidon de flui  dité 90, 9 g de carbonate de calcium (qualité  Pharmacopée     U.S.),    3,3 g de sulfate d'ammo  nium, 1 g de chlorure d'ammonium,

   2 g de  chlorure de magnésium     hexahydraté,   <B>100</B> mg  de sulfate de zinc     heptahydraté,    ainsi que des  traces de substances donnant naissance à des  ions ferreux, manganèse, cobalt, potassium et  phosphate et 10 g d'huile de lard (de la firme       Armour,    spécialement hibernée). Ce milieu  nutritif a été préparé par dilution, avec de  l'eau stérilisée, d'un     concentrat    quatre fois  plus concentré, qui avait été lui-même cuit à  120  pendant 30 minutes.

   On inocule les ré  servoirs par adjonction de 40 cc par litre d'un  inoculai de S.     aureofaciens.    On aère les réser  voirs et on les agite en ajoutant de l'huile de  lard supplémentaire, en quantité suffisante  pour empêcher la formation de mousse, puis  on effectue la récolte après approximativement  60 heures de fermentation à     27,1.    On obtient  un rendement moyen de 2500 mg de     chloro-          tétracycline    par litre.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation de chlorotétracy- cline selon la revendication du brevet princi pal, caractérisé en ce qu'on utilise comme mi lieu nutritif un milieu aqueux cuit contenant, par litre, 13 à 80 g d'amidon, 10 à 40 g d'une source d'azote organique, des composés non toxiques fournissant en solution des ions am monium, calcium, cobalt, ferreux, magnésium, manganeux, potassium, zinc, carbonate, chlo rure, phosphate et sulfate, et 5 à 30 g d'au moins un glycéride huileux. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, carac térisé en ce que ledit glycéride est présent dans le milieu nutritif depuis le début de la culture du micro-organisme. 2.

   Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride de l'huile de lard. 3. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride de l'huile de maïs. 4. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride de l'huile d'arachide. 5. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride de l'huile de coton. 6. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride de l'huile de soja. 7. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride de l'huile d'olive. 8.

   Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride de l'huile de sperma céti. 9. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride de l'huile de palme. 10. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride de l'huile de baleine. <B>Il.</B> Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride du mono-stéarate de glycéryle. 12. Procédé suivant la revendication et la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme glycéride du mono-oléate de glycéryle. 13.

   Procédé selon la revendication, carac- térisê en ce qu'on utilise un amidon de flui dité 90.