DK171744B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre - Google Patents

Description

i DK 171744 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre og salte heraf.

Pyrodruesyre er et værdifuldt mellemprodukt véd kemiske 5 synteser f.eks. til fremstilling af farmaceutika, plantebeskyttelsesmidler, polymere og levnedsmidler. Det er derfor naturligt, at der har været foretaget adskillige forsøg på at finde tekniske fremstillingsmetoder. Da pyrodruesyre er en central metabolit i alle mikroorganis-10 mers stofskifte, kan det ikke undre, at man først og fremmest har rettet interessen mod enzymatiske metoder og forgæringsmetoder.

Mange af de beskrevne bioteknologiske fremstillingsmeto-15 der sigter på at omdanne en egnet carbonkilde til pyrodruesyre. Det har længe været velkendt, at forskellige mikroorganismer kan danne pyrodruesyre. Således beskriver Biguet et al., (Chem. Abstr. 58, 14463 e (1963)) dannelsen af pyrodruesyre ved hjælp af forskellige gær-20 svampe af slægten Candida. En lignende iagttagelse blev gjort af Kretovich et al., med en stamme af svampen Candida tropicalis (Chem. Abstr. 62, 6832 a (1965)). Anvendelsen af en stamme af arten Acetobacter suboxydans til direkte fremstilling af pyrodruesyre ud fra D-glucose 25 blev beskrevet af Abe og Seito (Chem. Abstr. i^, 12285 b (1965)). Anvendelsen af svampestammer af slægten Mucor til fremstilling af pyrodruesyre ud fra glucose er ligeledes velkendt (J. Exptl. Botany 3J>, 487 (1965)). Omdannelsen af paraffiner til pyrodruesyre og 2-oxoglutarsyre 30 med forskellige mycobacterium-stammer er angivet (Chem. Abstr. 64, 16312 b (1966)). Anvendelsen af en corynebac-terium-stamme til fremstilling af pyrodruesyre ud fra D-gluconsyre er beskrevet (Chem. Abstr. 70, 86273 w (1969)). Omdannelsen af kortkædede fedtsyrer til pyro-35 druesyre ved hjælp af forskellige stammer af slægten No-cardia, Arthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Mycobacterium eller Candida er beskrevet af Maeyashiki og DK 171744 B1 2

Okada (Chem. Abstr. 82, 123305 d (1975)). En lignende opfindelse under anvendelse af kortkædede fedtsyreamider med stammer af samme slægt er beskrevet (Chem. Abstr. 82, 153737 p (1975)). En fremgangsmåde til fremstilling af 5 pyrodruesyre ud fra D-gluconsyre med stammen Nocardia fumlfera eller Pseudomonas tabatl er beskrevet af Uchlo og Hirose (Chem. Abstr. 83, 204815 t (1975)). En fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre ud fra D-glu-cose med en thlamln- og L-methlonin-afhængig mutant af 10 Candida llpolytica er beskrevet af Uchlo et al., (Chem. Abstr. 84, 178212 t (1976)). En fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre ud fra glycerol med en stamme af arten Xanthomonas campestris blev beskrevet af Behrens og Fiedler (DD 135 213 (1979)). Omdannelsen af citrusfrugt-15 skalleaffald til pyrodruesyre ved hjælp af svampen Debaryomyces coudertli er beskrevet af Moriguchi (Agric.

Biol. Chem. 46, 955 (1982)). Dannelsen af pyrodruesyre ud fra D-glucose ved hjælp af basidiomyceten Schizophyllum commune blev beskrevet af Takao og Tanida (J. Ferment.

20 Technol. 60, 277 (1982)). En fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre ud fra D-glucose med Agaricus campestris er beskrevet af Takao (Chem. Abstr. 98, 15498 r (1983)). Izumi og Matsumura beskriver acinetobacterstam-mer, der omdanner 1,2-propandiol til pyrodruesyre (Agric.

25 Biol. Chem. 46, 2653 (1982)). Omsætningen af vinsyre til pyruvat med Pseudomonas putida er beskrevet af Miyata et al. (Chem. Abstr. 104, 205568 d (1986)).

Alle disse mikroorganismer er imidlertid hverken tilgæn-30 gelige for offentligheden eller egner sig kun dårligt til teknisk produktion, da de kun frembringer pyrodruesyre i små koncentrationer eller med ringe udbytte, udover at der hyppigt dannes en eller flere andre syrer. Derfor er en økonomisk fremstilling ikke mulig.

Det er ligeledes beskrevet, at man ved hjælp af mikroorganismer kan overføre racemisk mælkesyre oxidativt til 35 DK 171744 B1 3 pyrodruesyre. Abe og Saito (Chem. Abstr. 58, 5737 d (1963), 6760 (1963)) beskriver anvendelsen af ikke of fentligt tilgængelige bakteriestammer til oxidation af racemisk mælkesyre. Disse egner sig imidlertid dårligt 5 til fremstilling af pyrodruesyre, da de kun danner det ønskede slutprodukt i utilstrækkelige mængder (mellem 27% og 52%). Herudover er betydelige mængder glucose, pepton og kødekstrakt nødvendig for at kunne opnå den nødvendige cellemasse til omsætningen. Sådanne kostbare bestanddele 10 forhindrer en økonomisk fremstilling af pyrodruesyre.

En teknisk metode til fremstilling af pyrodruesyre er ikke tidligere blevet beskrevet.

15 Der er derfor et behov for en økonomisk, teknisk anvendelig fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre.

Man har nu fundet en mikroorganisme, der er i stand til med højt rum-tidsudbytte at overføre optisk ren D-(-)-20 mælkesyre kvantitativt til pyrodruesyre i et billige næringssubstrat .

Opfindelsen tilvejebringer således en fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre og salte heraf der er ejen-25 dommelig ved at man dyrker bakterien Acetobacter spec.

ATCC 21409 under aerobe betingelser i nærvær af D-(-)-mælkesyre.

D-( -)-mælkesyre kan let på i og for sig kendt måde frem-30 stilles ud fra glucose.

Acetobacter spec. ATTC 21409 er deponeret i American Type Culture Collection (ATCC), Rockeville, Maryland, USA og er frit tilgængeligt.

For at gennemføre den omhandlede fremgangsmåde podes stammen Acetobacter spec. ATTC 21409 på et D-(-)-mælke- 35 DK 171744 B1 4 syreholdigt næringssubstrat og inkuberes deri. Forgæringen kan ske kontinuert eller diskontinuert. Man lader stammens celler direkte indvirke på substratet. Der kan anvendes passende velkendte inkubationsmetoder, særligt 5 foretrukken er anvendelsen af fermentorer i form af dybe, gennemluftede og omrørte tanke. Særdeles gode resultater opnås ved anvendelse af et flydende næringssubstrat.

Udvælgelsen af næringssubstratet til dyrkning af mikroor-10 ganismen er ikke kritisk, dog bør af hensyn til forbedret økonomi særligt anvendes prisbillige substratbestanddele. Velegnede næringssubstrater indeholder carbonkilder, nitrogenkilder, uorganiske salte og eventuelt ringe mængder sporstoffer og vitaminer. Som nitrogenkilder kan anvendes 15 uorganiske eller organiske nitrogenkilder eller matrial-er, der Indeholder sådanne forbindelser. Eksempler herpå er ammoniumsalte, majsstøbevæske, ølgærautolysat, soja-bønnemelhydrolysat, hvedegluten, gærekstrakt, gær, urinstof og katoffelprotein. Særligt fordelagtig er anvendel-20 sen af majsstøbevæske. Som carbonkilder kan anvendes D-glucose, mannose eller galactose, polyalkoholer som mannit eller alkoholer som ethanol.

Eksempler på uorganiske salte er salte af calcium, magne-25 sium, mangan, kalium, zink, kobber, jern og andre salte.

Som anion af saltene skal specielt nævnes phosphationen. Eventuelt tilsættes næringssubstratet vækstfaktorer som f.eks. pantotensyre, p-aminobenzosyre og thiamid. Blandingsforholdet af nævnte næringsstoffer afhænger af for-30 gæringens art og fastlægges i hvert enkelt tilfælde.

Sædvanligvis egner en D-(-)-mælkesyrekoncentration på ca.

1-100 g/1 fortrinsvis på 10-50 g/1 sig til gennemførsel af den omhandlede fremgangsmåde.

Dyrkningsbetingelserne fastlægges således, at man opnår de bedst mulige udbytter. Foretrukne dyrkningstemperatu- 35 DK 171744 B1 5 rer ligger fra 24 til 32 °C, fortrinsvis fra 26 til 30 °C. pH-værdien ligger i området fra 5 til 8, fortrinsvis 6-8. Sædvanligvis er en inkubationstid på fra 8 til 48 timer tilstrækkelig. I løbet af dette tidsrum opnås den 5 maksimale mængde af det ønskede slutprodukt i substratet.

Det er en fordel at følge mængden af den dannede pyro-druesyre i dyrkningssubstratet og afbryder reaktionen, når mængden af pyrodruesyre har nået maksimum.

10 Oer skal sørges for en tilstrækkelig gennemluftning, da reaktionen kun ved tilstrækkelig tilførsel af oxygen forløber med stor hastighed og med godt udbytte.

Den nødvendige mængde D-(-)-mælkesyre kan tilsættes sub-15 stratet fra begyndelsen eller tilsættes under dyrkningen i flere portioner. Det som substrat nævnte D-(-)-mælkesyre tilsættes substratet som salt. Til dette formål kan f.eks. anvendes natrium-, calium-, ammonium- og calciumsalte af D-(-)-mælkesyre. Specielt fordelagtigt er anven-20 delsen af calciumsaltene.

Den dannede og i substratet udskildte pyrodruesyre kan herefter måles på i og for sig kendt måde. Til dette formål er en enzymatisk påvisningsmetode fordelagtig. Pyro-25 druesyren eller saltet heraf kan fraskilles på i og for sig kendt måde og renses. Til dette formål egner sig f.eks. basiske ionbyttere. Alternativt kan forgæringsbouillonen Inddampes i vakuum, og slutproduktet kan bringes til ukrystallisation ved afkøling. De således op-30 nåede krystaller kan fraskilles ved centrifugering og tørres.

I det tilfælde hvor pyrodruesyren skal anvendes uden oparbejdning, , er det tilstrækkeligt, at dræbe mikroorga-35 nismen Acetobacter spec. ATTC 21409 i reaktionsblandingen for at forhindre en yderligere omsætning af slutproduktet. Dette kan f.eks. ske ved tilsætning af 0,1% n-oc- 6 DK 171744 B1 tanol og opvarmning til 45 °C i 30 min. Alternativt kan forgæringsbouillonen befries for mikroorganismer ved almindelig sterilfiltrering. Disse forgæringsbouilloner bør ved passende foranstaltninger som f.eks. afkøling 5 beskyttes mod mikrobiel kontamination.

Følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere: EKSEMPEL 1 10

Fremstilling af en stamkultur

Der fremstilledes et fast næringssubstrat (substrat A), der indeholdt følgende bestanddele: 15 D-(-)-mannit 10 g/1 ammoniumsulfat 5 g/1 magnesiumsulfat-7-hydrat 0,5 g/1 mangansulfat-1-hydrat 0,05 g/1 20 gærekstrakt 0,05 g/1 pepton 0,05 g/1 kaliumdihydrogenphosphat 1,5 g/1 dikaliumhydrogenphosphat 3,6 g/1 agar 20 g/1 25 vand ad 1 liter

Phosphatsaltene steriliseres separat fra resten af substratet (20 min. ved 121 °C) og tilsættes efter afkøling. Substratet pH-værdi er 7.

30

Celler af mikroorganismen Acetobacter spec. ATTC 21409 blev fortyndet decimalt og spredt på fast næringssubstrat. Efter 48 timers inkubation med 28 °C forekom ved tilsvarende fortynding enkeltkolonier. Enkelte kloner 35 blev udtaget og hver dyrket i 20 ml (i sterilt 100 ml Er-lenmeyerkolber) forkultursubstrat (= substrat B): 7 DK 171744 Bl D-(-)mannit 10 g/1 gærekstrakt 5 g/1 magnesiumsulfat-7-hydrat 0,5 g/1 vand ad 1 liter 5

Ingen pH-regulering, sterilisering i 20 min. ved 121 °C.

Inkubationen af denne forkultur blev foretaget ved 28 °C

1 en almindelig tilgængelig rysteinkubator ved 250 om-10 rystninger pr. min. i 16 timer.

For at undersøge biotransformationsevnen blev 20 ml af substrat C fyldt i sterile 100 ml Erlenmeyerkolber med vatpropper.

15

Substrat C: D-(-)mannit 10 g/1 majsstøbevæske 40 g/1 20 D-(-)mælkesyre (calciumsalt) 10 g/1 (beregnet som frie syrer)

pH 7 med 5 M NaOH

Sterilisering ved 121 °C i 40 min.

25 2 ml af forkulturene blev podet på dette substrat. Blandingen blev inkuberet under rystning ved 28 °C og 250 omrystninger pr. min. Koncentrationen af D-(-)-mælkesyre og pyrodruesyre blev bestemt ved hjælp af en almindelig 30 tilgængelig enzymatisk forsøgsmetode. Efter 5 timers forløb var som regel 100% af det tilsatte D-laktat omsat. Koncentrationen af pyrodruesyre var mindst 10 g/1. En koloni, der var i stand til dette, blev dyrket yderligere og lyophiliseret på i og for sig kendt måde. Dette mate-35 riale tjente som podemateriale til alle yderligere forsøg.

DK 171744 B1 8 EKSEMPEL 2

Forgæring 1 rystekolber 5 100 ml af substrat C fyldtes i en 1000 ml Erlenmeyerkolbe med vatprop og steriliseredes. Som kontrol anvendes 100 ml af det samme næringssubstrat dog med 10 g/1 L-( + )-mælkesyre (natriumsalt, beregnet som syre). Begge kulturer blev podet med 10 ml af en forkultur således som beskre-10 vet i eksempel 1. Inkubationen skete ved 28 °C og 250 omrystninger pr. min. i en rysteinkubator. Med 60 min. mellemrum blev udtaget prøver, og indholdet af pyrodruesyre bestemtes. Resultaterne er angivet i nedenstående tabel.

15 Pyrodruesyrekoncentration (g/1)

Blanding med Blanding med

Tid tilsætning af tilsætning af (timer) D-laktat L-laktat 20 - 0,0 0,0 0,0 1,0 1,2 0,8 2.0 3,0 1,4 3.0 5,7 1,2 25 4,0 10,2 0,9 5.0 11,4 0,7

Analysen af forgæringsbouillonen efter 5 timers forløb viste, at D-(-)-mælkesyren var fuldstændig omsat. L-(+)-30 mælkesyren var derimod stadig fuldstændig tilstede. Den i blandingen dannede pyrodruesyrer stammer fra oxidationen af den med majsstøbevæsken tilførte D-mælkesyre. Dette forklarer også den næsten for høje koncentration af pyrodruesyre i blandingen med D-(-)-mælkesyre.

35 9 DK 171744 B1 EKSEMPEL 3

Pyrodruesyredannelse i fermentor 5 En 1 liters fermentor blev fyldt med 900 ml af substrat C, dog med 20 g/1 D-mælkesyre (calciumsalt) og steriliseret. Som forkultur anvendtes 100 ml af en 12 timer gammel kultur af stammen Acetobacter spec. ATCC 21409 på substrat B, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 1.

10 Forgæringen blev foretaget ved 28 °C med en beluftnings-grad på 0,5 rumfang/minut og en omrøringshastighed på 1000 omdrejninger pr. minut. Der anvendtes intet skumdæmpende middel.

15 Efter 9 timers forløb var koncentrationen af pyrodruesyre (bestemt enzymatisk) 19,6 g/liter.

20 25 30 35

Claims (1)

1. DK 171744 B1 Patentkrav : Fremgangsmåde til fremstilling af pyrodruesyre og salte 5 heraf, kendetegnet ved, at man dyrker bakterien Acetobacter spec. ATCC 21409 under aerobe betingelser i nærværelse af D-(-)-mælkesyre. 15 20 25 30 35