Procédé de fabrication d'un antibiotique L'invention est relative à un procédé de fabrication d'un nouvel antibiotique, qui sera dénommé carbomycine dans la suite de la description. Cet antibiotique et ses sels sont particulièrement intéressants, in vitro, comme désinfectants ou par application locale ou in terne comme agents thérapeutiques pour com battre les mycobactéries pathogéniques et di vers micro-organismes gram-positifs.
L'antibiotique est formé pendant la culture, dans des conditions convenablement réglées, d'une souche qui n'a pas été décrite jusqu'ici et qui appartient à une espèce de micro-orga nismes connue sous le nom de<I>Streptomyces</I> halstedii. Cette souche a été cultivée. sur un milieu utilisé normalement pour l'identification d'actinomycètes et, en se basant sur les résul tats obtenus, elle a en effet été identifiée comme étant une nouvelle souche de<I>Streptomyces</I> hulstedii en se servant de la description des actinomycètes qui se trouve dans le traité de Bergey : Manual of Déterminative Bacterio- logy 6e édition (1948).
Les caractéristiques de cette souche diffèrent, en certains points, de la description des<I>Streptomyces</I> halstedii donnée par Bergey. Des cultures vivantes de la nouvelle souche ont-été déposées auprès de la Division de Fermentation du North Régional Research Laboratory à Peoria (Illinois) aux E.U.A. et ont été ajoutées à sa collection permanente de micro-organismes sous le Ne NRRL-2331.
Les caractéristiques culturelles de la nou velle souche, désignée ci-après par NRRL-2331 (initialement on la désignait par souche iso lée No 13040-30A ) sont indiquées dans le ta bleau suivant. (Les couleurs accompagnées de la lettre R sont celles de Ridgway, Color Stan dards and Nomenclature). Les indications sont basées sur celles obtenues avec six éprouvettes à moins qu'on ne le spécifie autrement.
<I>TABLEAU 1</I> <I>Streptomyces</I> halstedii NRRL - 2331 <I><U>Couleur</U></I> <I>Degré de</I> mycelium <I>aérien pigment</I> <I>Culture</I> prolifé- <I>et soluble Remarques</I> <I>ration sporulation</I> Glucose- modéré Bonne sporulation ; aucun Bord de la colonie lisse ; colonie lé- asparagine gris souris (R) à gris gèrement en saillie ; envers blanc à olive foncé (R) ; brun très clair ; spores gram-positi- quelques secteurs de ves ; tiges mesurant 2,27 X 1,95,u ;
m y c e 1 i u m aérien quelques spirales libres ; chaînes blanc. séparées recourbées au bout. Pla ques en dilution, colonies sembla bles excepté qu'elles ont des degrés variables de couleur depuis le gris olive (R) jusqu'au gris olive foncé (R).
-Glucose- modéré mycelium blanc; pas aucun Colonie plissée, envers blanc cré- Agar de spores ; bord 1i- meux.
chénique Agar pauvre m y c e 1 i u m aérien aucun envers blanc crémeux. nutritif à modéré blanc ; un peu de sporulation blanche autour du bord de la colonie ; un peu de colonies cireuses Morceaux pauvre m y c e 1 i u m aérien gris de pommes à modéré blanc ; aucune spo- clair de terre rulation brun Malate pauvre Bonne sporulation aucun envers blanc crémeux. de calcium à modéré gris souris foncé (R) ; colonies éta lées.
Plaques modéré m y c e 1 i u m aérien aucun envers blanc ; hydrolyse pauvre. d'amidon blanc ; sporulation pauvre<B>;</B> blanc gri sâtre Agar bon Bonne sporulation aucun envers gris foncé à gris clair ; peu synthétique gris souris (R) à gris de spirales en présence.
souris foncé (R). Cellulose pauvre <I><U>Couleur</U></I> <I>Degré de</I> mycelium <I>aérien pigment</I> <I>Culture</I> proli f <I>é- et Remarques</I> <I>ration sporulation soluble</I> Emerson bon Sur certaines parties aucun envers blanc crémeux. du tube aucune spo- rulation ; mycelium aérien blanc ; sur d'autres parties, une sporulation gris sou ris (R) Bouillon modéré nitrates réduits. à la dextrose et au nitrate Gélatine bon m y c e 1 i u m aérien aucun liquéfaction pauvre; envers blanc.
à 21o blanc<B>;</B> aucune spo- rulation Lait écrémé modéré aucun lait coagulé dans 2 éprouvettes ; (15 jours) lait non changé dans 2 éprouvettes ; aucune peptonisation ; protéolyse très faible. La nouvelle souche de<I>Streptomyces</I> halstedii <I>NRRL-2331</I> diffère de la description donnée dans le traité de Bergey à plusieurs points de vue.
Les différences sont indiquées dans le tableau suivant <I>TABLEAU 11</I> <I>Milieu Souche NRRL-2331 Description de</I> Bergey Amidon-Agar Croissance modérée ; mycelium Croissance abondante ; croissance bru- aérien blanc ; sporulation pauvre nâtre et brillante.
d'un blanc grisâtre.
Glucose-Agar Bord lichénique, reste blanc. Bord de la colonie lichénique devenant brun. Morceaux de Croissance pauvre à modérée avec Croissance abondante ; croissance hu- pommes de terre du mycelium blanc ; pas de spores. mide, plissée, de couleur crème teintée de vert.
Agar synthétique Spirales en présence mais pas nom- Pas de spirales. breuses. Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on cultive le<I>Streptomyces</I> halstedii <I>NRRL-2331</I> dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aérobies et en submersion, et qu'on isole, si on le désire, dudit milieu l'antibiotique qui s'est formé. L'antibiotique obtenu est un composé or ganique blanc et faiblement basique qui pré sente un point de fusion de 217-2180 C et, en dissolution dans l'éthanol, des maxima dans son spectre d'absorption ultraviolet à 240 m,u (e =<B>16,080)</B> et 327,5 m,u <I>(e =</I> 113).
La carbomycine montre une activité élevée contre plusieurs micro-organismes. Comme in diqué plus haut, elle est particulièrement re marquable par son action sur des mycobacté ries et les micro-organismes gram-positifs. Elle montre une certaine activité contre les micro organismes gram-négatifs mais à un degré moins élevé. Le tableau ci-dessous donne le spectre antibiotique de la carbomycine relative ment à divers micro-organismes gram-négatifs et gram-positifs.
Les essais ont été faits en ino-
EMI0004.0004
<I>TABLEAU <SEP> III</I>
<tb> <I>Croissance <SEP> Pas <SEP> de <SEP> croissance</I>
<tb> Strep. <SEP> faecalis <SEP> - <SEP> < 0,19 <SEP> mcg/ml
<tb> Brucella <SEP> bronchiseptica <SEP> 6,25 <SEP> mcg/ml <SEP> 12,5
<tb> A. <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 21 <SEP> 100
<tb> Proteus <SEP> Sp. <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> 173 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> M. <SEP> albicans <SEP> 8 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> typhosa <SEP> 344 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 132 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 134 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 139 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 50,19 <SEP> 0,39
<tb> B.
<SEP> subtilis <SEP> 219 <SEP> 0,39 <SEP> 0,78 En plus des micro-organismes susdits, cer taines souches résistantes ont été utilisées pour déterminer l'activité de l'antibiotique. Par exemple, en se servant d'une souche d'Auro- myces aerogenes, qui résiste à la chlortétracy- cline et au chloramphénicol, on constate que la croissance se produit à une concentration de 25 mcg de carbomycine par ml de bouillon nutritif mais qu'une croissance n'a pas lieu pour une concentration de 50 mcg/ml. Pour un deuxième essai de ce genre, une souche de A.
aerogenes, résistant à la fois à la strepto mycine et à la streptothricine, on a constaté également une croissance de cette souche en présence de 25 mcg/ml de carbomycine alors qu'aucune croissance n'a lieu pour une con centration de 50 meg/ml. Par ailleurs, en mon trant l'efficacité de l'antibiotique contre des souches résistantes de ce genre, cet essai prouve culant du bouillon nutritif contenant diverses concentrations de l'antibiotique pur avec l'or ganisme particulier essayé.
Les chiffres mar qués dans la colonne croissance indiquent la concentration la plus élevée qui a été essayée (en mcg/ml) pour laquelle la croissance des micro-organismes a encore lieu. L'essai a été fait dans les conditions normalisées, les éprou vettes étant incubées pendant une période nor malisée. également que l'antibiotique est nettement dif férent de la chlortétracycline, du chloramphé- nicol, de la streptothricine et de la strepto mycine.
Il est également à noter que la carbo- mycine est même plus active contre les souches résistant à l'A. aerogenes qu'il l'est contre la souche normale d'A. aerogenes, comme visi ble dans le tableau III susdit.
On a constaté qu'une souche de staphy- lococcus aureus est résistante in vitro à l'action de pénicilline à une concentration de 100 uni tés/ml ; à la dihydrostreptomycine avec 100 unités/ml ;
à la polymixine avec 100 unités/ml, alors qu'elle est sensible à l'action du chlor- amphénicol avec 100 mcg/ml et à la chlor- tétracycline avec 12,5 mcg/ml. La croissance de l'organisme en question est empêchée par une concentration de 3,1 me,- ,
/ml de carbo- mycine. La carbomyciné est très efficace contre plusieurs types de mycobactéries. Le tableau ci-dessous donne les résultats de ces essais. Dans ces cas, des éprouvettes, contenant un milieu liquide de Dubos avec 0,5 % d'albu mine, sont utilisées pour les essais. La carbo- mycine est ajoutée au milieu avec des concen trations différentes comme montré dans la pre mière colonne du tableau suivant.
Des éprou vettes du milieu contenant plusieurs concentra tions de l'antibiotique, comme indiqué, sont
EMI0005.0006
<I>TABLEAU <SEP> IV</I>
<tb> <I>Activité <SEP> de <SEP> la <SEP> carbomycine <SEP> contre <SEP> les <SEP> mycobactéries</I>
<tb> <I>mcg/ml <SEP> ranae <SEP> phlei <SEP> smegmatis <SEP> 607 <SEP> berolinense <SEP> butyricum</I>
<tb> 12,5 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 6,25 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 3,12 <SEP> <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 1,56 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 0,78 <SEP> + <SEP> <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP>
<tb> 0,39 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> <SEP> <SEP>
<tb> 0,
19 <SEP> + <SEP> + <SEP> <SEP> + <SEP> <SEP> + Le tableau ci-dessus montre que la carbo- mycine présente un degré d'activité extraordi naire contre ces mycobactéries.
On a constaté que la carbomycine a un ni veau relativement bas de toxicité quand elle est utilisée pour des essais sur des animaux. Par exemple, la valeur LDo, quand l'antibiotique est administré par injection dans les veines de souris sous la forme d'une solution dans de l'eau aci dulée, est approximativement égale à 7 mg/20 g de souris. La toxicité pour d'autres espèces et pour d'autres méthodes d'administration est comparable.
La culture du micro-organisme a lieu, de préférence, dans un milieu nutritif aqueux à une température d'environ 24-30e. Les milieux nutritifs convenables pour exécuter le procédé comprennent des hydrates de carbone, tels que des sucres, de l'amidon, du glycérol, de la fa rine de maïs et une source d'azote organique, telle que la caséine, la farine de soja, la farine d'arachides, le gluten de blé, la farine de grai nes de coton, l'albumine du lait, l'extrait enzy matique de caséine,, le trypton. Une source d'agents favorisant la croissance, tels que des ensuite inoculées avec des cultures de diverses mycobactéries. Le nom de l'espèce est indiqué en tête de chacune des colonnes du tableau.
Sous le nom des espèces on donne les résultats de l'essai. Celui-ci a lieu en incubant les tubes dans des conditions stériles pendant 18 heures. Le manque de croissance dans les éprouvettes à la fin de la période d'essai normalisée est in diqué par (-), une croissance douteuse par ( ) et une croissance par (+). produits de macération solubles fournis par les distilleries, l'extrait de levure, les résidus de fermentation des mélasses ainsi que des sels minéraux, tels que le chlorure de sodium, le phosphate de potassium, le nitrate de sodium, le sulfate de magnésium et des traces de ma tières inorganiques telles que le cuivre, le zinc et le fer peuvent également être utilisés avec des résultats avantageux.
Si une production excessive de mousse est obtenue pendant la fermentation, des agents antimousse, tels que des huiles végétales, peuvent être ajoutés au milieu de fermentation. Le<I>pH</I> de la fermenta tion tend à rester constant mais, si des varia tions se produisent, un agent tampon tel que le carbonate de calcium peut également être ajouté au milieu.
Un inoculum pour la préparation de car- bomycine, pour la croissance de la souche de <I>S.</I> halstedii, peut être obtenu en utilisant des cultures fournies par des germes de cette sou che sur des milieux tels que l'agar d'Emerson ou le lactose de boeuf. Les cultures peuvent être utilisées pour inoculer des flacons secoués ou des cuves d'inoculation pour la culture submer- gée. On peut également ensemencer des cuves d'inoculation avec le contenu de flacons se coués.
La croissance du micro-organisme atteint généralement son maximum en environ 2 à 3 jours. Toutefois, la constitution particulière des appareils utilisés, le degré d'aération, l'im portance de l'agitation, etc., peuvent influencer la vitesse à laquelle l'activité maximum est at teinte. En général, une période comprise entre environ 24 heures et 4 jours est une période désirable pour obtenir l'antibiotique. L'aération du milieu dans des cuves pour la culture sub mergée est poursuivie avec un débit d'environ un demi à deux volumes d'air frais par volume de bouillon et par minute. L'agitation peut être effectuée par des agitateurs appropriés bien connus de ceux qui s'occupent de l'industrie de fermentation.
Des conditions aseptiques doi vent, évidemment, être maintenues pendant le transfert de l'inoculum et pendant toute la croissance du micro-organisme.
Après la croissance du micro-organisme, le mycelium, qui est généralement très abondant et fin, peut être séparé du bouillon de fermen tation en se servant de divers appareils norma lisés, tels que des filtres-presses, des centrifu ges, etc. On a constaté qu'en diminuant le<I>pH</I> de l'ensemble du bouillon de fermentation jus qu'à environ 3,0 on facilite la filtration. Comme l'antibiotique n'est pas très stable dans des con ditions acides, le bouillon de fermentation est réglé de manière à être à peu près neutre quand il a été filtré. La carbomycine peut être séparée du bouillon de fermentation par un grand nom bre de moyens différents. Tout le bouillon peut aussi être utilisé tel quel pour l'isolement de l'antibiotique ou il peut être séché avant cet isolement.
L'antibiotique peut être purifié da vantage de différentes manières. Par exemple, le composé peut être extrait de la solution aqueuse à des<I>pH</I> neutres ou légèrement alca lins, compris de préférence entre environ 6 et environ 10 par divers solvants organiques non miscibles à l'eau, ces solvants comprenant des éthers, des hydrocarbures aromatiques, des esters, des cétones, des alcools inférieurs et des hydrocarbures halogénés. Parmi ces solvants, on peut citer à titre d'exemples l'éther diéthyli- que, le benzène, le toluène, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, la méthyl-isobutyl-cétone, le butanol et le chloroforme. Même pour des <I>pH</I> acides, certains de ces solvants extraient une quantité appréciable de l'antibiotique.
Ceci est surtout vrai pour des alcools non miscibles à l'eau, tels que le butanol, les pentanols, etc. L'antibiotique peut être extrait de la plupart des solutions avec un solvant et après avec de l'eau acidulée, de préférence à un<I>pH</I> inférieur à environ 2,5. Si on le désire, l'extrait dans le solvant peut être concentré avant l'extraction avec l'eau acidulée. En réglant le<I>pH</I> pour la neutralité ou l'alcalinité, l'antibiotique peut être extrait à nouveau avec un des solvants. Après l'évaporation du solvant et concentration de la solution, l'antibiotique forme des cristaux. Il cristallise généralement sous la forme d'aiguil les blanches épointées. Toutefois, dans certains cas, on obtient des cristaux en paillettes.
Le produit peut être recristallisé à nouveau dans le benzène, l'éther, des cétones inférieures ou des alcools inférieurs. Si on le désire, une solu tion dans un des alcools ou cétones miscibles à l'eau est concentrée et de l'eau est ajoutée pour faciliter la cristallisation. L'antibiotique peut encore être isolé par adsorption du bouil lon ou des produits concentrés par du charbon activé. Une reprise dans de l'acide ou dans l'eau, en même temps qu'avec un solvant misci ble à l'eau contenant de l'acide, permet d'ob tenir le composé sous une forme purifiée.
La carbomycine est un composé organique blanc et faiblement basique qui est soluble dans des acides aqueux dilués mais elle est seulement légèrement soluble dans l'eau (environ 0,5 mg/ml). Elle est extrêmement soluble dans plusieurs solvants organiques tels que l'acétone, l'éther, le benzène, le chloroforme et le dioxane et un peu moins soluble dans le méthanol et l'éthanol. Elle est insoluble dans l'hexane. En concentrant une solution de carbomycine dans un solvant, on tend à former des solutions sur saturées et les cristaux qui se forment ont une tendance à retenir un peu du solvant utilisé. La stabilité du composé diminue dans des solu tions fortement acides et basiques, même à la température ambiante.
Le composé est très instable après chauffage dans des solutions acides et alcalines et sa stabilité est maximum avec un<I>pH</I> compris entre 3 et 7. Sa stabilité à l'état sec ou après dissolution dans des sol vants secs est bonne.
Un produit de base cristallisé et fortement purifié, comme celui obtenu par quatre recris- tallisations dans des solvants tels que l'éthanol, le benzène, etc., tend à se présenter à l'état de cristaux imprégnés de solvants dont on peut séparer le solvant, d'une manière plus ou moins complète, par un séchage sous vide à 100,). Quand une telle matière est séchée dans ces conditions pendant trois heures, elle fond à 217-218 avec légère décomposition. L'échan tillon est introduit à 196o dans le bain, qui sert à la détermination du point de fusion, et la température du bain est augmentée à une vi tesse de 3,6,1 par minute.
La matière anhydre cristallisée forme un monohydrate quand elle est exposée à l'humidité atmosphérique. Ce monohydrate analysé a la composition sui vante : carbone = 59,01 ; hydrogène = 8,35 ; azote=1,66; oxygène (par différence)=30,98.
Le produit de base cristallisé, fortement purifié et séché sous vide à 1000, pendant trois heures, présente à l'analyse la composition sui vante : carbone = 60,04 ; hydrogène = 8,24 ; azote=1,55; oxygène (par différence)=30,17.
La rotation optique de la matière est d'en- viron [a],,=-55(l (solution à 1% dans du chloroforme). En titrant le composé dans un mélange de deux volumes de diméthyl forma- mide et un volume d'eau, on obtient un pKca <I>= 6,4</I> et un poids moléculaire d'environ 866.
Le spectre d'absorption ultraviolet du produit de base, quand il est dissous dans l'éthanol, a deux maxima, dont un se présente à 240 m ic (F = 16,080) et l'autre à 327,5 m ,u (#- = 113). Quand le produit de base cristallisé et anhydre est dissous dans le chloroforme, il a un certain nombre de sommets caractéristiques dans la région de l'infra-rouge. Parmi ces som mets, on peut citer les fréquences suivantes (en cm-') : 3510, 2920, 1732, 1690, 1630, 1460, 1375, 1300,<B>1</B>230, 1161, 1122, 1077, 1052, 1025, 1015, 976, 916, 910, 873 et 837. Le spectre infrarouge est montré sur le dessin ci- annexé.
Le diagramme du dessin indique en abscisses supérieures les fréquences f en cm-' avec, en abscisses inférieures, les lon gueurs d'ondes  en microns ,u et en ordonnées les valeurs de transmittance en Vo.
Plusieurs micro-organismes différents peu vent être utilisés pour déterminer l'activité des préparations de carbomycine. Ils comprennent le K. pneumohiae, le<I>B.</I> subtilis; le Staph. au- reus et d'autres organismes d'essais normalisés. Quand on utilise le<I>K.</I> pneumoniae, on peut se servir dé l'essai pour la mesure de la turbidité ou de l'essai à la plaque. Du chloramphénicol cristallisé peut être utilisé comme repère en accordant une valeur de 1000 unités/mg à cet antibiotique.
Sur cette base, la carbomycine cristallisée a une activité de 750 à 850 unités de chloramphénicol par mg. La carbomycine venue de fermentation montre une activité d'en viron 15 à environ 100 unités/ml.
Les exemples ci-dessous montrent comment peut être réalisée l'invention. <I>Exemple 1</I> Des spores d'un germe de S. halstedii NRRL-2331, obtenu sur de l'agar d'Emerson, sont transférés, dans des conditions aseptiques, dans un milieu nutritif ayant la composition sui vante cérélose 10 g farine de soja 10 chlorure de sodium 5 solubles de distillerie 5 . carbonate de calcium 1 Le mélange est dilué jusqu'à avoir le vo lume d'un litre et son<I>pH</I> est réglé jusqu'à être égal à 7 avec de la potasse7 caustique avant la stérilisation. Quand le milieu a refroidi, on ajoute les spores.
On cultive l'organisme dans des flacons secoués pendant deux jours à envi ron 28 . Le bouillon contenant le mycehum est ensuite transféré dans un milieu stérile, ayant un volume vingt fois plus grand et la composi tion suivante amidon 20 g caséine 10 farine de soja 15 carbonate de calcium 1 Ce mélange est dilué jusqu'à faire un litre et son<I>pH</I> est réglé à 7 avant l'introduction dans l'autoclave et l'ensemencement. Après agitation et aération, dans des conditions stériles pendant deux jours, l'activité du bouillon est de 100 uni tés/ml. Le<I>pH</I> du mélange est réglé à 3,0 et le mycelium est enlevé par filtration.
Le<I>pH</I> du filtrat est réglé à 6,5 et celui-ci est ensuite extrait deux fois avec un quart de volume de méthyl-isobutyl-cétone. Les phases solvant mélangées sont concentrées à un dixième de volume sous vide. L'antibiotique est ensuite extrait avec de l'eau à un<I>pH</I> d'environ 2,0 en se servant d'acide sulfurique pour régler le<I>pH.</I> La phase aqueuse est séparée, lavée avec un petit volume de benzène pour enlever la cétone dissoute" et le<I>pH</I> de la phase aqueuse est réglé à 6,5. L'antibiotique est extrait plusieurs fois à l'éther et les phases éther séparées sont sé chées sur du sulfate de sodium anhydre. Le solvant est enlevé par distillation et l'antibioti que cristallise sous forme d'aiguilles blanches.
Le produit est recristallisé en le dissolvant dans l'acétone, il est filtré et concentré, après quoi on ajoute de l'eau. Le produit obtenu est très efficace contre une variété de mycobactéries et de micro-organismes gram-positifs. <I>Exemple 2</I> Un milieu est préparé ayant la composition suivante Amidon 20 g solubles de distillerie 10 g farine de soja 15 g Le mélange de ces matières est ajouté à un litre d'eau et le<I>pH</I> est réglé à 7 avant l'addi tion d'un gramme de carbonate de calcium. Le milieu est alors introduit dans un autoclave et est ensemencé avec un inoculum S. halstedi <I>NRRL-2331</I> dans des conditions stériles. Le mélange est soumis à une aération et à une agitation dans des conditions stériles à envi ron 280 pendant deux jours.
On constate, i l'essai, que le bouillon filtré contient 25 unité; de carbomycine par millilitre de solution.
L'antibiotique sera mis sur le marché soin la marque MAGNAMYCINE déposée pai la titulaire.
Process for manufacturing an antibiotic The invention relates to a process for manufacturing a novel antibiotic, which will be called carbomycin in the remainder of the description. This antibiotic and its salts are particularly useful, in vitro, as disinfectants or by local or internal application as therapeutic agents for combating pathogenic mycobacteria and various gram-positive microorganisms.
The antibiotic is formed during cultivation, under suitably controlled conditions, of a strain which has so far not been described and which belongs to a species of microorganism known as <I> Streptomyces < / I> halstedii. This strain has been cultivated. on a medium normally used for the identification of actinomycetes and, based on the results obtained, it was in fact identified as being a new strain of <I> Streptomyces </I> hulstedii using the description of actinomycetes which is found in Bergey's treatise: Manual of Determinative Bacteriology 6th edition (1948).
The characteristics of this strain differ, in certain respects, from the description of <I> Streptomyces </I> halstedii given by Bergey. Live cultures of the new strain have been deposited with the Fermentation Division of the North Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, USA. and have been added to its permanent collection of microorganisms as Ne NRRL-2331.
The cultural characteristics of the new strain, designated hereinafter as NRRL-2331 (initially designated as isolated strain No. 13040-30A) are indicated in the following table. (Colors marked with the letter R are those of Ridgway, Color Stan dards and Nomenclature). Indications are based on those obtained with six specimens unless otherwise specified.
<I> TABLE 1 </I> <I> Streptomyces </I> halstedii NRRL - 2331 <I><U>Color</U> </I> <I> Degree of </I> mycelium <I> aerial pigment </I> <I> Culture </I> proliferative <I> and soluble Remarks </I> <I> ration sporulation </I> Glucose- moderate Good sporulation; no Edge of the colony smooth; mouse gray (R) to gray leesparagine colony slightly protruding; reverse white to dark olive (R); very light brown; gram-positive spores - some areas of ves; rods measuring 2.27 X 1.95, u;
m y c e 1 i u m aerial a few free spirals; white chains. separated curved at the end. Plates in dilution, colonies appear similar except that they have varying degrees of color from olive gray (R) to dark olive gray (R).
-Glucose- moderate white mycelium; not any Folded colony, white reverse spore-agar; 1st edge.
chenic Agar poor m y c e 1 i u m aerial no creamy white reverse. nutritious to moderate white; some white sporulation around the colony edge; some waxy colonies Poor m y c e 1 u m aerial gray of apples to moderate white; no soil sporulation brown Poor malate Good sporulation no creamy white reverse. calcium to moderate dark mouse gray (R); established colonies.
Plates moderate m y c e 1 i u m aerial no white reverse; poor hydrolysis. white starch; poor sporulation <B>; </B> grayish white Agar good Good sporulation no dark gray to light gray reverse; little synthetic mouse gray (R) to gray spirals present.
dark mouse (R). Poor cellulose <I><U>Color</U> </I> <I> Degree of </I> mycelium <I> aerial pigment </I> <I> Culture </I> proli f <I> é - and Remarks </I> <I> soluble sporulation ration </I> Emerson good On some parts no creamy white reverse. from the tube no sporulation; aerial mycelium white; on other parts, a brownish sporulation (R) Moderate broth reduced nitrates. with dextrose and nitrate Gelatin good m y c e 1 i u m air no poor liquefaction; white reverse.
at 21o white <B>; </B> no sporulation Moderate skimmed milk no coagulated milk in 2 test tubes; (15 days) unchanged milk in 2 test tubes; no peptonization; very low proteolysis. The new strain of <I> Streptomyces </I> halstedii <I> NRRL-2331 </I> differs from the description given in Bergey's treatise in several respects.
The differences are indicated in the following table <I> TABLE 11 </I> <I> Medium Strain NRRL-2331 Description of </I> Bergey Amidon-Agar Moderate growth; mycelium Abundant growth; gross growth white; sporulation poor natural and shiny.
grayish white.
Glucose-Agar Lichen edge, remains white. Edge of lichen colony turning brown. Poor to moderate growth pieces with abundant growth; growth hu- potatoes of white mycelium; no spores. mid, pleated, cream color tinged with green.
Synthetic Agar Spirals present but not named - No spirals. breuses. The process according to the invention is characterized in that the <I> Streptomyces </I> halstedii <I> NRRL-2331 </I> is cultivated in an aqueous nutrient medium under aerobic conditions and in submersion, and that the antibiotic which has formed is isolated, if desired, from said medium. The antibiotic obtained is a white, weakly basic organic compound which has a melting point of 217-2180 C and, when dissolved in ethanol, maxima in its ultraviolet absorption spectrum at 240 m, u (e = <B> 16.080) </B> and 327.5 m, u <I> (e = </I> 113).
Carbomycin shows high activity against several microorganisms. As indicated above, it is particularly remarkable for its action on mycobacteria and gram-positive microorganisms. It shows some activity against gram-negative microorganisms but to a lesser degree. The table below gives the antibiotic spectrum of carbomycin relative to various gram-negative and gram-positive microorganisms.
The tests were carried out in ino-
EMI0004.0004
<I> TABLE <SEP> III </I>
<tb> <I> Growth <SEP> No <SEP> of <SEP> growth </I>
<tb> Strep. <SEP> faecalis <SEP> - <SEP> <0.19 <SEP> mcg / ml
<tb> Brucella <SEP> bronchiseptica <SEP> 6.25 <SEP> mcg / ml <SEP> 12.5
<tb> A. <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 21 <SEP> 100
<tb> Proteus <SEP> Sp. <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> 173 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> M. <SEP> albicans <SEP> 8 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> typhosa <SEP> 344 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 132 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 134 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 139 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 50.19 <SEP> 0.39
<tb> B.
<SEP> subtilis <SEP> 219 <SEP> 0.39 <SEP> 0.78 In addition to the above microorganisms, certain resistant strains were used to determine the activity of the antibiotic. For example, using a strain of Auromycin aerogenes which is resistant to chlortetracycline and chloramphenicol, growth is found to occur at a concentration of 25 mcg of carbomycin per ml of nutrient broth but that 'growth does not take place at a concentration of 50 mcg / ml. For a second such test, a strain of A.
aerogenes, resistant to both streptomycin and streptothricin, a growth of this strain was also observed in the presence of 25 mcg / ml of carbomycin whereas no growth took place for a concentration of 50 meg / ml. On the other hand, by demonstrating the efficacy of the antibiotic against resistant strains of this kind, this test is conclusive proof of nutrient broth containing various concentrations of the pure antibiotic with the particular organism tested.
The numbers marked in the growth column indicate the highest concentration that has been tested (in mcg / ml) at which the growth of the microorganisms still takes place. The test was carried out under standard conditions with the test pieces incubated for a standard period. also that the antibiotic is markedly different from chlortetracycline, chloramphenicol, streptothricin and streptomycin.
It should also be noted that carbomycin is even more active against strains resistant to A. aerogenes than against the normal strain of A. aerogenes, as visible in Table III above.
It has been found that a strain of Staphy- lococcus aureus is resistant in vitro to the action of penicillin at a concentration of 100 units / ml; to dihydrostreptomycin with 100 units / ml;
to polymixin with 100 units / ml, while it is sensitive to the action of chloramphenicol with 100 mcg / ml and to chlor-tetracycline with 12.5 mcg / ml. The growth of the organism in question is prevented by a concentration of 3.1 me, -,
/ ml of carbo- mycin. Carbomycin is very effective against several types of mycobacteria. The table below gives the results of these tests. In these cases, test pieces, containing a Dubos liquid medium with 0.5% albumin, are used for the tests. The carbomycin is added to the medium with different concentrations as shown in the first column of the following table.
Test tubes of the medium containing several concentrations of the antibiotic, as indicated, are
EMI0005.0006
<I> TABLE <SEP> IV </I>
<tb> <I> <SEP> activity of <SEP> carbomycin <SEP> against <SEP> <SEP> mycobacteria </I>
<tb> <I> mcg / ml <SEP> ranae <SEP> phlei <SEP> smegmatis <SEP> 607 <SEP> berolinense <SEP> butyricum </I>
<tb> 12.5 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 6.25 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP > - <SEP> 3.12 <SEP> <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 1.56 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - < SEP> - <SEP> 0.78 <SEP> + <SEP> <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP>
<tb> 0.39 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> <SEP> <SEP>
<tb> 0,
19 <SEP> + <SEP> + <SEP> <SEP> + <SEP> <SEP> + The table above shows that carbo-mycin exhibits an extraordinary degree of activity against these mycobacteria.
Carbomycin has been found to have a relatively low level of toxicity when used in animal tests. For example, the LDo value, when the antibiotic is administered by injection into the veins of mice as a solution in acidic water, is approximately equal to 7 mg / 20 g of mice. The toxicity for other species and for other methods of administration is comparable.
The culture of the microorganism preferably takes place in an aqueous nutrient medium at a temperature of about 24-30 ° C. Nutrient media suitable for carrying out the process include carbohydrates, such as sugars, starch, glycerol, corn flour and an organic nitrogen source, such as casein, soy flour. , peanut flour, wheat gluten, cottonseed flour, milk albumin, enzymatic extract of casein, trypton. A source of growth promoting agents, such as subsequently inoculated with cultures of various mycobacteria. The name of the species is indicated at the head of each column of the table.
The test results are given under the name of the species. This takes place by incubating the tubes under sterile conditions for 18 hours. Lack of growth in the test tubes at the end of the standard test period is indicated by (-), questionable growth by () and growth by (+). soluble maceration products provided by distilleries, yeast extract, molasses fermentation residues as well as mineral salts, such as sodium chloride, potassium phosphate, sodium nitrate, magnesium sulfate and Traces of inorganic materials such as copper, zinc and iron can also be used with beneficial results.
If excessive foam production is obtained during fermentation, defoamers, such as vegetable oils, can be added to the fermentation medium. The <I> pH </I> of the fermentation tends to remain constant but, if variations occur, a buffering agent such as calcium carbonate can also be added to the medium.
An inoculum for the preparation of carbonycin, for the growth of the strain of <I> S. </I> halstedii, can be obtained by using cultures provided by organisms of this strain on media such as Emerson's agar or beef lactose. Cultures can be used to inoculate shake flasks or inoculation vessels for submerged culture. Inoculation tanks can also be inoculated with the contents of the coated vials.
The growth of the microorganism usually reaches its maximum in about 2 to 3 days. However, the particular constitution of the apparatus used, the degree of aeration, the amount of agitation, etc., may influence the rate at which the maximum activity is reached. In general, a period of between about 24 hours and 4 days is a desirable period to obtain the antibiotic. Aeration of the medium in tanks for the submerged culture is continued with a flow rate of approximately one-half to two volumes of fresh air per volume of broth and per minute. Agitation can be effected by suitable agitators well known to those in the fermentation industry.
Aseptic conditions must, of course, be maintained during transfer of the inoculum and throughout the growth of the microorganism.
After the growth of the microorganism, the mycelium, which is usually very abundant and fine, can be separated from the fermentation broth using various standardized devices, such as filter presses, centrifu ges, etc. It has been found that lowering the <I> pH </I> of the whole fermentation broth to about 3.0 facilitates filtration. Since the antibiotic is not very stable under acidic conditions, the fermentation broth is adjusted to be approximately neutral when it has been filtered. Carbomycin can be separated from fermentation broth by a number of different means. All the broth can also be used as is for the isolation of the antibiotic or it can be dried prior to this isolation.
The antibiotic can be further purified in different ways. For example, the compound can be extracted from the aqueous solution at neutral or slightly alkaline <I> pH </I>, preferably between about 6 and about 10, by various water-immiscible organic solvents, these solvents. including ethers, aromatic hydrocarbons, esters, ketones, lower alcohols and halogenated hydrocarbons. Among these solvents, there may be mentioned, by way of example, diethyl ether, benzene, toluene, ethyl acetate, butyl acetate, methyl-isobutyl-ketone, butanol and chloroform. . Even at acidic <I> pH </I>, some of these solvents extract an appreciable amount of the antibiotic.
This is especially true for water-immiscible alcohols, such as butanol, pentanols, etc. The antibiotic can be extracted from most solutions with a solvent and then with acidulated water, preferably at <I> pH </I> less than about 2.5. If desired, the solvent extract can be concentrated prior to extraction with acidulated water. By adjusting the <I> pH </I> for neutrality or alkalinity, the antibiotic can be extracted again with one of the solvents. After evaporation of the solvent and concentration of the solution, the antibiotic forms crystals. It generally crystallizes in the form of needle the sharp white. However, in some cases, flake crystals are obtained.
The product can be recrystallized again from benzene, ether, lower ketones or lower alcohols. If desired, a solution in one of the water-miscible alcohols or ketones is concentrated and water is added to facilitate crystallization. The antibiotic can also be isolated by adsorption of the broth or products concentrated with activated charcoal. Taking up in acid or in water, together with a water-miscible solvent containing acid, makes it possible to obtain the compound in a purified form.
Carbomycin is a white, weakly basic organic compound which is soluble in dilute aqueous acids but is only slightly soluble in water (approximately 0.5 mg / ml). It is extremely soluble in several organic solvents such as acetone, ether, benzene, chloroform and dioxane and somewhat less soluble in methanol and ethanol. It is insoluble in hexane. By concentrating a solution of carbomycin in a solvent, one tends to form over-saturated solutions and the crystals which form tend to retain some of the solvent used. The stability of the compound decreases in strongly acidic and basic solutions, even at room temperature.
The compound is very unstable after heating in acidic and alkaline solutions and its stability is maximum with a <I> pH </I> between 3 and 7. Its stability in the dry state or after dissolution in dry soils is good.
A crystallized and highly purified base product, such as that obtained by four recrystallizations from solvents such as ethanol, benzene, etc., tends to be present as crystals impregnated with solvents from which the residue can be separated. solvent, more or less completely, by drying under vacuum at 100,). When such a material is dried under these conditions for three hours, it melts at 217-218 with slight decomposition. The sample is introduced at 196o into the bath, which is used to determine the melting point, and the temperature of the bath is increased at a rate of 3.6.1 per minute.
The crystallized anhydrous material forms a monohydrate when exposed to atmospheric humidity. This monohydrate analyzed has the following composition: carbon = 59.01; hydrogen = 8.35; nitrogen = 1.66; oxygen (by difference) = 30.98.
The crystallized base product, highly purified and dried under vacuum at 1000 for three hours, exhibits the following composition on analysis: carbon = 60.04; hydrogen = 8.24; nitrogen = 1.55; oxygen (by difference) = 30.17.
The optical rotation of matter is about [a] ,, = - 55 (l (1% solution in chloroform). By titrating the compound in a mixture of two volumes of dimethyl formamide and one volume of water, one obtains a pKca <I> = 6.4 </I> and a molecular weight of approximately 866.
The ultraviolet absorption spectrum of the feedstock, when dissolved in ethanol, has two maxima, one of which occurs at 240 m ic (F = 16.080) and the other at 327.5 m, u (# - = 113). When the crystallized and anhydrous base product is dissolved in chloroform, it has a number of characteristic peaks in the infrared region. Among these summits, we can cite the following frequencies (in cm- '): 3510, 2920, 1732, 1690, 1630, 1460, 1375, 1300, <B> 1 </B> 230, 1161, 1122, 1077, 1052, 1025, 1015, 976, 916, 910, 873 and 837. The infrared spectrum is shown in the accompanying drawing.
The diagram of the drawing indicates on the upper abscissa the frequencies f in cm- 'with, on the lower abscissa, the wavelengths λ in microns, u and on the ordinate the transmittance values in Vo.
Several different microorganisms can be used to determine the activity of carbomycin preparations. They include K. pneumohiae, <I> B. </I> subtilis; the Staph. au- reus and other standard testing organizations. When using <I> K. </I> pneumoniae, the test can be used for the measurement of turbidity or the plate test. Crystallized chloramphenicol can be used as a benchmark by assigning a value of 1000 units / mg to this antibiotic.
On this basis, crystallized carbomycin has an activity of 750 to 850 units of chloramphenicol per mg. Fermentation carbomycin shows an activity of about 15 to about 100 units / ml.
The examples below show how the invention can be implemented. <I> Example 1 </I> Spores of a germ of S. halstedii NRRL-2331, obtained on Emerson's agar, are transferred, under aseptic conditions, into a nutrient medium having the following composition cerelose 10 g soybean flour 10 sodium chloride 5 distillers' solubles 5. calcium carbonate 1 The mixture is diluted to the volume of one liter and its <I> pH </I> is adjusted to be equal to 7 with caustic potash7 before sterilization. When the medium has cooled, the spores are added.
The organism is grown in shake flasks for two days at about 28. The broth containing the mycehum is then transferred to a sterile medium, having a volume twenty times greater and the following composition starch 20 g casein 10 soybean flour 15 calcium carbonate 1 This mixture is diluted to make a liter and its <I> pH </I> is set to 7 before introduction into the autoclave and inoculation. After stirring and aeration, under sterile conditions for two days, the activity of the broth is 100 units / ml. The <I> pH </I> of the mixture is set to 3.0 and the mycelium is removed by filtration.
The <I> pH </I> of the filtrate is adjusted to 6.5 and it is then extracted twice with a quarter volume of methyl-isobutyl-ketone. The mixed solvent phases are concentrated to one tenth of a volume under vacuum. The antibiotic is then extracted with water at a <I> pH </I> of approximately 2.0 using sulfuric acid to adjust the <I> pH. </I> The aqueous phase is separated, washed with a small volume of benzene to remove the dissolved ketone "and the <I> pH </I> of the aqueous phase is set to 6.5. The antibiotic is extracted several times with ether and the phases The ether separated are dried over anhydrous sodium sulfate, the solvent is removed by distillation and the antibiotic crystallizes in the form of white needles.
The product is recrystallized by dissolving it in acetone, it is filtered and concentrated, after which water is added. The product obtained is very effective against a variety of mycobacteria and gram-positive microorganisms. <I> Example 2 </I> A medium is prepared having the following composition Starch 20 g soluble distillery 10 g soybean flour 15 g The mixture of these materials is added to one liter of water and the <I> pH < / I> is set to 7 before adding one gram of calcium carbonate. The medium is then introduced into an autoclave and is inoculated with a S. halstedi <I> NRRL-2331 </I> inoculum under sterile conditions. The mixture is subjected to aeration and stirring under sterile conditions at about 280 for two days.
The filtered broth was found to contain 25 units on the test; of carbomycin per milliliter of solution.
The antibiotic will be marketed after the MAGNAMYCINE brand is registered by the holder.