CH314151A

CH314151A - Procédé de fabrication d'un antibiotique

Info

Publication number: CH314151A
Authority: CH
Inventors: Wilbur Tanner Fred; Masson Lees Thomas; Broderick Routien John
Original assignee: Pfizer & Co C
Priority date: 1952-02-07
Filing date: 1953-02-06
Publication date: 1956-05-31

Description


  Procédé de     fabrication    d'un     antibiotique       L'invention est relative à un procédé de  fabrication d'un nouvel antibiotique, qui sera  dénommé       carbomycine      dans la suite de la  description. Cet antibiotique et ses sels sont  particulièrement intéressants, in vitro, comme  désinfectants ou par application locale ou in  terne comme agents thérapeutiques pour com  battre les mycobactéries pathogéniques et di  vers micro-organismes gram-positifs.  



  L'antibiotique est formé pendant la culture,  dans des conditions convenablement réglées,  d'une souche qui n'a pas été décrite jusqu'ici  et qui appartient à une espèce de micro-orga  nismes connue sous le nom de<I>Streptomyces</I>       halstedii.    Cette souche a été cultivée. sur un  milieu utilisé normalement pour l'identification  d'actinomycètes et, en se basant sur les résul  tats obtenus, elle a en effet été identifiée comme  étant une nouvelle souche de<I>Streptomyces</I>       hulstedii    en se servant de la description des  actinomycètes qui se trouve dans le traité de         Bergey    :       Manual    of Déterminative     Bacterio-          logy      6e édition (1948).

   Les caractéristiques  de cette souche diffèrent, en certains points,  de la description des<I>Streptomyces</I>     halstedii     donnée par     Bergey.    Des cultures vivantes de la  nouvelle souche ont-été déposées auprès de la  Division de Fermentation du North Régional  Research     Laboratory    à     Peoria        (Illinois)    aux       E.U.A.    et ont été ajoutées à sa collection  permanente de micro-organismes sous le  Ne     NRRL-2331.     



  Les caractéristiques culturelles de la nou  velle souche, désignée ci-après par NRRL-2331  (initialement on la désignait par   souche iso  lée No 13040-30A      )    sont indiquées dans le ta  bleau suivant. (Les couleurs accompagnées de  la lettre R sont celles de Ridgway,     Color    Stan  dards and Nomenclature). Les indications sont  basées sur celles obtenues avec six éprouvettes  à moins qu'on ne le spécifie autrement.

        <I>TABLEAU 1</I>  <I>Streptomyces</I>     halstedii          NRRL    - 2331  <I><U>Couleur</U></I>  <I>Degré de</I>     mycelium   <I>aérien pigment</I>  <I>Culture</I>     prolifé-   <I>et soluble Remarques</I>  <I>ration sporulation</I>  Glucose- modéré Bonne sporulation ; aucun Bord de la colonie lisse ; colonie     lé-          asparagine    gris souris (R) à gris gèrement en saillie ; envers blanc à  olive foncé (R) ; brun très clair ; spores     gram-positi-          quelques    secteurs de     ves    ; tiges mesurant 2,27 X     1,95,u    ;

    m y c e 1 i u m aérien quelques spirales libres ;     chaînes     blanc. séparées recourbées au bout. Pla  ques en dilution, colonies sembla  bles excepté qu'elles ont des degrés  variables de couleur depuis le gris  olive (R) jusqu'au gris olive foncé  (R).  



  -Glucose- modéré     mycelium    blanc; pas aucun Colonie plissée, envers blanc     cré-          Agar    de spores ; bord     1i-    meux.  



  chénique  Agar pauvre m y c e 1 i u m aérien aucun envers blanc crémeux.  nutritif à modéré blanc ; un peu de  sporulation blanche  autour du bord de  la colonie ; un peu  de colonies cireuses  Morceaux pauvre m y c e 1 i u m aérien gris  de pommes à modéré blanc ; aucune     spo-    clair  de terre     rulation    brun       Malate    pauvre Bonne sporulation aucun envers blanc crémeux.  de calcium à modéré gris souris foncé  (R) ; colonies éta  lées.  



  Plaques modéré m y c e 1 i u m aérien aucun envers blanc ; hydrolyse pauvre.  d'amidon blanc ; sporulation  pauvre<B>;</B> blanc gri  sâtre  Agar bon Bonne sporulation aucun envers gris foncé à gris clair ; peu  synthétique gris souris (R) à gris de spirales en présence.  



  souris foncé (R).  Cellulose pauvre      <I><U>Couleur</U></I>  <I>Degré de</I>     mycelium   <I>aérien pigment</I>  <I>Culture</I>     proli        f   <I>é- et Remarques</I>  <I>ration sporulation soluble</I>  Emerson bon Sur     certaines    parties aucun envers blanc crémeux.  du tube aucune     spo-          rulation    ;     mycelium     aérien blanc ; sur  d'autres parties, une  sporulation gris sou  ris (R)  Bouillon modéré nitrates réduits.  à la dextrose  et au nitrate  Gélatine bon     m    y c e 1 i u m aérien aucun liquéfaction pauvre; envers blanc.

    à     21o    blanc<B>;</B> aucune     spo-          rulation     Lait écrémé modéré aucun lait     coagulé    dans 2 éprouvettes ;  (15 jours) lait non changé dans 2 éprouvettes ;  aucune     peptonisation    ; protéolyse  très faible.    La nouvelle souche de<I>Streptomyces</I>     halstedii   <I>NRRL-2331</I> diffère de la description donnée  dans le traité de     Bergey    à plusieurs points de vue.

   Les différences sont indiquées dans le tableau  suivant  <I>TABLEAU 11</I>  <I>Milieu Souche NRRL-2331 Description de</I>     Bergey     Amidon-Agar Croissance modérée ;     mycelium    Croissance abondante ; croissance     bru-          aérien    blanc ; sporulation pauvre nâtre et brillante.  



  d'un blanc grisâtre.  



  Glucose-Agar Bord lichénique, reste blanc. Bord de la colonie lichénique devenant  brun.  Morceaux de Croissance pauvre à modérée avec Croissance abondante ; croissance     hu-          pommes    de terre du     mycelium    blanc ; pas de spores. mide, plissée, de couleur crème teintée  de vert.  



  Agar synthétique Spirales en présence mais pas nom- Pas de spirales.  breuses.    Le procédé selon l'invention est caractérisé  en ce qu'on cultive le<I>Streptomyces</I>     halstedii     <I>NRRL-2331</I> dans un milieu nutritif aqueux  dans des conditions aérobies et en submersion,  et qu'on isole, si on le désire, dudit milieu  l'antibiotique qui s'est formé.    L'antibiotique obtenu est un composé or  ganique blanc et faiblement basique qui pré  sente un point de fusion de 217-2180 C et, en  dissolution dans l'éthanol, des maxima dans  son spectre     d'absorption    ultraviolet à 240     m,u     (e =<B>16,080)</B> et 327,5     m,u   <I>(e =</I> 113).

        La     carbomycine    montre une activité élevée  contre plusieurs micro-organismes. Comme in  diqué plus haut, elle est particulièrement re  marquable par son action sur des mycobacté  ries et les micro-organismes gram-positifs. Elle  montre une certaine activité contre les micro  organismes gram-négatifs mais à un degré  moins élevé. Le tableau ci-dessous donne le  spectre antibiotique de la     carbomycine    relative  ment à divers micro-organismes     gram-négatifs     et gram-positifs.

   Les essais ont été faits en ino-  
EMI0004.0004     
  
    <I>TABLEAU <SEP> III</I>
<tb>  <I>Croissance <SEP> Pas <SEP> de <SEP> croissance</I>
<tb>  Strep. <SEP> faecalis <SEP> - <SEP>  < 0,19 <SEP> mcg/ml
<tb>  Brucella <SEP> bronchiseptica <SEP> 6,25 <SEP> mcg/ml <SEP> 12,5
<tb>  A. <SEP> aerogenes <SEP> 2 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>  E. <SEP> coli <SEP> 21 <SEP> 100
<tb>  Proteus <SEP> Sp. <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>  Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> 173 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>  M. <SEP> albicans <SEP> 8 <SEP> 100
<tb>  E. <SEP> typhosa <SEP> 344 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>  K. <SEP> pneumoniae <SEP> 132 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>  S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 134 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>  S. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 139 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb>  Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 50,19 <SEP> 0,39
<tb>  B.

   <SEP> subtilis <SEP> 219 <SEP> 0,39 <SEP> 0,78       En plus des micro-organismes susdits, cer  taines souches résistantes ont été utilisées pour  déterminer l'activité de l'antibiotique. Par  exemple, en se servant d'une souche     d'Auro-          myces        aerogenes,    qui résiste à la     chlortétracy-          cline    et au     chloramphénicol,    on constate que  la croissance se produit à une concentration  de 25     mcg    de     carbomycine    par ml de bouillon  nutritif mais qu'une croissance n'a pas lieu  pour une concentration de 50     mcg/ml.    Pour  un deuxième essai de ce genre, une souche de  A.

       aerogenes,    résistant à la fois à la strepto  mycine et à la     streptothricine,    on a constaté  également une croissance de cette souche en  présence de 25     mcg/ml    de     carbomycine    alors  qu'aucune croissance n'a lieu pour une con  centration de 50     meg/ml.    Par ailleurs, en mon  trant l'efficacité de l'antibiotique contre des  souches résistantes de ce genre, cet essai prouve    culant du bouillon nutritif contenant diverses  concentrations de l'antibiotique pur avec l'or  ganisme particulier essayé.

   Les chiffres mar  qués dans la colonne   croissance   indiquent  la concentration la plus élevée qui a été essayée  (en     mcg/ml)    pour laquelle la croissance des  micro-organismes a encore lieu. L'essai a été  fait dans les conditions normalisées, les éprou  vettes étant incubées pendant une période nor  malisée.    également que l'antibiotique est nettement dif  férent de la     chlortétracycline,    du     chloramphé-          nicol,    de la     streptothricine    et de la strepto  mycine.

   Il est également à noter que la     carbo-          mycine    est même plus active contre les souches  résistant à l'A.     aerogenes    qu'il l'est contre la  souche normale d'A.     aerogenes,    comme visi  ble dans le tableau III susdit.  



  On a constaté qu'une souche de     staphy-          lococcus        aureus    est résistante in vitro à l'action  de pénicilline à une concentration de 100 uni  tés/ml ; à la     dihydrostreptomycine    avec 100  unités/ml ;

   à la     polymixine    avec 100 unités/ml,  alors qu'elle est sensible à l'action du     chlor-          amphénicol    avec 100     mcg/ml    et à la     chlor-          tétracycline    avec 12,5     mcg/ml.    La croissance  de l'organisme en question est empêchée par       une        concentration        de        3,1        me,-        ,

  /ml        de        carbo-          mycine.         La     carbomyciné    est très efficace contre  plusieurs types de mycobactéries. Le tableau  ci-dessous donne les résultats de ces essais.  Dans ces cas, des éprouvettes, contenant un  milieu liquide de     Dubos    avec 0,5 % d'albu  mine, sont utilisées pour les essais. La     carbo-          mycine    est ajoutée au     milieu    avec des concen  trations différentes comme montré dans la pre  mière colonne du tableau suivant.

   Des éprou  vettes du milieu contenant plusieurs concentra  tions de l'antibiotique, comme indiqué, sont  
EMI0005.0006     
  
    <I>TABLEAU <SEP> IV</I>
<tb>  <I>Activité <SEP> de <SEP> la <SEP> carbomycine <SEP> contre <SEP> les <SEP> mycobactéries</I>
<tb>  <I>mcg/ml <SEP> ranae <SEP> phlei <SEP> smegmatis <SEP> 607 <SEP> berolinense <SEP> butyricum</I>
<tb>  12,5 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>   6,25 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>   3,12 <SEP>   <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>   1,56 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP>   0,78 <SEP> + <SEP>   <SEP> - <SEP>   <SEP> - <SEP>  
<tb>  0,39 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP>   <SEP>   <SEP>  
<tb>  0,

  19 <SEP> + <SEP> + <SEP>   <SEP> + <SEP>   <SEP> +       Le tableau ci-dessus montre que la     carbo-          mycine    présente un degré d'activité extraordi  naire contre ces mycobactéries.  



  On a constaté que la     carbomycine    a un ni  veau relativement bas de toxicité quand elle est  utilisée pour des essais sur des animaux. Par  exemple, la valeur     LDo,    quand l'antibiotique est  administré par injection dans les veines de souris  sous la forme d'une solution dans de l'eau aci  dulée, est approximativement égale à 7     mg/20    g  de souris. La toxicité pour d'autres espèces et  pour d'autres méthodes d'administration est  comparable.  



  La culture du micro-organisme a lieu, de  préférence, dans un milieu nutritif aqueux à  une température d'environ     24-30e.    Les milieux  nutritifs convenables pour exécuter le procédé  comprennent des hydrates de carbone, tels que  des sucres, de l'amidon, du glycérol, de la fa  rine de maïs et une source d'azote organique,  telle que la caséine, la farine de soja, la farine  d'arachides, le     gluten    de blé, la farine de grai  nes de coton, l'albumine du lait, l'extrait enzy  matique de caséine,, le     trypton.    Une source  d'agents favorisant la croissance, tels que des    ensuite inoculées avec des cultures de diverses  mycobactéries. Le nom de l'espèce est     indiqué     en tête de chacune des colonnes du tableau.

    Sous le nom des espèces on donne les résultats  de l'essai. Celui-ci a lieu en     incubant    les tubes  dans des conditions stériles pendant 18 heures.  Le manque de croissance dans les éprouvettes  à la fin de la période d'essai     normalisée    est in  diqué par (-), une croissance douteuse par  ( ) et une croissance par (+).    produits de macération solubles fournis par  les distilleries, l'extrait de levure, les résidus de  fermentation des mélasses ainsi que des sels  minéraux, tels que le     chlorure    de sodium, le  phosphate de potassium, le nitrate de sodium,  le     sulfate    de magnésium et des traces de ma  tières inorganiques telles que le cuivre, le zinc  et le fer peuvent également être utilisés avec  des résultats avantageux.

   Si une production  excessive de mousse est obtenue pendant la  fermentation, des agents     antimousse,    tels que  des huiles végétales, peuvent être ajoutés au  milieu de fermentation. Le<I>pH</I> de la fermenta  tion tend à rester constant mais, si des varia  tions se produisent, un agent tampon tel que  le carbonate de calcium peut également être  ajouté au     milieu.     



  Un     inoculum    pour la préparation de     car-          bomycine,    pour la croissance de la souche de  <I>S.</I>     halstedii,    peut être obtenu en     utilisant    des  cultures fournies par des germes de cette sou  che sur des milieux tels que     l'agar    d'Emerson  ou le lactose de     boeuf.    Les cultures peuvent être       utilisées    pour inoculer des flacons secoués ou  des cuves d'inoculation pour la culture submer-           gée.    On peut également ensemencer des cuves  d'inoculation avec le contenu de flacons se  coués.

   La croissance du micro-organisme atteint  généralement son maximum en environ 2 à  3 jours. Toutefois, la constitution     particulière     des appareils utilisés, le degré d'aération, l'im  portance de l'agitation, etc., peuvent influencer  la vitesse à laquelle l'activité maximum est at  teinte. En général, une période comprise entre  environ 24 heures et 4 jours est une période  désirable pour obtenir l'antibiotique. L'aération  du milieu dans des cuves pour la culture sub  mergée est poursuivie avec un débit d'environ  un demi à deux volumes d'air frais par volume  de bouillon et par minute. L'agitation peut être  effectuée par des agitateurs appropriés bien  connus de ceux qui s'occupent de l'industrie  de fermentation.

   Des conditions aseptiques doi  vent, évidemment, être maintenues pendant le  transfert de     l'inoculum    et pendant toute la  croissance du micro-organisme.  



  Après la croissance du micro-organisme, le       mycelium,    qui est généralement très abondant  et fin, peut être séparé du bouillon de fermen  tation en se servant de divers appareils norma  lisés, tels que des filtres-presses, des centrifu  ges, etc. On a constaté qu'en diminuant le<I>pH</I>  de l'ensemble du bouillon de fermentation jus  qu'à environ 3,0 on facilite la filtration. Comme  l'antibiotique n'est pas très stable dans des con  ditions acides, le bouillon de fermentation est  réglé de manière à être à peu près neutre quand  il a été filtré. La     carbomycine    peut être séparée  du bouillon de fermentation par un grand nom  bre de moyens différents. Tout le bouillon peut  aussi être utilisé tel quel pour l'isolement de  l'antibiotique ou il peut être séché avant cet  isolement.

   L'antibiotique peut être purifié da  vantage de différentes manières. Par exemple,  le composé peut être extrait de la solution  aqueuse à des<I>pH</I> neutres ou légèrement alca  lins, compris de préférence entre environ 6 et  environ 10 par divers solvants organiques non  miscibles à l'eau, ces solvants comprenant des  éthers, des hydrocarbures aromatiques, des  esters, des cétones, des alcools inférieurs et des  hydrocarbures halogénés. Parmi ces solvants,  on peut citer à titre d'exemples l'éther diéthyli-    que, le benzène, le toluène, l'acétate d'éthyle,  l'acétate de butyle, la     méthyl-isobutyl-cétone,     le     butanol    et le chloroforme. Même pour des  <I>pH</I> acides, certains de ces solvants extraient  une quantité appréciable de l'antibiotique.

   Ceci  est surtout vrai pour des alcools non miscibles  à l'eau, tels que le     butanol,    les     pentanols,    etc.  L'antibiotique peut être extrait de la plupart  des solutions avec un solvant et après avec de  l'eau acidulée, de préférence à un<I>pH</I> inférieur  à environ 2,5. Si on le désire, l'extrait dans le  solvant peut être concentré avant l'extraction  avec l'eau acidulée. En réglant le<I>pH</I> pour la  neutralité ou l'alcalinité, l'antibiotique peut être  extrait à nouveau avec un des solvants. Après  l'évaporation du solvant et concentration de la  solution, l'antibiotique forme des cristaux. Il  cristallise généralement sous la forme d'aiguil  les blanches épointées. Toutefois, dans certains  cas, on obtient des cristaux en paillettes.

   Le  produit peut être recristallisé à nouveau dans  le benzène, l'éther, des cétones inférieures ou  des alcools inférieurs. Si on le désire, une solu  tion dans un des alcools ou cétones miscibles  à l'eau est concentrée et de l'eau est ajoutée  pour faciliter la cristallisation. L'antibiotique  peut encore être isolé par adsorption du bouil  lon ou des produits concentrés par du charbon  activé. Une reprise dans de l'acide ou dans  l'eau, en même temps qu'avec un solvant misci  ble à l'eau contenant de l'acide, permet d'ob  tenir le composé sous une forme purifiée.  



  La     carbomycine    est un composé organique  blanc et faiblement basique qui est soluble dans  des acides aqueux dilués mais elle est seulement  légèrement soluble dans l'eau (environ  0,5 mg/ml). Elle est extrêmement soluble dans  plusieurs solvants organiques tels que l'acétone,  l'éther, le benzène, le chloroforme et le     dioxane     et un peu moins soluble dans le méthanol et  l'éthanol. Elle est insoluble dans     l'hexane.    En  concentrant une solution de     carbomycine    dans  un solvant, on tend à former des solutions sur  saturées et les cristaux qui se forment ont une  tendance à retenir un peu du solvant utilisé. La  stabilité du composé diminue dans des solu  tions fortement acides et basiques, même à la  température ambiante.

   Le composé est très      instable après chauffage dans des solutions  acides et alcalines et sa stabilité est maximum  avec un<I>pH</I> compris entre 3 et 7. Sa stabilité  à l'état sec ou après dissolution dans des sol  vants secs est bonne.  



  Un produit de base cristallisé et fortement  purifié, comme celui obtenu par quatre     recris-          tallisations    dans des solvants tels que l'éthanol,  le benzène, etc., tend à se présenter à l'état de  cristaux imprégnés de solvants dont on peut  séparer le solvant, d'une manière plus ou moins  complète, par un séchage sous vide à     100,).     Quand une telle matière est séchée dans ces  conditions pendant trois heures, elle fond à  217-218 avec légère décomposition. L'échan  tillon est introduit à     196o    dans le bain, qui sert  à la détermination du point de fusion, et la  température du bain est augmentée à une vi  tesse de     3,6,1    par minute.

   La matière anhydre  cristallisée forme un     monohydrate    quand elle  est exposée à l'humidité atmosphérique. Ce       monohydrate    analysé a la composition sui  vante : carbone = 59,01 ; hydrogène = 8,35 ;       azote=1,66;    oxygène (par     différence)=30,98.     



  Le produit de base cristallisé, fortement  purifié et séché sous vide à 1000, pendant trois  heures, présente à l'analyse la composition sui  vante : carbone = 60,04 ; hydrogène = 8,24 ;       azote=1,55;    oxygène (par     différence)=30,17.     



  La rotation optique de la matière est     d'en-          viron        [a],,=-55(l        (solution    à     1%        dans        du     chloroforme). En titrant le composé dans un  mélange de deux volumes de     diméthyl        forma-          mide    et un volume d'eau, on obtient un       pKca   <I>= 6,4</I> et un poids moléculaire d'environ  866.

   Le spectre d'absorption ultraviolet du  produit de base, quand il est dissous dans  l'éthanol, a deux maxima, dont un se présente  à 240 m     ic        (F    = 16,080) et l'autre à 327,5 m     ,u          (#-    = 113). Quand le produit de base cristallisé  et anhydre est dissous dans le chloroforme, il a  un certain nombre de sommets caractéristiques  dans la région de l'infra-rouge. Parmi ces som  mets, on peut citer les fréquences suivantes (en       cm-')    : 3510, 2920, 1732, 1690, 1630, 1460,  1375, 1300,<B>1</B>230, 1161, 1122, 1077, 1052,  1025, 1015, 976, 916, 910, 873 et 837. Le  spectre infrarouge est montré sur le dessin ci-    annexé.

   Le diagramme du dessin indique en  abscisses supérieures les fréquences f en       cm-'    avec, en abscisses inférieures, les lon  gueurs d'ondes     Â    en microns     ,u    et en ordonnées  les valeurs de     transmittance    en     Vo.     



  Plusieurs micro-organismes différents peu  vent être utilisés pour déterminer l'activité des  préparations de     carbomycine.    Ils comprennent  le K.     pneumohiae,    le<I>B.</I>     subtilis;    le     Staph.        au-          reus    et d'autres organismes d'essais normalisés.  Quand on utilise le<I>K.</I>     pneumoniae,    on peut se  servir dé l'essai pour la mesure de la turbidité  ou de l'essai à la plaque. Du     chloramphénicol     cristallisé peut être utilisé comme repère en  accordant une valeur de 1000 unités/mg à cet  antibiotique.

   Sur cette base, la     carbomycine     cristallisée a une activité de 750 à 850 unités  de     chloramphénicol    par mg. La     carbomycine     venue de fermentation montre une activité d'en  viron 15 à environ 100 unités/ml.  



  Les exemples ci-dessous montrent comment  peut être réalisée l'invention.    <I>Exemple 1</I>    Des spores d'un germe de S.     halstedii          NRRL-2331,    obtenu sur de     l'agar    d'Emerson,  sont transférés, dans des conditions aseptiques,  dans un milieu nutritif ayant la composition sui  vante         cérélose    10 g  farine de soja 10  chlorure de sodium 5  solubles de distillerie 5 .  carbonate de calcium 1    Le mélange est dilué jusqu'à avoir le vo  lume d'un litre et son<I>pH</I> est réglé jusqu'à être  égal à 7 avec de la     potasse7    caustique avant la  stérilisation. Quand le milieu a refroidi, on  ajoute les spores.

   On cultive l'organisme dans  des     flacons    secoués pendant deux jours à envi  ron     28 .    Le bouillon contenant le     mycehum    est  ensuite transféré dans un milieu     stérile,    ayant  un volume vingt fois plus grand et la composi  tion suivante  amidon 20 g  caséine 10  farine de soja 15  carbonate de calcium 1      Ce mélange est dilué jusqu'à faire un litre  et son<I>pH</I> est réglé à 7 avant l'introduction dans  l'autoclave et l'ensemencement. Après agitation  et aération, dans des conditions stériles pendant  deux jours, l'activité du bouillon est de 100 uni  tés/ml. Le<I>pH</I> du mélange est réglé à 3,0 et  le     mycelium    est enlevé par filtration.

   Le<I>pH</I>  du filtrat est réglé à 6,5 et celui-ci est ensuite  extrait deux fois avec un quart de volume de       méthyl-isobutyl-cétone.    Les phases solvant  mélangées sont concentrées à un dixième de  volume sous vide. L'antibiotique est ensuite  extrait avec de l'eau à un<I>pH</I> d'environ 2,0 en  se servant d'acide sulfurique pour régler le<I>pH.</I>  La phase aqueuse est séparée, lavée avec un  petit volume de benzène pour enlever la cétone  dissoute" et le<I>pH</I> de la phase aqueuse est réglé  à 6,5. L'antibiotique est extrait plusieurs fois  à l'éther et les phases éther séparées sont sé  chées sur du sulfate de sodium anhydre. Le  solvant est enlevé par distillation et l'antibioti  que cristallise sous forme d'aiguilles blanches.

    Le produit est recristallisé en le dissolvant dans  l'acétone, il est filtré et concentré, après quoi  on ajoute de l'eau. Le produit obtenu est très  efficace contre une variété de mycobactéries  et de micro-organismes gram-positifs.    <I>Exemple 2</I>    Un milieu est préparé ayant la composition  suivante    Amidon 20 g  solubles de distillerie 10 g  farine de soja 15 g    Le mélange de ces matières est ajouté à un  litre d'eau et le<I>pH</I> est réglé à 7 avant l'addi  tion d'un gramme de carbonate de calcium. Le  milieu est alors introduit dans un autoclave et    est ensemencé avec un     inoculum    S.     halstedi     <I>NRRL-2331</I> dans des conditions stériles. Le  mélange est soumis à une aération et à une  agitation dans des conditions stériles à envi  ron 280 pendant deux jours.

   On constate,     i     l'essai, que le bouillon filtré contient 25 unité;  de     carbomycine    par millilitre de solution.  



  L'antibiotique sera mis sur le marché soin  la marque       MAGNAMYCINE      déposée     pai     la titulaire.

Claims

REVENDICATION Procédé de fabrication d'un nouvel anti biotique, caractérisé en ce qu'on cultive le Streptomyces halstedii NRRL-2331 dans un milieu nutritif aqueux dans des conditions aéro bies et en submersion. L'antibiotique obtenu est un composé or ganique blanc et faiblement basique, qui pré sente un point de fusion 217-218,) C et, en dis solution dans l'éthanol, des maxima dans son spectre d'absorption ultraviolet à 240 m p. (e = 16,080) et 327,5 m ,u (e = 113). SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on procède à la culture, en agitant, à une température de 24 à 300 pendant une période de 1 à 4 jours. 2.

Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on sépare l'antibiotique du bouil lon de fermentation. 3. Procédé selon la revendication, caracté risé en ce qu'on sépare l'antibiotique du bouil lon de fermentation par filtration de ce bouillon et par extraction avec un solvant à unpH com pris entre 6 et 10.