Procédé de préparation d'un vaccin de virus de poliomyélite
La présente invention concerne un procédé de préparation d'un vaccin de virus de poliomyélite par propagation et modification du virus de la poliomyélite, de telle sorte que l'on puisse le transformer et l'utiliser sous forme d'un vaccin vivant sûr et efficace. On peut éga- lement préparer à partir du virus propagé et modifié, comme il est décrit, des vaccins du type tué non infectieux.
La poliomyélite est une affection à virus neurotropique qui attaque de nombreux êtres humains avec parfois des résultats particulièrement navrants. On sait très mal comment cette affection se propage et il est difficile de prendre des mesures préventives. L'examen de nombreux sujets indique qu'un assez grand pourcentage de la population a des anticorps de la poliomyélite, ce qui indique qu'ils ont été infectés pendant un certain moment par le virus, probablement sans qu'on le sache. Ces sujets, qui subissent des infections subcliniques, peuvent ne pas comprendre la nature de leur maladie et propager inconsciemment l'affec- tion à d'autres sujets qui peuvent en souffrir plus sévèrement.
Actuellement, il n'existe aucun moyen efficace de prévenir et de contrôler la poliomyélite.
On ne connaît actuellement aucun agent chimio-thérapeutique et aucun antibiotique qui puisse affecter le cours de la maladie. De toute façon, de tels agents seraient précieux, principalement pour aider dans la remise sur pied du malade, mais auraient peu d'effet sur le controlle de la contagion de l'affection à d'autres.
La globuline gamma, que l'on obtient à partir des êtres humains, est un moyen inadéquat et ne confère au mieux qu'une période temporaire de protection. On a proposé des vaccins tués de virus virulents de poliomyélite, mais ils ne se sont pas révélés satisfaisants à cet effet.
On considère que les vaccins de virus vivants sont les moyens les plus efficaces de prévention et de contrôle des infections par virus.
Ils confèrent une immunité plus prolongée que les vaccins tués ; le malade immunisé par eux peut résister à une infection plus virulente et ils sont meilleur marché à produire car de plus petites quantités confèrent l'immunité. Certains vaccins tués sont relativement inefficaces, tandis que les vaccins de virus vivants provoquent le développement d'anticorps protecteurs comparables à ceux que l'on rencontre dans les infections naturelles.
On ne peut pas administrer la plupart des agents virus non modifiés sous forme de vaccins vivants en raison de l'extrême pathogénicité de beaucoup de ces virus. Ceci a été surmonté dans beaucoup de cas par modification de la pathogénicité de l'agent de virus par des moyens chimiques ou physiques. Un procédé couramment employé consiste à propager le virus chez un hôte non naturel, de sorte qu'après un certain temps il est modifié de telle sorte qu'il donne naissance à des anticorps qui, injectés à des animaux non immunisés, ne provoquent pas les sévères manifestations pathologiques du cours normal de la maladie.
Bien qu'on ait modifié un grand nombre d'agents virus par ce processus général, un petit nombre, comprenant le virus de la poliomyélite, n'ont pas encore été modifiés avec succès par propagation chez un hôte non naturel.
La poliomyélite est une infection naturelle des primates. Il est difficile de propager ce virus chez d'autres animaux. Bien qu'on l'ait adapté à la croissance chez les rongeurs, on n'a pas signalé de changement marqué dans sa virulence ou ses caractéristiques de croissance.
Le virus de la poliomyélite est l'un des rares qui a ainsi résisté fortement aux efforts qu'on a déployés pour le faire croître dans du tissu vivant d'embryon de poulet, bien que l'on ait réalisé de nombreuses tentatives dans ce sens sans succès. Les raisons de ces échecs dans les tentatives de propagation du virus de la poliomyélite dans les oeufsjsn incubation ne sont pas connues. Plusieurs facteurs y contribuent probablement, dont l'un peut être son faible titre
LD50 par comparaison aux autres agents de virus neurotropiques.
Le procédé selon l'invention pour la prépa- ration d'un vaccin de virus contre la poliomyélite pour l'immunisation des primates est caractérisé en-ce qu'on modifie le virus de poliomyélite par passage en série dans des rongeurs à la mamelle jusqu'à ce qu'il soit devenu susceptible de se développer dans les embryons de volaille, on isole le virus modifié à partir du tissu nerveux des rongeurs, on inocule le virus de poliomyélite modifié à des embryons de volaille et, après une période d'incubation dans ces embryons de volaille, on récolte le tissu embryonnaire et on en récupère le virus de poliomyélite, on poursuit les opérations d'inoculation, d'incubation et de récolte jusqu'à ce que le virus soit modifié de telle sorte qu'on puisse l'administrer à des primates par ingestion orale sans provoquer de maladie,
mais avec production d'anticorps protecteurs, puis on prépare le vaccin de poliomyélite à partir du tissu embryonnaire récolté au passage final.
Il est ainsi possible de modifier d'abord le virus de poliomyélite par une série de passages chez des rongeurs à la mamelle jusqu'à ce qu'il soit devenu adapté à la croissance dans les embryons de poulet. De préférence, ce processus consiste dans une série de passages de virus virulents de poliomyélite chez des rongeurs à la mamelle jusqu'à ce que le titre LD50 sur souris ait atteint une valeur d'au moins 10-5 calculé par la formule de Reed-Muench (Amer. Jour.
Hyg. 1938, 27, 493-7).
On obtient facilement à partir de diverses sources des souches de virus de poliomyélite qui se propagent dans le tissu nerveux central des rongeurs. Cette matière, habituellement sous forme d'une suspension aqueuse du tissu nerveux broyé véhiculant la semence de virus, est inoculée intracérébralement chez des rongeurs à la mamelle, de préférence des hamsters d'environ 1 à 12 jours. L'utilisation d'autres rongeurs à la mamelle et d'autres âges pour l'ac- cumulation du titre LD50 chez la souris et son adaptation à la croissance dans un tissu d'oeuf embryonnaire n'est pas exclue. On laisse croître ce virus chez les rongeurs à la mamelle jusqu'à ce qu'on observe des symptômes chez au moins certains des animaux inoculés.
Ce temps, qui est de l'ordre de 48 heures au début de la série de passages, est ensuite réduit de 18 à 24 heures au fur et à mesure que le virus est modifié par les passages chez les rongeurs à la mamelle.
Quand les symptômes de maladie sont présentés par certains des nourrissons inoculés, on sacrifie la totalité, on prélevé leur tissu nerveux central, on les met en suspension habituellement dans une solution saline isotonique et l'on poursuit une nouvelle inoculation de la manière décrite.
Un point important, en plus de l'utilisation des rongeurs à la mamelle, est la récolte du tissu infecté juste avant le moment auquel com mencent à se présenter des symptômes de paralysie. On a observé qu'il existe, à un moment précédant les symptômes visibles de paralysie, une plus grande concentration de particules de virus vivant dans le tissu nerveux. Par suite, en sacrifiant les rongeurs à la mamelle juste avant qu'ils ne présentent ces symptômes, il est possible d'obtenir une plus grande concentration de particules de virus à partir de leur tissu nerveux. Un mode commode d'établir le moment de la récolte du tissu nerveux central consiste à inoculer un certain nombre de rongeurs à la mamelle au même moment et à récolter le tissu nerveux infecté de tout le groupe quand le premier présente des signes cliniques de maladie.
De cette façon, on sacrifie la majorité des rongeurs restants et l'on prélève leur tissu nerveux à un moment où le titre du virus est voisin du maximum.
On répète en série le processus d'inoculation de rongeurs à la mamelle, de préparation d'une suspension de leur tissu nerveux et d'inoculation de nourrissons non immunisés de la manière décrite en observant constamment le titre Lu50 sur la souris de la suspension résul- tante. On trouve qu'il résulte de ce mode de préparation de virus que le titre LDjo sur souris de la préparation montre une tendance persistante à augmenter jusqu'à des niveaux aussi élevés que 10-5, et même 10-7, par des séries de passages répétées.
Quand le titre LD50 sur souris de la suspension préparée à partir du tissu nerveux central a atteint une valeur d'au moins 10-5, on peut transférer le virus à des oeufs en incubation de la manière décrite ci-après, puis le faire passer en série dans 1'embryon de poulet jusqu'à ce que le virus ait été modifié de telle sorte qu'on puisse l'utiliser avec sécurité comme vaccin vivant pour la prévention de la poliomyé- lite chez les humains et autres primates.
Dans le but de mieux faire comprendre l'in- vention, on va maintenant la décrire en se référant aux exemples particuliers suivants de passages en série du virus chez des hamsters à la mamelle et des embryons de poulet.
On prélève les cerveaux de deux souris ayant été infectés par la souche MEF-1 du virus de poliomyélite de type Lansing, on les met en suspension dans un mélange à parties égales de glycérol et d'eau et l'on réalise la suspension par broyage. On injecte cette suspension à des souris saines. Quand ces souris sont paralysées, on les tue, on prélève leur système nerveux central, on le broie dans une solution saline aqueuse isotonique et l'on injecte la suspension du tissu dans les cerveaux d'autres souris. On répète ce processus pendant neuf séries de passages dans des souris blanches de Suisse.
On injecte une suspension de tissu nerveux central provenant du neuvième passage chez des souris blanches de Suisse dans les cerveaux d'hamsters de Syrie (dorés) de 6 à 8 semaines.
Quand ces hamsters deviennent paralysés ou partiellement paralysés, on les tue et l'on broie leur système nerveux central en une suspension que l'on injecte dans les cerveaux d'autres hamsters du même âge. On poursuit ce processus pendant treize séries de passages et, au bout de ce temps, on trouve que le titre LD50 du virus ne varie pas considérablement d'un passage à l'autre une fois que la croissance a dé- buté dans les hamsters de cet âge. Le titre LDfio ne varie que de 10-2 à 10-3, tel qu'on le calcule par la formule de Reed-Muench.
A ce moment, on met en suspension les tissus nerveux centraux obtenus à partir des hamsters vieux de 6 à 8 semaines en broyant l'ensemble du cerveau et de la moelle épinière dans un broyeur Ten-Broeck dans les proportions de 1 g de tissu frais pour 9 cc de solution de Ringer pour obtenir une suspension à 10 /o.
La solution de Ringer utilisée contient 9 g de chlorure de sodium, 0, 3 g de chlorure de potassium, 0, 2 g de chlorure de calcium et 0, 2 g de bicarbonate de sodium dans 1 litre de solution.
On centrifuge la suspension obtenue par déchiquetage du tissu nerveux, pendant 30 minutes, dans une centrifugeuse de marque International N 1 à environ 2500 tours/minute. On utilise alors la suspension pour l'injecter à des hamsters à la mamelle comme il est décrit ciaprès.
On injecte une quantité de 0, 03 cc de la suspension à 10 ouzo ci-dessus intracérébrale ment dans chacun de 20 hamsters à la mamelle non sevrés de Syrie de 10 jours. Environ 48 heures plus tard, deux des animaux montrent des signes de maladie, et le troisième jour deux autres des animaux sont, de même, malades. Le jour où l'on note pour la première fois des symptômes, on tue les quatre animaux affectés, on prélève leur cerveau et leur moelle épinière et on les met en suspension à 10 10/o comme décrit ci-dessus. On congèle la suspension et on la conserve à - 15 avant de la soumettre à un essai pour en déterminer la stérilité bacté- rienne, la suspension étant alors prête pour une nouvelle utilisation.
Après l'essai de stérilité, on décongèle la suspension congelée et l'on en injecte 0, 03 cc dans les cerveaux d'autres hamsters à la mamelle non sevrés de 1 à 12 jours d'âge. On répète le processus de récolte comme il est décrit ci-dessus et l'on poursuit l'inoculation des autres hamsters à la mamelle par passages en séries. Dans certains cas, on utilise une solution saline isotonique pour préparer la suspension de virus au lieu de la solution de Ringer. D'autres fois, on ne récolte que le cervelet et la moelle épinière des hamsters à la mamelle infectés.
Au fur et à mesure que l'on poursuit les séries de passages, on trouve que le temps entre l'injection intracérébrale et les premiers symptômes de la maladie se raccourcit progressivement, de sorte qu'après un certain nombre de séries de passages, on récolte le tissu nerveux central approximativement 18 à 24 heures après l'inoculation au lieu de deux ou trois jours au commencement des séries.
Pendant la série de passages, on détermine constamment le titre LDso de la suspension de tissu. On a fait la constatation surprenante que le titre LD50 présente des accroissements définis. Ceci peut être illustré par le tableau suivant :
EMI4.1
Passage
<tb> par <SEP> hamster
<tb> Titre
<tb> LD50
<tb> Passage
<tb> par <SEP> hamster
<tb> Titre
<tb> LD50
<tb> Passage
<tb> par <SEP> hamster
<tb> Titre
<tb> LD50
<tb>
EMI4.2
<SEP> 1 <SEP> 10-2,65 <SEP> 45 <SEP> 10-5,50 <SEP> 85 <SEP> 10-6,70
<tb> <SEP> 5 <SEP> 10-2,60 <SEP> 50 <SEP> 10-5,20 <SEP> 90 <SEP> 10-560
<tb> 10 <SEP> 10-2,75 <SEP> 55 <SEP> 10-5,50 <SEP> 100 <SEP> 10-6,00
<tb> 15 <SEP> 10-4,00 <SEP> 60 <SEP> 10-4,80 <SEP> 105 <SEP> 10-6,25
<tb> 20 <SEP> 10-4,10 <SEP> 65 <SEP> 10-5,25 <SEP> 110 <SEP> 10-7,00
<tb> 25 <SEP> 10-4,75 <SEP> 70 <SEP> 10-5,
25 <SEP> 115 <SEP> 10-6,35
<tb> 30 <SEP> 75lO-s-so12010-5 <SEP>
<tb> 35 <SEP> 10-5,50 <SEP> 80 <SEP> 10-6,00 <SEP> 125 <SEP> 10-6,65
<tb> 4010-5, <SEP> 35130l0-o <SEP>
<tb>
Le premier passage dans des hamsters de 7 à 10 jours constitue le résultat de l'inoculation des animaux par une matière représentant le trente-deuxième passage en série chez des hamsters vieux de 6 à 8 semaines.
On voit d'après ce qui précède que le résultat du processus d'inoculation d'hamsters à la mamelle non sevrés et de récoltes de leur tissu nerveux central au moment où un premier animal ou les deux premiers présentent des signes de maladie, qu'il est possible de développer une souche de virus de poliomyélite ayant un titre
LD50 considérablement supérieur à toute valeur déjà indiquée.
On obtient la preuve que le virus conserve les caractéristiques de la souche Lansing de virus de la poliomyélite par des tests standard de neutralisation employant des antisérums spécifiques connus.
Dans une autre série de passages du virus chez des hamsters à la mamelle, on prépare une suspension à 10 ouzo de tissu nerveux provenant du vingt-troisième passage chez des bébés hamsters comme il est décrit ci-dessus et l'on injecte intracérébralement 0, 02 cc de la suspension chez des hamsters de trois jours. Quand les hamsters deviennent paralysés, le second jour après l'injection, on les sacrifie et l'on récolte leur cerveau et leur moelle épinière et l'on en fait une suspension de tissu comme il est décrit ci-dessus. On poursuit cette série de passages en raccourcissant le temps d'incubation du virus à environ 24 heures.
Le titre
LD50 sur souris de cette série présente la même valeur irrégulière, mais croissante, jusqu'à environ 10-625 au 8le passage en série avec un accroissement du titre jusqu'à plus de 10-7 au 115"'passage. Le virus venant du tissu nerveux central conserve également les caractéristiques sérologiques du virus de poliomyélite, comme le prouvent les tests de neutralisation utilisant un antisérum de singe efficace contre la souche
Lansing de poliomyélite.
On a fait la constatation surprenante que le virus de bébé hamster ainsi décrit est modifié à la suite de cette série de passages, de telle sorte qu'il perd son aptitude à provoquer une maladie nette chez les primates. Quand on inocule à des singes Rhésus intracérébralement 1 cc d'une suspension à 10 /o de virus de po liomyélite non modifié, invariablement ils deviennent prostrés et meurent. Par comparaison on peut inoculer intracérébralement à des singes Rhésus le virus modifié en série décrit ci-dessus et cependant ils se remettent généralement sans aucun symptôme de maladie et seulement des cas isolés de décès.
Malgré la modification du virus provoquée par une série de passages chez les hamsters, par laquelle sa virulence pour les primates est notablement diminuée, il n'a pas perdu sa capacité à déclencher la formation d'anticorps. Par exemple, quand on soumet des singes Rhésus à une injection intramusculaire de 4 cc d'une suspension à 10 ouzo de matière préparée à partir du cerveau et de la moelle épinière d'hamsters à la mamelle au 63e passage, laquelle suspension a un titre LDso sur souris de 10-5, le sérum de singe obtenu un mois après injection contient des anticorps de la poliomyélite. De même, on a introduit chez des chimpanzés le virus d'hamsters à la mamelle provenant des 82e, 84e et 94e passages en série à des intervalles d'approximativement un mois et trois mois respectivement.
On a trouvé que le sérum obtenu à partir des chimpanzés neutralise le virus homologue, ce qui établit le fait que l'on peut donner naissance à des anticorps de la poliomyélite en absorbant un vaccin de virus vivant. Le sérum prélevé sur les chimpanzés avant l'injection du virus ne neutralise pas le virus homologue de poliomyélite.
Les essais avec des souris au 119"passage sur jeune hamster indiquent que le virus a un titre LD d'environ 10"s. 5. On prépare une suspension à 10 /o de moelle épinière de souris paralysées inoculées par une matière provenant du 119e passage par hamster et l'on en inocule 0, 6 cc dans le sac à jaune d'embryons de poulet de sept jours.
Le quatrième jour après l'inoculation on récolte les embryons, on prépare une suspension contenant environ 75 O/o d'embryons et on l'essaie à nouveau sur des souris par injection intracérébrale. On trouve que le titre LD50 de la suspension d'embryons de poulet préparée est un peu inférieur, à savoir environ 10-2 5. Cependant, tous les animaux inoculés deviennent paralysés quatre à six jours après l'inoculation, moment auquel on les sacrifie, on prépare une suspension à 10 ouzo de leur moelle épinière et l'on injecte des portions de 0, 6 cc dans le sac à jaune d'embryons de poulet de sept jours comme précédemment.
On récolte à nouveau les embryons, on les met en suspension et on les essaie sur les souris. Le titre LD50 reste approximativement constant.
On prépare des suspensions du tissu nerveux des souris et on les inocule dans le sac à jaune d'oeufs en incubation. Le septième jour après l'inoculation, on récolte les embryons, on prépare une suspension de la matière réunie et on l'inocule dans le sac à jaune d'embryons de poulet, comme précédemment.
On poursuit l'inoculation des embryons de poulet en série en vérifiant de temps en temps le titre LD50 sur souris. Au fur et à mesure que l'on poursuit des séries de passages dans les oeufs'on on trouve que le virus conserve sa patho génicité pour les souris mais que, quand on l'injecte intracérébralement chez les singes, il est moins virulent que la souche parente, ce qui montre la propagation satisfaisante du virus dans le tissu d'embryons de poulet et une réduction de la virulence du virus par la suite de passages en série chez les embryons de poulet.
Dans une autre série de passages chez les embryons de poulet, on inocule des embryons de sept jours dans la cavité allantoïque par 0, 25 cc d'une suspension à 20 zozo de tissu nerveux central infecté récolté chez des hamsters à la mamelle au 131e passage, comme décrit cidessus. On incube ces oeufs à 370 pendant sept jours, après quoi on récolte les embryons et les membranes aseptiquement, on les réunit, on les broie dans un mélangeur Waring et on les centrifuge à 2000 tours/minute pendant 20 minutes dans une centrifugeuse Anglehead.
On prépare une suspension à 20 ouzo du tissu broyé provenant du premier passage par oeuf et on l'inocule dans la cavité allantoïque d'embryons de poulet de sept jours et l'on poursuit l'incubation pendant sept jours à 37 . On réalise ainsi 10 passages successifs par oeuf en utilisant des embryons de sept jours et une pé- riode d'incubation de sept jours à 370.
Tandis que l'on poursuit ces passages par oeuf on réalise des titrages sur souris de la suspension préparée à partir du tissu embryonnaire infecté. On trouve que le virus se propage dans les oeufs en incubation. Par ailleurs, on trouve qu'une période d'incubation de 4 à 5 jours à 370 après inoculation dans la suspension de virus donne un titre LD50 sur souris plus élevé dans le tissu embryonnaire que celui qu'on obtient pendant la période d'incubation de sept jours. Par suite, on utilise des périodes d'incubation plus courtes dans les passages par oeuf successifs. Au fur et à mesure que l'on poursuit les séries de passages dans les tissus embryonnaires, on observe que le titre LDso sur souris montre une nette tendance à augmenter.
On obtient la preuve de l'identité de l'agent propagé sur oeuf avec le virus de poliomyélite du type Lansing par l'essai de neutralisation sur souris réalisé à différents niveaux de passage par oeuf avec du sérum de singe sain de type connu provenant des différentes sources. Des études de contre-neutralisation sur souris montrent que des anticorps stimulés dans des singes par des virus de poliomyélite des types Brunhilde et Leon neutralisent le virus du type
Lansing propagé sur oeuf à un degré suggérant une certaine relation sérologique avec la souche parente obtenue par les passages en série sur oeuf.
D'autres tests ayant trait à la virulence du virus pour les primates montrent qu'il est modifié par les passages en série dans du tissu embryonnaire d'oeuf au point que l'on peut l'utili- ser comme vaccin de virus vivant, de préférence pour l'administration par voie buccale.
Les avantages de la propagation du virus de poliomyélite dans 1'embryon de poulet sont évidents pour les spécialistes de la question.
Quand on prépare des vaccins de virus vivants à partir du tissu central nerveux d'animaux, il existe le danger toujours présent que l'animal puisse être infecté par quelque autre affection neurotropique et que l'on puisse ainsi inoculer au patient certains pathogènes qui pourraient provoquer une maladie ou même la mort. Malheureusement, il n'est pas toujours possible de détecter ces contaminations avant que le mal ait été fait et des accidents de ce type, ainsi que des attaques d'encéphalite allergique se sont produits quand on a utilisé des vaccins préparés à partir de tissu nerveux central d'animaux.
Quand on utilise des embryons de poulet, le milieu de culture est exempt d'agents potentiellement pathogènes pour l'homme et il y a peu de danger de récolter un organisme contaminant en même temps que le tissu d'embryons de poulet à partir duquel on prépare le vaccin de virus vivant. De plus, étant un hôte non naturel pour la plupart des agents de virus, le tissu embryonnaire de poulet se compose remarquablement bien pour la modification du virus au point désiré de sécurité. En outre, on dispose d'une façon illimitée d'oeufs fertiles que l'on peut se procurer facilement à toute époque de l'année et qui sont relativement peu coûteux par comparaison avec les animaux. Bien que l'on puisse utiliser des oeufs d'autres volailles, on préfère ceux de poule en raison de leur bas prix et du fait qu'ils sont à peu près constamment disponibles.
Pour ces raisons, ainsi que d'autres, on considère comme un progrès net dans la technique de propager du virus de poliomyélite dans du tissu d'embryon de poulet.
On peut suivre diverses méthodes de croissance du virus de poliomyélite dans les embryons de poulet. Le point d'inoculation peut être la membrane chorio-allantoïque, le sac allantoïque, le sac à jaune ou autre part. La période d'incubation peut varier de 2 à 10 jours ou plus en tenant compte naturellement de la production la plus efficace de corps virulents, ce qu'on détermine par des essais de titration sur les souris. Comme on l'a noté ci-dessus, on préfère une période d'incubation de 2 à 7 jours après l'inoculation. L'âge de 1'embryon au moment de l'inoculation peut de même largement varier depuis environ 1 à 12 jours.
Le volume de l'inoculum peut également varier considérablement, mais il est généralement de l'ordre de 0, 05 à 0, 8 cc, de préférence d'environ 0, 2 à 0, 5 cc. La matière récoltée contenant le virus désiré peut consister dans 1'embryon tout entier ou si on le désire, certaines parties de celui-ci, telles que la membrane chorio allantoïque, le fluide allantoïque ou le sac à jaune. Ces points peuvent être facilement dé- terminés par les spécialistes de la question avec très peu d'expérimentation en suivant les indications fournies ici.
Pour préparer un vaccin de virus vivant à partir du tissu embryonnaire, on le récolte de la manière décrite ci-dessus, puis on le broie en suspension avec une solution isotonique saline de Ringer ou tout autre agent de suspension classique. Si on le désire, on peut centrifuger la matière pour éliminer les tissus grossiers.
Comme la route préférée d'inoculation est l'in- gestion par voie buccale, le vaccin peut être constitué simplement par le tissu embryonnaire broyé que l'on peut administrer directement ou de préférence dans du lait, du chocolat ou toute autre nourriture. Environ 1 à 5 cc du tissu embryonnaire broyé de 20 à 50 ouzo constitue normalement une dose d'immunisation du vaccin de virus vivant. On peut répéter le processus d'immunisation à intervalles de 1 à 3 mois ou plus jusqu'à ce qu'on atteigne le niveau désiré d'anticorps chez le patient.
Si l'on désire préparer un vaccin de virus tué, on peut traiter le tissu embryonnaire infecté par de la formaline, du phénol, de l'oxyde d'éthylène ou tout autre agent chimique ou physique désactivant qui détruit le virus sans affecter son antigénicité.
Par exemple, on peut traiter une suspension de 20 à 50 ouzo de tissu embryonnaire de poulet par de la formaline au taux d'environ 0, 1 à 0, 2 ouzo en poids par rapport au volume de la totalité de suspension de tissu. On maintient ensuite cette préparation jusqu'à ce que toutes les particules de virus soient désactivées. A la place de la formaline, on peut utiliser du phénol au taux de 0, 4 O/o en poids ou de l'oxyde d'éthylène en quantité d'environ 0, 05"/o à 2, 5 /0. On préfère en réalité ce dernier en raison du fait qu'il désactive réellement le virus dans les 48 heures. On peut éliminer l'excès d'oxyde d'éthylène par évaporation quand des essais sur souris montrent que le virus n'est plus pathogène.