Verfahren zur Reinigung von Konzentraten der Vitamine der B12-Gruppe
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigemg von Konzentraten, die die Vitamine der B12-Gruppe enthalten, mittels phenolischer Verbindungen.
Die Vitamine der B12-Gruppe sind bekanntlich in der Na. tuer weit verbreitet, vor allem als Erzeugnisse mikrobieller Tätigkeit, cloeh kommen sie stets nur in au¯erordent lich kleinen Mengen vor. Der erste Verfah renssehritt zur Gewinnung der Vitamine der B12-Gruppe aus den versehiedenen Naturprodukten ist die Herstellung von Konzentraten. Diese Aufgabe gelingt z. B. in der Weise, dass man aus dem Ausgangsmaterial einen wässrigen Extrakt herstellt, diesen mit einem Adsorptionsmittel, wie z. B. Aktiv- kohle, behandelt und das Adsorbat mit wäss rigen Alkoholen eluiert.
Nach dem Einengen des Eluates im Vakuum auf ein kleines Volumen erhält man ein hochaktives Konzentrat der Vitamine der B12-Gruppe.
Derartige Konzentrate können nun in verschiedener Weise auf ; earbeitet werden, so z. B., indem man die wässrigen Lösungen des antianämischen Faktors mit Phenol extrahiert. Bei einem neueren Verfahren wird in der Weise vorgegangen, dass die vitamin-Bl2- haltige Losung bei einem. pg-Wert von 1, 0 mit einem alkylierten Phenol, vorzugsweise o-Amyl-phenol, extrahiert wird. Ein weiteres Verfahren beruht darauf, dass ein vitamin Bl2-haltiges wässriges Konzentra. t mit einer Mischung von Phenol und einem apolaren Lösungsmittel, wie Chloroform, Benzol, Toluol usw., , ausgesch ttelt wird.
Schliesslich wurde an Stelle von Phenol auch Kresol, also gleich- falls ein alkyliertes Phenol, zur Extraktion von Vitamin B12 aus wϯrigen L¯sungen verwendet.
Die weitere Reinigung dieser Konzentrate beruht auf uf der Überführung des Vitamins B12 aus der phenolhaltigen organischen Phase in die wässrige Phase. Dies geschieht aussehliess- lich entweder durch Zusatz grosser Mengen von Fl ssigkeiten, die als solche das Vitamin B12 nicht lösen und zugleieh mit Wasser nicht mischbar r sind, wie z. B.. Athyläther, Pe- trolÏther, Chloroform, oder aber durch Entfernen des Phenols durch Wasserdampf clestillation.
Die eingangs erwähnten, durch Einengung der Eluate herstellbaren, wässrigen Konzentrate können auch in der Weise aufgearbeitet werden, dass man das Vitamin B12 nach Zusatz von anorganischen Salzen, besonders von Ammonsulfat, durch Extraktion mit Alkoho- len gewinnt. Es ist aber auch versehiedent lich vorgeschlagen worden, so vorzugehen, dass man den bei der Sättigung des Konzentrates der Vitamine der B12-Gruppe mit anorganischen Salzen, wie z. B. Ammonsulfat, entstehenden, praktisch die gesamte Vitamin Bl2-Aktivität enthaltenden Niedersehlag mit oder ohne Verwendung eines Filterhilfsmittels unmittelbar abtrennt.
In allen Fällen erhält man Anreicherungen von Vitaminen der Bl2-Gruppe, die einer weiteren, sehr gründ- lichen Reinigung bed rfen, die auf einer systematischen Abtrennung von Verunreini- gungen beruht, bevor-es gelingt, die Vitamine der B12-Gruppe zur Kristallisation zu bringen.
All. diese Verfahren sind mit Mängeln behaftet, die durch die vorliegende Erfindung Weitgehend vermindert oder umgangen bzw. beseitigt. werden können.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass gewisse Phenole mit den Vitaminen der B12-Gruppe Komplexe zu, bilden vermögen, deren Stabilität von der Art des Phenols und vom Milieu abhängt. Sie sind z. B. als Lösungen in Kohlenwasserstoffen stabil, dagegen unstabil in samerstoff- haltigen polaren Lösungsmitteln, wie z. B. in Alkoholen, Äthern, Ketonen usw.
Bei der Verwendung eines grossen Überschusses an n Phenolen, wie dies normalerweise bei Extraktionen der Fall ist, hat man es mit Lösungen der Bl2-Phenol-Komplexe in der betreffenden phenolhaltigen Phase zu tun, so dass man bei solchen Operationen von "Extraktionen" spricht. Darunter soll hier stets eine komplexbildende Extraktion" verstanden werden.
Wenn jedoch nur eine kleine Menge des betreffenden Phenols einer wässrigen Lösung, die eine oder mehrere B12-Arten enthÏlt, zugefügt wird, so dass diese Lösung an dem betreffenden Phenol nur oder noch nicht gesättigt ist, so fÏllt der Phenol-Bj2-Komplex in öliger Form aus und kann aus dem wässri- gen Medium gewonnen werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Reinigung von Vitaminen der B12-Gruppe, welches dadurch gekennzeichnet ist, da¯ man die verunreinigten Vitamine mit Phenolen behandelt,. welche befähigt sind, mit den Vitaminen Komplexe zu bilden, alsdann die Komplexe auf Grand ihrer Löslichkeitseigenschaften von den Verunreinigungen trennt und schliesslich die Vitamine aus den Komplexen wieder freisetzt.
Die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann wie folgt geschehen : 1. a) Extraktion der Vitamine der B12 Gruppe a. us der wässrigen Phase mit Lösun- gen von halogenierten Phenolen in Kohlenwasserstoffen bzw. in Schwefelkohlenstoff, oder b) Extraktion trockener, pulverformiger, die Vitamine der er B12-Gruppe enthaltender Produite mit phenolha. ltigen Lösnngsmitteln.
2. Überführung von Vitaminen der B, 2- Gruppe aus der phenolhaltigen, organischen Phase in die wässrige Phase.
Die Reinigung der Vitamine der B12- Gruppe kann auch, insbesondere wenn diese in Form einer bereits vorgereinigten, wässrigen Lösung vorliegen, durch AusfÏllung der Vitamine der B-Gruppe aus wässrigen Lo- sungen durch Meine Mengen mit Vitamin Bt2 komplexbildender Phenole und ansehliessende Freisetzung der Vitamine a. us den Phenolkomplexen erfolgen.
Die einzelnen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend in der gleichen Reihenfolge näher besehrieben.
Es wurde gefunden, dass die eingangs ge schilderten, zur Zeit bekannten. Verfahren zur Extraktion von Vitaminen der B, 2- Gruppe aus wässrigen Lösungen beträchtlich verbessert werden können, wenn an Stelle von Phenol oder alkylierten Phenolen halogenierte e Phenole, gelöst in gewissen mit Wasser nicht mischbaren Solventien, wie z. B. in gewissen Kohlenwasserstoffen oder halogenierten Kohlenwasserstoffen oder Schwefelkohlenstoff, zur Extraktion der Vitamine der B12-Gruppe aus einer wässrigen Phase verwendet werden.
Unter glewissen Solventien werden solehe Flüssigkeiten verstanden, die u. a ein ge nügendes Lösungsvermögen für halogenierte Phenole besitzen. Die sehr beträchtliche und überraschende Überlegenheit gegenüber Phenolen und Kresolen gilt vor allem, wie aus der folgenden Ta. belle zu ersehen ist, für solche halogenierte Phenole, die das Halogen in meta-bzw. para-Stellung enthalten, wie z. B. m-Chlor-phenol bzw. p-Chlor-phenol.
Tabelle 1
Phenolgehalt in Trichloräthylen, bei dem der Verteilungskoeffizient für B12 etwa z ist
Lfd. Nr. Phenolderivate Stellung des Halogens des Methyls in Mol/Liter Vol.-Verh. wϯ./org. Phase in % Vol.-Verh. wϯ./org. Phase
1:1 5:1 10:1 1:1 5:1 10:1
1 Phenol 0, 95 2, 05 3, 3 8, 93 19, 3 31, 0
2 o-Chlor-phenol ortho 2, 24 28, 8 3 m-Chlor-phenol meta 0, 42 0, 6 0, 76 5, 4 7, 7 9, 8
4 p-Chlor-phenol para 0, 6 0, 8 1, 12 7, 7 10, 3 14, 4
5 2,5-Dichlor-phenol ortho 1, 67 27, 2 meta
6 2, 6-Dichlor-phenol ortho in gesättigter Lösung keine Komplexbildung ort.
ho mit Vitamin Bt2
7 2, 4-Dichlor-phenol ortho 1, 76 27, 5 para
8 2, 4, 6-Trichlor-phenol ortho in gesättigter Lösung keine Komplexbildung ortho mit Vitamin B12 para
9 2, 4, 6-Trichlor-phenol ortho in gesättigter Losung keine Komplexbildung ortho mit Vitamin B12 para 10 o-Kresol ortho 1, 56 16, 8 11 m-Kresol meta 0, 94 10, 1 12 p-Kresol para 0, 86 9, 3 13 6-Chlor-3-kresol para meta 0, 64 0, 64 0, 64 9, 1 9, 1 9, 1 14 6-Chlor-2-kresol meta ortho in gesättigter Losung keine Komplexbildung mit Vitamin Bt2 15 5-Clilor-2-kresol pa.
ra ortho 1, 02 14, 6
Aus der Tabelle 1 ist zn entnehmen, dass in ortho-Stellung einfach halogenierte Phenole ein sehwaches Komplexbildungsvermo- gen, in ortho-Stellung zweifach halogenierte Phenole kein Komplexbildungsvermögen ur Vitamine der B12-Gruppe besitzen ; ferner, da¯ in para-Stellung halogenierte Phenole im allgemeinen ein besseres Komplexbildangs- verm¯gen f r Vitamine der B12-Gruppe ha. ben als nicht halogenierte Phenole, sowie dass ein Halogen in meta-Stellung das Kom plexbildlmgsvermögen f r Vitamine der B12 Gruppe ausserordentlich steigern kann.
Halo- genierung der Kresole erhöht im allgemeinen das Komplexbildungsvermögen für Vitamine der Bl2-Gruppe beträchtlich, vor allem unter Berücksichtigung der molaren Konzentra. tio- nen ; einen Ausnahmefall bildet 6-Chlor-2- kresol, das kein Komplexbildungsvermögen für Vitamine der B12-Gruppe besitzt.
Die Überlegenheit von halogenierten Phenolen vor allem gegenüber Phenol zeigt sich besonders bei Extraktionen mit kleinen Volumina organischer Phase. So muss z. B. bei einer Extraktion mit 1/5 Volumen an Extrak- tionsmittel, z. B. mit Trichloräthylen + Phenolkörper, das letztere 19, 3% Phenol, jedoch nur 9, 1 /o 6-Chlor-3-kresol, 10, 3"/o p-Chlor- phenol oder 7, 7"/ m-Chlor-phenol enthalten, wenn der Verteilungskoeffizient für die Vitamine der B12-Gruppe den Wert 1 besitzen soll.
Eine noch grössere Überlegenheit der halo genierten Phenole gegenüber z. B. dem Phenol ergibt sich bei Extraktionen mit Vio Volumen an Extraktionsmittel. Man benötigt dann z. B. nur 14, 4 /o an p-Chlor-phenol in Trichloräthylen gegenüber der doppelten Menge an Phenol (31, 0 /o). Bezieht man die Verhältnisse auf molare Konzentrationen, so kommt-wie die Tabelle 1 zeigt-die Uber- legenheit gewisser halogenierter Phenole noch deutlicher zum Ausdruck. Das rasche Ansteigen des Bedarfs an Phenol mit der Verringerung des Volumes an Extraktionsmitteln ist auf die verhältnismässig hohe Löslichkeit von Phenol in Wasser zurückzuführen.
Das Phenol verteilt sich zwischen Wasser und Phenolträger, z. B. Trichloräthylen, und je grösser das relative Volumen der wässrigen Phase ist, desto mehr Phenol geht für die Extraktion verloren. Diese Erscheinung tritt bei halogenierten Phenolen nur in einem sehr geringen Masse auf, was auf die geringe L¯slichkeit dieser Stoffe in Wasser zurückzu- f hren ist. So steigt z. B. der Bedarf an 6 Chlor-3-kresol mit Verringerung des Vols- mens an Extraktionsmittel praktisch gar nicht an, wie aus der Tabelle 1 zu, ersehen ist.
Die bei diesem Extraktionsprozess (1a) anzuwendenden Konzentrationen an halogenierten Phenolen in der organischen Phase sind aus der oben angeführten Tabelle ersichtlich.
Die Extraktion der wässrigen Phase mit den oben genannten Losungsmittelgemischen kann in Scheidetrichtern bzw. nach dem Ge genstromprinzip in Scheidetrichterbatterien oder in Solvent-Zentrifugal-Extraktoren durchgef hrt werden.
Als Ausgangsmaterial kann jedoch auch ein Trockenprodukt verwendet werden (lb), das die Vitamine der B12-Gruppe enthält und das nach einer der folgenden beiden Methoden gewonnen werden kann.
1. Eine auf ein kleines Volumen eingeengte Losung, die die Vitamine der B12 Gruppe enthält, wird z. B. mit Ammoniumsulfat gesättigt und zugleich mit einem höheren Alkohol, wie z. B. n-Butanol, Amylalkohol oder Benzylalkohol, extrahiert. Der Extrakt wird im Vakuum verdampft, zur Trockne gebracht und das Trockenprodukt pulverisiert.
2. Eine gleichartige Lösung wie unter 1. wird ebenfalls mit Ammoniumsulfat gesättigt.
Der dabei entstehende Niederschlag, der die Vitamine der Bzz-Gruppe enthält, wird als solcher oder nach Zusatz einer Filterhilfe, wie Kieselgur, abgetrennt und entweder unmittel- bar im Valiuum getrocknet oder durch Vermengen mit ausgeglühtem Natriumsulfat oder Gips wd dergleichen entwassert und das Trockenprodukt pulverisiert.
Die Extraktion dieses Trockenproduktes, das die Vitamine e der Bl2-Gruppe enthält, kann wie folgt geschehen : Das nach einer der beiden geschilderten Methoden gewonnene, die Vitamine der Blz-Gruppe enthaltende Troekenpulver wird mit einem komplexbildenden Lösungsmittelgemisch extra. hiert. Dieses besteht aus Phenol bzw. einem halogenier- ten Phenol und einem geeigneten, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, das für sich allein die Vitamine der B12-Gruppe nicht zu lösen vermag, wie z. B. niedere Kohlenwasserstoffe oder niedere halogenierte Kohlenwasserstoffe oder Schwefelkohlenstoff. Derartige Lösungsmittel dienen lediglich als PhenoltrÏger und werden nachfolgend auch als solche bezeichnet.
Bei dieser Extraktion gehen die Vitamine der Bl2-Gruppe als Kom plexe in Losung, wÏhrend die ganz überwie- gende Menge anorganischer Salze sowie eine beträchtliche Menge von organischen Verunreinigungen ungelöst zur ckbleiben.
Es kann aber auch in der Weise vorgegan- gen werden, dass die Extraktion des Trocken- pulvers, das die Vitamine der $12 Gruppe enthält, durch fraktionierte Perkolation mit einer Reihe von Losungsmitteln und/oder Lösungsmittelgemischen vorgenommen wird. Zu diesem Zweck wird das Trockengut, mit Aceton verrührt und in breiigem Zustand in den Perkolator eingef llt. Es wird zunäehst, eventuell unter Druck oder bei erhöhter Tem peratur, mit Aceton durchgewaschen, wobei vor allem gelbgefärbte Verunreinigungen in Lösung gehen.
Sodann wäscht man mit einem der er oben genannten Phenolträger, zunäehst ohne Phenolzusätze, oder mit einem andern geeigneten Solvens, in dem die Vitamine der Bl, nicht loslich sind, wobei weitere Verunreinigungen gelöst werden. Die bis zu diesem Punkt anfallenden Perkolate sind praktisch frei von Vitaminen der B12-Gruppe und können daher unberiicksichtigt bleiben.
Schliesslich perkoliert man mit einem Gemisch eines Phenolträgers mit einem Phenol. Der Gehalt der in diesem Stadium anzuwenden- den Perkolierungsflüssigkeit an Phenolkörper soll mehr als 5 /ai betragen. Obgleich z. B.
Trichloräthylen erst. naeh Zusatz von etwa 10-15% Phenol ein ausgesprochen gutes Vermögen, die Vitamine der B12-Gruppe aus Wasser zu extrahieren, besitzt, kann man bei Verwendung eines festen Extraktionsgutes, bereits mit 5-10%igen Phenoll¯sungen, eine ausgezeichnete Perkolation erzielen. Bereits bei einem Gehalt von 5% an Phenol bzw. an einem halogenierten Phenol, z. B. in Trichlor- äthylen, zeigt sich eine schwache losende Wir kung auf die Vitamine der B12-Gruppe, wÏhrend es völlig unm¯glich ist, mit einem derartigen Lösungsmittelgemisch die Vitamine der B12-Gruppe aus einer wässrigen Lösung zu extrahieren.
Bei dieser Ausführungsform werden einerseits durch die Vorperkolation mittels Solventien, in denen die Vitamine der B12 Gruppe nicht löslich sind, beträchtliche Men- gen von Verunreinigungen entfernt, anderseits bleiben bei der Hauptperkolation viele Verunreinigungen im Perkolator zurück. Das zur weiteren Verarbeitung kommende Per kolat, das die Vitamine der B12-Gruppe ent- hÏlt, ist tief rot gefärbt und kann mit Vorteil auf f kristallisierte Vitamine der B12-Gruppe weiterverarbeitet werden.
Diese Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens hat den Vorteil, dass man mit verhältnismässig geringen Losungs- mittelmengen und einer sehr herabgesetzten Menge an Phenolkörper auskommt. Dies bringt einerseits den Vorteil, dass man in kleineren Aufbereitungsgefässen arbeiten kann lied damit leistungsfähiger ist, anderseits, dass die Aufbereitnng erleichtert wird, da wesentlich kleinere Phenolmengen im La-ufe der weiteren Aufarbeitung zu entfernen sind.
Selbstverständlich bedingt das Arbeiten mit geringeren Lösungsmittelmengen auch einen beträchtlichen wirtschaftlichen Erfolg.
Die Anwendung des die Vitamine der B12 Gruppe enthaltenden Trockenpulvers als Ausgangsmaterial ermöglicht die Benützung eines Perkolators, was insofern vorteilhaft ist, als einerseits die Entfernung von Vermreini- gungen durch fraktionierte Anwendung verschiedener L¯sungsmittel leicht möglich-ist und anderseits die Hauptmenge von Verunreinigungen ungel¯st zurückbleibt.
Allch gegenüber der bereits bekannten Extraktion von Trockenpulvern, die die Vitamine der B12-Gruppe enthalten, mit andern Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen, bietet die erwähnte Ausführungsform den Vorteil, dass man zu einem weitaus reineren Extrakt bzw. Perkolat gelangt, da die hierbei anzuwendenden Lösungsmittel, wie Trichlor- Ïthylen, Benzol usw., die vorhandenen Ver Unreinigungen nicht oder nur in geringerem Ma¯ zu l¯sen vermögen als z. B. Alkohole, und bedingt mithin einen beträchtlichen Fortschritt.
Man musste, um die Vitamine der Bic Gruppe aus der organischen Phase zu verdrängen und in die wässrige Phase überzu- treiben, nach den bisherigen Verfahren stets sehr grosse Mengen von den eingangs genannten Flüssigkeiten verwenden, meist mehr als das Volumen der organischen Phase. Es wurde nun gefimden, dass die den bisherigen Verfahren anhaftenden MÏngel durch folgende Arbeitsweise beseitigt werden können.
Diese beruht auf der iiberraschenden Beob achtvmg, dass die Vitamine der B12-Gruppe aus den Phenolkomplexen durch Zusatz sehr geringer Mengen gewisser sauerstoffhaltiger polarer Stoffe freigesetzt und aus den phenol ha. ltigen Loswgsmitteln bzw. Lösungsmittel- gemischen glatt verdrängt und in die wässrige Phase übergeführt-werden können.
Dies wird durch folgende Beispiele ver anschaulicht :
Man geht von einem Konzentrat aus, das im Verlauf der Reinigimg der Vitamine der B12-Gruppe aus einem natiirlichen Substrat erhalten wurde. Wird dieses Konzentrat mittels Triehloräthylen + p-Chlor-phenol extra- hiert, so erhÏlt man z. B. 100 cm3 Extrakt, der neben verschiedenen Vernnreinigwgen aus 20% p-Chlor-phenol in Triehloräthylen mit 7, 5-10 mg Vitamin B12 besteht. Zu diesem Extrakt werden 50 cm3 Wasser zugesetzt.
In dem so entstehenden Zweiphasensystem befinden sich die Vitamine der B12-Gruppe ausschliesslich in der organischen Phase, wa. hrend die wässrige Phase völlig farblos ist und praktisch keine Vitamine der B12-Gruppe enthält. Diese Mischung wird mm mit einem der folgenden Stoffe in den angeführten Mengen, stets bezogen auf 100 cm3 der organischen Phase, versetzt und geschüttelt :
3, 5 cm3 Athylacetat
5, 0 cm3 Äthyläther
5, 0 cm3 Dioxan
5, 0 em3 Aeeton
6, 0 em3 Methyläthylketon
7, 5 em3 n-Butanol
7, 5 em3 Amylalkohol
15, 0 em3 Metha. nol.
In allen Fällen gehen die Vitamine der B12-Gruppe schlagartig und praktisch quanti tativ in die wässrige Phase über. Die Wirkung ist sehr instruktiv und iiberraschend.
Da die sonstigen gefärbten Vertmreiniglmgen in der organischen Phase zu einem betrÏchtlichen Teil zurückbleiben, ist die wϯrige Lösung intensiv und rein rot gefÏrbt.
Es versteht sich von selbst, dass die in der obigen Tabelle angeführten Zahlen nur einen Anhaltspunkt darstellen und sowohl nach oben wie auch nach unten in gewissen Grenzen iiberschritten werden können. Der Zusatz polarer sauerstoffhaltiger. Stoffe zu dem Zweiphasensystem Wasser/Kohlenwasser- stoff + Phenolkorper verschiebt den Ver teilungskoeffizienten der Vitamine e der B12 Gruppe zugunsten des Wassers, das hei¯t dieser Zusatz vermindert die Löslichkeit der Vitamine der B12-Gruppe in der phenolhaltigen Phase.
Je na, chdem, ob mehr oder weniger an sauerstoffhaltigem polarem Stoff zugesetzt wird, wird der Verteilungskoeffizient mehr oder weniger verschoben, was wieder zur Folge hat, dass man bei der anschliessenden Extraktion der Vitamine der B12-Gruppe mit Wasser mit mehr oder weniger häufigen Aus schüttelungen auskommt.
Die Bedeutvmg des erfindungsgemässen Verfahrens für die Reinigung der Vitamine e der B12-Gruppe wird besonders deutlich, wenn man es mit der nach den bisherigen Verfahren anzuwendenden Arbeitsweise vergleicht. Ein älmlieher Effekt hinsichtlich der Uberfühomg der Vitamine der B12-Gruppe aus der organischen in die wϯrige Phase lässt sich nämlich nach den bereits bekannten Verfahren erst durch Zusatz des gleichen Volumes von TrichlorÏthylen, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Schwefelkohlenstoff oder eines etwas geringeren Volumes an Benzol usw. erzielen, also in obigem Beispiel erst durch Zusatz von mindestens 75 bis 100 em3 s Losungsmittel. Der Untersehied ist mithin ausserordentlich deutlich.
Während nÏmlich die bei den bisher bekanntgeworde- nen Verfahren angewendeten Lösungsmittel lediglich die Funktion haben, die phenolhaltige, organische Phase so weit zu verdünnen, dass das Phenol seine Eigenschaft ver liert, die Vitamine der B12-Gruppe in der organischen Phase zu halten, tritt bei der er wähnten Ausführungsform, bei der nicht die Verdiinnmg, sondern die Zusätze polarer sauerstoffhaltiger Mittel eine entscheidende Rolle spielen, ein völlig neuartiger Effekt ein, der eine sehr beträchtliche Einsparung an Verdrängungsmitteln bedingt.
Zur Abgrenzung von den bisher bekannt- gewordenen Verfahren sei noch auf folgendes hingewiesen : Unter den in der obigen Aufstellung genannten polaren Stoffen wurde bisher lediglich Äthyläther zur Uberführung ; der Vitamine der B12-Gruppe in die wϯrige Phase verwendet. In diesem Falle wurde aber zum Untersehied von dem erfindungsgemässen Verfahren vor Anwendung des ¯thers der eigent, liehe Phenolträger, nämlich Benzol, be seitigt. Ferner wurde ein 10faches Volumen des Äthers angewendet, also im gleichen Sinne wie bei. einem apolaren Medium, nämlich zum Verdünnen des Phenols, um es auf diese Weise im Hinblick a. uf sein Lösungsvermögen f r die Vitamine der B12 Gruppe unwirksa. zu machen.
Diese Anwendung entspricht daher weder dem Sinne noch dem Umfang nach der erwähnten Ausfüh rungsform, denn diese beruht a. uf der erstmaligen Erkenntnis, da¯ die Wirkung des Äthers, wie auch der andern, obengenannten sauerstoffhaltigen polaren Medien, offenbar in deren Eigenschaft besteht, mit Phenolen
Solvate bzw. Komplexe zu bilden, die die Vitamine der B12-Gruppe nicht mehr zu binden vermögen.
Die in der obigen Tabelle angeführten Mengen an polaren sauerstoffhaltigen Stoffen verursaehen in Abwesenheit von Wasser be reits die Bildung einer die Vitamine der 3t2-
Gruppe enthaltenden Ausflockung in den phenol-oder phenolderivathaltigen Solven tien. Ein geringer weiterer Zusatz an Ver drängungsmitteln kann zur volligen Ausfäl- lung der Vitamine der Bi2-Gruppe führen.
Dies trifft z. B. für Ketone, Ester, Ather und dergleichen zu, also für jene polaren Stoffe, die die Vitamine der B12-Gruppe nieht zu losen vermögen. Alkohole verursachen in den oben angef hrten Mengen zwar auch eine Ausflockung, die aber nicht quantitativ ist. Ob durch den Zusatz eines geeigneten sauerstoff- haltigen polaren Stoffes zu einer die Vitamine der B12-Gruppe enthaltenden Mischung von Phenol oder einem Phenolderivat mit einem geeigneten Lösungsmittel eine quantitative oder nur teilweise Ausfloekllmg der Vitamine der B12-Gruppe stattfindet, ist an sich belanglos.
Auf jeden Fall wird aber durch das erfindungsgemässe Verfallren die Löslichkeit der Vita. mine der Bl2-Gruppe in dem betreffenden Medium, oder anders ausgedrückt, die Stabilität der B12-Phenol-Komplexe, so weit herabgesetzt, dass die betreffenden Vitamine ohne weiteres mit Wasser extrahiert werden können.
Die theoretische Erklärung der Wirkungs- weise der genannten sa, uerstoffhaltigen polaren Stoffe besteht wohl darin, dass Phenole mit ihnen Solvate bzw. Komplexe zu bilden vermögen. Ein derartiges, mit gewissen-polaren Molekülen beladenes Phenol-Molekiil besitzt offenbar nicht mehr das Vermögen, als Träger f r Vitamine der B12-Gruppe zu dienen. Infolgedessen besitzen Phenol und Phenolderivate nicht mehr die Fähigkeit, polaren Medien, die nicht Lösungsmittel fiir Vitamine der B12-Gruppe sind, ein Lösungsvermögen f r diese Vitamine zu erteilen.
Ebensowenig besitzen Phenole die Fähigkeit, in polaren M, edien, die Vitamine der B12-Gruppe zu lösen vermögen, die Löslichkeit f r diese zu erhöhen, falls das Molekülverhältnis Phenol : polares Medium kleiner ist als 1. Polare Me- dien, die anomal hohe Zusätze an Phenol enthalten, weisen selbstverständlich das Vermögen auf, Vitamine der B12-Gruppe zu lösen und sie aus Wasser zu extrahieren. Diese Beobachtungen stehen in guter Übereinstim- mung mit der Feststellung, dass z. B. sehr geringe Mengen von Methanol (z. B. 0, 5 /o) in einer Lösung von Phenol in Chloroform das Absorptionsspektrum des Phenols be trächtlich verändern.
Bereits 2, 5% Methanol in Chloroform bewirken, dass das Absorptions- spektrum des Phenols die gleiche Gestalt an nimmt wie in reinem Methanol. Dies spricht dafür, dass schon bei diesem geringen Metha nolgehalt eine vollige Solvatisieruy von Phenol stattgefunden hat.
Alle bisher vorgeschlagenen Verfahren gebrauchen die phenblischen Substanzen im Sinne von Losungsmitteln. Die wässrige Phase bzw. ein trockenes Pulver, die die Vitamine der B12-Gruppe enthalten, werden mit Hilfe einer phenolreichen organischen Phase extrahiert, wobei diese Gemische im allgemeinen mehr als 10 an Phenolkörpern enthalten.
Es wurde mm gefunden, dass sich die Vitamine der B12-Gruppe mit sehr geringen Mengen an verschiedenen phenolischen Sub- stanzen, welche mit Vitaminen der B12- Gruppe Komplexe bilden, a. us der wässrigen Phase ausfällen lassen. Die hierzu benötigten Konzentrationen an solchen Phenolen in der stark verdünnten wässrigen Losung der Vitamine der B12-Gruppe liegen meist unter der Sättigungskonzentration des betreffenden Phenols in Wasser. Nur in stark verunreinigten wässrigen Losungen, wie z. B. in Rohkonzentraten, sind etwas höhere Konzentrationen an Phenolkörpern zur qua. ntitativen Ausfällung der Vitamine der B12-Gruppe notwendig.
Mit dieser Ausfällung ist eine wesentliche Reinigung der Vitamine der B12-Gruppe verbunden. Stoffe, die mit Phenolen keine Fallungen geben, werden praktisch restlos abgetrennt. Hierzu gehören vor allem die bran- nen Verunreinigungen, die z. B. in aus Fanal- sehlamm gewonnenen Extrakten vorkommen.
Der neuartige und völlig unerwartete Befund, dass sich die Vitamine der B12 Gruppe aus wälssrigen Lösungen durch Phenole, die sich ja als ausgezeichnete Lösungsmittel für diese Vitamine bewährten, gefällt werden können, erklärt sich folgenderma¯en:
Es ist bekannt, dass Phenole mit Sauer stoffverbindungen, wie z. B. mit ¯thern, Aldehyden, Ketonen, SÏuren, Estern, sowie mit Aminen und Säureamiden Komplexe bilden können, die oft schwer löslich sind (vgl.
P. Pfeiffer, Organisehe Molekülverbindll. n- gen?, Stuttgart. 1922 ; K. Freudenberg, Kapitel : Komplexverbindungen in Stereoche- mie?, Leipzig und Wien 1932). Bei den nach Zusatz geringer Mengen geeigneter Phenole zu wässrigen Lösungen von Vitaminen der B12-Gruppe beobachteten FÏllungen handelt es sich vermutlich um dera. rtige Komplexe.
Das Vitamin-Bl2-Molekül enthält genügend Sauerstoff-und Stiekstoffatome, die als Elektronendonatoren zur Ausbildung derartiger Komplexe dienen können. Die ausnahmslos in Wasser schwer löslichen Komplexverbindun- gen der Vitamine der B12-Griippe mit geeigneten Phenolkörpern loden sich ausgezeichnet im Überschuss der betreffenden Phenolkörper.
Sie gehen also in die flüssige phenolreiche Phase oder in die feste Phenolphase über, falls ein Überschuss an Phenolkörpern angewendet wird. Wendet man den Phenolkörper nicht als solchen an, sondern als Gemisch mit einem Kohlenwasserstoff oder mit Schwefelkohlenstoff, so wandern die Vitamine der B12-Grupp. e als Phenolkörper-Komplexe aus der wässrigen in die organische Phase.
Sowohl bei FÏllungen mit Phenol als auch bei Extraktionen mit Phenolgemischen aus wϯrigen Lösungen hat man es also nicht mit den freien Vitaminen der B12-Gruppe zu, tun, sondern mit ihren Komplexverbindungen mit Phenolen, die sehr gut in den entsprechenden Phenolen, in der phenolreichen Phase des Phenol-Wasser-Gemisches sowie in Phenol korper-Kohlenwasserstoff-Gemischen und in Phenolk¯rper-Schwefelkohlenstoff-Gemischen, nicht jedoch in Wasser bzw. in der phenolarmen Phenolkörper-Wasser-Phase l¯slich sind.
Für die Bildung der Komplexe von Phenolen mit Vitaminen der B12-Gruppe gelten folgende Gesetzmässigkeiten, die sich aus den Werten der untenstehenden Tabelle 2 nnter Mitberücksichtigung der bereits früher gemaehten Angaben ergeben :
1. Die Komplexbildung findet unter Bedingungen statt, die eine Reaktion zwischen den beiden Partnern ermöglichen, also z. B. in wässriger Lösung cler beiden Bestandteile, ) der zwischen den in L¯sung befindlichen Vitaminen der B12-Gruppe und dem in geschmolzenem oder festem Zustand oder als L¯sun vorliegenden Phenol bzw. zwischen Vitaminen der B12-Gruppe in festem Zustand und geschmolzenem oder gelöstem Phenolk¯rper.
Fiir praktische Zwecke ist es wichtig, da¯ die Komplexbildung bevorzugt dann stattfindet, wenn das betreffende Phenol im eschmolzenen Zustand vorliegt. Feste Phe nole reagieren demgemäss im allgemeinen bevorzugt bei Temperaturen, die um den Schmelzpunkt oder h¯her liegen. Manche Phenole bilden jedoch auch in festem Zustand Komplexe. Die nachfolgend angeführten Be obaehtungen stützen sich auf die Reaktion von Phenolen mit wässrigen Losungen von Vitaminen der B12-Gruppe bei gewohnlicher oder erh¯hter Temperatur.
F r praktische Zwecke ist sehr wichtig, dass die Komplex- bildung praktisch quantitativ und in geringsten Konzentrationen der Vitamine der B-Gruppe erfolgt, und dass auf diese Weise eine Isolier mg von Vitaminen der B12 Gruppe aus schr verd nnten L¯sungen m¯g lich ist.
2. F r das Zustandekommen der Komplexbildung muss der Phenolkörper eine freie Hy droxylgruppe besitzen. Verätherte oder veresterte Phenole sind daher ungeeignet.
3. Phenolkörper mit mehr als einer Hy Iroxylgruppe, wie l) i-oder Tri-llydro. xy- benzole, sind zur Komplexbildung nicht be fähigt.
4. Phenolkörper mit sauerstoffhaltigen Substituenten, wie Nitro-, Carbinol- und Car bonylgruppen usw., ferner auch solehe mit Aminogrvppen besitzen kein bzw. nur ein iusserst schwaches Vermögen zur Komplex- bildung mit Vitaminen der B12-Gruppe, 5. AuBer dem Phenol selbst sind auch zahlreiche Derivate des Monohydroxybenzols sowie. auch die Naphthole zur Komplexbil- dung befähigt.
Diese Fähigkeit wird durch die Art und Position bestimmter Substituen- ten in gesetzmässiger Weise in positivem oder negativem Sinn beeinflusst, also verstärkt oder abgeschwächt, und in manchen Fällen a. ueh völlig beseitigt, wie die folgenden Ausführungen zeigen : a) Nicht sauerstoffhaltige, negativ geladene Substituenten, wie Halogene, verstärken grundsÏtzlich die BindungsfÏhigkeit des Phenols, wenn sie meta-oder paraständig sind.
Die meta-Stellung verstärkt die Bindungsfähigkeit mehr als die para-Stellung. b) Substituenten, wie Alkylgruppen, be einflussen das Bindungsvermögen praktisch nicht, wenn sie meta-oder pa. raständig sind. c) Alle Substituenten in der ortho-Stel- lung schwächen die Komplexbildungsfähigkeit der Phenole ab, d) Bei mehr als einem Substituenten wirkt sich deren Art und Position noch stÏrker aus. WÏhrend die Besetzung der metaund para-Stellung auch durch mehrere negativ geladene Reste im allgemeinen verstä. r- kend wirkt, hat die Besetzung der beiden ortho-Stellungen einen durchaus ungünstigen Einfluss auf das Komplexbildungsvermögen.
So bi-lden Phenolkörper, bei denen die beiden ortho-Stellungen durch Alkyle oder Halogene substituiert sind, in der KÏlte keine Kom plexe mit den Vitaminen der B12-Gruppe (in wϯriger Losung). Dabei ist aber die molekulare Grösse des Substituenten von Einfluss, denn zweifach mit Chlor in ortho-Stellung substituierte Phenole bilden im geschmolzenen Zustand, also in der Hitze, noch einen Komplex beim Schütteln mit der wässrigen L¯sung von Vitamin B12, nicht aber die analogen Dibromverbindungen.
Zur Erklärung dieser Beobachtungen und Gesetzmässigkeiten mögen folgende Ausfüh- rungen dienen :
Die Tatsache.,'dassortho-substituierte Phenole zur Komplexbildung weniger befÏhigt sind als ortho-unsubstitmierte, lässt sich nur durch den Begriff der sterisehen Hinderung erklären. Je grösser die ortho-ständigen Substituenten sind, um so reaktionsträger wird das Phenolhydroxyl. Das grössere Bromatom vermindert die Reaktionsfähigkeit des Phe no. lhydroxyls stärker als das Chloratom. Demzufolge ist 2, 4, 6-Tribrom-phenol nicht mehr in der Lage - und zwar auch nicht in geschmolzenem Zustand-die Vitamine der B12-Gruppe zu binden.
Das in gleicher Weise chlorierte Phenol besitzt aber in geschmolzenem Zustand noch die Fähigkeit zur Komplexbildung. Diese Beobachtungen korrespon- dieren mit Befunden, die in völlig ander. em Zusammenhang gemacht wurden. So gibt z. B. 2, 6-Di-tertiär-butyl-4-methyl-phenol mit den meisten Phenolreagenzien nicht mehr die typischen Phenolreaktionen. Die Reaktionsträgheit dieser Verbindung ist auf die sterische Hinderung des Phenolhydroxyls durch die in ortho-Stellung befindlichen beiden tertiÏren Butylgruppen zurückzuführen (vgl. hierzu N. C. K. Jones et al., Ind. Eng. Chem.
44, [1952], 2721).
Zur praktischen Durchführung der Fäl lung der Vitamine der Bt2-Gruppe wird die entsprechende Menge an Phenolk¯rpern in die wässrige Losung dieser Vitamine eingerührt und das Rühren eine Zeitlang fortgesetzt. Bei festen Phenolen ist meist eine Erwärmung des Gemisches auf eine Temperatur, bei der das Phenol geschmolzen ist, notwendig. Je nach der Lösliehkeit des betreffenden Phenols in Wasser bildet sich entweder sofort oder erst nach mehreren Stunden eine Trübung.
Nach kurzem Stehen setzen sich die Komplex- verbindungen der Vitamine der B12-Gruppe als rote ölige oder feste Niederschläge am Boden ab, die anschliessend abgetrennt werden können.
Zu. r Erleichterung der Abtrennmg dieser Niederschläge von der wässrigen Flüssigkeit wird zweckmässigerweise ein poröser Träger, wie z. B. Kieselgur oder Zellstoffpulver, mit eingerührt, der den Niedersehlag einschliesst und eine rasche Klärung der Flüssigkeit bewirkt.
Der kombinierte Effekt, der durch gleich- zeitige Verwendung von Phenolkörpern und porösem TrÏger erzielt wird, erweekt den Anschein. einer Adsorption der Vitamine der B-GruppeandiesenTräger, der nach der Fällung gleichmässig rot gefa. rbt ist. Es wurde aber bewiesen, dass es sich hierbei nicht um eine Adsorption handelt, denn in gleich- artigen Versuchen, die ohne TrÏger bzw. mit enorm hohen Dosen an Träger durchgeführt wurden, konnte praktisch der gleiche Fäl lungseffekt erzielt werden, wie aus der Tabelle 2 zu ersehen ist.
Tabelle 2 Fällung von Vita. minen der B12-Gruppe aus der wässrigen Lösung mit Phenol unter Verwendung einer gereinigten, a. us Fanl- schlamm gewonnenen Vitamin-B12-L¯sung.
Temperatur etwa 20 , pH 4, 5. Die Zahlen der Tabelle stellen den Vitamin-B, 2-Gehalt der wässrigen Lösungen dar, gemessen mittels des Spektrophotometers von Beckman, in Gamma pro cm3, nach der Fällung und Filtration.
Fällungen mit bzw. ohne Verwendung von Kieselgur mit steigenden Mengen an Phenol.
% % Phenol Kieselgur o 2 4 5 6 7 8
0 23, 6 23, 8 23, 6 22, 9 16, 7 6, 1 1, 3
1 23, 7 23, 6 23, 8 21, 9 16, 6 4, 6
2 24, 0 23, 7 23, 4 23, 4 16, 5 5, 2
3 23, 4 23, 8 24, 0 22, 8 16, 4 8, 0
4 23, 8 23, 6 23, 5 22, 9 16, 4 6, 1-
Kieselgur (bzw. Zellstoffpulver) spielt hier also praktiseh nur die Rolle einer Filterhilfe. Es reicht in den meisten Fällen ein tu- satz von 0, 5 bis 2 /an Filterhilfe aus.
Die Tabelle 3 enthält Daten, die die Fäll- barkeit der Vitamine der B12-Gruppe durch verschiedene Phenole nÏher illustrieren. Diese Ta. belle zeigt, daB diesbezüglich zwischen den einzelnen Phenolen grössere Unterschiede bestehen, die mit den Beobachtungen korrespon- dieren, die an Gemischen der gleichen Phenole mit Kohlenwasserstoffen gemacht wurden und in den vorstehenden Ausführungen enthalten sind.
Tabelle 3
Fällbarkeit der Vitamine der B12-Gruppe aus wässrigen Lösungen durch verschiedene Phenole unter Verwendung einer gereinigten Vita. min-Bl2-Lösung aus Fa. ulschlamm mit einem Gehalt von 30 Gamma Vitamin B12 je cm3 unter Zusatz von 1 /o Kieselgur als Filterhilfe.
% Gehalt an Phenolkörper in der Nr.Phenolk¯rper
L¯sung, notwendig zur vollstÏndi gen FÏllung von B12 (A) in der KÏlte in der Hitze (geschmolzen) L¯slichkeit des Phenolk¯rpers in Wasser(B) C=100 A B 1 Phenol 8 8, 2 97, 5 o-Chlor-phenol 2, 2 2, 8 78, 5 2a o-Brom-phenol 2, 2 sehr wenig loslich 3 m-Chlor-phenol 1, 6 2, 6 61, 5 4 p-Chlor-phenol 2, 0 2, 7 74, 0 a p-Brom-phenol 1, 7 1, 42 120, 0 5 2, 5-Dichlor-phenol etwa 1, 0 weniger aIs 1, 0 weniger loslich
6 2,6-Dichlor-phenol keine FÏllung mehr als 1, 0
7 2, 4-Dichlor-phenol Fällungweniger als 1, 0 0, 45
8 2, 4, 6-Trichlor-phenol keine Fällmg etwa 2, 5 0, 08
9 2,4,
6-Tribrom-phenol keine Fällungkeine Fallung 10 o-Kr. esol 2, 6 2, 6 100 11 m-Kresol 2, 4 2, 42 99, 2 12 p-Kresol 2,0 2, 29 87, 3 13 6-Chlor-3-kresol 1, 0 weniger als 1, 0 unlöslich 14 6-Chlor-2-kresol keine FÏllung weniger als 1, 0 15 4-Chlor-2-kresol Fällung 165-Chlor-2-kresol Fällungweniger als 1, 0 17 2, 5-Dimethyl-1-oxybenzol keine Fällungmehr als 1, 0 18 3, 5-Dimethyl-1-oxybenzol keine FRIlung mehr als 1, 0 19 3,4-Dimethyl-1-oxybenzol keine Fällung mehralsl, 0 20 p-tertiär-Amylphenol keine Fällungweit mehr als 1, 0 21 p-Oxy-diphenyl keine Fällungweit mehr als 1, 0 22 o-Oxy-diphenyl keine FÏllung weit mehr als 1, keine 23 Thymol keine Fällung praktischkeinePä,
llung 24 Carvaerol Fällung Fällung 25 α-Naphthol keine FÏllung etwa 2 sehr wenig l¯slich 26 ¯-Naphthol keine FÏllung mehr als 2 0, 075
Die Tatsache, da. zur vollständigen Aasfällung der Vitamine der B-Gruppeunter- schiedliche Mengen der verschiedenen Phenolkörper notwendig sind, ist teils durch die e oben angeführten Gesetzmässigkeiten zu erklÏren, teils dadurch, dass die einzelnen Phe nolkörper verschiedene Lösliehkeit in Wasser besitzen. Im allgemeinen ist der Bedarf an Phenolen, die in Wasser schwerer l¯slich sind, geringer.
Es findet nämlich zwischen Wasser und den Vitaminen der B12-Gruppe ein Wettbewerb um den Phenolkörper statt, wobei sich ein Gleichgewiclit einstellt, das die Verteilung des Phenolkörpers zwischen dem Vitamin der Gruppe und Wasser bestimmt und dessen Lage von der Fähigkeit des Phenols, die beiden Wettbewerber zu binden, abhÏngt.
Der Faktor B der Tabelle 3 charakteri siert Tingefähr das Vermögen des Phenolkör- pers zur Bindung von Wasser. Der Faktor C sagt gewisserma¯en aus, ob der betreffende Phenolkörper die Vitamine der B12-Gruppe besser-oder schlechter bindet, verglichen mit dem Wasserbindungsvermögen. J. e niedriger der Faktor C ist, um so. fester-verglichen mit Wasser-werden die Vitamine der B12 Gruppe durch den Phenolkörper gebunden.
Die obigen Ausführungen gelten auch für wässrige Lösungen von kristallisierten Vitaminen der Bl2-Gruppe und nicht nur für die oben erwähnten Vitamin-Bl2-Konzentrate.
Stark verunreinigte Rohextrakte ben¯tigen zur vollständigen AusfÏllung von Vitaminen der B12-Gruppe etwas mehr Phenolkörper, manchmal sogar die doppelte Menge, verglichen mit den Zahlen der Tabelle 3.
Die Ausfällung der Vitamine der B12 Gruppe mit Phenolkörpern kann im pH-Be- reich 1, 0 bis 8, 5 durchgeführt werden. Bei pH-Werten über 8, 5 ist die Fällbarkeit herabgesetzt. Die Absetzbarkeit des Niederschlages und die Klärbarkeit der Flüssigkeit, vor allem nach Zusatz von Kieselgur oder Zellstoff- pulver, steigt mit sinkenden pH-Werten.
Die Abtrennung des die Vitamine der B, 2- Gruppe enthaltenden Niederschlages kawi entweder durch Filtration oder mit Hilfe einer Zentrifuge erfolgen.
Die Wiedergewinnmg der Vitamine der B12-Gruppe aus dem abgetrennten und z. B.
Kieselgur-oder Zellstoffpulver oder eine andere Filterhilfe enthaltenden Niederschlag kann auf folgenden Wegen gesehehen : a) Der Niedersehlag kann auch in feuch- tem Zustand mit einem Kohlenwasserstoff bzw. Schwefelkohlenstoff, dem man zusÏtzliche Mengen an Phenolkörpern beimischt, extrahiert werden, wobei die Vitamine der B12-Gruppe in das Gemisch a. us Phenolkor per + Kohlenwasserstoff bzw. Schwefel- kohlenstoff übergehen. In diesem Fall bleibt der Komplex zunächst erhalten. b) Der Niedersehlag kann mit. einem wasserlöslichen, jedoch die Vitamine der B12- Gruppe nicht lösenden Solvens, wie z. B. mit einem niederen Keton, verrührt, anschliessend abgesaugt, und getrocknet werden.
Bei dieser Prozedur wird der Komplex zerlegt und die Phenolkomponente beseitigt. Nach dem Vermischen des so erhaltenen Pulvers z. B. mit Wasser gehen die Vitamine der B12 Gmppe sofort in Lösung ber. c) Der Niedersehlag kann mit einem Alkohol verrührt und abgesaugt werden. Im Filtrat erseheinen die Vitamine der B- Gruppe neben dem Phenolkörper. In diesem Fall wird der Komplex gleiehfalls zerlegt.
In jedem der unter a) bis c) beschriebe- nen Arbeitsgange findet eine weitere Reinigung der Vitamine der B12-Gruppe statt, bestehend in einer Beseitigung von Proteinen, Farbstoffen usw.
Die folgenden Ausf hrungsbeispiele zu den zuvor beschriebenen Massnahmen zur Rei nigung von Konzentraten der Vitamine der B12-Gruppe sollen die Durchführung des neuen erfindungsgemϯen Verfahrens und dessen Niitzlichkeit erlÏutern.
Beispiel 1 100 em3 eines rotbraun gefÏrbten Vitamin B12-Konzentrates, das aus Faulschlamm ge wonnen wurde und nach dem mikrobiologi- sehen Test mit der E. coli-Mutante 113-3 30 Gamma. Vitamin B12 je cm3, also insgesamt 3 mg, enthält, wird auf pH 7, 0 gebracht und mit 20 lmd sodann zweimal je 10 em3 einer 20%igen L¯sung von p-Chlor-phenol in Tri ehlorathylen extrahiert. Die dunkelroten Ex traktewerden vereinigt und einmal mit 10 em3 einer 5%igen Natriumbicarbonatl¯sung und anschliessend noch dreimal mit je 10 cm3 Wasser gewaschen.
Der nun anfallende e Extrakt von 40 em3 enthält 2, 9 mg Vitamine der B12-Gruppe neben versehiedenen Verunreinigungen. Die in diesem Extrakt enthaltene Trockensubstanz enthält etwa. l". an Vitaminen der B12-Gruppe. Diese Losung wird mit 2 cm3 n-Butanol versetzt und viermal mit je 10 cm3'Wasser ausgeschüttelt. Die vereinigten, intensiv rot gefärbten wässrigen Ex- trakte werden zweimal mit je 10 em3 n-Bu tanol vnd dreimal mit je 15 cm3 Äthyläther gewaschen. Man n erhält eine rein rot gefärbte wässrige Lösung, die 2, 8 mg Vitamine der B12-Gruppe enthÏlt. In der in dieser Lösung befindliehen Trockensubstanz wurden die Vitamine der B12-Gruppe auf etwa 6"/o angereichert.
Beispiet 2
100 em3 des gleichen Faulschla. mmkonzen- trates wie im Beispiel 1 werden auf PH 7, 0 gebracht und viermal mit 10 cm3 einer 15%igen L¯sung von m-Chlor-phenol in o-Diehlor-benzol extrahiert. Die vereinten Ex- trakte werden zweimal mit je 5 cm3 einer 5%igen Natriumbicarbonatl¯sung und anschliessend dreimal mit je 5 em3 Wasser gewaschen. Der so erhältliche Extrakt von 40 em3 wird nun mit 2 em3 sec. Butanol versetzt und ebenso behandelt, wie im Beispiel 1 besehrieben.
Beispiel 3 100 cm3 des gleichen Faulschla. mmkonzen trates wie im Beispiel 1 werden auf pli 6, 5 eingestellt und viermal mit je 10 em3 einer 15%igen L¯sung von 6-Chlor-3-kresol in Tetrachlorkohlenstoff extrahiert. Die vereinten Extrakte werden zweimal mit je 5 em3 einer 5%igen Natriumbicarbonatl¯sung und anschliessend zweimal mit je 5 em3 Wasser gewaschen. In dieser Weise erhält man einen Extrakt, der mit 2, 5 cm3 Isopropanol versetzt und ebenso weiter beha. ndelt wird, wie im Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 4
136 em3 eines wässrigen Vitamin-B. 12- Konzentra. tes, das aus Faulsehlamm gewon- nen wurde und 40 Gamma. Vitamin B12 je cm3 enthält, wird auf pH 7, 0 gebracht und mit 1, 4 g Kieselgur und 78 g Ammoniumsul- fat versetzt. Nach dem L¯sen des Ammoniumsulfats fÏllt ein rotlicher, flockiger Niederschlag aus, der abgesaugt wird. Der feuchte, rot gefärbte Filterrüekstand (etwa 8, 2 g) wird durch Verreiben mit 7, 6 g wasserfreiem Natriumsulfat in ein trockenes Pulver übergeführt. Das so erhaltene Trockenprodukt wird ansehliessend im Morse fein pulveri siert und mit 25 cm3 TrichlorÏthylen vermischt.
Der so erhaltene Brei gelangt nun in einen Perkolator. Sobald der Fliissigkeitsspiegel fast das obere Niveau erreicht hat, wird. ein Gemisch von Triehloräthylen mit 5 /o p-Chlor-phenol eingefüllt. Dieses Ge- misch extrahiert nur unbedeutende Mengen an Vitaminen der B12-Gruppe sowie gelbe Fa. rbstoffe. Erst nach Erhöhung der p-Chlor- phenolkonzentration im Trichloräthylen auf 10% werden etwa 35 cm3 eines dunkelrot ge- färbten Perkolats erha. lten.
Die weitere Perkolation mit dem gleichen Losungsmittelgemisch liefert einen nur schwach gelblieh gefärbten Durehlauf Die Säule ist nach der Perkolation braun gefärbt und enthält die Hauptmenge an Verunreinigungen. Das die Vitamine der B12-Gruppe enthaltende Perkolat von 35 cm3 wird mit 2 em3 Aceton versetzt und wie im Beispiel 1 weiterbehandelt.
Beispiel 5
50 em3 eines aus Faulschlamm gewonnenen Konzentrates der Vitamine der B12- Gruppe mit einem Vitamin-B12-Gehalt von 40 Gamma je cm3 werden mit 29 g Ammo niumsulfat versetzt und anschlieRend viermal mit je 10 cm3 n-Butanol extrahiert. Der Butanolextra. kt wird im Vacuum bei 30 bis 40 bis zur Trockne verdampft. Der anfallende Rüekstand wird mit 5 cm3 einer Mischung von 1 g Phenol lund 4 cm3 Trichloräthylen extrahiert, der Extrakt anschliessend viermal mit je 1 em. 3 Wasser gewaschen. Der so gereinigte Extrakt wird mit 0, 3 cm3 Dioxan versetzt und wie im Beispiel 1 weiterbehan- delt.
Beispiel 6
50 cm3 des gleichen Vitamin-Bl2-Konzen- trates wie im Beispiel 5 werden unter Rühren mit 29 g Ammoniumsulfat und 0, 5 g Kieselgur versetzt. Der ausgeflockte rote Niederschlag wird abgesaugt. Dieses Feuchtprodukt von 3, 0 g wird mit 2, 8 g wasserfreiem Natrumsulfat vermischt und zu einem Pulver verrieben. Das auf diese Weise in ein trockenes Pulver übergeführte Konzentrat der Vitamine der B12-Gruppe wird anschliessend mit etwas Aceton verrührt und in einen kleinen Perkolator eingefüllt. Nach Durchlaufen des Acetons wird mit 5 cm3 3 Triehlorathylen nachgewasehen und dann mit 15 cm3 Triehloräthylen mit einem Phenolgehalt von 15 /a perlioliert.
Das zurückbleibende Perkolatorgut ist nun braun gefärbt, und die gesamte Vitamin-B12 Aktivität befindet sich im rot gefärbten Per kolat. Dieses wird mit 0, 8 cm3 Äthylaeetat versetzt und wie im Beispiel 1 weiterbehandelt.
Beispiel 7
In der gleichen Weise, wie im Beispiel I beschrieben, werden 35 cm3 eines Extraktes hergestellt, der aus einem Gemisch von 10 /o p-Chlor-phenol in Triehloräthylen besteht und einen Gehalt von 5, 2 mg Vitamine der B12-Gruppe besitzt. Dieser Extrakt wird mit 3, 5 em3 Methyläthylketon versetzt, wobei ein karminroter flockiger Niederschlag ausfällt.
Dieser wird abgetrennt, mit etwas Trichlor athylen gewaschen und anschliessend in 5 em3 Wasser gelöst. Die anfallende Lösung kann mit Vorteil zur weiteren Reinigung und Kri- stallisation der Vitamine der B12-Gripp, e be- nutzt werden.
Beispiel 8
Zu. 500 cm3 einer weitgehend gereinigten wässrigen Lösung von PH 3, 5, enthaltend 25 Gamma je em3 an Vitaminen der B12 Gruppe, werden 11 g p-Chlor-phenol und 5 g Kieselgur zugefügt. Nach 10 Minuten langein Schütteln wird der rote, flockige, leicht absetzbare Niedersehlag mit Hilfe einer Glassinternutsche G3 abfiltriert, anschliessend mit 20 cm3 Aceton verrührt, abfiltriert, mit etwas Aceton nachgewaschen und im Va kuumexsikkator von Aceton befreit. Der rot gefärbte, pulverförmige Niedersehlag wird mit 20 cm3 Wasser verrührt und abgesaugt.
Der Filterrüekstand wird mit wenig Wasser nachgewaschen. Die Vitamine der B12-Gruppe befinden sich nun quantitativ im Filtrat, wo- bei eine Konzentrierung der Vitamine der B12-Gruppe in der wässrigen Lösung auf das etwa 20fache sowie eine wesentliche Reini gung-auf einem schnellen und schonenden Weg stattgefunden hat.
Beispiel 9
Zu 200 cm3 einer weitgehend gereinigten wässrigen Lösung von PH 3, 5, enthaltend 40 Gamma je cm3 an Vitaminen der B12g Gruppe, werden 16 g Phenol und 2 g Kieselgur zugesetzt. Nach kurzem Schütteln wird der flockige rote Niedersehlag abfiltriert, mit 8%iger wϯriger Phenoll¯sung gewaschen, anschliessend mehrmals mit je 10 cm einer Mischung von 20 Teilen phenol und 80 Teilen Trichloräthylen verrührt und jeweils abfiltriert. Der rotgefä. rbte Phenol-Triehlo. räthy len-Extrakt enthält mlr die Vitamine der B12 Gruppe in praktisch quantitativer Ausbeute in wesentlich gereinigtem Zustand angerei- chert und wird wie im Beispiel 1 weiterbehandelt.
Beispiel 1J 4, 5 cm3 eines aus Faulsehlamm gewonne- nen Eluatkonzentrates vom pl, 3, 5, das 70 Gamma pro em3 an Vitaminen der B12 Gruppe neben mancherlei Verunreinigungen enthält, werden mit 0, 18 g p-Chlor-phenol und 0, 18 g Kieselgar 10 Minuten la. ng, gesch ttelt, anschliessend wird der ausgeXal- lene Niederschlag abfiltriert und mit 5 cm3 Aceton verrührt. Nach dem Absaugen, Nach- tvaseheil mit Aceton wd Trocknen im Va kuum wird das rot gefärbte Pulver mit 1, 0 cm3 Wasser verrührt, abfiltriert und mit wenig Wasser nachgewaschen.
Die Vitamine der B12-Gruppe finden sich nun im wässrigen Filtrat in weitgehend gereinigter Form in praktisch quantitativer Ausbeute.
Zu, r Abgrenzung des Anmeldegegenstan- les zum Stand der Technik wurden im Zeitpunkt der Anmeldung bereits folgende Veriffentlichungen in Betracht gezogen :
1. Amerikanische Patentschrift Nr. 2582589 ;
2. Amerikanische Patentschrift Nr. 2594314 ;
3. Amerikanische Patentschrift Nr. 2609325 (bzw. deutsche Patentschrift Nr. 940850) ;
4. Amerikanische Patentschrift Nr. 2613171 ;
5. Deutsche Patentschrift Nr. 675415 ;
6. Deutsche Patentschrift Nr. 681269 ;
7. Deutsche Patentschrift Nr. 696390 ; 8. Deutsehe Patentschrift Nr. 842527 ;
9. Deutsche Patentschrift Nr, 859352 ; L0. Bioehem. J. 41 (1948), Proe. VIII ;
Smith et al. ; 11. T. Pharm. Pharmacol 1 (1949) 60 ;
Ellis et al.