Einrichtung zur mikroskopischen Abbildung nicht selbstleuchtender Objekte, deren Einzelheiten keine oder zu geringe Helligkeitsunterschiede hervorrufen, durch Phasenkontrast <B>Es</B> ist bekannt, dass bei der mikroskopi- sehen Abbildung jede Inhomogenität in der Objektebene, hervorgerufen durch von der Umgebung abweichende Absorption, abwei chenden Breeluingsindex oder abweichende Dicke in jeder der Aperturblendenebene kon jugierten Ebene eine Beugungsfigur der Aperturblende erzeugt.
Bei hinreichend klei nem Objekt ist. diese weit ameinandergezogen, während die von hinreichend grossem Gesichts feld erzeugte Beugungsfigur sieh auf das geometrische Bild der A.perturblende zusam menzieht.. Letztere entspricht also dem direk ten vom Objekt nicht beeinflussten Licht.
Mit dem in der deutschen Patentsehrift Nr. 6361.68 angegebenen Phasenkontrastver- f.'ahren wurde von Professor Zernike durch Einwendung der Abbesehen Lehre von der Bildentstehung im Mikroskop auf nicht ab sorbierende, also im normalen Hellfeldbild unsichtbare Objekte gezeigt,
dass man diese durch geeignete Phasenänderung und Sch-%vä- eliung des direkten Lichtes allein oder des vom Objekt abgebeugten Lichtes sichtbar ma- ehen kann.
Beim Köhlersehen Beleuchtungsprinzip dient die Aperturblende in der vordern Kon- densorbrennebene als Ersat.zliehtquelle. Zur Durchführung des Phasenkontrast-Verfahrens wird im geometrischen Bild der Aperturblende ein phasendrehendes Plättehen passender Ab sorption angebracht. werden. Als günstigste Blendenforzn hat sich der Kreisring erwiesen.
Dies lässt sich theoretisch und experimen tell bestätigen. Das strenge Zernikeverfahren liefert ein objekttreues Phasenkontrastbild, für die Beobachtung im durchfallenden Licht ist, das ein solches, bei dem ein Objekt mit überall gleichem, aber höherem Brechungsindex oder überall gleicher, aber grösserer Dicke als die Umgebung gleichmässig dunkel auf hellem Grund erscheint (positiver Kontrast).
Da. aber der Phasenring eine endliche Aus dehnung haben muss, wird stets auch ein Teil des durch das Objekt abgebeugten Lichtes vom Phasenring beeinflusst. Das Zernikever- fahren ist aaso nicht in aller Strenge durch führbar. Hierdurch kommen Strukturen in das Bild, die im Objekt nicht vorhanden sind. Das Phasenkontrastbild ist also objektunähn lich, was sich in Form einer dunklen Beran- dung innerhalb des Objektes und einem hellen Hof um das Objekt äussert.
Der dunkle Rand und helle Hof breiten sieh mit schmaler wer dendem Ring und kleinerem Objekt mehr und mehr aus, das Bild wird also immer objektähnlicher. Nach einer der Erfindung zugrundeliegenden Überlegung wurde als Mass der Objektähnlichkeit der wellenoptisch mit Hilfe der Kirchhoffschen Beugungsformel be- rechnete Parameterwert
EMI0002.0003
-B-AR er kannt..
In ihm sind
EMI0002.0005
_ Wellenzahl pro 2,T cm, f = Brennweite des Objektivs, 2 B = Durchmesserdes Phasenobjekts und <I>AR</I> = Breite des Phasenringes.
Diese Verhältnisse sind in der Fig.1 in Kurvenform nochmals dargestellt, und es be deuten zusätzlich p = die durch das Objekt hervorgerufene Phasenänderung im Bogenmass, 2B" = Durchmesser des von einem kreisför migen Objekt erzeugten Bildes, p" = Abstand irgendeines Bildpunktes von der optischen Achse und Ip" = Intensität im Punkt p". Nach der Darstellung entspricht das objekt treue Bild dem I\-Wert Null.
Für verschiedene F-Werte wurde die Intensitätsverteilung in der Darstellung beispielsweise für den Achro- maten mit f = 2,35 cm und für grünes Licht der Wellenlänge a = 5,46 # 10-5 cm berechnet und Übereinstimmung mit der Helligkeitsver- teilung im Bilde einiger künstlicher, der Rech nung angepasster Phasenobjekte erzielt.
Bei photograpbischen Aufnahmen wurde sowohl Ringbreite als auch Objektgrösse variiert und so der allmähliche Übergang zum objekttreuen Phasenkontrastbild dargestellt. Man kommt so zu dem Schluss, dass die bisher übliche, normale Phasenkontrasteinrichtung nur sehr kleine Objekte objekttreu wiedergibt, während grössere, entsprechend dem dunklen Rand und hellen Hof, Strukturen zeigen, die im Objekt nicht. vorhanden -sind.
Mit zunehmender Ob jektähnlichkeit der Phasenobjekte werden die absorbierenden Objekte in Übereinstimmung mit der Theorie immer objekunähnlicher, um schliesslich fast vollständig zu verschwinden. Die ' phasenkontrastmikroskopische Untersu chung natürlicher Objekte, deren Struktur nicht genau bekannt ist, kann deshalb zu Trugschlüssen Anlass geben.
In einigen bisher belianntge%vordenen Ar beiten über das Phasenkontrastverfahren sind Vorschläge zur kontinuierlichen Veränderung des Kontrastes durch Variation der Phasen drehung und Durchlässigkeit des Phasenringes -emacht worden. Auf diese Weise kann man den Phasenring dem Objekt anpassen und so für die gegebene Ringbreite optimalen Kon trast erzielen. An dem Grad der Objekttreue wird hierdurch jedoch nichts geändert.
Auf Grind der der Erfindung zugrunde liegenden Überlegung erscheint es noch wicli- t.iger, den Kontrast durch Veränderung der Ringbreite zu variieren, denn nur so kann mit Sicherheit die wahre Struktur irgendeines phasendrehende und absorbierende Objekte enthaltenden natürlichen Präparates elznittelt werden.
Die kontinuierliehe Änderung- der Breite des Phasenringes ist dabei nicht unbedingt notwendig. Verwendet man neben dein bisher üblichen noch einen leicht auswechselbaren sehr schmalen Phasenring, so sind nachein ander die drei wichtigsten Fälle zu beobaeh- ten. Im Hellfeld werden die absorbierenden Objekte objekttreu abgebildet.
Im an sich be kannten normalen Pliasenkontrastbild sind die absorbierenden und phasendrehenden Objekte gleichzeitig, doch je nach Grösse mehr oder weniger objektunähnlieh sichtbar, während der sehr schmale Phasenring eine nahezu objekttreue Abbildung der Phasenobjekte lie fert. Mit Hilfe dieser drei Bilder kann man also verhältnismässig sichere Aussagen über die wahre Struktur eines beliebigen Präpara tes machen.
Die Erfindung bezieht sieh demnach auf eine Einrichtung zur mil,:roäl@opischen Abbil dung nicht selbstleuehtender Objekte, deren Einzelheiten keine oder zu geringe Helligkeits- unterschiede hervorrufen, durch Phasenkon trast, im Durehlicht oder Auflieht mit in irgendeinem Bilde der Aperturblende ange ordneten Phasenringen und einer den Phasen ringen entsprechend ausgebildeten, in der Brennebene des Kondensors angeordneten Aperturblend@e, deren Bild sieh mit den Pha senringen deckt.
Diese Einrichtung besteht darin, dass wenigstens zwei Phasenringe un terschiedlicher Breite sowie Mittel zum schnel len, nacheinander erfolgenden Einstellen auf die verschiedenen Phasenringe vorgesehen sind.
Wie sich das erwähnte Auswechseln der Phasenringe ohne Unterbrechung der mikro skopischen Beobachtung in einfacher -Weise durchführen lässt, soll im folgenden beispiels weise beschrieben werden, doch ist. hierzu noch eine Vorbemerkung notwendig.
Zum Beispiel wird durch Aufspaltung des Phasenringes in zwei konzentrisehe Ringe der Grad der Objektähnlichkeit erhöht. Zweck mässig haben hierbei die beiden Ringe einen solchen Abstand, dass die zu einem Ring gehörende Beugungsfigur vom zweiten Ring nicht wesentlich beeinflusst wird.
Wird hier für verschiedene Objektgrössen 2 B entspre- eherid dem schon erwähnten Para.meterwert 1' und verschiedenen Ringabständen 4 R der Parameterwert eingeführt, so ergibt sieh aus
EMI0003.0015
einer Ableitung, dass mit
EMI0003.0017
für T > 5 der Ringabstand 'obige Bedingung erfüllt.
Bringt man nun innerhalb des normalen Phasenringes in entsprecbendem Abstand einen zweiten, sehr schmalen Phasenring und auch in der zugehörigen Aperturblende einen zwei ten entsprechenden Ring an, so liefern beide Ringe zusammen das dem normalen Phasen ring entsprechende Phasenkontrastbild, da die Störung durch den schmalen Ring vernacli- lässigbar klein ist.
Zieht man jetzt die Kon- densoririsblende so weit. zu, dass der nor male äussere Ring der Aperturblende ganz verdeckt ist, so sieht man für .P > 5 das dem schmalen Ring entsprechende Phasenkontrast- bild, da in diesem Fall entsprechend dem passend gewählten Abstand die Beugungs figur von dem normalen Ring nur sehr wenig beeinflusst wird.
Die Verhältnisse sind beispielsweise noch mals in der Fig. 2 schematisch dargestellt. Es bedeuten: 1 die Kondensoririsblende, 2 die Aperturblende,.3 den Kondensor, 4 das Objek tiv, 5 die Objektebene und 6 die in der hin- tern Brennebene liegende Phasenringblende. Weiterhin stellt 7 den an sich bekannten Phasenring normaler Breite und 8 einen zwei ten, wesentlich schmaleren Phasenring dar.
Entsprechend sind auf der Aperturblen- denseite 9 der dem normalen Phasenring ent sprechende und 10 der dem schmalen Phasen ring entsprechende Aperturblendenring. Au sser den beiden den Phasenringen entsprechen den Aperturblendenxingen 9 und 10 ist ein dritter, breiter, aber in der Objektivbrenn- ebene keinem Phasenring entsprechender Apert.urblendenring vorgesehen.
Dies wird in der Fig.3 verdeutlicht, in welcher zu den schon erwähnten Phasenringen 7 und 8 und den Aperturblendenringen 9 und 10 noch ein weiterer, aber breiter A.perturblendenring 11 hinzukommt. Dadurch ist es möglich, mit der Irisblende nacheinander die Aperturblenden- ringe 11 und 9 abzudecken.
Dies entspricht einer nacheinander durchgeführten Beobach tung im Hellfeld, im normalen Phasenkontrast und schliesslich einer dem schmalen Phasen ring 9 entsprechenden, nahezu objekttreuen Abbildung der Phasenobjekte. Dieser zusätz liche Aperturblendenring 11 bringt in Verbin- dtung mit der erwähnten Irisblende auch für die bisher verwendete Phasenkontrasteinrich- tung mit um einem Phasenring wesentliche Vorteile.
Man kann, ohne die mikroskopische Beobachtung unterbrechen zu müssen, durch Betätigen der Irisblende allmählich von der Hellfeld- zur Phasenkontrastbeobachtung über gehen. Das ist wesentlich, wenn das Präparat ausser Phasenobjekten auch Amplitudenob- jekte enthält.
Eine andere Möglichkeit zum Auswechseln der Phasenringe lässt sich z. B. mit Hilfe einer Zwischenabbildung schaffen.
Das vom Kondensor -f- Objektiv erzeugte Bild der Aperturblende liegt stets entweder kurz hinter dem Objektiv oder besonders bei den stärkeren Systemen im Objektiv selbst, so dass diese Ebene zum Auswechseln der Phasenringe nicht zugänglich ist. Um diesen Schwierigkeiten zu entgehen, ist schon eine Zwischenabbildung der hintern Brennebene in eine günstigere Stelle vorgeschlagen worden.
Man verwendet dann ein Objektiv ohne Phasenplättchen und bringt letzteres an den Ort der Zwischenabbildung., wo es leicht gegen ein anderes ausgetauscht werden kann. Fer ner können für verschiedene Objektive ver schiedene konzentrische Phasenringe auf einer Revolverscheibe angebracht und eine zweite in der Aperturblendenebene angeordnete Re volverscheibe mit den Phasenringen entspre chenden Aperturblenden vorgesehen sein.
Dieses Ausführungsbeispiel wird nach der schematischen Darstellung in Fig. 4 näher erläutert. Es bedeuten 12 die hintere Brenn- ebene, 13 .das Zwischenabbildungssystem und 14 bzw. 15 die in der Phasenringebene bzw. in der Aperturblendenebene angeordneten Re volverscheiben.
Die beiden Revolverscheiben können auch statt mit konzentrischen Phasenringpaaren bzw. Aperturbllendenringpa.aren mit. für ver- sehiedene Objektive verschiedenen, aber ein zelnen Phasenringen bzw. Aperturblenden- ringen unterschiedlichen Breiten versehen sein, doch so, dass jedem Objektiv zwei oder mehr Phasenringe unterschiedlicher Breite zu gehören, so dass unter Verzicht der Irisblende allein durch Bedienung der Revolverscheiben der durch unterschiedliche Ringbreiten der Phasen- bzw.
Aperturblendenrin.ge hervorge rufene Phasenkontrast erzielt wird. Es lässt sich zeigen, dass die beschriebene Einrichtung auch für 1' < 5 brauchbar ist. In den For- meln
EMI0004.0038
ist für jedes Objektiv<I>f</I> konstant. K, <I>AR</I> ,sowie d R kann man nur in verhältnismässig engen Grenzen verändern. Es war in dem erwähnten Beispiel
EMI0004.0046
f = 2,
35 cm und für den normalen Phasenring d R = 0,061 ein.
dR kann man kaum grösser als 0,1 cm machen. Einsetzen dieser Werte in 1' und 1' ergibt 1'=5#10B; 1' normal =3 #103B Für Objekte mit 1' < 5 wird 1' normal < 3.
Das heisst aber, da.ss man bei sehr kleinen Objek ten auf die Wirkung des schmalen Ringes verzichten kann, da, wie aus der Darstellung der berechneten Intensitätsverteilung (Fig.1) und photographischen Aufnahmen ersichtlich ist, schon der normale Phasenring ein objekt treues Bild, liefert.
Die hier speziell für die Beobachtung im durchfallenden Licht. beschriebene Einrich tung lässt sich natürlich auch für die Beobach tung im reflektierten Licht verwenden.