Verfahren zur Herstellung von Streptogramin Vorliegende Erfindung bezieht sieh auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen ,Antibiotikums, nämlich von Streptogramin, (-las dadurch gekennzeichnet ist; dass man Streptomyces graminofaciens in einem Nähr medium, das assimilierbaren Stickstoff, Kohle hydrate und anorganische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert.
Der neue antibiotische Stoff erweist sich, wie Versuche ergaben, gegen eine grosse Zahl verschiedenster Bakterien wirksam. Von den Bakterien, die sieh in Gegenwart des neuen Antibiotikums nicht weiter entwickeln, seien genannt Hämophilus Pertussis, Bacillus sub- tilis, Streptococcus pyogenes und insbesondere Staphylocoeeus aureus, der gegen Penicillin und andere erhältliche Mittel resistent gewor den ist.
Den letztgenannten Mikroorganismus trifft man bei einer grossen Zahl von ernst haften und oft tötlichen Infektionen mensch- lieher Lebewesen an. Es ist interessant, dass eine Kultur von Staphylococcus aureus, die durch Serienübertragung gegen mehr als die hundertfaehe der ursprünglichen hemmenden Dosis Penicillin resistent gemacht wurde, gegen Streptogramin immer noch vollkommen empfindlich ist.
Eine detaillierte Liste von gegen den neuen Stoff empfindlichen Mikroorganismen ist in der Tabelle I zusammengestellt.
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<I>Tabelle <SEP> I</I>
<tb> Bakteriostatische <SEP> Wirksamkeit <SEP> in <SEP> vitro <SEP> in
<tb> Mikrogramm <SEP> pro <SEP> em3 <SEP> Kulturmedium
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> 0,03 <SEP> <B>-0,08</B>
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> 0,02 <SEP> <B>-0,03</B>
<tb> Strep. <SEP> agalactiae <SEP> 0,04
<tb> Strep. <SEP> fecalis <SEP> 0,94 <SEP> -1,12
<tb> D. <SEP> pneumonia <SEP> 0,16 <SEP> -0,31
<tb> C. <SEP> diphteria <SEP> <B>0,005-0,02</B>
<tb> S. <SEP> typhosa <SEP> 1,25 <SEP> <B>->10</B>
<tb> S. <SEP> paraty-phi <SEP> > <SEP> 10
<tb> S. <SEP> Schottmuelleri <SEP> > <SEP> 10
<tb> Shig. <SEP> Bonnei <SEP> 7,5 <SEP> -10
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 30
<tb> P. <SEP> multocida <SEP> 1,8 <SEP> <B>-3,8</B>
<tb> K.
<SEP> pneumoniae <SEP> <B>>10</B>
<tb> Ps. <SEP> aeruginosa <SEP> > <SEP> 30
<tb> P. <SEP> vulgaris <SEP> > <SEP> 30
<tb> Br. <SEP> Abortus <SEP> 15
<tb> H. <SEP> Pertussis <SEP> 0,06 Die neue Substanz ist eine neutrale Ver bindung. Gereinigte Konzentrate des Anti biotikums sind in Wasser schwer löslich (etwa 0,1 mg/em3). Die Substanz ist leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton und Äthylace- tat, unlöslich in Ligroin. Versuche, das Streptogramin in kristallisierter Form zu er halten, blieben bisher ohne Erfolg. Verschie dene mit dem Antibiotikum gesättigte Lösungs mittel schieden beim Abkühlen kleine feste Kügelchen aus.
Gelegentlich agglomerieren sich solche Kügelchen zu Pseudokristallen (Nadeln), die jedoch zwischen den gekreuz ten Nicholschen Prismen keine Auslöschung ergaben. Das wirksamste bisher erhaltene Prä parat enthält die Elemente Kohlenstoff, Was serstoff, Sauerstoff und Schwefel (letzterer in Spuren als Verunreinigung). Die Elemen- taranalyse ergab im Durchschnitt C = 62,25 %, N = 8,42 0/0.,
H = 6,62 0/0, S = Spuren. Die daraus errechnete empyrische Formel ent spricht etwa C2sH33N307.
Streptogramin besitzt ein charakteristi sches Infrarotabsorptionsspektrum (s. Zeich nung). Dieses wurde erhalten mit einem automatisch registrierenden Infrarot-Spektro- photometer Modell 21 von Perkin-Elmer mit NaCl-Prisma. Das Spektrum wurde automa tisch von 2,0-15 ic aufgezeichnet. Die Probe wurde in schwerem Mineralöl fein verteilt und ohne Verwendung eines Abstandhalters gleichmässig zwischen zwei Salzplatten ausge breitet. Als Blindversuch verwendet man Mi neralöl allein.
Die Spitzen des Blindversuches bei 3,4, 6,8, 7,2 y sind teilweise dem Mineralöl zuzuschreiben. Die charakteristischen Bänder werden nachstehend angegeben: 3,05, 3,43, 3,54, 5,80, 6,02, 6,17, 6,23, 6,35, 6,46, 6,58, 6,94, 7,03, 7,32, 7,46, 7,64, 7,72, 7,96, 8,09, 8,20, 8,44, 8,61, 8,94, 9,45, 9,65, 9,78, 10,15, 10,26, 10,60, 10,80, 10,98, 11,29, 11,50, 11,78, 12,28, 12,68, 13,00, 13,23, 13,40 und 14,35.
Es ist interessant, dass das wirksamste Prä parat ein Absorptionsspektrum besitzt, das mit einem Konzentrat -von nur 10 0/a dieser Wirksamkeit identisch ist, was darauf schlie ssen lässt, dass die unwirksamen Verunreini gungen eine nahe verwandte Struktur besit zen und eine Erklärung dafür gibt, warum das Antibiotikum schwer in kristalliner Form erhältlich ist. Weitere Gründe für die Ver mutung einer nahen strukturellen Verwandt schaft zwischen dem Antibiotikum und den darin enthaltenen inaktiven Verunreinigiln- gen ergeben sich aus der Schwierigkeit, diese durch Gegenstromverteilung in Lösungsmit teln zu trennen.
Die Phasenregel-Lösliehkeits- analyse einer solchen Mischung zeigt auch, dass nur eine Komponente vorhanden ist, das beisst, dass beide Stoffe isomorph sind. Der Schmelzpunkt von Streptograminpr äparaten (etwa 155 C) liegt unabhängig von der Wirk samkeit in gewissen Grenzen, was auch für die spezifische Drehung (u =-134 , D-Linie des Natriums) zutrifft.
Vor und nach der Hydrolyse ist die Nin- hydrinreaktion (a-Aminostiekstoff) negativ. Die Anwesenheit eines Ringstickstoffatoms ergibt sich aus der positiven Farbprobe mit Dimethylaminobenzaldehy d in Phosphorsäure.
Eine positive Farbreaktion beim Kuppeln mit Diazosulfanilsäure bzw. mit Ferrichlorid zeigt die Anwesenheit von einer oder mehreren phenolischen Gruppen an.
Der Mikroorganismus, welcher die neue chemische Substanz der vorliegenden Erfin dung erzeugt, wurde aus einer Bodenprobe aus dem Staate Texas isoliert. Dieser Organis mus, wie er in der Erde gefunden wird, und seine spontanen Mutanden gehören zur Gat tung, die als Streptomyces bezeichnet wird. Er ist typisch aerob und zeigt in submerer Kultur nur beschränktes Wachstum.
Er bildet ein echtes Mycelium. Bei Verwendung von Natriumkaseinat-Agar erhält man nach der Beimpfung und einer angemessenen Inkuba tionszeit an der Oberfläche ein Wachstum und kräftige Sporenbildung. Die mikroskopische Untersuchung zeigt verzweigte vegetative My- celien von etwa 1 Mikron Durchmesser.
Es bilden sieh in die Luft wachsende Hyphen von 1-1,3 Mikron Durchmesser, die kugelige Co- nidien tragen, welche in dichten Spiralen endende Ketten bilden. Diese Conidien haben einen Durchmesser von etwa 1,2 Mikron.
Lackmusmileh ergibt eine ausgezeichnete Kultur in Form eines dunkelbraunen oder schwarzen Kragens an der Oberfläche des Nährmediums. Es findet eine Peptonisierung mit. ausgeprägter alkalischer Reaktion statt (PH 6,4 geht über in 8,2).
In einer Nitratbrühe erzielt man mässiges bis ausgezeichnetes Wachstum mit weissen, sporentragenden Oberflächenkolonien und etwas weissem Sediment am Boden des Rea- genzglases. Das Nitrat wird in 14 Tagen bei 37 C schwäch zu Nitrit reduziert.
In einer Tryptonhrühe stellt man ein mä- 1irres Z\ aehstum in Form einer weissen bis ,)räuliehen teilweisen Haut fest. Es entsteht (,in gelbes lösliches Pigment. Die Indolprobe ist negativ.
In synthetischer Brühe (Czapek) entsteht eine vollständige Haut aus kleinen Kolonien, die mit weissen bis grauen Lufthyphen be deckt. sind. Die Flüssigkeit ist rötlichbraun pigmentiert.
Gelatineabstriche werden bei 37 C in sie ben Tagen verflüssigt, obschon das Wachs tum, in Form von wenigen braunen Oberflä- elienkolonien und geringfügigem Bodensedi ment, schwach ist..
Das Wachstum auf Kartoffelstüeken ist ausgezeichnet. Die Oberflächen der Stücke -erden. mit sehr dünnen Kolonien überzogen, die ihrerseits von pulverigen weissen Hyphen bedeckt sind, die später grau werden. Die Kartoffelstücke werden schwarz.
Das Wachstum auf Stärke-Agar ist reich lich in Form von unregelmässig ausgebildeten, schwach erhobenen, braunen Kolonien mit rauher Oberfläche und Furchen vom Rand zur 1-Iitte. Die Oberflächen sind von grauen Luft hyphen mit weissem Rande bedeckt. Die Rück seite der Kolonie ist braun bis schwarz. Die Stärke wird hydrolysiert.
Das Wachstum auf Bennets Agar ist aus- ;ezeiehnet und die Kolonien gleichen denjeni gen auf Stärke-Agar. Es entsteht kein lös liches Pigment.
Das Wachstum auf Nähragar (Fleischpep- 1 on) ist mässig, und die Kulturen gleichen denjenigen auf Stärke-Agar.
Das Wachstum auf Glukose-Pepton-Agar ist mässig und ergibt braune, unregelmässig -erandete Kolonien, die in den Agar eindrin gen. Sie sind von weissen Lufthyphen bedeckt. Die Rückseite der Kolonien ist braun bis schwarz. Bei den bei 37 C kultivierten Kolo- liien wird eine gewisse Spaltenbildung fest ,gestellt. Es entsteht kein lösliches Pigment.
Das Wachstum in Glukose-Asparagin-Agar ist schwach und ergibt unregelmässig geformte, lederfarbige Kolonien mit spärlichen weissen Hyphen bei 30 C.
Auf synthetischem Agar (Czapeks) ergibt sich ein mässiges Wachstum von lederfarbigen netzartigen Kolonien, ähnlich denjenigen auf Glukose-Asparagin. Eine Bildung von Sporen oder löslichem Pigment lässt sich nicht fest stellen.
Natriumkaseinat-Agar ergibt bei 30 C ein ausgezeichnetes Wachstum von unregelmässig gerandeten, geruchlosen Kolonien, die mit grauem Mycel bedeckt sind. Bei 37 C erhält man federig geränderte, flache Oberflächen kolonien mit Sporen in der Mitte und sporen- freien Rändern. Die Rückseite der Kolonie zeigt eine braune Mitte mit farblosem Rand. Lösliches Pigment wird nicht gebildet.
Auf Tyrosin-Agar erhält man ein schwa ches Wachstum von dünnen kuppelförmigen, braunen Kolonien ohne sichtbare Hyphen. Die Rückseite der Kolonien ist hellbraun. Es bildet sieh kein lösliches Pigment.
Auf Calciummalat-Agar ist das Wachstum mässig unter Bildung von federig gerändertem Kolonien unter der Oberfläche mit gewölbter Mitte über dem Agar, die mit gelbweissen Lufthyphen bedeckt ist. Lösliches Pigment wird nicht gebildet. Im ganzen ist das Wachs tum und die Sporenbildung bei 37 C besser als bei 30 C; doch ergeben auch wenige Grade mehr oder weniger befriedigende Ergebnisse.
Auf Grund dieser Eigenschaften unter scheidet sich der Organismus von jeder der in Bergeys Manual of Determinative Bacterio- logy, 6. Auflage, S. 929-967, beschriebenen Arten. Für den Organismus wurde die Be zeichnung Streptomyces graminofaciens ge wählt. Kultivierung <I>des</I> Hikroorganismus Die Kultivierung des Mikroorganismus er folgt wie gesagt aerob, z. B. in üblicher Weise unter Bewegung und Belüftung.
Man kann eines der üblichen Fermentationsmedien ver wenden, das die üblichen Bestandteile, wie Kohlehydrate, Stickstoffquellen, Mineralsalze, wie Phosphate, und Spurenelemente enthält. Als gut geeignet erwies sich zum Beispiel fol- gendes Kulturmedium:
Cerelose (Marken- produkt 0,8%, N-Z-AminB (Trypton, Mar- kenprodukt) 0,2819/o" Sojapepton der Borden Co., Sheffield, 0,051/9, Hefeextrakt Basa- minebact (Markenprodukt) 0,10/0, Glutamin- säure 0,10/0, NaCl 0,083%,
K2HP04 0,24 %, KH2P04 0,2 "/0, M Cl2 0,0002 0/0. Die Cere- lose kann durch andere Kohlehydrate wie Dextrin oder Stärke ersetzt werden.
Zu Beginn der fermentativen Züchtung des S. graminofaciens stellt man das p11 des Mediums am besten auf 6,7 bis 7,0 ein.
<I>Beispiel</I> lV1an stellt ein steriles Kulturmedium von folgender gewichtsmässiger Zusammensetzung her:
EMI0004.0033
Cerelose <SEP> 0,8 <SEP> 0l\0
<tb> N-Z-Amin <SEP> B <SEP> 0,28 <SEP> 0/a
<tb> K2HP04 <SEP> 0,24 <SEP> 0/0
<tb> KH,P04 <SEP> 0,2 <SEP> 0/0
<tb> Hefeextrakt <SEP> Basaminbact <SEP> 0,2 <SEP> o/a
<tb> Mononatriumglutamat <SEP> 0,1 <SEP> 0/0
<tb> NaCl <SEP> 0,083 <SEP> 0/0
<tb> Sheffield-Soja-pepton <SEP> 0,05 <SEP> 0/0
<tb> MnC12 <SEP> 0,0002%
<tb> p11 <SEP> 6,7 <SEP> bis <SEP> 6,8.
In eine 250-cm3-Flasche, welche das Kul- turmedium enthält, gibt man eine öse voll sterile Erde, die vorher mit S. graminofaeiens beimpft wurde. Man kultiviert vier Tage bei 25 C, - wobei die Flasche geschüttelt wird. Hiervon nimmt man 10 cm3 und gibt sie in eine 2-Liter-Flasche mit Medium und schüt, telt weitere drei Tage bei 25 C.
Dann setzt man die Kultur in einer 1.2 Liter fassenden, mit Rührwerk versehenen Flasche bei p11 6,7 fort, indem man 360 cm3 des Inokulums aus der 2-Liter-Flasche zugibt. Als Anti-Schaummittel verwendet man Anti- foam DC 200 (Markenprodukt). Man rührt mit 1750 Umdrehungen in der Minute. Zwecks Belüftung wird pro Minute i/.4 des Volumens an steriler Luft eingeleitet. Die Temperatur wird auf 25 C gehalten und der Ansatz 24 Stunden weiterbehandelt.
12 Liter dieses Fermentierungsproduktes werden in einen Tank gegeben, der 600 Liter des Ki"t1lrmedlilmS vom PH<B>6,7</B> enthält. Als Anti-Scliauinmittel verwendet man ebenfalls DC 200 . Man rührt mittels eines 120 Um drehungen pro Minute machenden Rührers und führt zur Belüftung etwa 1.i des Volu- mens an steriler Luft pro Minute ein. Die Temperatur wird auf 25 C gehalten und der Ansatz 48 Stunden weiter kultiviert.
Dann wird die Kultur in noch grösseren Tanks fortgesetzt, indem man zu 2400 Liter des Kulturmediums 48 Liter Fermentations- produkt gibt. Die Arbeitsbedingungen sind gleieb. wie beim Ansatz von 600 Liter.
Nach 24 Stunden enthielt das Fermentationsmedium 91,2 Eii?heiten/cms und naeh 48 Stunden 177 Einheiten/cin3. Das entspricht 17,7 Mikro- gTamm/em3, bezogen auf die Wirksamkeit des reinsten isolierten Streptograminpräparates. Isolierung <I>des</I> Streptogranzins Das My eel wird durch Filtration entfernt und das Filtrat mit.
1/3 seines Volumens Athylaeetat im Gegenstromext.raktor extra liiert. Das das Antibiotikum enthaltende Lö sungsmittel wird mit 1/5 seines Volumens Phosphatpuffer vom p14 9,0, dann mit 1/,, sei nes Volumens Acetatpuffer vom p11 3,5 und dann mit 1/,, seines Volumens Wasser gewa- sehen. Durch diese Waschungen werden, ob schon sie nicht aussehla-ebend sind,
Verun- reinigung-en entfernt, die sonst das Endpro dukt verunreinigen würden. Das gewaschene Lösungsmittel wird durch Vakuumdestillation auf etwa 4 Liter eingeengt und dann mit dem dreifachen Volumen Ligroin behandelt, wobei das aktive Material ausfällt, das nach Filtra- tion und Trocknen im Vakuum etwa 50 % rein ist und 200 g ausmacht.
Zur weiteren Reinigung wird eine 1.00/0ige Lösung der rohen Substanz in Methanol mit dem neunfaehen Volumen l0/0igem Phospha.t- puffer bei p11 7,0 behandelt. Iran hält 18 bis 24 h bei 5 C und filtriert. Das Antibioti kum bleibt im Filtrat und wird so von einer beträchtlichen Menge gefärbter inaktiver Ver unreinigung getrennt. Das Filtrat wird durch Vakuumdestillation auf 1/1o seines Volumens eingeengt. Dabei scheidet sich das Antibioti- kum in gereinigter Form aus der Lösung aus, es wird abfiltriert, mit.
Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet; Ausbeute 90 g reines \treptogramin.
Physiologische Eigenschaften Streptogramin hat eine intraperitonale Toxi- zität bei weissen Mäusen von etwa. 450 mg/kg (LD.o). Mäuse, welche intraperitonal mit 1000 minimal lethalen Dosen pathogener Organismen infiziert wurden, wurden durch einen kleinen Bruchteil der toxischen Dosis Streptogramin geschützt.
Das Streptogramin wurde während vier Tagen auf verschiedenen Wegen verabfolgt und die minimale Menge in Mikrogramm pro Dosis bestimmt, bei der 501/o der Versuchstiere am Leben blieben. Die Er gebnisse sind in der folgenden Tabelle zusam mengestellt
EMI0005.0019
<I>Tabelle <SEP> II</I>
<tb> Infektionsmittel <SEP> Verabreichungsart <SEP> I'D <SEP> "u <SEP> Dosis <SEP> in
<tb> Mikrogramm/Dosis
<tb> Staph. <SEP> aureus <SEP> intraperitonal <SEP> 1,9
<tb> <SEP> <SEP> intramuskulär <SEP> 3525
<tb> <B> <SEP> </B> <SEP> oral <SEP> 1509
<tb> <SEP> <SEP> intravenös <SEP> 492
<tb> <SEP> <SEP> subkutan <SEP> 543
<tb> Strept.
<SEP> pyogenes <SEP> intraperitonal <SEP> 1.,2
<tb> <SEP> <SEP> intramuskulär <SEP> <B>111</B>
<tb> <SEP> <SEP> oral <SEP> 664
<tb> <SEP> * <SEP> <SEP> intravenös <SEP> 142 Es ist bezeichnend, dass eine einzige Dosis Streptogramin etwa so wirksam ist wie sieben Dosen von gleicher Grösse, und dass das Mittel sowohl bei intraperitonaler, intravenöser, intramuskulärer oder oraler Verabreichung wirksam ist.
Experimentell hervorgerufene Wunden bei Kaninchen, die mit Staphylocoe- cus aureus infiziert waren, zeigten bei Be handlung mit Streptogramin eine verkürzte Heilungsdauer im Vergleich zu unbehandel ten Kontrolltieren.
Die Verabreichung des Streptogramins auf allen Wegen (intravenös, intraperitonal, intra muskulär, subkutan und oral) wurde in allen Fällen gut. vertragen, und es zeigten sich keine Anzeichen von Nekrose, Verfärbung oder andere Schädigungen.
Das wirksamste isolierte Präparat hatte einen Schmelzpunkt von etwa 155 C und eine spezifische Drehung
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