CH338447A

CH338447A - Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe

Info

Publication number: CH338447A
Authority: CH
Inventors: Albert Dr Wettstein; Ernst Dr Vischer; Charles Dr Meystre
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1955-02-07
Filing date: 1955-02-07
Publication date: 1959-05-31

Description

Verfahren zur Herstellung von Dehydroverbindungen der Steroidreihe Es ist bereits bekannt, dass man in Verbindun gen der Pregnanreihe einen Abbau der Seitenkette auf mikrobiologischem Wege herbeiführen kann; es entstehen dabei Androstanverbindungen und gleich zeitig wird in 1,2- und gegebenenfalls in 4,5-Stel- lung eine Doppelbindung eingeführt; bei genügend langer Inkubation wird ausserdem der D -Ring auf gespalten.

Auf diesem Wege lässt sich zum Beispiel das Progesteron, wie auch d5-3f-Oxy-20-oxo-pre- gnen, 11-Desoxy-corticosteron oder 3,20-Dioxo-allo- pregnan in einer Verfahrensstufe in di,4-3,17 Dioxo- androstadien bzw. 1,2-Dehydro-testololacton über führen.

Es wurde nun gefunden, dass in Stereoiden, ins besondere der Pregnanreihe, die 1,2-Doppelbindung ohne Seitenkettenabbau oder Ringaufspaltung auf biochemischem Wege eingeführt werden kann, wenn man in 1,2-Stellung gesättigte Steroide der aeroben Einwirkung von Enzymen von Calonectria decora, Altemaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus, oder Ophiobolus Miyabeanus unterwirft.

Als Ausgangsstoffe können zum Beispiel ver wendet werden: Abkömmlinge des Spirostans, Allo- spirostans, Furostans, Allofurostans, Cholans, Allo- cholans, Pregnans, Allopregnans, Androstans und Testans. Vorzugsweise weisen die Ausgangsstoffe in 3-Stellung eine freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppe auf.

Sie können gesättigt sein oder Doppelbindungen, ausser in 1-Stellung, enthal ten, z. B. in 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9: 11-, 14- oder 16- Stellung, oder zusätzliche Substituenten besitzen, wie freie oder abgewandelte Oxy-, Oxo- oder Carboxyl- gruppen, ferner Epoxygruppen oder Halogenatome, beispielsweise in 6-, 7-, 8-, 9-, 11-, 12-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 20- oder 21-Stellung oder Methyl- gruppen,

zum Beispiel in 17a- oder 17f-Stellung. Die oben genannten Ausgangsstoffe können von beliebiger sterischer Konfiguration sein und können auch als Racemate vorliegen. Auch Steroide der sogenannten Nor- und/oder Homo-Reihen, insbe sondere 19-Nor- und D-Homo-Verbindungen lassen sich als Ausgangsstoffe verwenden. Besonders wich tige Ausgangsstoffe sind Verbindungen der Pregnan- reihe, die in 3- und 20-Stellung freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppen enthalten, z. B.

Progesteron, 11-Dehydro-progesteron, 11-, 12-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-Oxy-progesterone, 45- oder 44- Pregnen-3-ol-20-one, 45-Pregnen-3,20-diole, 11 Des- oxy-corticosteron, Cortison, Hydrocortison, 11-Epi- hydrocortison, Aldosteron, 18-Oxy-corticosteron, 11- Epi-18-oxy-corticosteron, 18-Oxo-corticosteron,

17a- Oxy - aldosteron, 18-Oxy - hydrocortison, 18-Oxy- und 18-Oxo-cortison, 18-Oxy- und 18-Oxo-cortexon, Substanz S (Reichstein), 18-Oxy- und 18-Oxo-Sub- stanz S (Reichstein), Pregnan-3,20-dion, Pregnan- 3-ol-20-on,

Allopregnan-3,20-dion, Pregnan- und Allopregnan-3,11,20-trion-17a,21-diol, Pregnan- und Ällopregnan - 3,20 - dion-11,6,17a,21-triol, Pregnan- und Allopregnan-3,18,20-trion-116,21-diol, Pregnan- und Allopregnan-3,20-dion-11 f,18,21-triol, Pregnan- und Allopregnan-3,20-dion-18,21-diol,

die entspre chenden 21-Oxo-verbindungen und bzw. oder 9a- Fluor- und Chlorderivate, beispielsweise 9a Fluor cortison, 9a-Fluor-hydrocortison, 9a-Fluor-aldosteron und 9a-Fluor-18-oxy-corticosteron, ferner in 1,2- Stellung gesättigte Androstanverbindungen, zum Bei spiel 44- oder d5-Androsten-3,17-dion, Testosteron, d5-Androsten-3-ol-17-on, Adrenosteron, Androstan- 3,17-dion,

Ätiansäuren, zum Beispiel 44- oder d5 Ätiensäuren, Alloätiansäuren, die insbesondere in 3-, 11- und bzw. oder 18-Stellung Oxy- oder Oxo- gruppen aufweisen, bzw.

entsprechende Verbindun gen mit funktionell abgewandelten Oxy- oder Oxo- gruppen. In den Ausgangsstoffen kann die funktionell abgewandelte Oxygruppe zum Beispiel eine mit einer aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure, beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure oder Furancarbonsäure,

veresterte oder eine verätherte Oxygruppe darstellen, zum Beispiel die Tetrahydropyranyloxy-, Benzyloxy- oder Tri- phenylmethoxygruppe. Die funktionell abgewandelte Oxogruppe ist vorteilhaft eine ketalisierte Oxogruppe, abgeleitet insbesondere von einem zweiwertigen Alko hol, wie die Äthylendioxygruppe.

Die genannten Ausgangsstoffe werden verfah rensgemäss mit Enzymen der oben genannten Pilz arten in Reaktion gebracht. Für die Gewinnung dieser Enzyme eignen sich die an sich hierfür bekannten Medien, zum Beispiel solche mit Zuckern, wie Glucose oder Lactose, mit Peptonen, Maisquellwas ser, Sojaprodukten und dergleichen, sowie mit Mine ralsalzen, oder aber synthetische Nährlösungen. Man arbeitet unter aeroben Bedingungen, beispiels weise in Schüttelkultur oder bei untergetauchtem Wachstum unter Rühren und Luftzufuhr. Die ge nannten Pilze unterscheiden sich von andern Mikro organismen, zum Beispiel den Bakterien, durch gutes Wachstum unter verhältnismässig einfachen Zucht bedingungen.

Die verfahrensgemässe Reaktion kann in den beschriebenen Pilzkulturen stattfinden. Man kann gegebenenfalls auch angereicherte oder abge trennte Enzyme verwenden. Im einfachsten Fall wird man die Dehydrierung in einer Aufschwemmung des abgetrennten Pilzmycels, des homogenisierten Pilz- mycels oder in Filtraten bzw. wasserhaltigen Extrak ten davon durchführen.

Die Isolierung der Verfahrensprodukte lässt sich nach bekannten Methoden vornehmen. Ihre Abtren nung kann zum Beispiel durch Extraktion des Re aktionsgemisches mit einem organischen Lösungs mittel, zum Beispiel Methylenchlorid oder Essig ester, erfolgen. Für die weitere Reinigung des so erhaltenen Extraktes eignen sich besonders Chro- matographie, zum Beispiel an Aluminiumoxyd oder Silicagel, Anwendung von Verteilungsmethoden, zum Beispiel des Gegenstromverfahrens, oder die Tren nung mittels Girard-Reagentien,

wie Trimethyl- ammonium- oder Pyridinium-essigsäurehydrazid. An schliessend an die Reinigung oder an ihrer Stelle kann schliesslich, vorzugsweise aus organischen oder wäs serig - organischen Lösungsmitteln, umkristallisiert werden.

Durch Einführung der 1,2-Doppelbindung ge langt man zu wertvollen Heilmitteln der Steroid-, insbesondere der Pregnanreihe, die sich, verglichen mit den in 1,2-Stellung gesättigten, therapeutisch wirksamen Verbindungen durch eine gesteigerte Wirksamkeit auszeichnen.

Von den Verfahrenspro dukten sind insbesondere zu nennen das 41,4_3,11,20 Trioxo - 17a,21 - dioxypregnadien, dl.4_3,20-Dioxo- 11ss,17a,21-trioxy-pregnadien, 41.4_3,11,20-Trioxo- 21-oxy-pregnadien, 4l.4_3,20-Dioxo-llss,21-dioxy- pregnadien, dl,4-3,20-Dioxo-17a"21 - dioxy - pregna- dien, dl#4-3,20-Dioxo-21-oxy-pregnadien, 414-3,18, 20-Trioxo-llss,21-dioxy-pregnadien,

J1.4-3,11,18,20- Tetraoxo-21-oxy-pregnadien, 41,4-3,20 - Dioxo-l 1ss, 18,21-trioxy-pregnadien, 41,4-3,18,20-Trioxo-llss, 17a,21-trioxy-pregnadien, 4l.4-3,11,18,20-Tetraoxo- 17a,21-dioxy - pregnadien, 4l.4-3,20-Dioxo-l 1ss,17a, 18,21-tetraoxy - pregnadien, d1.4-3,20-Dioxo-18,

21- dioxy-pregnadien, 41,4-3,18,20-Trioxo-21-oxy - pre- gnadien, dl.4-3,20-Dioxo-17a,18,21-trioxy - pregna- dien, dl,4-3,18,20-Trioxo-17a,21-dioxy - pregnadien, die entsprechenden 21-Oxo- sowie 21-Desoxy-ver- bindungen, ferner entsprechende Verbindungen mit funktionell abgewandelten Oxy- und/oder Oxogrup- pen, wie Ester, Äther,

Halogen-Derivate, zum Bei spiel 9a-Halogen-, insbesondere die Fluor- oder Chlorverbindungen. Sofern die Verfahrensprodukte nicht die Konfiguration und die Substituenten von therapeutisch verwendbaren Steroiden aufweisen, können sie als Zwischenprodukte zu deren Herstel lung, zum Beispiel der obengenannten Verbindungen, dienen.

Verfahrensprodukte mit freien Oxy- und/oder Oxogruppen lassen sich in an sich bekannter Weise in ihre funktionellen Derivate, beispielsweise Ester, Äther, Enolester, Enoläther, Ketale, Thioäther und Thioketale, ferner Hydrazone, Oxime und Enamine überführen. Vorhandene freie Oxy- und/oder Oxo- gruppen lassen sich vollständig oder teilweise funk tionell abwandeln.

Zur Herstellung von Estern und Enolestern sind beliebige organische und anorganische Säuren, wie aliphatische, alicyclische, araliphatische, aromatische oder heterocyclische Carbon-, Thioncarbon-, Thiol- carbon- oder Sulfonsäuren verwendbar, vorzugsweise Ameisensäure, Essigsäure, Chloressigsäuren, Tri- fluoressigsäure, Propionsäure, Buttersäuren,

Valerian- säuren, Diäthylessigsäure, Capronsäuren, Önanth- säuren, Caprylsäuren, Palmitinsäuren, Crotonsäure, Undecänsäure, Undecylensäure, Oxalsäure, Bernstein säure, Pimelinsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Carb- aminsäuren, Alkoxycarbonsäuren,

ss-Cyclopentyl-pro- pionsäure, Hexahydrobenzoesäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Cyclohexylessigsäure, Phenylpro- pionsäuren, Trimethylgallussäure, Phthalsäure, Fu- ran-2-carbonsäure, Isonicotinsäure, Methansulfon- säure, Toluolsulfonsäure, Schwefelsäuren,

Halogen wasserstoffsäuren oder Phosphorsäuren.

Verfahrensprodukte mit funktionell abgewandel ten Oxy- und/oder Oxogruppen lassen sich in Ver bindungen mit freien Oxy- oder Oxogruppen über führen. Auf diese Weise können insbesondere in polysubstituierten Derivaten die funktionell abgewan delten Gruppen auch teilweise in Freiheit gesetzt werden.

Dies erfolgt zum Beispiel durch chemische oder enzymatische Hydrolyse, beispielsweise unter Verwendung saurer oder basischer Mittel, durch Umesterung oder Umacetalisierung. Aus den auf diese Weise oder auch direkt erhaltenen, nur par tiell abgewandelten, wie veresterten bzw. veräther- ten Derivaten lassen sich durch anschliessende funk tionelle Abwandlung, zum Beispiel Veresterung oder Verätherung, polysubstituierte Derivate, insbeson dere auch gemischte Ester oder Äther bzw.

Ester- Äther, herstellen.

In den folgenden Beispielen sind die Tempera turen in Celsiusgraden angegeben. Beispiel 1 4 Liter 70prozentige Bierwürze werden in einem Schüttelgefäss sterilisiert (PH 5,1) und mit 150 em3 einer 2 Tage alten Schüttelkultur von Calonectria decora in 70prozentiger Bierwürze beimpft. Das Ge fäss lässt man 24 Stunden bei 270 schütteln, wobei sich die Kultur gut entwickelt. Dann gibt man eine Lösung von 1 g Cortexon in 25 cm3 Aceton unter sterilen Bedingungen zu und lässt weiter bei 270 schütteln. Nach 2 Tagen wird das Mycel abgetrennt und gut mit Wasser und Essigester gewaschen.

Nach erschöpfender Extraktion der vereinigten Filtrate mit insgesamt 4 Liter Essigester werden die Extrakte mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der so gewonnene rohe Extrakt (1,1 g) wird an einer Säule von 30 g Silicagel nach der Durchlaufmethode chromatographiert, wobei man mit Chloroform und mit Chloroform-Aceton-Ge- mischen steigenden Acetongehaltes eluiert. Die ein zelnen Fraktionen (je 100 cm3)

untersucht man pa- pierchromatographisch. Die mit Chloroform eluierten Anteile enthalten nur Verunreinigungen, während sich in den Chloroform - Aceton(9: 1)-Fraktionen eine neue Substanz befindet, die im Papierchromato- gramm (System Propylenglykol-Toluol) etwas weni ger weit als Cortexon wandert. Die Fraktionen mit höherem Acetongehalt enthalten nur wenig hoch polares Material. Die die erwähnte neue Substanz enthaltenden Fraktionen vereinigt man und dampft sie im Vakuum ein.

Durch Umkristallisieren des Rückstandes aus Aceton-Petroläther-Gemischen er hält man das reine 1-Dehydro-cortexon vom F. = 185 bis .1920 in beinahe quantitativer Ausbeute. Diese Verbindung reduziert alkalische Silberdiammin- Lösung rasch und stark.

Die Analyse stimmt auf die Bruttoformel C21H,803 (Ber. C 76,79 H 8,59 %, Gef. C 76,67 H 8,84 0/0). Das UV-Spektrum der freien Verbindung zeigt eine starke Bande mit dem Maximum bei244 m,y (E = 14 200), dasjenige des Dinitrophenylhydrazons eine solche bei 388 mu (a = 39 000).

Die entsprechenden Banden des Cor- texons liegen bei 240 m/c (s = 16 200) resp. 378 mit (a = 39 000).

Beispiel 2 Verwendet man zur Dehydrierung des Cortexons statt der in Beispiel 1 beschriebenen Kultur von Calonectria decora in analoger Weise Kulturen von Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Miyabeanus, so erhält man nach der in Beispiel 1 beschriebenen Aufarbeitung das 1-Dehydrocortexon in hoher Ausbeute.

Beispiel 3 Man züchtet, wie in Beispiel 1 beschrieben, in einem Schüttelgefäss 4 Liter einer Kultur von Calonectria decora und gibt unter sterilen Bedingun gen eine Lösung von 1 g Cortison.in 25 cm3 Me thanol zu. Das Gefäss wird darauf bei 270 geschüt telt. Nach 4 Tagen trennt man das Mycel ab und extrahiert das Kulturfiltrat erschöpfend mit insge samt 3 Liter Essigester. Die vereinigten Extrakte wer den mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Va kuum eingedampft.

Der so erhaltene rohe Rückstand wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, an 30 g Silicagel nach der Durchlaufmethode chromatographiert. Die mit Chloroform-Aceton (6 : 4)-Gemischen eluierten Anteile bestehen zur Hauptsache aus einer Substanz, die etwas polarer ist als das Ausgangsmaterial. Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum einge dampft. Aus Aceton-Äther-Gemischen wird das 1- Dehydro-cortison kristallisiert. F. = 231 bis 2340.

Die Substanz reduziert alkalische Süberdiammin-Lö- sung rasch und stark und zeigt im UV-Spektrum eine starke Absorption bei 240 mu (E = 15 800). Durch Acetylierung mit Pyridin-Acetanhydrid erhält man das entsprechende 21-Acetat vom F. = 224 bis 2300. In ähnlicher Weise lässt sich zum Beispiel das Önan- that oder Undecylenat herstellen.

Beispiel 4 Zu 4 Liter einer gut entwickelten Kultur von Calonectria decora gibt man unter sterilen Bedin gungen eine Lösung von 1 g Hydrocortison in 25 cm3 Methanol. Nach 4tägigem Schütteln bei 270 wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert und chro- matographiert. Die mit Chloroform-Aceton (1 : 1)-Ge- mischen eluierten Anteile enthalten eine Substanz, die etwas polarer als Hydrocortison ist.

Diese Frak tionen vereinigt man und dampft sie ein. Das 1-De- hydro-hydrocortison wird aus Methanol oder Aceton Äther-Gemischen umkristallisiert. F. =238 bis 2410. Es reduziert alkalische Silberdiammin-Lösung rasch und stark und zeigt im UV-Spektrum eine starke Absorption bei 244 m,ec (s = 15 100).

Beispiel S In einem Erlenmeyerkolben von 500 cm3 Fas sungsvermögen werden 150 cm3 70prozentige Bier würze sterilisiert und mit Calonectria decora be- impft. Man lässt 2 Tage bei 270 schütteln und gibt zu der nun gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg Aldosteron in 1,5 cm3 Aceton zu. Dann schüttelt man bei 270 weiter und filtriert nach 3 8 Stunden das Mycel ab.

Das Kulturfiltrat wird mit Essigester erschöpfend extrahiert, die Extrakte mit Wasser gewaschen, ge trocknet und eingedampft. Der Rückstand wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, an 1 g Silicagel chromato- graphiert, wobei die einzelnen Fraktionen (je 20 cm3) papierchromatographisch untersucht werden. In den mit Chloroform-Aceton (1: 1) -Gemischen eluierten Anteilen befindet sich eine Substanz, die etwas po larer ist als Aldosteron und alkalische Silberdiammin- Lösung reduziert.

Sie wird aus Aceton-Äther-Ge- mischen kristallisiert und stellt das 1-Dehydro-aldo- steron dar. Im UV-Spektrum zeigt sie starke Absorp tion bei 244 m@t.

Beispiel 6 In 14 Erlenmeyerkolben von 200 cm3 Fassungs vermögen werden je 50 cm3 70prozentige Bierwürze sterilisiert und mit Calonectria decora beimpft. Nach 2tägigem Schütteln bei 270 haben sich die Kulturen gut entwickelt.

Unter sterilen Bedingungen gibt man zu den 14 Kulturen je eine der nachstehen den 14 Verbindungen (je 10 mg in 0,5 cm3 Me thanol gelöst): Cortexon, Cortison, Hydrocortison, 17a-Oxy- cortexon, Corticosteron, 11-Epi-corticosteron, 11- Epi-hydrocortison, Aldosteron, 17a - Oxy-aldosteron, Progesteron, Pregnenolon, 21-Oxy-pregnenolon,

An- drostan-3,17-dion und Androsten-3,17-dion. Man lässt 2 Tage lang bei 270 weiter schütteln und extra hiert dann die Kulturen mit Essigester. Die papier- chromatographische Untersuchung der einzelnen Ex trakte zeigt, dass alle Ausgangssubstanzen in die ent sprechenden 1 Dehydro-Verbindungen übergeführt worden sind,

die gegenüber den Ausgangsstoffen. ganz leicht erhöhte Polarität besitzen und sich in ihren Spektren charakteristisch von diesen unter scheiden.Beispiel 7 Verwendet man zur Dehydrierung der in Bei spiel 6 genannten Substanzen statt der dort beschrie benen Kulturen von Calonectria decora Kulturen von Alternaria passiflorae Ophiobolus heterostrophus oder Ophiobolus Miyabeanus,

. so zeigt die papierchromato- graphische Untersuchung der Extrakte die gleichen Umsetzungsprodukte, wie sie in Beispiel 6 beschrie ben sind.Beispiel 8 Zu 4 Liter einer gut entwickelten Kultur von Calonectria decora gibt man unter sterilen Bedin gungen eine Lösung von 1 g 3,11,20-Triketo-17a,21- dioxy-allopregnan in 25 cm- Methanol. Man lässt 3 Tage bei 270 schütteln und trennt dann das Mycel ab.

Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chro- matographie des Rohextraktes wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die mit Chloroform-Aceton (1: 1)-Gemischen eluierten An teile enthalten das 1 Dehydrocortison, das aus Ace- ton-Äther-Gemischen kristallisiert erhalten wird, F. = 230 bis 2330. Es besitzt die in Beispiel 3 beschriebenen Eigenschaften.

Wird an Stelle der Lösung von 3,11,20-Tri- keto - 17a,21 - dioxy - allopregnan eine Lösung von 3,11,20-Triketo-17a,21-dioxy - pregnan in 25 cm3 Methanol einer analogen Kultur von Calonectria decora zugesetzt und in der beschriebenen Weise aufgearbeitet, so erhält man ebenfalls das 1-Dehydro- cortison in guter Ausbeute.

Beispiel 9 Unter sterilen Bedingungen wird eine Lösung von 1 g 3,20-Diketo-11,B,17a,21-trioxy-allopregnan in 25 cm Methanol zu 4 Liter einer Kultur von Calonectria decora gegeben und die Mischung 4 Tage bei 270 geschüttelt. Dann trennt man vom Mycel ab und führt die Extraktion des Kulturfil trates und die chromatographische Auftrennung des Extraktes wie in Beispiel 1 beschrieben durch.

Aus den mit Chloroform-Aceton (1: 1)-Gemischen eluier- ten Anteilen wird das 1-Dehydro-hydrocortison in guter Ausbeute kristallisiert erhalten, F. = 239 bis 242 . Es besitzt die in Beispiel 4 beschriebenen Eigenschaften.

Beispiel 10 Eine Lösung von 1 g Androstan-3,17-dion in 25 cm3 Aceton wird unter sterilen Bedingungen zu 4 Liter einer Kultur von Calonectria decora gege ben. Nach 36stündigem Schütteln bei 270 trennt man das Mycel ab und schüttelt das Kulturfiltrat er schöpfend mit Methylenchlorid aus. Der Extrakt wird je zweimal mit 0,1-n. Salzsäure und 1prozenti ger Natriumbicarbonatlösung und dreimal mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft.

Den Rückstand (1,2 g) chromatographiert man an 30g Aluminiumoxyd nach der Durchlaufmethode, wobei man mit Petroläther-Benzol-Gemischen, mit Benzol, mit Benzol-Äther-Gemischen und mit Äther eluiert. Die mit Petroläther-Benzol und mit Benzol ab gelösten Anteile enthalten das bekannte d1.-1Andro- stadien-3,17-dion, das aus einem Aceton-Petroläther- Gemisch in rhombischen Platten kristallisiert. F. _ 145 bis 1460; [a]D =+"0" (CHC13).

Beispiel 11 Eine Lösung von 40 mg, gemäss Beispiel 1 her gestelltem, 1-Dehydro-cortexon ([a]D = -I-1200 in CHC13) in 2 cm3 Pyridin werden mit 2 cm3 Essig säureanhydrid versetzt und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach 16 Stunden dampft man die Lösung im Vakuum bei 300 ein und nimmt den Rückstand in einem Chloroform-Äther-(1-4)-Ge- misch auf. Man wäscht die Lösung je dreimal mit 0,1-n.

Salzsäure, mit 2prozentiger Natriumhydrogen- carbonatlösung und mit Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Durch Umkristallisieren des erhaltenen Rückstandes aus einem Aceton-Petrol- äther-Gemisch erhält man das reine 1-Dehydro-cor- texon-21-acetat vom F. = 203 bis 205 . [a]D = +134 (CHCl3).

Beispiel 12 Zu 4 Liter einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 11-Dehydrocorticosteron in 25 cm3 Aceton. Man lässt 3 Tage lang bei 270 schütteln und filtriert dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfil trates und die Chromatographie des Rohextraktes an Silicagel wird wie in Beispiel 1 beschrieben durch geführt.

Die Chloroform- und die Chloroform Aceton (95: 5)-Fraktionen enthalten Verunreinigun gen und etwas Ausgangsmaterial, während die Chloro- form-Aceton (90: 10) -Fraktionen zur Hauptsache aus einer Substanz bestehen, die im Papierchromato- gramm etwas langsamer läuft als das Ausgangs material. Diese Substanz stellt das d1,4-3,11,20-Tri- keto-21-oxy-pregnadien dar, das aus Aceton-Äther kristallisiert wird. Die Kristalle zersetzen sich zwi schen 200 und 220 , je nach Heizgeschwindigkeit etwas verschieden.

Die Substanz absorbiert im W bei 240 m,u und zeigt im IR die für die di,4-3- Keto -Gruppierung charakteristischen Banden bei 5,99,c4, 6,14/t und 6,22,u.

Beispiel 13 Zu 4 Liter einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Corticosteron' in 25 cm3 Aceton. Man lässt 4 Tage bei 270 schütteln und filtriert dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Silicagel wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Die mit Chloroform und mit Chloroform Aceton (95: 5) eluierten Anteile enthalten Verunreinigungen und Ausgangsmaterial. Mit Chloroform-Aceton (90: 10) und (80:20) wird zur Hauptsache eine Substanz eluiert, die im Papierchromatogramm etwas langsamer wandert als das Ausgangsmaterial. Es han delt sich um das 1-Dehydro-corticosteron, das aus Aceton umkristallisiert wird. F. = 216 bis 2200 (Zersetzung), lab = +1580 (Alkohol). Im UV ab sorbiert die Substanz bei244 mu (8 = 15 300) und zeigt im IR Banden bei 2,76, 2,86, 5,84, 5,99, 6,14, 6,22, 7,44, 8,73, 9,22, 9,38 und 9,63,u.

Das mittels Pyridin-Acetanhydrid bei 200 herge stellte 21-Acetat schmilzt bei 159 bis 161 ; [ab = +l510 (Dioxan), UV -Absorptionsspektrum AmOX 243 mit (e = 14 800).

Beispiel 14 Zu 4 Liter einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g 17a-Oxy-cortexon (Reichsteins Substanz S) in 25 cm3 Methanol. Man lässt 3 Tage bei 270 schüt teln und filtriert dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates und die Chromatographie des Rohextraktes an Silicagel wird wie in Beispiel 1 be schrieben durchgeführt.

Die Chloroform- und die Chloroform-Aceton (97,5: 2,5)-Fraktionen enthalten Verunreinigungen, während mit Chloroform-Aceton (95: 5) etwas Ausgangsmaterial eluiert wird. Die Chloroform-Aceton (90: 10)-Fraktionen bestehen aus einem Gemisch, das neben wenig Ausgangsmaterial und höher polaren Produkten zur Hauptsache 1- Dehydro - 17a-oxy - cortexon enthält.

Dieses wird durch Kristallisation aus Aceton rein erhalten; F. = 227 bis 2330 (Zersetzung); [a]D = +760 (Äthanol); UV-Absorptionsspektrum: i",aX 244 my (a= 16 200).

Im IR finden sich Banden u. a. bei 2,76, 2,85, 5,84, 6,00, 6,15, 6,23, 9,01, 9,20, 9,55 und 10,04,u. Das mittels Pyridin-Acetanhydrid hergestellte 21- Acetat schmilzt bei 216 bis 222 , Lah = +86 (Dioxan); UV-Absorptionsspektrum: AmOX 244 mu 15 400).

Beispiel 15 Zu 4 Liter einer Kultur von Calonectria decora, die wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet wird, gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Progesteron in 25 cm3 Aceton. Man lässt 24 Stunden bei 270 schütteln und filtriert dann das Mycel ab. Die Extraktion des Kulturfiltrates wird wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.

Der Rohextrakt wird an einer Säule von 30 g alkalifreiem Aluminiumoxyd chromatographiert, wobei die ein zelnen Fraktionen (je 100 cm3) papierchromatogra- phisch untersucht werden. Die Petroläther-Benzol- Fraktionen enthalten Ausgangsmaterial, während mit Benzol zur Hauptsache 1-Dehydro-progesteron eluiert wird.

Dieses wird aus Äther-Petroläther kristalli siert, F. = 151 bis 152 ; [a]D = +1200 (Äthanol); UV-Absorptionsspektrum: @m0@ 245 m,u (a = 16 150).

Im IR finden sich Banden u. a. bei 5,86, 5,99, 6,14, 6,23, 7,23, 7,38, 8,33, 8,62, 10,55 und 12,24,u. Beispiel 16 In einem Schüttelgefäss wird 1 Liter einer Nährlösung, enthaltend 15 g Pepton, 10 cm3 Mais quellwasser (Cornsteepliquor), 0,1 g Rohglucose und im übrigen Leitungswasser, auf p$ 6,8 einge stellt und sterilisiert. Dann wird mit einer Kultur Calonectria decora beimpft.

Man lässt 48 Stunden bei 270 schütteln und gibt dann zur gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 250 mg Cortison in 8 cm3 Methanol. Man schüttelt weiter bei 270, filtriert nach 3 Tagen das Mycel ab und extrahiert das Kulturfiltrat wie in Beispiel 1 beschrieben mit Essigester. Die papierchromatogra- phische Untersuchung des Rohextraktes zeigt, dass neben wenig höhenpolaren Anteilen nur 1-Dehydro- cortison, aber kein Ausgangsmaterial mehr vorhan den ist.

Mittels Kristallisation aus Aceton-Äther und aus Methanol wird das 1-Dehydro-cortison rein erhalten.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von 1,2-Dehydro- steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass man in 1,2 Stellung gesättigte Steroide der aeroben Einwirkung von Enzymen von Calonectria decora, Altemaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus oder Ophio- bolus Miyabeanus unterwirft. UNTERANSPRÜCHE 1.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man Oxygruppen aufweisende, in 1,2-Stellung gesättigte Steroide als Ausgangsstoffe verwendet und die Oxygruppen der erhaltenen 1,2- Dehydrosteroide verestert. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man in 1,2-Stellung gesättigte Steroide, die in 3-Stellung eine freie oder funktionell ;abgewandelte Oxy- oder Oxogruppe aufweisen, als Ausgangsstoffe verwendet. 3.

Verfahren nach Patentanspruch und den Un teransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man in 1,2-Stellung gesättigte Pregnane oder Allo- pregnane als Ausgangsstoffe verwendet. 4. Verfahren nach Patentanspruch und den Un teransprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man 44-Pregnene als Ausgangsstoffe verwendet. 5. Verfahren nach Patentanspruch und den Un teransprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff Cortison verwendet. 6.

Verfahren nach Patentanspruch und den Un teransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der Androstanreihe als Aus gangsstoffe verwendet. 7. Verfahren nach Patentanspruch und Unter anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man An- drostan-3,17-dion als Ausgangsstoff verwendet.