CH329570A - Verfahren zur Herstellung von 17-Oxy-steroiden - Google Patents

Description

  Verfahren     zur        Herstellung    von     17-Oxy-steroiden       Es ist     bereites        bekannt,        mittels    Enzymen  aus Nebennieren, insbesondere mit deren       Ilomogenaten    oder auch bei ihrer     Durchströ-          mung,        Hydroxylgruppen,    u. a. in     17a-Stellung     von     Steroiden    einzuführen.

   So interessant  diese     Funktion    tierischer Enzyme vom theo  retischen Standpunkt aus ist, so vermag sie  zur     präparativen    und speziell     industriellen     Gewinnung von     17a-Oxy-Steroiden    nicht zu       befriedigen.    Mit     mikrobiologisehen    Methoden,  die sich auch in grösstem Stile anwenden las  sen, ist die genannte Reaktion bisher nicht  durchführbar     gewesen.     



  Es     wurde    nun gefunden, dass     17-Oxy-          steroide        hergestellt        werden    können, wenn man  auf Verbindungen der     Pregnanreihe,    die in       17-Stellung    ein     Wasserstoffatom        aufweisen,     durch     aerobe    Kulturen von Pilzen der Ord  nung     ivIoniliales,        vorzugsweise    der Art.     Tri-          ehothecium        roseum,        produzierte    Enzyme ein  wirken lässt.

   Ausgangsstoffe für das neue Ver  fahren sind     allgemein    Verbindungen der       Pregnanreihe,    wie     Pregnane,        Allopregnane,          Isopregnane,    wie 14- oder     17-Isopregnane,    so  wie Homo-. und     Nor-pregnane,    z.

   B.     A-Nor-,          D-Homo-    und 19-N     or-pregnane,    die in     17-          Stellung    ein     Wasserstoffatom        aufweisen.    Die  Verbindungen können gesättigt oder unge  sättigt,     sein    und beliebige     Substituenten    auf  weisen.     Doppelbindungen    befinden sich z. B.

    in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 14-, 15-     und/oder        20-          Stellung.    Die     Konfiguration    der Ausgangs-         stoffe    ist vorzugsweise diejenige des     Pregnans,          5a-Pregnans,        17a-Pregnans    oder entsprechen  der     Racemate,    wie sie bei der Totalsynthese  erhalten werden.

   Als     Substituenten    kommen       besonders.    in Frage freie bzw. funktionell ab  gewandelte     Hydroxyl=,        Oxo-    oder     Carboxyl-          grup:pen,    wie Ester-, Äther-,     Thioester-,        Thio-          äther-,        Thiol-    und Thronester-,     Acetal-,        Mer-          captal-,        Ketal-,        Hydrazon-,        Semicarbazon-    und       Enolgruppen,    z.

   B. in 3-, 7-, 11-, 12-, 16-, 18-,  1.9-, 20- und     21-Stellung.    Ausgangsstoffe sind  u. a.     Cortexon,    9,11- oder     11,12-Dehydro-cor-          texon,        16a-Oxy-cortexon,        18-Oxo-    und     18-Oxy-          cortexon,        Corticosteron,        11-Epi-corticost.eron,          11-Dehydro-corticosteron,18-Oxy-corticosteron,     Progesteron,     17a-Progesteron,        11-Keto-Pro-          gesteron,

  11a-    sowie     11ss-Oxy        Progesteron,        9,11-          oder        11.,12-Dehydro-progesteron,        19-Oxo-pro-          gesteron,        19-Nor-progesteron,        Pregnenolon,        21-          Oxy-pregnenolon,        Aldosteron    bzw. ihre funk  tionellen Derivate.  



  Die verwendeten Enzyme     sind    mikrobio  logischer Herkunft und durch     aerobe    Kul  turen von Pilzender Ordnung     Moniliales,        vor-          zugsweise        d-er    Art     Trichot.hecium        roseum,    pro  duziert. Zur Einführung von Sauerstoff in  kubiert man meist direkt die Ausgangsstoffe  mit den unter an sich bekannten     aeroben    Be  dingungen     submers        wachsenden    Kulturen der       genannten    Pilze.

   Diese werden zweckmässig       bewegt.,    d. h. geschüttelt oder     gerührt,    und  enthalten     assimilierbaren        Kohlenstoff,    insbe-      sondere     Kohlenhydrate    sowie gegebenenfalls       Wuchsstoffe,        beispielsweise        Maisquellwasser     oder Bierwürze, und     anorganische    Salze. Es  sind somit natürliche,     synthetische    oder halb  synthetische Nährlösungen brauchbar.

   Das  praktisch einfachste Verfahren ist im folgen  den     geschildert:    Man züchtet die     Organismen     in Apparaturen     und    unter ähnlichen Bedin  gungen wie sie bei der     Antibiotika-Fabxika-          tion    als sog.     T.ieftankverfahren    bekannt sind.  Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die  genannten     Ausgangsstoffe    in feiner Disper  sion oder Lösung,     beispielsweise    in Methanol,  Aceton oder     Äthylenglykal    zu und     inkubiert     weiter.

   Schliesslich trennt man vom     Mycel    ab,  extrahiert das Filtrat und/oder die     Myeel-          masse    und     isoliert    aus dem Extrakt die     Re-          aktionsprodukte    in an sich bekannter Weise,  z.

   B. durch     Entmischungsverfahren,        Adsorp-          tion,        Chromatographie,        Kristallisation,    Über  führung in     funktionelle    Derivate, wie     Girard-          Verbindungen    und dergleichen.

       Dieselben    Um  setzungen lassen sich aber auch durchführen,  indem man die wirksamen Enzyme aus ent  sprechenden     aeroben    Kulturen von Pilzen der  Ordnung     Moniliales,    wie der Art     Tricho-          thecium        roseum,    zuerst abtrennt und unter  Ausschluss der wachsenden Kulturen verwen  det.  



  Die     Verfahrensprodukte    können als Heil  mittel Verwendung finden oder     als    Zwischen  produkte zu ihrer     Herstellung    dienen. Von  grösstem praktischem Interesse sind z. B.     Cor-          tison.,        Hydrocortison,        1,2-Dehydrocortison,        1,2-          Dehydro-hydrocortison,        Reichsteins    Substanz  S,     1.7a-Oxy-aldosteron    sowie die z.

   B. aus Pro  gesteron.,     Pregnenolon    und     11-Ketoprogesteron     entstehenden     polyoxygenierten    Derivate.  



  In den nachfolgenden Beispielen besteht       zwischen        Gewichtsteil    und     Volumteil    die  gleiche Beziehung wie zwischen Gramm und  Kubikzentimeter. Die Temperaturen sind in       Celsiusgraden    angegeben.    <I>Beispiel 1</I>  2000     Volumteile    einer sterilisierten     Czapek-          Dox-Nährlösung    werden mit einer Kultur von       Trichothecium        roseum    beimpft und 5 Tage    bei     2711    geschüttelt.

   Dann gibt man zur gut  entwickelten     Kultur    unter sterilen Bedingun  gen eine Lösung von 0,5     Gewichtsteilen        Cor-          texon    in 15     Volumteilen    Aceton zu und schüt  telt bei 27  weiter. Nach 4 Tagen     nutseht    man  ab, wäscht den     Rückstand    einige Male mit  Wasser und extrahiert das Kulturfiltrat 3mal  mit je 1200     Volumteilen    Essigester.

   Die Essig-!       esterlösungen    werden mit     ln-Salzsäure,    Was  ser,     1n-Natriumbicarbonatlösung    und Wasser  gewaschen, getrocknet und bei 40-50  im       Vakuiun    eingedampft. Der 0,62 Gewichtsteile  betragende     Rückstand    wird an 10 Gewichts-,  teilen     Silicagel        chromatographiert,    wobei zi  erst mit Chloroform allein, dann mit     Chloro-          form-Aceton-Gemischen    mit steigendem     Ace-          ton:gehalt        eluiert,    wird.

   Mit     Chloroform    und       Chloroform-Aceton   <B>(95:5)</B> werden wenig     Cor-          texon    enthaltende Verunreinigungen     eluiert.     Die ersten     Chloroformfraktionen    mit     1011/o     Aceton geben beim Eindampfen einen Rück  stand, der mit.     konz.        Schwefelsäure    die für       Substanz    S     (17a-Oxy-cortexon)    charakteri  stische karminrote Färbung gibt..

       Dieser    Rück  stand wird aus     Aceton-Äther-Gemischen        um-          kristallisiert,    wobei reine Substanz S vom  F. =     202-213     und der     spezifischen    Drehung       [a]D    =     -I-132     (in Äthanol) erhalten wird.  Zur     Acetylierung    werden 0,02 Gewichtsteile  der reinen Substanz mit 0,2     Volumteilen        Pyri-          din    und 0,4     Volumteilen        Acetanhydrid    15       Stunden    bei 20  stehengelassen.

   Das     Gemisch     versetzt man mit. Wasser, dampft im Vakuum  ein und     kristallisiert    den     Rückstand    aus Ace  ton um, wobei Substanz     S-acetat    vom F. = 239  bis 241  erhalten wird.  



  Die weiteren     Chl.oroformeluate    mit     101/o     Aceton geben beim Eindampfen eine etwas  stärker polare Verbindung, die mit     konz.     Schwefelsäure zuerst eine rötliche, dann  braungelbe Färbung mit grüner Fluoreszenz       zeigt.        Diese    Substanz kristallisiert     aus    Aceton  in klaren     Prismen,    die beim Erwärmen ab  etwa 130  verwittern     und    bei 202-212  schmel  zen und im Gemisch mit Substanz S eine  starke     Depression    .des Schmelzpunktes er  geben.

   Die bei 135  im Hochvakuum getrock  neten     Kristalle    geben Analysenwerte, die mit      der Bruttoformel     021H3,04    gut übereinstim  men. Da die Substanz im UV absorbiert. und  alkoholische     Silberdiaminlösung    reduziert,  handelt es sich hier um ein neues     Oxy-eorte-          xon,    das von Substanz S verschieden ist.  



  An Stelle von     Czapek-Dox-Nährlösung    kön  nen auch mit Wasser verdünnte oder unver  dünnte Bierwürze oder andere Nährmedien  verwendet werden, die auf je 2000     Volum-          teileWasser    die folgenden     Zusätze    enthalten:

         Lösung   <I>A:</I> 20     Gewichtsteile        Glukose,    8 Ge  wichtsteile sek.     Ammoniumphosphat,    10     Ge-          wichtsteile        Na.triumchlorid,    4     Gewichtsteile     sek.

       Ka.liumphosphat,    2     Gewichtsteile        krist.          Magnesiumsulfat,    0,8 Gewichtsteile     Caleium-          chlorid,    0,04 Gewichtsteile     krist.        Eisen-(II)-          sulfat,    0,02 Gewichtsteile     krist.        Mangan-(II)-          sulfat.     



       Lösung   <I>B:</I> 40     Volumteile        Maisquellwasser          (Cornsteepliquor),    20 Gewichtsteile     Rohglu-          kose,    4 Gewichtsteile sek.     Kaliumphosphat.     



  <I>Lösung C: 20</I> Gewichtsteile     Pepton,    200       Gewichtsteile        Glukose,    4     Gewichtsteile        prim.          Ammoniumphosphat,    4 Gewichtsteile     Ka,lium-          nitrat,    1 Gewichtsteil     krist.        Magnesiumsulfat,     0,2 Gewichtsteile     Cal'eiumchlorid.     



  <I>Lösung D:</I> 20 Gewichtsteile     Pepton,    7 Ge  wichtsheile Fleischextrakt, 80 Gewichtsteile       Glukose,    15 Gewichtsteile     Natriumchlorid.     



       Beispiel        N     50     Volumteile    einer sterilisierten     Czapek-          Dox-Nährlösun:g    werden mit     Triehothecium          roseum    beimpft und 5 Tage bei 27  geschüt  telt.. Die gut entwickelte Kultur     versetzt    man  unter sterilen Bedingungen mit einer Lösung  von 0,01 Gewichtsteil     11-Dehydro-corticosteron          (11-Keto-cortexon)    in 0,5     Volumteilen    Aceton  und schüttelt bei 27  weiter. Nach 3 Tagen  wird wie in Beispiel 1 beschrieben     abgenutscht     und extrahiert.

   Der     Extraktionsrückstand    ent  hält auf Grund der     papierehromatographi-          schen    Untersuchung neben wenig Ausgangs  material zur Hauptsache     Cortison        (11-Keto-          17a-oxy-eortexon),    das sieh nach an sich be  kannten Methoden isolieren und reinigen lässt.  Eine analoge     Umsetzung    erhält man nach         6tägiger    Inkubation des     11-Dehydro-cortico-          sterons.     



       Beispiel   <I>3</I>  Eine wie in Beispiel 2 bereitete     Tricho-          theeium-roseum-Kultur    wird mit einer Lösung  von 0,01 Gewichtsteil     Corticosteron    in 0,5     Vo-          lumteilen    Aceton versetzt und 3 Tage bei 27        inkubiert    und analog den Angaben in Bei  spiel 2 aufgearbeitet. Die     papierchromatogra-          phzsche    Untersuchung des Extraktes zeigt,  dass der Ausgangsstoff grösstenteils in Sub  stanz M     (17a-Oxy-cortieosteron)    umgewandelt  ist.  



  Werden ' analog den obigen Angaben an  Stelle von     Corticosteron,    Progesteron,     11-Keto-          progesteron    oder     Pregnenolon        inkubiert,    so  erhält man nach der Aufarbeitung ebenfalls  grösstenteils     höherpolare    Verbindungen.  



  <I>Beispiel 4</I>  Eine wie in Beispiel 2 bereitete Kultur  von     Trichothecium        roseum    wird: mit einer  Lösung von 0,01 Gewichtsteil     d1.4-3,11,20-Tri-          keto-21-oxy-pregna,dien    in 0,5     Volumteilen     Aceton     versetzt    und 3 Tage bei 27      inkubiert.     Die Aufarbeitung erfolgt analog den Angaben  in Beispiel 2.

   Die     -Untersuchung    des Extraktes       mittels        Papierchromatographie    zeigt, dass der  Ausgangsstoff grösstenteils in     Al,4-3,11,20-Tri-          heto-17a,21-dioxy=pregnadien        (1-Dehydro-cor-          tison)        inngewandelt    worden     ist.     



  Wird analog den obigen Angaben an Stelle  von     4I.4-3,11,20-Triketo-21-oxy-pregnadien    das       A1,4-3,20-Diketo-11ss,21-dioxy-pregna@dien        in-          kubiert,    so     erhält    man nach der Aufarbeitung  zur Hauptsache das     dl,4-3,20-Diketo-11fl,17u,          1-t.rioxy-pregnadien        (1rDehydro-hydrocorti-          son).     



  Das Ausgangsmaterial kann folgenderma  ssen gewonnen werden:       dl,4-3,11,20-Triketo-21-oxy-pregnadien     2000 V     olumteile        sterilisierte    Bierwürze wer  den mit einer Kultur von     Calonectria        decora     geimpft und bei 27  geschüttelt.

   Nach 3 Tagen  werden unter sterilen Bedingungen zu der gut  entwickelten     Kultur    0,5 Gewichtsteile     11-De-          hydro-corticosteron        (Verbindung    A)     in    15       .Volumteilen    Aceton zugegeben;

   sodann wird      das     Gemisch    bei     derselben    Temperatur für  3 weitere Tage     geschüttelt.    Das     Mycel    wird       abfiltrzert    und das Kulturfiltrat wird in Bei  spiel 1     extrahiert.    Der     Extraktionsrückstand     wird an einer Säule von 15 Gewichtsteilen       S:

  ilicagel        chromatographiert,    wobei zuerst mit  Chloroform, sodann mit     Chloroform-Aceton-          Mischungen    mit     steigendem        Acetongehalt          eluiert        wird.    Jede Fraktion (50     Volumt.cile)     wird     papierehromatographisch    untersucht.

   Mit  Chloroform und     Chloroform-Aceton    (95:5)  werden einige Verunreinigungen und etwas       Ausgangsmaterial        eluiert.        Die        Chloroform-          Aceton   <B>(90:

  </B>     10-)    -Fraktionen     enthalten    jedoch  hauptsächlich eine Substanz, welche im     Pa-          pierchromatogTamm    etwas langsamer läuft       als    das     Ausgangsmaterial.    Es handelt sich um  das     d1,4-3,11,20-Triketo-21-oxy-pregn.a.dien.    Es  wird aus     Aceton-Äther        umkristallisiert    und       schmilzt    dann bei 200-215 , je nach Heiz  geschwindigkeit.

   Im UV zeigt die Verbindung  eine     Absorptionsbande        mit    Maximum bei  244     mu        und    im     IR-Spektrum    Banden bei       5,99,u,    6,14     ,u    und 6,23     it,    welche charakte  ristisch für     41,4-3-Ketone    sind.  



       d1.4-3,20    -     Diketo-11ss,21-        dioxy-pregnadien     Zu 2000     Volumteilen    einer Kultur von     Calo-          nectria        decora.,    welche wie oben     dargestellt        ist,     werden unter     sterilen    Bedingungen 0,5     Ge-          wichtssteile        Corticosteron    in 15     Volumteilen     Aceton gegeben.

   Die Züchtung, Extraktion  und     Chromatogra-phie    an     Silicagel    werden     wie     oben angegeben ausgeführt. Die Chloroform  und     Chloroformaceton    (90     :10)-Fraktionen     enthalten Verunreinigungen und etwas     Aus-          gangsmaterial.    Die Hauptverbindung, welche  in den     Chlioroformaceton(90,    :

  10)- und (80       20)-Fraktionen    enthalten ist, läuft im     Papier-          chromatogramrn    etwas langsamer als das     Aus-          ga-ngsmaterial.    Es handelt sich um 41,4-3,20-         Diketo-11ss,21-dioxy-pregnadien,    das aus Ace  ton     umkristallisiert    wird.

   Es schmilzt bei 216  bis 220  (unter Zersetzung) und besitzt die  optische Drehung     -f-    158  (Äthanol) ; im     UV-          Absorptionsspektrum    weist     es    ein Maximum  bei 244     mu        (e    15300) und im     IR-Absorptions-          spektrum    Banden bei 2,76     ,u,        2,86,u,        5,84,u,          5,99,u,        6,14,u,        6,22,u,    7,44     1t,        8,73,u,        9,22,u,

            9,38,u    und 9,63     ,cc    auf.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von 17-Oxy- steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass man auf Verbindungen der Pregnanreihe, die in 17-Stellung ein Wasserstoffatom aufweisen, durch aerobe Kulturen von Pilzen der Ord nung Monil.iales produzierte Enzyme einwir ken lässt. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man Pilze der Art Trichothecium roseum verwendet. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man als Pregnan- verbindung Cortexon verwendet. 3. Verfahren nach Patentanspruch, da durch. gekennzeichnet, dass man als Pregnan- verbindung Corticosteron verwendet. 4. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man als Pregnan- verbindung 11-Dehydro-corticosteron verwen det. 5.

   Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man als Pregnan- verbindung 41.4-3,11,20-Triketo-21-oxy-pre- gna-dien verwendet. 6. Verfahren nach Patentanspruch, da durch gekennzeichnet, dass man als Pregnan- verbindung dz>4-3,20-Diketo-llf,21-dioxy-pre- gnadien verwendet.