Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxysteroiden mittels hydroxylierender Enzyme verschiedener Arten von Mikroorganismen Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einführen von Hydroxylgruppen (Hydroxylie- rung) in ein Steroidmolekül, indem Desoxysteroide der Einwirkung bestimmter Mikroorganismen bzw. bestimmter Enzyme solcher Mikroorganismen aus gesetzt werden.
Die Entdeckung der bemerkenswerten therapeu tischen Eigenschaften von Kortison, Hydrokortison und verwandter Verbindungen hat ein weites Inter esse wachgerufen, um einfachere und wirtschaft- lichere Verfahren zum Herstellen dieser Verbin dungen zu finden. Bis jetzt wurden letztere haupt sächlich erzeugt mittels sehr komplizierter Synthese, die eine beträchtliche Anzahl von verschiedenen Operationen benötigte, wobei diese Anzahl not wendigerweise vom Ausgangsmaterial abhängt. So erfordert z. B. eine typische Synthese von Hydro- kortison aus relativ billiger Desoxycholsäure etwa 40 getrennte Reaktionen.
Der schwierigste Schritt bei der Synthese dieser Verbindungen ist die Ein führung von Sauerstoff in verschiedene Stellungen des Steroidmoleküls, insbesondere von Hydroxy- gruppen in die 11-, 17- und 21-Stellung. Wegen der Schwierigkeit des Einführens dieser Hydroxygruppen sind die richtige Auswahl des Ausgangsmaterials, die Reihenfolge und Anzahl von Operationen wichtige Faktoren.
Für die Auswahl des Ausgangsmaterials müssen die Kosten und die Leichtigkeit der Hy- droxylierung gegeneinander abgewogen werden, und eine ausgedehnte Forschung ist erforderlich, um fest zustellen, welche Ausgangsmaterialien am meisten Aussicht haben.
Es ist vor kurzem vorgeschlagen worden, die Hydroxylierung von Steroiden mittels Gärverfahren durch die Einwirkung von speziellen hydroxylieren- den Stämmen von Mikroorganismen oder ihrer hy- droxylierenden Enzyme durchzuführen.
Die in der Literatur bekanntgewordenen Verfahren zum Erzeu gen von vielfach hydroxylierten Produkten, das heisst von Produkten, die in mehreren Stellungen des Steroidmoleküls hydroxyliert werden, ergaben je doch zahlreiche andere, unerwünschte, hydroxylierte Produkte, auch Mischungen von Stereo- und Stel- lungsisomeren, jedoch nur eine geringe Menge von jedem einzelnen Stoff. Die Erträge an den ge wünschten Einzelprodukten sind sehr niedrig, und zufolge der verschiedenen erhaltenen Arten von Mi schungen sind ausserordentlich komplizierte Extrak tionsverfahren erforderlich,
um sie voneinander zu trennen. Es ergibt sich somit die praktische Un möglichkeit, vielfach hydroxylierte Steroide in kom merziell interessanten Mengen mittels dieser Ver fahren herzustellen.
Es ist somit sehr erwünscht, mittels eines Gär- verfahrens ein vielfach hydroxyliertes Steroid mit gutem Ertrag herstellen zu können, insbesondere ein Steroid, das in denjenigen speziellen Stellungen hy- droxyliert ist, die für die Herstellung wertvoller Hormone Oxygruppen aufweisen müssen. Ein sol ches Verfahren würde die Ausmerzung vieler kom plexer Schritte ermöglichen, die bis jetzt als nötig erachtet wurden, um als Hormone wirkende Steroide hervorzubringen.
Ferner würde ein solches Ver fahren, was möglicherweise noch wichtiger ist, die Notwendigkeit einer sorgfältigen Wahl des Aus gangsmaterials ausschalten. In einem solchen Fall würde die Benützung von billigen Substanzen er möglicht, die bislang für die Erzeugung von Hor monen nicht in Betracht kamen.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist nicht den Schwierigkeiten unterworfen wie die vorher zur Ver fügung stehenden Verfahren. Ferner kann mit diesem Verfahren die Herstellung von vielfach hydroxylier- ten Steroiden mit wirtschaftlich interessanten Erträ- gen und ohne Bildung von unerwünschten Neben produkten erreicht werden. Es ist zudem möglich, durch das vorliegende Verfahren die 11-, 17- und 21-Kohlenstoffatome in Steroiden direkt zu hydroxy- lieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Ver fahren zur Herstellung von Polyhydroxysteroiden, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Steroid der Einwirkung mindestens zweier ver schiedener, nicht von der gleichen Mikroorganismen art stammender Hydroxygruppen einführender En zyme ausgesetzt wird, wobei jedes der Enzyme in einer andern Stellung des Steroids Hydroxygruppen einführt und mindestens zeitweise die Enzyme von mindestens zwei Mikroorganismenarten in dem Re aktionsgemisch vorhanden sind.
Gemäss vorliegender Erfindung kann die Viel- fach-Hydroxylierung von Steroiden in einer einzigen Gäroperation ausgeführt werden, indem die Steroide der Einwirkung von mehreren hydroxylierenden Stämmen von Mikroorganismen oder von diesen er zeugten hydroxylierenden Enzymen gleichzeitig aus gesetzt werden, von denen jeder einzelne selektiv in erster Linie in einer bestimmten Stellung des Steroid- moleküls hydroxyliert. Es wird dadurch möglich, zwei oder mehrere Stellungen eines Steroidmoleküls zu hydroxylieren,
ohne dass gleichzeitig auch eine grosse Anzahl von unerwünschten, hydroxylierten Produkten, wie z. B. Stereo- und Stellungsisomere, gebildet werden, die den Ertrag an den gewünsch ten Produkten herabsetzen und mittels komplizierter Extraktionsverfahren von den gewünschten Pro dukten abgetrennt werden müssen.
Die Fähigkeit des vorliegenden Verfahrens, erwünschte vielfach hy- droxylierte Steroide mit gutem Ertrag zu erzeugen, ist ein neues und unerwartetes Resultat, da man er warten würde, dass die verschiedenen, im gleichen Verfahren benützten Mikroorganismenarten einander gegenseitig beeinträchtigen und damit den Ertrag an gewünschten Produkten reduzieren würden, entweder dadurch, dass ein oder mehrere dieser Mikroorga- nismenarten die andern vergiften, oder dass sich eine andere gegenseitige Einwirkung ergibt, die zur Zer störung der Organismen führt.
Es hat sich jedoch ganz im Gegenteil gezeigt, dass es durch Verwenden bestimmter Mikroorganismenarten bzw. ihrer Enzyme für die Hydroxylierung der verschiedenen Kohlen- -,toffatome möglich wird, eine strenge Kontrolle der Hydroxylierung des Steroids auszuüben und dadurch einen hohen Ertrag am gewünschten, vielfach hy- droxylierten Produkt zu erzielen.
Diese Möglichkeit einer Kontrolle der Vielfach-Hydroxylierung ist sehr wichtig, da dies bisher unmöglich war.
Da gemäss vorliegender Erfindung die Vielfach- Hydroxylierung nur mit einer einzigen Gäroperation stattfinden kann, ist es nicht mehr nötig, die Kompo nenten nach jeder Hydroxylierungsperiode voneinan der zu trennen, wie dies nötig wäre, wenn jeder Hydroxylierungsschritt für sich durchgeführt würde.
Dies ist ein Vorteil, da dadurch der Ertrag stark er- höht wird; denn bei Verfahren, die für jeden Hy- droxylierungsschritt eine besondere Gäroperation er fordern, geht immer ein bedeutsamer Teil des ge wünschten hydroxylierten Steroids durch das zu seiner Abtrennung aus den Gärbrühen benützte Ver fahren verloren. Beim Verfahren nach vorliegender Erfindung hat es sich gezeigt, dass der infolge der Isolierungsprozedur erlittene Verlust beträchtlich verringert wird. Werden z.
B. zwei Kohlenstoffatome hydroxyliert, so wird der Verlust um etwa 50'% ver- ringert,
und bei Hydroxylierungen von drei Kohlen stoffatomen in einem einzigen Reaktionsgemisch um etwa 67'%. Wegen der hohen Kosten der erzeugten Verbindungen besitzt jede Verlustverringerung einen beträchtlichen wirtschaftlichen Wert. Es ist aber auch möglich, Mikroorganismenstämme zu verwen den, die, obschon sie vom Standpunkt der Hydroxy- lierung aus etwas weniger wirkungsvoll sind, aus an dern Gründen, z.
B. wegen der Nährerfordernisse, der Stabilität und der Erhältlichkeit, wünschenswer ter sind.
Zur Durchführung des Verfahrens nach vorlie gender Erfindung kommen verschiedene Arbeits weisen in Frage. Die verschiedenen Stämme der Mi kroorganismen können alle auf einmal zugegeben werden oder kontinuierlich oder in unregelmässigen Intervallen während der Gärperiode. Ebenso kann nur eine einzige Mikroorganismenart zu Beginn der Gärperiode oder kontinuierlich oder in unregel mässigen Intervallen während derselben beigegeben werden, und am Ende der Gärperiode oder im Ver laufe des Gärzyklus kann die nächste Mikroorga- nismenart zugegeben werden. Es kann aber auch irgendeine Kombination dieser beiden Vorgehen benützt werden.
In welcher Reihenfolge die verschiedenen Mikro organismen zur Hydroxylierung der verschiedenen Stellungen des Steroids zugegeben werden, ist gleichgültig. Es wäre zu erwarten, dass die Verwen dung gewisser Mikroorganismen des adaptiven Typs, das heisst solcher Mikroorganismen, die erst in Be rührung mit einem geeigneten Steroid das betreffende Enzym produzieren, wegen unerwünschter Anpas sung zur Bildung von unerwünschten hydroxy- lierten Steroiden führen oder die Gegenwart ge wisser Gruppen der Hydroxylierung entgegenarbeiten würde.
Welche Typen von Mikroorganismen benützt werden, ist aber nicht von Belang, ausgenommen, dass vorteilhaft ein Mikroorganismus verwendet wird, der für die spezielle, zu hydroxylierende Stel lung in hohem Grade selektiv ist, das heisst einen solchen, der einen Ertrag von wenigstens 30'%, vor- zugsweise aber wenigstens 501/o, vom gewünschten hydroxylierten Steroid ergibt.
Dieser Ertrag variiert jedoch gemäss dem ver wendeten Gärboden, und eine kleine Senkung der angeführten Erträge kann in Kauf genommen wer den, wenn dafür die Verwendung gewisser Nähr böden erleichtert wird. Die Tabelle 1 zeigt eine Liste von Mikroorga nismen, die in der 11-Stellung hydroxylieren, und die spezielle Konfiguration, in der diese 11-Hydroxy- lierung stattfindet:
EMI0003.0005
EMI0003.0006
Für die Hydroxylierung der 11-Stellung wird die Verwendung eines hydroxylierenden Stammes von Fungis der Familie Dematiaceae oder von hydroxy- lierenden, von diesen Mikroorganismen erzeugten Enzymen vorgezogen, da diese Organismen selektiv hydroxylieren. Eine speziell wirkungsvolle Gruppe gehört zur Gattung Spondylocladium. Für die Ein führung der Hydroxygruppe in 11-Stellung in der ss-Konfiguration,
wie sie beim Hydrokortison vor liegt, ist der Stamm F4-1568 der bevorzugte Orga nismus. Die Verwendung der Species Aspergillus ochraceus des Genus Aspergillus ist ebenfalls hoch erwünscht für die Hydroxylierung, da diese Species in lla-Stellung hydroxylierte Produkte mit hohem Ertrag ergibt.
Die Verwendung der andern in der Tabelle 1 angeführten Mikroorganismen zur Einführung einer Hydroxygruppe in die 11-Stellung ist, obschon diese für das Verfahren nach der Erfindung geeignet sind, doch weniger wünschenswert, da sie nicht das. selek tive Qualitätsmerkmal der Familie Dematiaceae und der Species A. ochraceus aufweisen, und deshalb bei ihrer Verwendung einige unerwünschte Produkte entstehen. Eine Schwierigkeit besteht darin, dass viele von diesen andern hydroxylierenden Mikro- organismen, wie z.
B. verschiedene Species der Mucorales, in ihren Nähranforderungen sehr spezi fisch und daher die zum Züchten solcher Mikro organismen geeigneten Nährböden beschränkt sind. Ebenso werden die Sporen mancher Phycomyceten, einschliesslich der Mucorales, durch den Gefrier trocknungsprozess zerstört, wodurch sich grosse Schwierigkeiten für das Beibehalten ihrer wünschens werten Eigenschaften ergeben, da die Kulturen dege nerieren.
Ferner wachsen die Mucorales sehr schwer im untergetauchten Zustand und, wenn sich auf der Oberfläche der Gärflüssigkeit Schaum an sammeln kann, so sammeln sie sich im Schaum an und entwickeln sich in der Form eines Häutchens auf der Oberfläche der Kulturflüssigkeit.
Diese Bil dung eines Oberflächenhäutchens ist unerwünscht, da dieses den Mikroorganismus an der engen Be rührung mit dem im Hauptteil der Gärbrühe ent- haltenen Steroid hindert. Unter solchen Umständen sind daher grosse Mengen von Schaumschutzmitteln erforderlich, wodurch jedoch die Isolation der ge wünschten hydroxylierten Steroide erschwert wird.
Die Tabelle 2 führt eine Reihe von Mikro organismen an, die in der 17-Stellung hydroxylieren. Es sind aber auch andere Species der Gattung Tri- choderma für die Hydroxylierung des 17-Kohlen- stoffatoms geeignet.
EMI0004.0013
<I>Tabelle <SEP> 2</I>
<tb> <U>Mikroorganismus <SEP> Stellung</U>
<tb> Glicoladium <SEP> 17a
<tb> Trichoderma <SEP> 17a
<tb> Trichoderma <SEP> lignorum <SEP> 17a
<tb> <SEP> F5-1688 <SEP> 17a
<tb> <SEP> album <SEP> 17a
<tb> <SEP> glaucum <SEP> 17a
<tb> <SEP> nigrovirena <SEP> 17a
<tb> <SEP> königi <SEP> 17a
<tb> <SEP> viride <SEP> 17a
<tb> <SEP> nunbergii <SEP> 17a
<tb> <SEP> narcissi <SEP> 17a Die Tabelle 3 führt eine Reihe von Mikroorga nismen an, die die 21-Stellung hydroxylieren. Ausser den genannten sind aber auch noch andere Species der Familie Sphaeroidaceae und insbesondere die jenigen des Genus Wojnowicia geeignet.
EMI0004.0019
<I>Tabelle <SEP> 3</I>
<tb> <U>Mikroorganismus <SEP> Stellung</U>
<tb> Sphaeroidaceae <SEP> 21
<tb> Wojnowicia <SEP> 21
<tb> <SEP> graminis <SEP> (MF-2419) <SEP> 21
<tb> Hendersonia <SEP> 21
<tb> <SEP> acicola <SEP> 21
<tb> <SEP> herpotricha <SEP> 21
<tb> <SEP> phragmitis <SEP> 21
<tb> rubi <SEP> 21
<tb> <SEP> aberrans <SEP> 21
<tb> <SEP> abietus <SEP> 21
<tb> Ceratopyonis <SEP> 21
<tb> Eriosporina <SEP> 21
<tb> Prosthemium <SEP> 21
<tb> Cryptostictes <SEP> 21
<tb> Dilophosphora <SEP> 21
<tb> Uroconis <SEP> 21
<tb> Phoma <SEP> 21
<tb> <SEP> umicola <SEP> 21
<tb> <SEP> hibernica <SEP> 21
<tb> betae <SEP> 21
<tb> Pyrenochaeta <SEP> 21
<tb> <SEP> decipiens <SEP> 21
<tb> Coniothyrium <SEP> fuchelü <SEP> 21
<tb> Septoria <SEP> aesculi <SEP> 21
<tb> Phopsis <SEP> citri <SEP> 21
<tb> Septoria <SEP> apü <SEP>
21
<tb> lycopersici <SEP> 21 Die Hydroxylierung der 6-Stellung kann mittels gewisser Stämme des Genus Rhisopus, z. B. arrhisus und RH-176, ausgeführt werden. Verschiedene an dere Stellungen des Steroids, z. B. die 7,8- und 14-Kohlenstoffatome, können auch mittels anderer, bekannter Mikroorganismen hydroxyliert werden.
Die oben angeführten Mikroorganismen können von bekannten Quellen bezogen werden, z. B. von den Northern Regional Research Laboratories in Peoria, Illinois, von der American Type Culture Collection in Washington, D. C. oder vom Centraal- bureau voor Schimmelculture in Baarn, Holland. Sie können aber auch mittels bekannter Techniken aus natürlichen Quellen gewonnen werden. Die Züchtung der Mikroorganismen erfolgt z. B.
unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium und in enger Berührung mit dem zu hydroxylierenden Steroid, wobei das Züchten des Mikroorganismus fortgesetzt wird, bis die ge wünschte Hydroxylierung eingetreten ist.
Das Ver fahren kann aber auch ausgeführt werden mittels von ihrem Nährboden getrennter, homogen verteil ter Zellen, indem zuerst der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem Gärmedium gezüch tet, die Zellen vom Nährmedium getrennt und diesen fastenden Zellen das Steroid beigefügt wird, worauf die aeroben Bedingungen genügend lang fort gesetzt werden, bis die gewünschte Hydroxylierung eingetreten ist.
Das Steroid kann dem Nährmedium als eine Suspension in einem Mittel, z. B. Wasser, zugefügt werden, oder als eine Lösung in einem Lösungs mittel, z. B. Aceton, Propylglykol, Dimethylform- amid oder Dimethylacetamid, oder in feinverteilter Form, z. B. als festes, sehr feines Pulver. Im all gemeinen ist es wünschenswert, dass das Steroid in sehr feinverteilter Form vorliegt, damit ein maxi maler Kontakt mit dem hydroxylierenden Kultur medium ermöglicht und die Vollendung der Reak tion gewährleistet wird.
Das vorliegende Verfahren kann sowohl in Ober flächenkulturen wie in untergetauchten Kulturen, von unter aeroben Bedingungen wachsenden Mikro organismen ausgeführt werden, obschon es für praktische Zwecke am besten durch Züchten der Mikroorganismen im untergetauchten Zustand in einem wässerigen, das Steroid enthaltenden Gär- medium ausgeführt wird.
Es ist von Wichtigkeit, dass ein Gärmedium aus gesucht wird, welches für das Züchten aller verwen deten Mikroorganismenarten geeignet ist, und die Bedingungen, unter welchen jede Mikroorganismen art wirkungsvoll hydroxyliert, müssen während seiner Hydroxylierungsperiode aufrechterhalten wer den. Da die Steroide sowohl nacheinander wie auch miteinander mit Erfolg hydroxyliert werden können, gestattet das erfindungsgemässe Verfahren eine gute Kontrolle der für jeden hydroxylierenden Organis mus günstigsten Bedingungen.
Die Verwendung einer Kombination von Mikro organismen im vorliegenden Verfahren ermöglicht einen wirkungsvollen Gebrauch des Nährmediums, indem die Ausnützung desselben vollständig sein kann. In andern Gärverfahren ist die Ausnützung des Nährmediums unvollständig. Dieser Faktor wirkt sich in einer Reduktion der Kosten der Ausführung des Verfahrens aus und ermöglicht somit eine wei tere Wirtschaftlichkeit.
Zum Züchten der hydroxylierenden Stämme des Mikroorganismus geeignete wässrige Nährmedia müssen Quellen von assimilierbarem Kohlen- und Stickstoff enthalten sowie Spuren anorganischer Salze. Irgendwelche der gewöhnlichen Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, z. B. Dextrose, Cerelose, Invertmelasse, Glukose und dergleichen, die in Gär- medien verwendet werden, können verwendet wer den. Ebenso können komplexe Stickstoffquellen, wie sie gewöhnlich in kommerziellen Gärprozessen ver wendet werden, auch für die vorliegenden Zwecke gebraucht werden, wie z.
B. Laktalbumin-Auszug ( Edamin ) und Maisaufbrühflüssigkeit, oder anor ganische Stickstoffquellen, z. B. dibasisches Ammo- niumphosphat, Ammoniumnitrat und dergleichen, Spuren von andern Substanzen, z. B. Nikotinamid oder anorganischen Salzen, z.
B. von löslichen Salzen von Magnesium, Zink, Kalium, Natrium, Phosphor und Eisen, stehen gewöhnlich in komplexen Quellen von Kohlen- und Sauerstoff zur Verfügung oder können dem Gärmedium beigefügt werden, um ein maximales Wachstum des hydroxylierenden Mikro organismus anzuregen.
Nachfolgend sind Beispiele von wässrigen Nähr medien aufgeführt, die im vorliegenden Verfahren benützt werden können.
EMI0005.0020
<I>Medium <SEP> Nr. <SEP> 1</I>
<tb> Handelsgängige <SEP> Dextrose <SEP> (Cerelose) <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Handelsgängiger <SEP> Laktalbuminauszug <SEP> (Edamin) <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g
EMI0005.0021
<I>Medium <SEP> Nr.2</I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invertmelasse <SEP> <B>100</B> <SEP> g
<tb> Handelsgängiger <SEP> Laktalbuminauszug <SEP> (Edamin)
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g
EMI0005.0022
<I>Medium <SEP> Nr.3</I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invertmelasse <SEP> <B>100</B> <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g
EMI0005.0023
<I>Medium <SEP> Nr.4</I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invertmelasse <SEP> 100 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 20 <SEP> g
EMI0005.0024
<I>Medium <SEP> Nr. <SEP> 5</I>
<tb> Black <SEP> Strap <SEP> Invertmelasse <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> <B>6,3-</B>
<tb> <B>C</B>
EMI0005.0025
<I>Medium <SEP> Nr.
<SEP> 6</I>
<tb> Dextrose <SEP> 50 <SEP> g
<tb> (NH4)2HP0 <SEP> 7,5 <SEP> g
<tb> <B>K2HPO4</B> <SEP> 1 <SEP> g
<tb> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> KCl <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> ZnS04-7H <SEP> 20 <SEP> 0,01 <SEP> g Alle Medien Nr. 1-6 werden mit destilliertem Wasser auf 1 Liter Nährflüssigkeit ergänzt und das pH mit Natriumhydroxyd auf 6,5 festgesetzt.
EMI0005.0029
<I>Medium <SEP> Nr.7</I>
<tb> Kubanische <SEP> Black <SEP> Strap <SEP> Melasse <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g Destilliertes Wasser wird zugegeben bis zu einem Totalvolumen von 1 Liter Nährflüssigkeit und das PH mit Natriumhydroxyd auf 5,9 festgesetzt.
EMI0005.0031
<I>Medium <SEP> Nr. <SEP> 8</I>
<tb> Kubanische <SEP> Black <SEP> Strap <SEP> Melasse <SEP> 100 <SEP> g
<tb> Maisaufbrühflüssigkeit <SEP> 5 <SEP> g Destilliertes Wasser wird zugegeben bis zu einem Totalvolumen von 1 Liter Nährflüssigkeit und das pH mit Natriumhydroxyd auf 5,8 festgesetzt.
Die Zugabe von kleineren Mengen von Schaum schutzmitteln ist, obschon nicht unbedingt erforder lich; bei einigen Gärmedien angebracht. So hat sich gezeigt, dass die Zugabe eines substituierten Oxazalins zu gewissen Gärmedien besonders geeignet ist zur Verringerung der Schaummenge, obschon auch an dere Schaumschutzmittel verwendet werden können. Oxazalin ist ein nichtflüchtiges, kationisches, ober flächenaktives Mittel vom Amintyp, das unter dem Namen Alkaterg C im Handel erhältlich ist.
Durch das vorliegende Verfahren können die Betriebskosten gesenkt werden. Insbesondere trifft dies zu für den dabei beteiligten Zeitfaktor, die Re duktion der benötigten Ausrüstung und den Kraft verbrauch. Beim Ausüben des vorliegenden Ver fahrens ist nur ein Gärbottich erforderlich, wo bis jetzt zwei oder mehr benötigt wurden. Die Sterili sation des Gärmediums kann in einem Schritt aus geführt werden, wodurch sich eine weitere Wirt schaftlichkeit ergibt.
Das Verfahren nach der Erfindung eignet sich besonders zur Umwandlung von 4-Pregnen-3,20- dion, einem relativ billigen Material, in 4-Pregnen- 11,ss,17a,21-triol-3,20-dion durch die Einführung von 11f"-, 17a- und 21-Hydroxygruppen. Es können aber auch andere Steroide hydroxyliert werden, wo durch Hormone bzw. Zwischenstufen für die Her stellung solcher erzeugt werden.
Das vorliegende Verfahren ist daher allgemein anwendbar auf ge sättigte und ungesättigte Zyklopentanpolyhydrophen- anthrene. Diese können Substituenten enthalten, z. B. Keto, Hydroxyl, Acyloxy, Halogen, Alkyl und dergleichen, in verschiedenen Stellungen des Zyklo- pentanpolyhydrophenanthrenkerns. Ausserdem kön nen solche Verbindungen eine Keto-, eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoff-, eine Karbon säure-Seitenkette in 17-Stellung aufweisen.
Beispiele von Klassen solcher Zyklopentanpolyhydrophen- anthrene sind: Pregnane, Pregnene; Allopregnene, Allopregnane, Androstane, Gallensäuren und deren Ester, Sterine, Sapogenine und deren Derivate.
Es können also in den Stellungen 11, 17, 21, 6 und in verschiedenen andern zwecks Gewinnung der ent sprechenden Polyhydroxy-Derivate folgende wichtige Steroide hydroxyliert werden:
EMI0006.0016
4-Pregnen-3,20-dion;
<tb> 4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion;
<tb> 4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion-21-acetat;
<tb> Desoxykortikosteron;
<tb> 4-Pregnen-17a-21-diol-3,20-dion;
<tb> 3-Keto-cholsäure;
<tb> Lithocholsäure;
<tb> Diosgenin;
<tb> 5,6-Dichlor-diosgenin;
<tb> 4-Pregnen-3f-ol-20-on;
<tb> 5,6-Dichlor-pregnan-3iss-ol-20-on;
<tb> 5,6-Dichlor-pregnan-21-ol-3,20-dion;
<tb> 4-Pregnen-6-a-3,20-dion <SEP> usw.
Beispielsweise kann ein 11-, 17-, 21-Desoxy- pregnen gemäss folgendem Vorgehen hydroxyliert werden: Drei Muster eines sterilen Kulturmediums, wie sie oben angeführt sind, werden zuerst je mit einer verschiedenen Mikroorganismenart, von denen die erste selektiv in 21-, die zweite in 17- und die dritte in 11-Stellung hydroxyliert, geimpft, indem eine kleine Menge von Sporensuspension oder einer vege tativen Züchtung des Organismus eingeführt wird.
Das mit dem in 21-Stellung hydroxylierenden Mikro organismus geimpfte Nährmedium wird dann bei einer Temperatur von etwa 20-45 C bebrütet, während es in Gegenwart von Sauerstoff für eine Periode von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen umgerührt wird. Dann wird eine Lösung eines in 11-, 17- und 21-Stellung keinen Sauerstoff aufwei senden Pregnens in einem Lösungsmittel, z.
B. Pro- pylglykol, dem Gärmedium zugesetzt und das Um rühren und Belüften für etwa 5-30 Stunden oder bis die Hydroxylierungsaktion fertig ist, fortgesetzt. Während dieser Gärperiode wird das zweite, den in der 17-Stellung hydroxylierenden Mikroorganismus enthaltende Medium bei einer Temperatur von etwa 20-45 C bebrütet, wobei es in Gegenwart von Sauerstoff für eine Periode von einigen Stunden bis zu mehreren Tagen umgerührt wird. Dieses Medium wird dann dem vergärten pregnenhaltigen Medium zugesetzt und das Umrühren und Belüften für etwa 5-30 Stunden fortgesetzt.
Dann wird der in 11-Stel- lung hydroxylierende Mikroorganismus zugesetzt, der in gleicher Weise bebrütet worden ist, und die Gärung für etwa 5-30 Stunden fortgesetzt. Ist diese Hydroxylierung vollständig, so kann das 11-, 17-, 21-Trihydroxy-pregnen aus der Gärbrühe durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel isoliert werden.
Für die sen Zweck geeignete Lösungsmittel sind: Chloroform, Methylenchlorid, 2-Methyl-5-äthylpyridin, organische Säureester, aromatische Kohlenwasserstoffe, Ketone und Amide usw. Die das hydroxylierte Steroid ent haltende Lösung kann dann verdampft werden, wo bei das gewünschte Produkt zurückbleibt, das durch Umkristallisation oder andere bekannte Verfahren weiter gereinigt werden kann.
Das Verfahren nach der Erfindung kann aber auch so durchgeführt werden, dass nur die hydroxy- lierenden, durch die Gärung der Mikroorganismen erzeugten Enzyme mit dem zu hydroxylierenden Steroid in Berührung gebracht werden. Dies kann geschehen durch Abtrennung der hydroxylierenden Enzyme aus der Gärbrühe gemäss bekanntem Vor gehen und indem diese Enzyme mit einem Steroid in einem wässrigen Mittel in enge Berührung gebracht werden, auf ähnliche Art und Weise wie beim oben angeführten Vorgehen mit einem Gärmedium.
Auf ähnliche Weise wie oben angeführt kann das 11-, 17-, 21-Trihydroxy-pregnen, bevor es vom Me dium getrennt wird, mit andern Mikroorganismen weiter vergärt werden zwecks Hydroxylierung an derer Stellungen. Es kann z. B. das oben angeführte Vorgehen fortgesetzt werden mit einem Mikroorga nismus, der in 6-Stellung hydroxyliert, z. B. mit Rhizopus arrhizus, und das 6,11,17,21-Tetrahy- droxy-pregnen wird dann von der Gärbrühe getrennt.
<I>Beispiel 1</I> Vier Muster von etwa 50 cm- eines Nähr mediums, wie es oben unter Nr. 1 angegeben ist, wurden während 20 Minuten bei 170 C in 250-cm'- Flaschen sterilisiert. Jedes dieser Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer vegetativen Züchtung der Kultur MF-2419 geimpft. Die geimpften Mischun gen wurden dann mittels eines mit 220 U. p. M. um laufenden Rührers während etwa 72 Stunden bei 28 C umgerührt. Eine sterile Lösung von 20 mg 4-Pregnen-3,20-dion in 5 cm3 Propylen wurde jeder Flasche zugesetzt und das Umrühren mit der glei chen Tourenzahl für etwa 48 Stunden fortgesetzt.
Dann wurden 50 cms einer Kultur, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm?- einer vegetativen Züchtung F4-1568 enthielt, jeder Flasche zuge setzt. Diese Kultur wurde erhalten durch Entwickeln des Mikroorganismus für drei Tage im genannten Medium. Die etwa 100 cm-- enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und einzelne Flaschen entfernt nach 12, 24, 48 und 72 Stunden Inkubation und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden auf Papierstreifen getüpfelt und mit dem Lösungs system Benzol/Formamid nach der von Zaffaroni Science 111, 6 (1950) angegebenen Technik ent wickelt.
Es wurde dabei ein Ultraviolett absorbie rendes, Tetrazolium reduzierendes Produkt gebildet, das den gleichen Beweglichkeitsgrad aufwies wie 4-Pregnen-11.,ss,21-diol-3,20-dion. Ein Band des Oxy dationsproduktes wurde vom Papier eluiert und das Ultraviolettspektrum seines Schwefelsäure-Chromo- gens erhalten.
Es stellte sich als identisch heraus mit demjenigen von 4-Pregnen-llss,21-diol-3,20-dion. <I>Beispiel 2</I> Sechs Muster von etwa 50 cms eines Nährmit tels gemäss Nährmedium Nr. 1 wurden für 20 Mi nuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer vegetativen Züchtung von MF-2419 geimpft. Die geimpften Mischungen wurden dann mit einem Rührer mit einer Tourenzahl von 220 während etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt.
Eine sterile Lö sung von 10 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 2,5 cm3 Propylglykol wurde jeder Flasche zugesetzt und das Umrühren mit der gleichen Tourenzahl für etwa 48 Stunden fortgesetzt. Dann wurden jeder Flasche 50 em3 einer Kulturzüchtung, die ursprünglich das Medium Nr. 1 und 5 cm3 einer vegetativen Züch tung F4-1568 enthielt, zugesetzt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch Entwickeln des Mi kroorganismus in diesem Medium während drei Tagen.
Die je etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und einzelne Flaschen nach 6 bzw. 12, 24, 48, 72 und 98 Stunden Inkubation ent fernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden in Form von Flecken auf Papierstreifen auf getragen und mit dem Lösungssystem Benzol-Form- amid entwickelt.
Es wurde ein Ultraviolett absorbie rendes, Tetrazolium reduzierendes Produkt gefun den, das die gleiche Beweglichkeit aufwies wie 4-Pregnen-1 lss,21-diol-3,20-dion. <I>Beispiel 3</I> Sechs Muster von je etwa 50 cm3 eines Nähr bodens ,mit der Zusammensetzung des Mediums Nr. 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Fla- schen sterilisiert. Jedes dieser Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 Vegetativzüchtung von Kultur F4-1568 geimpft.
Die geimpften Muster wurden dann mit einem Rührer und einer Tourenzahl von 220 für etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt. Eine sterile Lösung von 10 mg 4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion in 2,5 cm3 Propylglycol wurde jeder Flasche zugesetzt und für weitere 24 Stunden mit der gleichen Touren zahl umgerührt. Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Medium Nr. 1 und 5 cm-' einer Vegetativzüch- tung MF-2419 enthielt. Diese Kulturzüchtung wurde erhalten durch Entwickeln des Mikroorganis mus in diesem Medium für drei Tage.
Die etwa 100 em3 enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und die einzelnen Flaschen nach 6 bzw. 12, 24, 48, 72 und 96 Stunden Inkubation entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden in Form von Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid-Methanol entwickelt. Es wurde gegenüber 4-Pregnen-llss,17a,21-triol- 3,20-dion ein Umsetzungsprodukt beobachtet, das Ultraviolettstrahlen absorbierte und Tetrazollum re duzierte.
Das Ultraviolettspektrum des Produktes in konzentrierter Schwefelsäure stellte sich als iden tisch heraus mit demjenigen von 4-Pregnen- l lss,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 4</I> Fünf Muster von je etwa 50 cms einer Kultur mit der Zusammensetzung von Medium Nr.
1 wur den für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer Vegetativzüchtung der Kultur MF-2419 geimpft. Mit einem Rührer von der Tourenzahl 220 wurden dann die geimpften Mischungen für etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt.
Jeder Flasche wurde eine sterile Lösung von 10 mg von 4-Pregnen- 3,20-dion in 2,5 cm3 Propylglykol zugesetzt und für weitere 48 Stunden mit der gleichen Drehzahl umge rührt. Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die anfänglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm?, einer Vegetativzüchtung F5-1688 enthielt. Diese Kulturzüchtung wurde erhalten durch dreitägiges Entwickeln des Mikro organismus in diesem Medium.
Die je etwa<B>100</B> cm3 enthaltenden Flaschen wurden wiederum mit der selben Tourenzahl und derselben Temperatur wäh rend 72 Stunden umgerührt. Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung F4-1568 enthielt. Diese Züchtung wurde auf ähnliche Art und Weise wie die andere erhalten. Die jetzt etwa 150 cm3 enthalten den Flaschen wurden umgerührt und je nach 6, 12, 24, 48 und 72 Stunden Inkubation entfernt und mit Chloroform extrahiert.
Die Extrakte wurden in Form von Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid-Methanol entwickelt. Ein Ultraviolett absorbierendes, Tetrazolium reduzieren des Produkt wurde beobachtet, dessen Rf und Schwe- felsäurespektrum identisch waren mit 4-Pregnen- 11ss,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 5</I> Fünf Muster von je etwa 50 em3 eines Nähr bodens von der Zusammensetzung des Mediums Nr. 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3- Flaschen sterilisiert.
Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Aspergillus niger geimpft. Die geimpften Mischungen wurden dann mit einem Rührer von 220 U. p. M. während etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt. Eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 0,5 cm3 Dimethylformamid wurde dann jeder Flasche zugesetzt und für weitere 48 Stunden um gerührt.
Dann wurde jeder Flasche eine Kultur züchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung Trichoderma albuni enthielt. Diese Kulturzüchtung wurde erhalten durch Entwickeln des Mikroorganis mus im Medium für 48 Stunden. Die etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und nach 48 Stunden entfernt. Eine der Flaschen wurde mit Chloroform extrahiert und als Flecken auf einen Papierstreifen aufgebracht.
Der Flecken war in der Region von 4-Pregnen-lla,17a-diol-3,20-dion. 50 cm3 einer Kulturzüchtung, enthaltend 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Hendersonia acicola im Nährmedium Nr. 1, wurden jeder der übrigen Fla schen zugesetzt. Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Flaschen wurden umgerührt und einzeln je nach 24 bzw. 48, 72 und 96 Stunden Inkubation entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden als Flecken auf Papier aufgetragen und mit dem Lö sungssystem Benzol / Formamid entwickelt.
Die Flecken befanden sich in der Region von 4-Pregnen- 11 a,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 6</I> Fünf Muster von je etwa 50 cm3 eines Nähr bodens gemäss dem Nährmedium 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm- einer Vegetativzüchtung einer Kultur von Trichoderma glaucum geimpft. Die geimpften Mischungen wurden dann mit einem Drehrührer mit der Tourenzahl 220 für etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt.
Eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 0,5 cm3 Dimethylformamid wurde jeder Flasche zugesetzt und das Umrühren mit der gleichen Tourenzahl für etwa 60 Stunden fortgesetzt. Dann wurden jeder Flasche 50 cms einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Wojnowicia gramines enthielt. Diese Kulturzüchtung wurde er halten durch dreitägige Entwicklung des Mikroorga nismus im genannten Nährmedium.
Die etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden mit dersel ben Geschwindigkeit für 48 Stunden umgerührt. Eine dieser Flaschen wurde mit Chloroform extra hiert und der Extrakt als Flecken auf einen Papier streifen aufgetragen. Der Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion. Jeder der übrigen Flaschen wurden 50 cm3 einer Kultur züchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Cunninghamella blackesleana enthielt.
Diese Kulturzüchtung wurde durch eintägiges Entwickeln des Mikroorganismus im genannten Nährmedium er halten. Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Fla schen wurden umgerührt und einzeln nach 12 bzw. 24, 48 und 72 Stunden Inkubation entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden als Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid-Methanol entwickelt.
Die Flecken befanden sich in der Region von 4-Pregnen- 11ss,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 7</I> Es wurde das Vorgehen nach Beispiel 6 einge schlagen, ausgenommen, dass am Anfang die Kultur Wojnowicia graminis und dann die Kultur Tricho- derma glaucum verwendet wurde, gefolgt von Cun- ninghamella blackesleana. Die Ergebnisse waren die gleichen wie beim Beispiel 6.
<I>Beispiel 8</I> Fünf Muster von je etwa 50 cm3 des Nähr mediums Nr. 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 em3 einer Vegetativzüchtung einer Kultur von Penicillium adametzi geimpft. Die ge impften Mischungen wurden dann mit einem Dreh- rührer mit 220 U. p.
M. für etwa 48 Stunden bei 28 C umgerührt. Jeder Flasche wurde eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 0,5 cm3 Dimethylformamid zugesetzt und das Um rühren mit derselben Drehzahl für 48 Stunden fort gesetzt. Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Trichoderma lignorum enthielt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch dreitägiges Ent wickeln des Mikroorganismus im genannten Nähr medium.
Die etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden wiederum mit derselben Drehzahl und Temperatur während 60 Stunden umgerührt. Eine dieser Flaschen wurde mit Chloroform extrahiert und der Extrakt als Flecken auf einen Papierstreifen aufgetragen. Der Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-lla,17a-diol-3,20-dion. 50 cm3 einer Kulturzüchtung, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Wojnowicia graminis enthielt, wurden jeder der übrigen Flaschen zugesetzt.
Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Flaschen wurden wiederum umgerührt und nach 24 bzw. 48, 72 und 96 Stunden Inkuba tion entfernt und mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden in Form von Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid- Methanol entwickelt.
Der Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-lla,17a,21-triol-3,20-dion. <I>Beispiel 9</I> Es wurde das Vorgehen nach Beispiel 8 einge schlagen, ausgenommen, dass die Kultur von Wojno- wicia graminis anfänglich verwendet wurde, dann die Kultur Trichoderma lignorum und zum Schluss Penicillium adametzi. Die Ergebnisse waren diesel ben wie bei Beispiel B.
<I>Beispiel 10</I> Es wurde das Vorgehen nach Beispiel 8 einge schlagen, ausgenommen, dass anfänglich die Kultur Trichoderma lignorum, dann die Kultur Wojnowicia graminis und zum Schluss Penicillium adametzi ver wendet wurden. Das Ergebnis war dasselbe wie beim Beispiel B.
<I>Beispiel 11</I> Es wurde das Vorgehen nach Beispiel 8 einge schlagen, ausgenommen, dass die Kultur von Penicil- lium adametzi zuerst, dann die Kultur Wojnowicia graminis und zum Schluss Trichoderma lignorum verwendet wurde. Das Ergebnis deckte sich mit demjenigen nach Beispiel B. <I>Beispiel 12</I> Fünf Muster von je etwa 50 cm3 eines Nähr bodens Nr. 1 wurden für 20 Minuten bei 120 C in 250-cm3-Flaschen sterilisiert.
Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm3 einer Vegetativzüchtung F5-1688 geimpft. Die geimpften Mischungen wurden dann mit einem Rührer mit der Tourenzahl 220 während etwa 72 Stunden bei 28 C umgerührt. Jeder Flasche wurde eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 0,5 cm3 Dimethylform- amid zugesetzt und das Umrühren für etwa 48 Stun- nen fortgesetzt.
Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüch- tung Wojnowicia graminis enthielt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch dreitägiges Ent wickeln des Mikroorganismus im genannten Medium. Die jetzt etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wur den mit derselben Drehzahl für 48 Stunden umge rührt. Eine dieser Flaschen wurde dann mit Chloro form extrahiert und als Flecken auf einen Papier streifen aufgetragen.
Der Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion. 50 cm3 einer Kulturzüchtung, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Omphalistra lucida (MF-22101) enthielt, wur den jeder der übrigen Flaschen zugesetzt. Diese Kulturzüchtung wurde erhalten durch siebentägiges Entwickeln des Mikroorganismus im genannten Nährmedium. Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Flaschen, wurden wiederum umgerührt und nach 12 bzw. 24, 48 und 72 Stunden Imkubation weggenom men und mit Chloroform extrahiert.
Die Extrakte wurden als Flecken auf Papier aufgetragen und im System Chloroform/Formamid-Methanol entwickelt. Es wurde ein Tetrazolium reduzierender Flecken in der Region von 4-Pregnen,-11P, "17a,21-triol-3,20- dion beobachtet. Mit einem Teil des Rückstandes wurde das Ultraviolettspektrum in konzentrierter H.S04 erhalten, das sich als demjenigen von 4-Pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20-dion ähnlich erwies.
Ein zweiter Teil des Extraktes wurde wiederum als Flecken auf Papier aufgetragen und dann mit Di- chromat in Eisessig oxydiert. Das Papier wurde ent wickelt und zeigte einen Flecken von derselben Be weglichkeit wie 4-Pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion. Ein weiterer Teil wurde nach dem Eosinophil-Test als aktiv befunden.
<I>Beispiel 13</I> Fünf Muster von je etwa 50 cms des Nähr mediums Nr. 1 wurden in 250-cm3-Flaschen für 20 Minuten bei 120 C sterilisiert. Jedes Muster wurde dann mit etwa 5 cm?, einer Vegetativzüchtung von Hendersonia rubi geimpft. Diese geimpften Mischun gen wurden dann mit einem Drehrührer mit einer Drehzahl von 220 für etwa 72 Stunden bei 28 C umgerührt. Jeder Flasche wurde eine sterile Lösung von 20 mg von 4-Pregnen-3,20-dion in 3 cm3 Pro pylglyco, zugesetzt und für weitere 48 Stunden um gerührt.
Dann wurden jeder Flasche 50 cm3 einer Kulturzüchtung zugesetzt, die ursprünglich das Nähr medium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Trichoderma nigrovirens enthielt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch dreitägiges Ent wickeln des Mikroorganismus im genannten Nähr medium. Die etwa 100 cm3 enthaltenden Flaschen wurden mit der gleichen Drehzahl für 48 Stunden umgerührt. Der Inhalt einer der Flaschen wurde dann mit Chloroform extrahiert und der Extrakt in Form eines Fleckens auf einen Papierstreifen auf getragen.
Dieser Flecken befand sich in der Region von 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion. Jeder der übrigen Flaschen wurden 50 cm3 einer Kulturzüch tung zugesetzt, die anfänglich die das Nährmedium Nr. 1 und 5 cm3 einer Vegetativzüchtung von Stig- mina platani (MF-2395) enthielt. Diese Kultur züchtung wurde erhalten durch dreitägiges Ent wickeln des Mikroorganismus im genannten Nähr medium. Die jetzt etwa 150 cm3 enthaltenden Flaschen wurden wieder für 24 Stunden umgerührt und mit Chloroform extrahiert.
Die Lösungen wur den zusammengeschüttet, bis fast zur Trockenheit verdampft, als Flecken auf Papierstreifen aufgetra gen und entwickelt. Es wurde eine Tetrazolium re duzierende Komposition an der Stelle von 4-Pregnen- 11p,17a,21-triol-3,20-dion gefunden.