CH385204A

CH385204A - Verfahren zur Herstellung von Steroidverbindungen

Info

Publication number: CH385204A
Application number: CH7360659A
Authority: CH
Inventors: Takeda Rokuro; Nakanishi Itaru; Uchibayashi Masao; Kusaka Tsunaharu; Terumichi Jiro; Uchida Minoru; Katsumata Michio; Yoshino Kikuko; Fujitani Hiroshi; Nawa Hayao
Original assignee: Takeda Pharmaceutical
Priority date: 1958-05-26
Filing date: 1959-05-26
Publication date: 1964-12-15
Also published as: US3037915A

Description


  Verfahren     zur        Herstellung    von     Steroidverbindungen       Es wurden gefunden, dass man     Steroidverbindun-          gen    dadurch in wertvollere Steroidverbindungen über  führen kann, dass man sie mit einer Kultur eines  Mikroorganismus, welcher entweder zur     Gattung          Pseudomonas    oder zur Gattung     Serratia    gehört, be  handelt.  



  Im besonderen bezieht sich die vorliegende Er  findung auf ein Verfahren zur     1,2-Dehydrierung    von  Steroiden der     Pregnan-    oder     Allopregnanreihe,    z. B.  von     41-3-0n-    oder     41-3,20-Dion-Verbindungen    der       Pregnanreihe,    bei denen ausser den 11- und/oder       17-Stellungen    die     21-Stellung        sauerstoffhaltig    sein  kann oder nicht, oder von funktionellen Derivaten  davon.

   Als Ausgangsmaterial kann man 3-0n- oder       3,20-Dionverbindungen    der     Pregnanreihe,    deren       21-Stellung    sauerstoffhaltig sein kann oder nicht, oder  funktionelle Derivate davon verwenden.  



  Zur Durchführung der erfindungsgemässen Um  setzung kann man so vorgehen, dass man einen     Stamm     aus der Gattung     Pseudomonas    oder aus der Gattung       Serratia    in einem das obige Material enthaltenden,  sterilen Medium     aerob    bebrütet oder das aus den  Bakterien hergestellte     Redoxenzym    mit dem Material       aerob    in Berührung bringt, wobei zwischen den in  1- und     2-Stellung    befindlichen     Kohlenstoffatomen    des  Materials eines Doppelbindung gebildet wird.  



  Bei den funktionellen Derivaten     kann    es sich  beispielsweise um ein Steroidderivat handeln, welches  durch Überführung der     Hydroxylgruppe    in der 3-,  11-, 17-, 20- oder     21-Stellung    des Materials in eine  funktionelle Gruppe, wie z. B. Ester, Äther, Halo  genid,     Ketal,        Hydrazon,        Semicarbazon    usw., herge  stellt wird, oder aber um ein Steroidderivat, welches  durch Ersatz des in der 9-, 16- oder     19-Stellung    des  Materials haftenden Wasserstoffatoms durch Halogen,    wie z.

   B.     9a-Fluor    und     -Chlor,    oder durch eine       Hydroxylgruppe    erhalten wird.  



  Typische Steroidverbindungen, welche man bei  der vorliegenden     Erfindung    als Ausgangsmaterial  verwenden kann,     sind    beispielsweise die folgenden:       Pregnan-3,20-dion,     4     4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion,     4     4-Pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion,     d     4-Pregnen-3,20-dion,     4     4-Pregnen-11ss,21-diol-3,20-dion,     4     4-Pregnen-21-ol-3,20-dion,     4     4-Pregnen-1        1ss,17a,21-triol-3,20-dion,          Allopregnan-3,20-dion,     d     4-Pregnen-21-ol-3,11,20-trion,

       d     4-Pregnen-1        6a,17a,21-triol-3;20-dion,          9a-Fluor-d        4-pregnen-1        1ss,17a,21-triol-3,20-dion,     d     4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion.     



  Ferner kann man jene Verbindungen verwenden,  welche aus den obigen Verbindungen durch     Vereste-          rung,        Verätherung    oder durch Ersatz der     Hydroxyl-          gruppe    durch ein Halogenatom oder durch über  führen der     Oxogruppe    in ein     Ketal,        Hydrazon    oder       Semicarbazon    erhalten werden.  



  Die erfindungsgemässe Umsetzung wird im allge  meinen dadurch zustande gebracht, dass man das  Material     mit    Bakterien der Gattung     Pseudomonas     oder der Gattung     Serratia    oder mit dem     Redoxenzym,     welches man aus den Bakterien unter     aeroben    Be  dingungen erhält, in Berührung bringt. Geht man so  vor, so werden die Endprodukte durch die folgende  Massnahme erhalten:     Bildung    einer Doppelbindung  zwischen dem     Cl    und     C2    mittels     Dehydrierung.     



  Die gemäss vorliegender Erfindung erhältlichen  Produkte sind wertvolle Arzneimittel oder wertvolle  Zwischenprodukte zur Herstellung derselben. So      kann man die     erfindungsgemäss        erhältlichen    Verbin  dungen nach dem Abtrennen aus dem Reaktions  gemisch mittels bekannter Methoden oder auch  ohne Abtrennen für die verschiedenen Zwecke ver  wenden.  



  Gemäss vorliegender Erfindung verwendet man  einen Bakterienstamm aus der Gattung     Pseudomonas     (nachstehend mit     Ps.    bezeichnet) oder der Gattung       Serratia    (nachfolgend mit S. bezeichnet). Typische       Arten    davon sind die folgenden:

         Ps.        boreopolis        Gray    und     Thornton,          Ps.        fluorescens        Migula,          Ps.        geniculata        (Wright)        Chester,          Ps.        putida        (Trevisan)        Migula,          Ps.        ovalis        Chester,

            Ps.        convexa        Chester,          Ps.        mephitica        Claydon    und Hammer,       Ps.        Oleovorans    Lee und     Chandler,          Ps.        arvilla        Gray    und     Thornton,          Ps.        aeruginosa        (Schroeter)        Migula,          Ps.        coronafaciens        (Elliot)

      Stevens,       Ps.        mildenbergii        Bergey    et     a1.,          Ps.        fragi        (Eichholz)        Huss        emend.        Hussong    et     a1.,          Ps.        tetrolens        Hayens,          Ps.        reptilivora        Caldwell    und     Ryerson,

            Ps.        riboflavina        Foster,          Ps.        striafaciens        (Elliot)    Starr und     Bulkholder,     S.     marcescens        Bizio,     S.     plymuthica        (Lehmann    und Neumann)       Bergey    et     a1.,     S.     indica    (Eisenberg)     Bergey    et     a1.,     S.

       kiliensis        (Lehmann    und Neumann)     Bergey     et     a1.,    und  S.     Piscatorum    (Lehmann und Neumann)     Breed.     Die obigen Namen sind aus      Bergey's    Manual of       Determinative        Bacteriology ,    7. Auflage, Verlag     The          Williams        and        Wilkins    Co., Baltimore,     Md.,    USA,  1957, entnommen.

   Sollten einige der obigen Arten  durch andere Nomenklaturen bezeichnet werden kön  nen, so sollen sie trotzdem unter die für die vorlie  gende Erfindung verwendbaren Bakterien fallen.  



  Die oben erwähnten Mikroorganismen sind bei  den öffentlichen     Kultursammlungen,    wie z. B.      Nor-          thern        Utilization    Research Brauch, U. S. Department  of     Agriculture,        Peoria,        11l.,    USA ,      American    Type         Collection,    Washington, D.

   C., USA ,      Centraal-          bureau        voor        Schimmelcultures,        Baarn ,     Institute of       Applied        Microbiology,    Tokyo     University,    Tokyo,  Japan ,  Institute     for    Fermentation, Osaka, Osaka,  Japan  und      Nagao    Institute, Tokyo, Japan , zu  gänglich. Die Mikroorganismen kann man auch aus  den natürlichen Quellen mittels der bekannten Me  thoden isolieren.  



  Das zum Wachsen der Mikroorganismen verwen  dete Nährmedium wird vorzugsweise Kohlenstoff  und Stickstoffquellen enthalten, die sie assimilieren  können. Auch eine kleine Menge an anorganischen  Salzen, die für ihr Wachstum nötig sind, wird       wünschenswerterweise    vorhanden sein. Als Kohlen  stoffquellen kann man die folgenden verwenden: Glu  cose (oder     Ceresole),        Maltose,        Sucrose,        Dextrin,     Stärke,     Invertzucker    und Glycerin. Als Stickstoff  quelle kann man die folgenden Materialien verwen  den:     Peptone,    Fleischextrakte, Casein und komplexe  Stickstoffquellen, wie z.

   B.     Edamin        (Lactalbumin-          hydrolysat),        Maiseinweichflüssigkeit    und Sojabohnen  produkte, welche man allgemein für     Fermentierungen     in grossem     Massstabe    verwendet, ferner stickstoff  haltige, organische Verbindungen, wie z. B. Harn  stoff, organische und     anorganische        Ammoniumsalze     und verschiedene Arten von Nitraten. Zur Herstellung  eines geeigneten Mediums kann man auch anorga  nische Salze, wie z. B.     Kaliumphosphat,    Natrium  chlorid,     Ferrosulfat    und     Magnesiumsulfat    zugeben.

         Gewünschtenfalls    kann man auch andere wachstums  fördernde Materialien, wie z. B. Vitamine und     Stimu-          lantien,    dem Medium zugeben.  



  Die für die vorliegende Erfindung verwendbaren  Mikroorganismen wachsen auch in einfacheren Me  dien als den bisher verwendeten in hinreichendem  Masse, wobei die verbleibenden Zellen der Mikro  organismen für den gleichen Zweck verwendet werden  können. In diesem Falle sind die     obgenannten    Nähr  mittel nicht notwendigerweise unentbehrlich. Da  ausser dem     Adaptivenzym    das     Konstitutivenzym    der  Mikroorganismen als Enzymsystem im vorliegenden  Verfahren verwendet wird, ist das vorliegende Ver  fahren vorteilhafter und weniger zeitraubend als die  bekannten Verfahren.  



  Für die vorliegende Erfindung verwendbare Me  dien sind die folgenden:  
EMI0002.0136     
  
    <I>Beispiele <SEP> für <SEP> Zusammensetzungen <SEP> des <SEP> Incubationsmediums</I>
<tb>  (2) <SEP> % <SEP> (3)
<tb>  C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP>  " <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2
<tb>  KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> KH2p04 <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,1</B>
<tb>  MgS04 <SEP> * <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,05 <SEP> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,05
<tb>  FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001 <SEP> FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001 <SEP> FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001
<tb>  Glycerin <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> Glycerin <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> Ammonium  Harnstoff <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> NH4N03 <SEP> .

   <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> lactat <SEP> . <SEP> . <SEP> 2
<tb>  pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0 <SEP> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,5 <SEP> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,5
<tb>  C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> bedeutet <SEP>  Maiseinweichflüssigkeit .       
EMI0003.0001     
  
    (4) <SEP> % <SEP> (5) <SEP> % <SEP> (6)
<tb>  C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> * <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> Harnstoff <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> Glycerin <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb>  KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,01 <SEP> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,03 <SEP> Pepton <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb>  MgS04-7H20 <SEP> 0,05 <SEP> MgS04-7H20 <SEP> 0,02 <SEP> Fleischextrakte <SEP> 0,5
<tb>  FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,00l <SEP> FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001 <SEP> NaCI <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb>  Ammonium  succinat <SEP> . <SEP> 2 <SEP> Glucose <SEP> . <SEP> .

   <SEP> 2
<tb>  pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0 <SEP> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,8 <SEP> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0
<tb>  (7) <SEP> % <SEP> (8) <SEP> % <SEP> (9)
<tb>  Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> Hefeextrakte <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> Brunnenwasser <SEP> oder
<tb>  Cerelos <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1 <SEP> destilliertes <SEP> Wasser
<tb>  C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,2 <SEP> MgS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,05
<tb>  FeS04 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,001
<tb>  C. <SEP> S. <SEP> L. <SEP> bedeutet <SEP>  Maiseinweichflüssigkeity.

         Die Mikroorganismen können gemäss vorliegender  Erfindung durch eine stationäre Kultur ausgebrütet  werden, doch wird man angesichts der     aeroben    Natur  das Kulturmedium vorzugsweise schütteln oder unter  Lüftung     submers    züchten.  



  Die als Ausgangsmaterialien verwendeten Steroide  kann man dadurch mit dem     Redoxenzymsystem    in  Kontakt bringen, dass man sie     während    der Inkuba  tion der Mikroorganismen in das Medium einführt.  Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass man die  Mikroorganismen während einer gewissen Zeit  züchtet und die gewachsenen Zellen     auszentrifugiert,     worauf man sie in einem anderen Medium mit den  als Ausgangsmaterialien verwendeten     Steroidverbin-          dungen    in Berührung bringt. Im letzteren Falle muss  das Medium nicht notwendigerweise die oben ge  nannten Nährstoffe enthalten.  



  Da die Mikroorganismen, welche zur Gattung       Pseudomonas    oder zur Gattung     Serratia    gehören, in  Medien von verhältnismässig einfacher Zusammen  setzung wachsen können, so kann die Umwandlung  der Ausgangsmaterialien nach dem vorliegenden  Verfahren in einem einfachen Medium, wie es sich  für die Nachbehandlung eignet, bewirkt werden.  



  Der     pH-Wert    des Mediums, die     ReaktionsteMpe-          ratur    (Züchtungstemperatur), die Reaktionsdauer  (Züchtungsperiode) und andere Bedingungen wird  man selbstverständlich der besonderen Art der Aus  gangsverbindungen, den zu erzeugenden     Steroidver-          bindungen,    den in Frage stehenden Mikroorganismen,  der Art des     Zusammenbringens    des Substrats und des  Enzyms und der Konzentration des Mediums an  passen. Im allgemeinen wird man einen     pH-Wert    von  etwa 6-9, eine Reaktionstemperatur von 20 bis 37  C  und eine Reaktionsdauer von 3 bis 50 Stunden be  vorzugen.

   Diese Bedingungen sollen aber den Rah  men der vorliegenden Erfindung in keiner Weise  einengen. Bei der Züchtung einer Kultur von bei  spielsweise     Ps.        boreopolis        während    etwa 2 bis 3 Stun  den in Gegenwart einer beträchtlichen Menge eines    niedrigen Alkohols, wie z. B. Methanol oder Äthanol,  in einer Menge von etwa 5     Vol:o/o@,    bezogen auf das  Kulturmedium, bildet sich beinahe ausschliesslich eine  Doppelbindung zwischen den     Ci    und     C2    Stellungen  des Substrats.  



  Im allgemeinen wird man einer Konzentration  des Substrats von 0,1 bis 0,5     Q/a    den Vorzug geben.  Je nach Art des verwendeten Mikroorganismus und  des Endproduktes sowie der anderen Kulturbedingun  gen kann man aber auch mit anderen Konzentratio  nen noch bessere Resultate erzielen. Die Zugabe des  Substrates erfolgt zu     Beginn    der Inkubationszeit  oder in einem geeigneten späteren Stadium. Werden  die     zentrifugierten    Zellen mit dem Substrat in Be  rührung gebracht, so kann man die Zellen dem das  Substrat enthaltenden Medium zusetzen.

   Das Substrat  wird dem Medium entweder einmalig oder     portionen-          weise    in Form eines     feinen    Pulvers, als Lösung oder  Suspension beispielsweise in Methanol, Äthanol,       Propylenglycol,        Dioxan,        Dimethylformamid    oder  Wasser, oder als Lösung oder Suspension in einem  ein oberflächenaktives Mittel oder ein     Dispergie-          rungsmittel    enthaltenden Lösungsmittel zugesetzt.  



  Um die Reaktion glatt verlaufen zu lassen, ist es  wünschenswert, dass das Ausgangsmaterial im Me  dium als Lösung oder in Form eines möglichst feinen  Pulvers vorliegt.  



  Die so erzeugten und im Medium angereicherten  Endprodukte können beispielsweise wie folgt isoliert  werden:  a) Die Produkte werden auf einem geeigneten       Adsorptionsmittel,    wie z. B. aktiver Kohle,     adsorbiert     und hierauf mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie  z. B. Methanol und Äthanol,     eluiert.     



  b) Die Produkte werden mit einem mit Wasser  nicht mischbaren, geeigneten Lösungsmittel, wie z. B.       Chloroform,        Methylenchlorid    und     Äthylenchlorid,          extrahiert    oder nach dem Gegenstromprinzip extra  hiert.      c) Die Produkte werden auf einem geeigneten  Trägermittel,     wie    z. B.

   Aluminiumoxyd,     Silicium-          dioxydgel,        Cellulose    und     Holzfasermasse,        chromato-          graphiert,     d) Die Produkte werden dadurch getrennt, dass  man die verschiedenen Löslichkeitsgrade zwischen  zwei Lösungsmitteln sich zu Nutze macht.  



  e) Die Produkte werden zuerst in einem Lö  sungsmittel extrahiert und hierauf als Derivate ihrer  funktionellen Gruppen durch Anwendung von       Girard's-Reagenzien,    das heisst     Trimethylcarbonyl-          hydrazinomethyl-ammoniumchlorid    und     Hydrazino-          carbonylmethyl-pyridiniumchlorid,    isoliert, oder sie  werden     mit    einem niedrigen     Fettsäureanhydrid    und  einem     Entsäuerungsmittel        acyliert    und die so abge  trennten Derivate in die ursprünglichen Verbindungen       übergeführt.     



  Manche der so erhaltenen Produkte stellen       Adrenocorticalhormone,    männliche Sexualhormone  und weibliche Sexualhormone dar, welche man oral  oder     parenteral    verabreichen kann.     Wiederum    andere  dieser Verbindungen können als Zwischenprodukte  für die Herstellung von Arzneimitteln, denen die  genannte Wirksamkeit zukommt, oder für die Her  stellung von Zwischenprodukten verwendet werden.  



  Die Temperaturen sind in sämtlichen Beispielen       unkorrigiert    angegeben. Sämtliche Analysenwerte  beziehen sich auf Gewichtsprozente. In den Bei  spielen bedeuten die Ausdrücke  UV-Spektrum  und        IR    Spektrum  das ultraviolette Spektrum, welches  man in     äthanolischer    Lösung einer Probe beobachtet,  und das     Infrarotspektrum,    welches man in einer  flüssigen     Paraffinsuspension    für jede Probe beob  achtet.

   Die Abkürzung     ATCC    für die Kultursamm  lung bedeutet      American    Type     Culture        Collection,          Peoria,        I11.,    USA .  



  <I>Beispiel 1</I>  50     cm3    des oben erwähnten Mediums 1 werden  in einem     350-cm3-Schüttelbecher    während 15 Minu  ten bei einem Dampfdruck von 1,05     kg/cm2    sterili  siert. Dann wird das Medium mit     Ps.        olevorans    mit  Hilfe von zwei Platinösen     angeimpft    und während  10 Stunden unter Schütteln     (100-150mal    pro Minute  bei einer Amplitude von 5,08 cm) bei etwa 28  C  ausgebrütet.

   Hierauf versetzt man mit 10 mg       44-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion    und 2,5     cm3          Propylenglykol,    worauf man das Gemisch während  weiteren 10 Stunden unter den gleichen Bedingungen  ausbrüten lässt. Dann wird der flüssige Anteil 3mal  mit je 50     cm3        Äthylacetat    extrahiert, während der  feste Anteil 3mal     mit    je 5     cm3    Aceton extrahiert  wird. Beide Extrakte werden vereinigt und das Lö  sungsmittel unter     vermindertem    Druck in Anwesen  heit von Stickstoff bei     Zimmertemperatur    destilliert.

    Das verbleibende kristalline Pulver stellt eine Mi  schung von     41,4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-3-on          41,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion    dar. Diese bei  den Verbindungen werden durch die nachfolgenden  Teste     identifiziert.       1. Das Pulver wird in einer kleiner Menge von       Chloroform    gelöst und die Lösung nach der Methode  von     Zaffaroni    der     Papierverteilungschromatographie     unterworfen, das heisst, sie wird mit     Propylenglycol-          Toluol    entwickelt, worauf die entsprechenden Stellen  an den entsprechenden Zonen in Erscheinung treten.  



  2. 1,0 g des Pulvers wird in 12,5     cm3        Pyridin     gelöst und die Lösung mit 7,5     cm3        Essigsäureanhydrid     versetzt. Nach dem Stehenlassen während 24 Stun  den bei     Zimmertemperatur    erwärmt man die Lösung  während 1 Stunde auf 50  C und     destilliert    das Lö  sungsmittel unter     vermindertem    Druck ab. Der Rück  stand wird in Chloroform gelöst und die Lösung mit  verdünnter Salzsäure, hierauf mit einer     wässrigen     Lösung von     Natriumcarbonat    und schliesslich mit  Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat  getrocknet und dann zur Trockne eingedampft.

   Der  Rückstand wird auf 280 g     Magnesiumsilikat    mittels  einer Mischung von Äther und Aceton entwickelt,  wobei sich die beiden Verbindungen voneinander  trennen. Während der     Chromatographie    nimmt der       Acetongehalt    allmählich zu. Die beiden Verbindun  gen werden aus Aceton     umkristallisiert,    wobei man  0,2 g farblose Nadeln vom     Smp.    215-218  C und  0,1 g farblose Prismen vom     Smp.    178-179  C erhält.

    Die erstere Verbindung besteht aus  
EMI0004.0071     
  
    IR-Spektrum
<tb>  y",a,: <SEP> 3,00 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 5,75<I>,u,</I> <SEP> 5,82<I>,u,</I> <SEP> 6,03<I>,u</I>
<tb>  6,20<I>,u,</I> <SEP> 6,25<I>,u,</I> <SEP> 11,20<I>,u.</I>     
EMI0004.0072     
  
    Analyse:
<tb>  ber. <SEP> für <SEP> C"11"0,: <SEP> C <SEP> = <SEP> 71,48, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,82
<tb>  gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 71,26, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,78       Eine Lösung von 0,4 g dieser Substanz in 40     cm3     Methanol wird mit einer Lösung von 0,42 g     Kalium-          bicarbonat    in 5     cm3    Wasser versetzt. Das Gemisch  wird während 1 Stunde unter     Rückfluss    erhitzt und  hierauf unter vermindertem Druck eingeengt.

   Der  Rückstand wird mit     Chloroform        extrahiert.    Die       Chloroformlösung    wird mit Wasser gewaschen und  über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, worauf  man das Lösungsmittel     abdestilliert.    Der Rückstand  wird aus Aceton umkristallisiert, wobei man 0,245 g  farblose Platten vom     Smp.    225-228  C (unter Zer  setzung) erhält.

   Dieses Produkt dürfte das d     1,4-          Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion    sein, dessen Eigen  schaften die folgenden sind:       IR-Spektrum          Ymat:        3,00,u,    5,80     ,u,        6,00,u,        6,18,u,        6,22,u.     
EMI0004.0092     
  
    Analyse:
<tb>  ber. <SEP> für <SEP> <B>C21112804:</B> <SEP> C <SEP> = <SEP> 73,22, <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,19
<tb>  gef:: <SEP> C <SEP> = <SEP> 73,01, <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,13.

         Die letztere Verbindung ist das     20ss,21-Diacetoxy-          d        1,4-pregnadien-17-ol-3-on,    welches die folgenden  Eigenschaften aufweist:  [a] :     -I-    l00      (c    = 1,0     fl/o,        CHC1D    3).  UV-Spektrum       d",@@:    243     my        (E    = 15 900).

      
EMI0005.0001     
  
    IR-Spektrum
<tb>  <B>AICI;Vx'</B> <SEP> <I>2,87 <SEP> ,a.,</I> <SEP> 5,78<I>,u,</I> <SEP> 6,04<I>,u,</I>
<tb>  <I>6,16,u,</I> <SEP> 6,25 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 11,30<I>,u.</I>     
EMI0005.0002     
  
    Analyse:
<tb>  ber. <SEP> für <SEP> <B>C <SEP> 25H3406.</B> <SEP> C <SEP> = <SEP> 69,74, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,96
<tb>  gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 69,49, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,88.       Eine Lösung von 0,65 g dieser     acetylierten    Ver  bindung in 50     cm3    Methanol wird mit einer Lösung  von 1,2g     Kaliumbicarbonat    in 5     cm3    Wasser versetzt  und das Gemisch während 1 Stunde unter     Rückfluss     erhitzt.

   Das Reaktionsgemisch wird hierauf unter     ver-          mindertem    Druck eingeengt und der Rückstand in  Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Äther extrahiert,  der Extrakt mit Wasser gewaschen und über wasser  freiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel  wird entfernt. Der Rückstand wird aus einer     Aceton-          Äther-Mischung    umkristallisiert, wobei man 0,22 g  farblose Prismen vom     Smp.    194-195  C erhält.

   Das  Produkt ist das d     1>4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-3-on     mit folgenden Eigenschaften:       [a120:        -I-    33  (c = 1,0 %     CHC13).     UV-Spektrum       A,"":    244 mg     (s    = 14 200).       IR-Spektrum          A",ax:        3,00,u,        6,00,u,        6,21,u,        6,26,u,        11,32,u.     
EMI0005.0026     
  
    Analyse:
<tb>  ber. <SEP> für <SEP> <B>C21HS004' <SEP> C=72,80, <SEP> H=8,73,</B>
<tb>  gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> <B>72,31,</B> <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,40.

         Die beiden obigen Verbindungen besitzen die  gleichen Eigenschaften wie jene der entsprechenden,  nach den bekannten Methoden erhaltenen Produkte.  



  Der Stamm     Ps.        oleovorans,    welcher im vorliegen  den Beispiel verwendet wird, ist deponiert bei     ATCC     unter der Identitätszahl     ATCC    13 474.  



  <I>Beispiel 2</I>  30 Liter des weiter oben unter Nr. 3 bezeichneten  synthetischen Mediums wird     während    20 Minuten bei  einem Dampfdruck von 1,05     kg/cm2    sterilisiert.  Dieses Medium wird hierauf mit     Ps.        boreopolis    an  geimpft und während 24 Stunden unter solcher Ent  lüftung und Schütteln bei 28  C ausbrüten gelassen,  dass ein Liter einer     Natriumsulfitlösung    6,3-7,0     Milli-          mol    Sauerstoff pro Stunde absorbiert     (Kooper,        Fels-          rome,        Millar:

          Ind.    Eng.     Chem.   <I>36,</I> 504 [1944]).  Dieses Medium wird dann     mit    einer Mischung von  18 g 4     4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion    und 20     cm3          Propylenglykol        versetzt    und die erzielte Suspension  während 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen,  wie sie oben angegeben sind, gezüchtet. Die     Gär-          brühe    wird filtriert und die Zellen und das Filtrat  mit dem gleichen Volumen     Äthylacetat    extrahiert.

    Die vereinigten Extrakte werden mit     1/1o    Volumen  einer 2     o/oigen        wässrigen        Natriumbicarbonatlösung     gewaschen, über wasserfreiem     Natriumsulfat    (3 bis  10 g pro Liter) getrocknet und eingedampft, wobei    man eine Mischung von d     1,4-Pregnadien-17a,20ss,21-          triol-3-on    und 4     4-Pregnen-l        lss,17a,21-triol-3,20-dion          erhält.    Eine jede dieser beiden Verbindungen wird  wie folgt identifiziert.  



  Eine Lösung des Produktes in 47     cm3        Pyridin     wird mit 29     cm3        Essigsäureanhydrid    versetzt und das  Gemisch zuerst während 22 Stunden bei     Zimmer-          temperatur    und hierauf während einer     Stunde    bei  50 C stehengelassen.

   Nach dem     Entfernen    des Lö  sungsmittels wird der Rückstand in     Chloroform    ge  löst und die Lösung zuerst mit     -verdünnter        Salzsäure,     hierauf mit     Natriumbicarbonatlösung    und schliesslich  mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natrium  sulfat getrocknet und eingedampft. Durch     Umkristalli-          sieren    des Rückstandes aus Äther oder Aceton     erhält     man farblose Prismen vom     Smp.    178-179 C. Das  Produkt hat die nachstehenden Eigenschaften.

   Es  handelt sich um das       [a120    :     -h-    100  (c = 1,0%,     CHCl3).          UV-Spektrum          A",ax:    243,5 mg (a = 15 900).  
EMI0005.0083     
  
    IR-Spektrum
<tb>  A,"ax: <SEP> 2,85 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 5,75 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 6,01 <SEP> <I>,u,</I>
<tb>  <I>6,15,u, <SEP> 6,22 <SEP> ,u,</I> <SEP> 11,29 <SEP> <I>,u.</I>     
EMI0005.0084     
  
    Analyse:
<tb>  ber. <SEP> für <SEP> C25H340s: <SEP> C <SEP> = <SEP> 69,74, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,96,
<tb>  gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 69,52, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,92.

         Eine Lösung von 0,65 g dieser     Acetylverbindung     in 50     cm3    Methanol wird mit einer Lösung von 1,2 g       Kaliumbicarbonat    in 5     em3    Wasser versetzt und das  Gemisch     während    einer Stunde unter     Rückfluss    zum  Sieden     erhitzt.    Das Reaktionsgemisch wird unter ver  mindertem Druck eingeengt,

   der Rückstand in Wasser  gelöst und die Lösung mit Äther     extrahiert.    Die  ätherische Lösung wird mit Wasser gewaschen und  über     wasserfreiem    Natriumsulfat     getrocknet.    Der  Äther wird     abdestilliert.    Durch     Umkristallisieren    des  Rückstandes aus Aceton und Äther     erhält    man 0,22 g  farblose Prismen vom     Smp.    194-195  C.

   Das Pro  dukt, welches das d     1.4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-          3-on    darstellt, besitzt die folgenden Eigenschaften:  [a]20:     +    33  (c =     1,019/o        CHC13).     



       UV-Spektrum          A",ax:    244,5<I>mg</I>     (E   <I>=</I> 14 200).       IR-Spektrum          A,"ax:        3,00,u,        6,00,u,        6,20,u,        6,25,u,        11,30,u.     
EMI0005.0114     
  
    Analyse:
<tb>  ber. <SEP> für <SEP> <B>C21H3004'</B> <SEP> C <SEP> = <SEP> 72,80, <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,73
<tb>  gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 72,53, <SEP> H <SEP> = <SEP> 8,43.       Das Produkt lässt sich auch durch Vergleich mit  einer authentischen Probe, welche nach einer andern  Methode erhalten wird, identifizieren.  



  Die Mutterlauge aus dem obigen Produkt wird  auf 100 g     Magnesiumsilikat        -mit        einer        Mischung    von      Benzol und     Chloroform    (Mischungsverhältnis 1:1)  entwickelt und die     kristalline    Substanz, welche mittels  des     Chromatogramms    abgetrennt wurde, aus einer  Mischung von Methanol und Aceton umkristallisiert,  wobei man farblose     Körner    vom     Smp.    214-216  C  erhält.

   Das so erhaltene     21-Acetoxy-d        4-pregnen-          11ss,17a-diol-3,20-dion    besitzt die folgenden Eigen  schaften:       IR    Spektrum       A",a1:        2,95,u,        3,05,u,        5,75,u,        5,85,u,        6,15,u.     
EMI0006.0016     
  
    Analyse:
<tb>  ber. <SEP> für <SEP> C.3H3206: <SEP> C <SEP> = <SEP> 68,29, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,97
<tb>  gef.: <SEP> C <SEP> = <SEP> 67,91, <SEP> H <SEP> = <SEP> 7,86.       Das Produkt lässt sich auch durch Vergleich mit  einer authentischen Probe, welche mit einer andern  Methode erhalten worden ist, identifizieren.  



  Der Stamm     Ps.        boreopolis,    welcher in diesem  Beispiel verwendet worden ist, ist bei     ATCC    unter  der Nummer     ATCC    13 476     registriert.     



  <I>Beispiel 3</I>  Das obige Medium 3 wird mit S.     marsescens    in       Gegenwart    von     44-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion     kultiviert. Behandelt man die erzielte Brühe wie in  Beispiel 2, so erhält man 150 mg d     1.4-Pregnadien-          17a,21-diol-3,20-dion.     



  Der Stamm S.     marsescens,    welcher in diesem Bei  spiel verwendet wird, ist bei     ATCC    unter der Num  mer     ATCC    13 477 registriert.  



  <I>Beispiel 4</I>  Das oben erwähnte Medium 9 wird mit den  Zellenkörpern aus     Ps.        boreopolis    und     d4-Pregnen-          17,21-diol-3,20-dion    versetzt und das Gemisch genau  gleich wie in Beispiel 3 behandelt, wobei man eine  Mischung von       41,4-Pregnadien-17a"21-diol-3,20-dion,          44-Pregnen-llss,17a,21-triol-3,20-dion    und       41,4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-3-on     erhält.  



  Diese Produkte werden durch     Papierehromato-          graphie        identifiziert.     



  Der Stamm     Ps.        boreopolis,    welcher in diesem  Beispiel verwendet wird, ist der gleiche Stamm wie  jener gemäss Beispiel 2.    <I>Beispiel 5</I>  Das Medium 3 wird mit S.     plymuthica    in Gegen  wart von     44-Pregnen-llss,l7a,21-triol-3,20-dion    ge  züchtet. Wird dieses     Kulturdemium    in gleicher Weise  wie in Beispiel 1 behandelt, so     erhält    man     ,11,4_          Pregnadien-1        lss,17a,21-triol-3,20-dion.     



  Der     Stanun    S.     plymuthica    ist bei     ATCC    unter der  Nummer     ATCC    13 478 registriert.  



  <I>Beispiel 6</I>  Das oben erwähnte Medium 4 wird mit     Ps.        oleo-          vorans    in Gegenwart von     44-Pregnen-17a,21-diol-          3,20-dion    gezüchtet.     Erfolgt    die Behandlung in der    gleichen Weise wie in Beispiel 1, so erhält man       d1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion.    Die Richtig  keit der Bezeichnung dieses Produktes lässt sich  durch einen Vergleich mit einer authentischen, nach  einem andern Verfahren erhaltenen Probe feststellen.  Der Stamm     Ps.        oleovorans,    welcher in diesem Bei  spiel verwendet wird, ist der gleiche Stamm wie  jener von Beispiel 1.  



  <I>Beispiel 7</I>       Ps.        boreopolis,    welches in einem     Agarbouillon     gezüchtet worden ist, wird mit einer Platinöse zur  Impfung von 50     cm3    des Mediums 6 in einem       200-em3-Schüttelbehälter    verwendet. Die Züchtung  erfolgt unter Verwendung einer rotierenden Schüttel  vorrichtung, wobei die Behandlung während 18 Stun  den bei     28"C    geschieht. Die so gezüchtete Samen  kultur wird zur Impfung in 3 Liter des genannten  Mediums 6 in einer     Fermentierungsvorrichtung    ver  wendet, worauf man die Züchtung während 6 Stun  den bei 28  C unter Lüftung (1,5 Liter pro Minute)  und unter Rühren bei 250 Umdrehungen pro Mi  nute durchführt.

   Das Kulturmedium wird dann mit  einer Lösung von 1,2 g     d4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-          dion    in 150     em3    Äthanol versetzt, worauf man die  Züchtung während weiterer 3 Stunden unter den  obigen Bedingungen     weiterführt.     



  Nachdem man den     pH-Wert    mittels Schwefel  säure auf 4,0 eingestellt hat, werden 50     cm3    der  obigen Kultur 3mal mit je 50     cm3        Äthylacetat     extrahiert, worauf man die vereinigten Extrakte mit  20     cm3    einer 1     0/eigen        wässrigen        Natriumcarbonat-          lösung    und hierauf mit 20     cm3    destilliertem Wasser  wäscht. Nach dem Trocknen über wasserfreiem  Natriumsulfat wird das Lösungsmittel unter vermin  dertem Druck auf einem Wasserbade bei einer Tem  peratur von 55  C eingeengt.

   Mittels     Papierchromato-          graphie    werden 850 mg     41,4-Pregnadien-17a,21-diol-          3,20-dion    in der gesamten Kultur festgestellt. Dabei  stellt man auch fest, dass keine anderen Produkte  zugegen sind.  



  Der in diesem Beispiel verwendete     Stamm    von       Ps.        boreopolis    ist der gleiche wie jener in Beispiel 2.    <I>Beispiel 8</I>  Ein Kulturmedium, in welchem     Ps.        boreopolis    in  der gleichen Weise wie in Beispiel 7 gezüchtet wor  den ist, versetzt man mit einer Lösung von 1,2 g       44-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion    in 30     cm3    Äthanol.  Dann wird unter den gleichen Bedingungen wie in  Beispiel 7 die Züchtung während weiterer     21-Stun-          den    durchgeführt.

   In der Kulturflüssigkeit werden  schliesslich 635 mg     41,4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-          3-on    festgestellt, während andere Produkte nicht vor  handen sind.  



  Der in diesem Beispiel verwendete     Stamm    von       Ps.        boreopolis    ist der gleiche wie in Beispiel 2.  <I>Beispiel 9</I>  Ein in der gleichen Weise wie in Beispiel 7 ge  züchtetes Kulturmedium von     Ps.        oleovorans    wird mit      einer Lösung von     d4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion     in 60 eins Äthanol versetzt. Der Züchtungsvorgang  wird während weiterer 4 Stunden unter den gleichen  Bedingungen wie in Beispiel 7 fortgeführt.  



  Genau gleich wie in Beispiel 7 kann man auf  diese Weise die Anwesenheit von 660 mg d     1,4_          Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion    und 204<B>mg</B>     41,4_          Pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion    oder von  <B>108</B> mg     41.4-Pregnadien-17a,20ss,21-triol-3-on    fest  stellen.  



  Der in diesem Beispiel verwendete Stamm von       Ps.        oleovorans    ist der gleiche wie in Beispiel 1.    <I>Beispiel 10</I>  Eine Suspension einer Kulturflüssigkeit von       Ps.        oleovorans    auf einem     Agarbouillon    in 10     eins     sterilisiertem, destilliertem Wasser wird     mit    einer  Platinöse entnommen und die     Konzentration    auf ein  Zehntel verdünnt. Die verdünnte Suspension wird in       Petrischalen    mit     Ultraviolettstrahlen    während 1 bis  5 Minuten mit Hilfe einer 30 Watt-Lampe bei einer  Distanz von 54 cm bestrahlt.

   Diese Kultur wird dann  auf einem     Agarbouillon        angeimpft,    worauf man die  auf dem     Agar    gewachsenen Kolonien erneut auf  einem anderen     Agarbouillon    impft. Dann wird ein  Teil dieses Kulturmediums in 500     cms    des oben er  wähnten Mediums 6 in einem     3-Liter-Kulturkolben          angeimpft    und während 18 Stunden unter Schütteln  bei 28  C gezüchtet. Die so erhaltene Samenkultur  wird in einem rostfreien     30-Liter-Stahlbehälter     geimpft und die Inkubation während 5 Stunden bei  28  C durchgeführt.

   Das Kulturmedium     wird    dann  mit einer Lösung von 12 g     44-Pregnen-17a,21-diol-          3,20-dion    in 750     cm3    Äthanol versetzt, worauf man  eine weitere Inkubationszeit von 12 Stunden unter  den gleichen Bedingungen anschliesst.

   Mittels einer       Papierchromatographie    eines Extraktes, welcher  durch Extrahieren der Brühe mittels     Äthylacetat     erhalten wird, stellt man 2,5 g     41,4-Pregnadien-          17a,21-        diol    - 3,20 -     dion,    0,6 g     d1,4-Pregnadien-          17a,20ss,21-triol-3-on    und 3,8 g     41,4-Pregnadien-          llss,17a-21-triol-3,20-dion    in der Kulturbrühe fest.  



  Die gesamte Kulturbrühe wird dann in ähnlicher  Weise wie in Beispiel 1 behandelt, indem man sie  bei einem     pH-Wert    von 4,0 mit     Äthylacetat    extra  hiert. Hierauf wird die     Äthylacetatlösung    unter ver  mindertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei  man 8,1 g kristallines Pulver erhält.

   Nach dem     Acety-          lieren    des rohen Pulvers mittels     Pyridin    und Essig  säureanhydrid unterwirft man das erhaltene     acety-          lierte    Material der     Kolonnenchromatographie    auf  einem     Magnesiumsilikat,    wobei man die Kolonne  mit einer Mischung von Äther und Aceton entwickelt  und den     Acetongehalt    erhöht, um das Material in  3 Fraktionen abzutrennen.

   Aus der ersten Fraktion  erhält man 2,0 g     21-Acetoxy-41,4-pregnadien-17a-ol-          3,20-dion    in Form von farblosen Nadeln, welche nach  dem     Umkristallisieren    aus Aceton bei     215-2l8     C  schmelzen. Aus der zweiten Fraktion erhält man  300 mg 20ss,21-Diacetoxy-d1,4-pregnadien-17a-ol-         3-on    in Form von farblosen Prismen, welche nach  dem     Umkristallisieren    aus Aceton bei 178-179  C  schmelzen.

   Aus der letzten Fraktion schliesslich ge  winnt man 3,3 g farblose Körner vom     Smp.    230  C,  sofern das Produkt aus einer Mischung von     Dioxan     und     Äthylacetat    umkristallisiert worden ist. Dieses       zuletzt    genannte Produkt, welches     21-Acetoxy-d1,4_          pregnadien-llss,17a-diol-3,20-dion    darstellt, besitzt  die folgenden Eigenschaften:

           [a]        D    :     +        116         (c        =        1,0        %        Dioxan).     UV-Spektrum       @niaX-    243     mu        (E    = 15 300).       IR-Spektrum     
EMI0007.0075     
  
    d",0,y: <SEP> 2,993,075,745,82
<tb>  6,076,3011,29<I>,u.</I>     
EMI0007.0076     
  
    Analyse: <SEP> C <SEP> = <SEP> 68,63 <SEP> %, <SEP> H <SEP> = <SEP> <B>7,511/9</B>
<tb>  <B>C=68,370/9,</B> <SEP> H=7,38%.

         Ein jedes der obigen 3 Produkte ist mittels  entsprechender authentischer Probe identifiziert  worden.  



  Der in diesem Beispiel verwendete Stamm von       Ps.        olevorans    ist der gleiche wie in Beispiel 1.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Steroidverbin- dungen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Steroidverbindung, welche der Pregnanreihe oder der Allopregnanreihe angehört, mit einem Redoxenzym- system eines Mikroorganismus, welcher zur Gattung Pseudomonas oder zur Gattung Serratia gehört, in Berührung bringt,

um eine Doppelbindung zwischen den 1- und 2-Stellungen des Steroids einzuführen. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Ausgangsmaterial Pregnan-3;

20-dion, d4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion, 44-Pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion, d4-Pregnen-3,20-dion, d4-Pregnen-l lss,21-diol-3,20-dion, 44-Pregnen-21-ol-3,20-dion, d4-Pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20-dion, Allopregnan-3,20-dion, d4-Pregnen-21-ol-3,11,20-trion, d4-Pregnen-16a,17a,21-thol-3,20-dion, 9-Fluor-44-pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20-dion oder d4-Pregnen-17a-ol-3,20-dion verwendet. 2.

Verfahren nach Patentanspruch und Unter anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Pseudomonas oleovorans, Pseudo- monas fluorescens, Pseudomonas boreopolis, Serratia marcescens oder Serratia plymuthica verwendet.