Procédé de stabilisation d'un vaccin contre la poliomyélite
Comme on le sait, la poliomyélite est une maladie à virus à processus fatal ou à séquelles déformantes. En raison de la nature de la maladie, la seule manière sûre d'aborder le problème est de nature prophylactique, c'est-à-dire de mettre au point des moyens de prévenir l'apparition de la maladie. Récemment, on a mis au point un vaccin tué contre la poliomyélite, composé de virus poliomyélitiques tués mais antigènes, des types 1, 2 et 3, qui a fait l'objet d'essais cliniques très étendus. Ce vaccin contre la poliomyélite est, comme beaucoup d'autres, une préparation aqueuse qui s'administre par injection.
Il est ainsi essentiel que le vaccin soit stérile, c'est-à-dire exempt de bactéries, moisissures et mycètes, non seulement au moment de sa fabrication et de son emballage, mais encore au moment de son administration. Bien qu'il soit peut-être possible, au moins théoriquement, de préparer et emballer le vaccin dans des conditions aseptiques, ces vaccins peuvent être pollués au moment de leur administration, en particulier si l'emballage est à doses multiples, comme il est courant. En outre, la fabrication dans des conditions complètement aseptiques est d'un coût prohibitif et tout à fait impraticable.
On a proposé, pour que le vaccin antipoliomyélitique soit exempt de bactéries, de moisissures et de mycètes contaminants et reste sous cet état, d'ajouter comme agent de préservation un composé du mercure, en l'espèce le thiomérosal. Bien que ce moyen fournisse une solution au problème de la pollution, il en soulève un autre, qui est peut-être encore plus sérieux, à savoir la perte d'activité du vaccin antipoliomyé- litique provoquée par le thiomérosal. Il s'ensuit que les vaccins antipoliomyélitiques contenant du thio mérosal comme agent de préservation doivent être administrés peu après leur fabrication.
Ceci est, bien entendu, tout à fait indésirable en raison de ce que le vaccin est difficile et coûteux à préparer, de sorte que sa production doit être limitée à des exigences évaluées à court terme. Cette raison, jointe au fait que la préparation du vaccin exige plusieurs mois, fait qu'il est impossible de préparer assez de vaccin pour satisfaire à des demandes imprévues. Il existe ainsi une pressante demande pour un vaccin contre la poliomyélite, qui, tout en étant exempt de manière certaine de bactéries, de moisissures et de mycètes au moment de l'administration, conserve son activité, c'est-à-dire son caractère antigène, pendant un temps considérable, dans les conditions normales de magasinage.
La présente invention, qui répond à cette demande, a pour objet un procédé de stabilisation d'un vaccin constitué par une solution aqueuse contenant au moins un type de virus de la poliomyélite tué mais antigène. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on introduit dans ladite solution, à titre d'agent stabilisant de l'activité antigène et d'inhibiteur du dévelop- pement de microorganismes, du chlorure de benzé- thonium en quantité telle que la concentration dudit chlorure dans le vaccin soit comprise entre t/20000 et 1/soooo.
Le chlorure de benzéthonium est, de préférence, incorporé dans le vaccin en ajoutant lentement à celui-ci une solution aqueuse étendue dudit chlorure, sous une agitation efficace. Chimiquement, le chlorure de benzéthonium est le chlorure de benzyl diméthyl- [2- (2- (p-1, 1, 3, 3-tétraméthylbutylphénoxy)- éthoxy)-éthyl]-ammonium monohydraté, de formule
EMI2.1
Les produits préférés sont ceux qui contiennent le chlorure de benzéthonium à une concentration de l'ordre de 1/20000 à 1/40000.
Le vaccin contient, de préférence, les types 1, 2 et 3 de ces virus de la poliomyélite. Des vaccins particulièrement indiqués sont ceux à teneur relativement faible en protéines, de préférence moins d'environ 18 à 20 gamma par centimètre cube d'azote protéinique. Ces vaccins peuvent être produits par un certain nombre de voies différentes.
On peut, par exemple, faire macérer du tissu rénal de singe et soumettre le produit à l'action de la trypsine, de manière à éliminer les tissus étrangers, laisser les cellules résiduelles se multiplier, ensemencer le milieu au moyen de virus de la poliomyélite, soumettre le mélange à l'incubation, recueillir le filtrat, désactiver le virus vivant par traitement au moyen de formaldéhyde, de radiations ultra-violettes ou par un autre moyen approprié, et ajouter du chlorure de benzéthonium dans les. proportions indiquées. On peut, si on le veut, préparer des vaccins sans effectuer de traitement à la trypsine, mais dans ce cas, la teneur en protéines des vaccins peut être excessivement élevée et doit être évaluée avant usage.
Dans la préparation des vaccins mixtes, c'est-à-dire des vaccins contenant plusieurs types de virus de la po liomyélite, on mélange habituellement les filtrats recueillis contenant les divers types après désactivation ; bien que, si on le désire, ce mélange puisse être effectué avant. Quand on utilise des vaccins désacti- vés à la formaldéhyde, on obtient les résultats les meilleurs en utilisant des vaccins auxquels on n'a pas ajouté de bisulfite de sodium à l'effet d'en réduire la teneur en formaldéhyde.
Exemple 1 :
Le vaccin peut être préparé comme suit :
On prépare des cellules en vue de la culture du virus de la poliomyélite par le procédé de Dulbecco,
Journal of Experimental Medicine, 99, p. 167 (1954).
En bref, ce procédé consiste à préparer tout d'abord une suspension de cellules épithéliales de reins de singe (voir Dulbecco, Proc. Nat. Acad. Sci., 38, p. 747 (1952)) par traitement de tissus de reins de singe macérés, provenant d'espèces Cynomalgus ou
Rhesus en bonne santé, au moyen de trypsine, de manière à enlever les matières étrangères et à libérer les cellules individuelles. On laisse ces cellules se multiplier sur une surface en verre convenable dans un certain nombre de milieux de culture de tissus.
On ensemence alors la pellicule de cellules rénales ainsi produite au moyen d'une culture du type 1 (souche Mahoney) de virus de la poliomyélite, et l'on soumet le mélange à l'incubation à 36-370 C jusqu'à destruction complète des cellules et mise en liberté de grandes quantités de nouveau virus. On recueille le fluide contenant le virus et on le fait passer sur une bougie en verre fritté ultra-fine. On essaie le filtrat contenant le virus vivant de la poliomyélite du type 1 quant à sa teneur en virus, sa stérilité bactérienne et sa pureté de souche.
On prépare un filtrat contenant du virus de la poliomyélite vivant du type 2 (souche MEF-1) par le procédé décrit ci-dessus, en vue de la préparation du filtrat contenant le virus de la poliomyélite du type 1. On prépare également un filtrat contenant du virus vivant de la poliomyélite du type 3 (souche
Saukett) par le même procédé.
Les virus vivants contenus dans les filtrats séparés sont désactivés par addition de formaldéhyde et soumis à l'incubation conformément au procédé décrit en détail dans l'Amendement 2 du Minimum
Requirements of Poliomyelitis Vaccine publié le 20 mai 1954 par-l'United States Department of
Health, Education and Welfare. On n'ajoute pas de bisulfite pour neutraliser la formaldéhyde en excès.
On réunit des quantités à peu près égales de vaccins de virus tué antipoliomyélitique des types 1, 2 et 3, et l'on divise l'ensemble en parties aliquotes que l'on utilise pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. On conserve une partie aliquote inaltérée comme échantillon témoin.
Stabilisation : on ajoute lentement 0, 75 cc d'une solution à 1 0/o de chlorure de benzéthonium sous agitation modérée, mais efficace, à 150cc de vaccin tué aqueux froid de la poliomyélite préparé comme indiqué ci-dessus. On place le produit ainsi obtenu dans des ampoules en quantités propres pour l'im- munisation. Ce vaccin contre la poliomyélite, qui contient du chlorure de benzéthonium à une concentration de Vsoooo, conserve son activité dans les conditions normales de magasinage (à la température du réfrigérateur) pendant au moins huit mois.
Il reste également exempt de pollution par des bactéries, des moisissures et des mycètes dans les conditions normales d'usage et de magasinage.
Les essais d'activité effectués sur l'échantillon témoin et le vaccin stabilisé comme décrit ci-dessus sont indiqués dans le tableau I. Ces activités sont déterminées par le procédé de neutralisation du sérum décrit par Salk, Youngner et Ward, American
Journal of Hygiene, 60, p. 214 (1954). Les résultats sont exprimés en titre moyen géométrique. En bref, la méthode d'essai comporte l'inoculation de singes au moyen de trois doses de 1 cc du vaccin d'essai à des intervalles d'une semaine, la saignée des animaux au bout du traitement, la préparation d'un sérum à l'aide du sang recueilli, puis la détermination du nombre d'anticorps présents dans le sérum.
Cette détermination s'effectue par une série de dilutions du sérum au moyen d'une solution saline et mélange des parties aliquotes diluées au moyen d'une solution normalisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses du type donné de virus poliomyélitique.
Par exemple, pour déterminer l'activité du type 1, on utilise une solution normalisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses du virus poliomyéliti- que type 1 ; pour déterminer l'activité du type 2 ou du type 3, on utilise une solution normalisée de virus infectieux des types correspondants. Le point final du titrage est la dilution à laquelle le sérum contient suffisamment d'anticorps pour neutraliser exactement le nombre connu d'unités infectieuses du virus présent dans la solution normalisée, c'est-à-dire se combiner avec ces unités et les rendre inoffensives.
On utilise un certain nombre de singes dans l'analyse de l'activité ou puissance de chaque type de virus polio myélitique. Les résultats ainsi obtenus sont placés sous une forme permettant une évaluation comparative et statistique en prenant le logarithme à base 2 du point final de dilution du sérum pour chaque singe, faisant la moyenne des chiffres obtenus et prenant l'antilogarithme de la moyenne ainsi obtenue.
Cet antilogarithme est dénommé le titre moyen géométrique des vaccins et est naturellement différent pour chaque type de virus présent dans le vaccin.
Etant donné que le titre moyen géométrique dépend de la puissance de la solution normalisée du virus infectieux de la poliomyélite utilisé dans l'essai, il est nécessaire de spécifier le nombre d'unités infec tieuses du virus de la poliomyélite présent dans la solution normalisée pour qu'il reflète la signification exacte du titre moyen géométrique. Le procédé de calcul du titre moyen géométrique est indiqué en détail dans l'Amendement No 2 du Minimum Requi- rements of Poliomyelitis Vaccine cité précédemment.
Pour déterminer la stabilité au magasinage des propriétés antigènes des vaccins stabilisés conformément à l'invention, on chauffe le vaccin à 37 C pendant une semaine, puis on le conserve à 40 C pendant huit semaines. On détermine alors la puissance ou activité de chacun des types comme cidessus. Etant donné qu'une semaine de chauffage à 370 C produit le même effet sur l'activité du vaccin que six mois de magasinage à 40 C, le vaccin, dans ces conditions d'essai, est conservé un temps équivalent à huit mois à 40 C. L'échantillon témoin est conservé à 40 C pendant neuf semaines, au bout desquelles on détermine la puissance de chacune des souches de virus comme décrit ci-dessus.
TABLEAU 1
Nombre Nombre d'unités
Echantillon essayé Type de singes infectieuses de virus Titre moyen
de virus utilisés neutralisées géométrique
Témoin 1 8 lOI6 256
2 8 101, 5 650
3 8 10218 41
Vaccin contenant 1 12 10i, 6 204
du chlorure de benzéthonium, 2 12 1ots5 540
conc. = 1/20000 3 12 10 , 8 47 * Activité de la solution normalisée utilisée dans les essais.
Ainsi qu'il ressort des résultats ci-dessus, le vaccin du procédé selon l'invention conserve la puissance à l'égard des trois types de virus pour une durée de magasinage équivalent à huit mois à 40 C. Au contraire, les vaccins préservés au thiomérosal perdent complètement leur activité à l'égard des trois types de virus dans les mêmes conditions de magasinage. C'est ce que montrent les essais suivants.
On prépare un vaccin désactivé au moyen de formaldéhyde contenant les types 1, 2 et 3 de virus polio myélitique, comme il est décrit ci-dessus, et on le divise en parties aliquotes. On conserve une partie aliquote comme témoin et l'on ajoute suffisamment de thiomérosal à une autre partie aliquote pour que la concentration en cet agent de préservation soit de'l'iooooo. On chauffe à 370 C les deux échantillons pendant une semaine, on les conserve à 40 C pendant une semaine, puis on détermine la puissance ou activité de chaque type de virus par le procédé décrit ci-dessus. Le chauffage et le magasinage de ces échantillons équivalent à un magasinage de six mois environ à 40 C.
Les résultats de ces essais d'activité figurent dans le tableau 2 :
TABLEAU 2
Nombre Nombre d'unités
Echantillon essayÚ Type de singes infectieuses de virus Titre moyen
de virus utilisÚs neutralisÚes * gÚomÚtrique
Témoin. 1 11 101,5 284
21110'. s809
31110"773
Vaccin contenant 1 12 101, 5 < 4 du thiomÚrosal, 2 12 101,5 26 conc. = 1/looooo 3 12 100,8 9 * Activité de la solution normalisée utilisée dans les essais.
Exemple 2 :
On prépare un filtrat aqueux désactivé à la formaldéhyde contenant les types 1, 2 et 3 de virus de la poliomyélite, comme il est décrit dans l'exemple 1, et on le divise en parties aliquotes. On conserve une partie aliquote à l'état inaltéré comme échantillon témoin.
On traite une autre partie aliquote du filtrat en ajoutant goutte à goutte à chaque litre de vaccin en l'espace de deux minutes environ 5 cc d'une solution 1/zoo de chlorure de benzéthonium, à froid, avec agitation efficace. La solution ainsi obtenue, contenant le chlorure de benzéthonium à la concentration de l/40000, constitue le vaccin stabilisé.
Pour déterminer la stabilité au magasinage des propriétés antigènes du vaccin stabilisé, on conserve le vaccin à 40 C pendant quatre semaines. On détermine alors l'activité de chaque type de virus, comme il est décrit ci-dessus. L'échantillon témoin est conservé en même temps à 40 C pendant quatre semaines, puis l'activité de chaque type de virus est déterminée comme il est dit ci-dessus.
Les résultats de ces essais de puissance sont indiqués dans le tableau 3 :
TABLEAU 3
Nombre Nombre d'unités
Echantillon essayé Type de singes infectieuses de virus Titre moyen
de virus utilisÚs neutralisÚes * gÚomÚtrique
Témoin. 1 12 101,36 178
2 12 101,5 316 31210' ! 107
Vaccin contenant 1 10 101, 36 152 du chlorure de benzéthonium, 2 10 104,5 490 cône. = 1/40000 31010' : 60 * Activité de la solution normalisée utilisée dans les essais.
A titre de comparaison, on a indiqué dans le tableau 4 les résultats des essais d'activité d'un autre échantillon témoin et du vaccin stabilisé préparé comme décrit ci-dessus à l'aide de différents vaccins désactivés par la formaldéhyde contenant les types 1, 2 et 3 du virus de la poliomyélite.
TABLEAU 4
Nombre Nombre d'unités
Echantillon essayé Type de singes infectieuses de virus Titre moyen
de virus utilisés neutralisées * géométrique
Témoin 111lOo68
2 11 lOle 141
3 11 10@,86 76
Vaccin contenant 1 12 10@,@6 71 du chlorure de benzÚthonium, 2 12 10@,5 71 conc. = 1/40000 3 12 10@,8@ 76 * Activité de la solution normalisée utilisée dans les essais.
Ainsi qu'il ressort des tableaux 3 et 4, les vaccins du procédé selon 1'invention contenant du chlorure de benzéthonium à la concentration de 1/40000 Conservent leur puissance, eu égard aux trois types de virus pendant un magasinage de quatre semaines à 40 C. Les échantillons témoins conservent leur puissance dans les mêmes conditions de magasinage, mais sont susceptibles de pollution par des moisissures et des mycètes.
Il est également évident qu'il n'y a pas de différence nette entre la puissance des vaccins contenant le chlorure de benzéthonium et celle des échantillons témoins.