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"PROCEDE DE FABRICATION D'UN VACCIN CONTRE LA POLIOMYELITE"
La présente'Invention se.rapporte à des procédés de préparation de vaccins et, plus particulièrement, à des procédés de préparation de vaccins contre la poliomyélite.
Comme on le sait, la poliomyélite est une maladie à virus à processus fatal ou à séquelles déformantes. En raison de la nature de la maladie, la seule manière sûre
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d'aborder le problème est de nature prophylactique, c'est-à- dire de mettre au point des moyens de prévenir l'apparition de la maladie. Récemment, on a mis au point un vaccin tué contre la poliomyélite, composé de virus poliomyélitiques tués mais antigènes, des types 1, 2 et 3, qui a fait l'objet d'essais cliniques très étendus. Ce vaccin contre la polio- myélite est, comme beaucoup d'autres, une préparation aqueuse qui s'administre par injection. Il est ainsi essentiel que le vaccin soit stérile, c'est-à-dire exempt de bactéries, moisissures et mycètes, non seulement au moment de sa fabri-. cation et de son emballage, mais encore au moment de son administration.
Bien qu'il soit peut-être possible, au moins théoriquement, de préparer et emballer le vaccin dans des conditions aseptiques, ces vaccins peuvent être pollués au moment de leur administration, en particulier si l'embal- lage est à doses multiples, comme il est courant. En outre, la fabrication dans des conditions complètement aseptiques est d'un coût prohibitif et tout à fait impraticable. On a proposé, pour que le vaccin anti-poliomyélitique soit exempt de bactéries, de*moisissures et de mycètes contaminants et reste sous cet' état, d'ajouter comme agent de préservation un composé du mercure, en l'espèce le thiomérosal.
Bien que ce moyen fournisse une solution au problème de la pollution, il en soulève un autre,qui est peut-être encore plus sé- rieux, à savoir la perte d'activité du vaccin anti-polio- myélitique provoquée par,,le thiomérosal. Il s'ensuit que les vaccins anti-poliomyélitiques contenant du thiomérosal comme agent de préservation doivent être administrés peu après leur fabrication. Ceci est bien entendu tout à fait indésirable en raison de ce que le vaccin est difficile ,et coûteux à préparer, de aorte que sa production doit être limitée à des exigences évaluées à court terme.
Cette rai-
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son, jointe au fait que la préparation du vaccin exige plu- sieurs mois, fait qu'il est impossible de préparer assez de vaccin pour satisfaire à des demandes imprévues. Il existe ainsi un pressant besoin de fabriquer un vaccin contre la poliomyélite qui non seulement soit exempt de manière cer- taine de bactéries, de moisissures et de mycètes au moment de l'administration, mais encore conserve son activité, c'est-à-dire son caractère antigène, pendant un temps consi- dérable dans les conditions normales de magasinage.
La présente invention se propose donc de fournir un vaccin antipoliomyélitique restant exempt de manière certaine de bactéries, de moisissures et de mycètes conta- minants pendant un temps considérable dans les conditions normales de magasinage et d'utilisation par le médecin.
Elle se propose également de fabriquer un vaccin anti-poliomyélitique conservant son activité pendant un temps considérable dans les conditions normales de magasina ge.
De façon surprenante, la demanderesse a trouvé que l'on pouvait parvenir, à ces fins, ainsi que d'autres buts qui apparaîtront dans la suite, et remédier aux diffi- cultés susdites concernant les vaccins anti-poliomyélitiques en incorporant 'dans le Vaccin "tué" de la poliomyélite, c'est-à-dire une solution aqueuse contenant un virus de la. poliomyélite non infectieux mais antigène, une substance appartenant à une classe' de composés connus pour constituer des agents précipitants 'et'dénaturants des protéines.
Plus particulièrement, l'invention comporte l'Incorporation de chlorure de benzéthonium dans un vaccin aqueux tué anti- poliomyélitique à une concentration, en grammes par centi- mètre cube, comprise entre 1/20.000 et 1/50.000 environ.
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Le chlorure de benzéthonium est de préférence incorporé dans le vaccin en ajoutant lentement une solution aqueuse étendue de chlorure de benzéthonium à un vaccin aqueux tué anti- poliomyélitique, sous une agitation efficace.
Chimiquement, le chlorure de benzéthonium est le chlorure de benzyldiméthyl
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2- 2-(-1.1.3.3-tétraméthylbutylphênoxy) éthoxy) -éthyl - ammonium monohydraté, de formule
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Les produits préférés sont ceux qui contiennent le chlorure de benzéthonium à une concentration de l'ordre de 1/20.000 à 1/40.000.
Les vaccins aqueux tués anti-poliomyélitiques uti- lisés dans la fabrication des produits selon l'invention peu. vent contenir un des types variés de virus poliomyélitiques ou tous. Les vaccins préférés sont ceux qui contiennent lés types 1, 2 et 3 de ces virus. De:3 vaccins particulièrement indiqués sont ceux à teneur relativement faible en protéi- nes, de préférence moins.d'environ 18 à 20 gamma par centi- mètre cube d'azote protéinique. Ces vaccins peuvent être produits par un.certain nombre de voies différentes.
On peut, par exemple, faire macérer du tissu rénal de singe et son-
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mettre le produit a l'action de la trypsine de manière à éliminer les tissus étrangers, laisser les cellules rési- duelles se multiplier, ensemencer le milieu au moyen de virus de la poliomyélite,' soumettre le mélange à l'incuba- tion, recueillir le fluide'et désactiver le virus vivant par traitement au moyen de formaldéhyde, de radiations ultra-violettes ou par un atre moyen approprié. On peut, si on le veut, préparer des vaccins sans effectuer de trai-
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tement à la trypsine, mais)dans ce cas la teneur en protéi- nes des vaccins peut être excessivement élevée et doit être évaluée avant usage.
Dans la préparation des vaccins mixtes, c'est-à-dire des vaccins contenant plusieurs types de virus de la poliomyélite, on mélange habituellement les fluides recueillis contenant les divers types après désactivation; . bien que, si on le désire, ce mélange puisse être effectué avant. Quand on utilise des vaccins désactivés à la formai-* déhyde, on obtient les résultats les meilleurs conformément à l'invention en utilisant des vaccins auxquels on n'a pas ajouté dé bisulfite de sodium à l'effet d'en réduire la teneur en formaldéhyde.
Les exemples suivants illustrent la présente inven- tion.
Exemple 1
On prépare des cellules en vue de la culture du vi- rus de la poliomyélite par le procédé de Dulbecco, Journal of Expérimental Medicine, 99, p. 167 (1954). En bref, ce procédé consiste à préparer tout d'abord une suspension de cellules épithéliales de reins de singe (voir Dulbecco, Proc. Nat. Acad. Sci., 38, p. 747 (1954)) par traitement de tissusde reins de singe macérés, provenant d'espaces
Cynomalgus ou Rhesus en bonne santé, au moyen de trypsine de manière enlever les matières étrangères et à libérer les cellules individuelles. On laisse ces cellules se mult plier sur une surface en verre convenable dans un certain nombre de milieux de'ouït' de tissus.
On ensemence alors . la pellicule de cellules rénales ainsi produite au moyen d'une culture du type 1 (souche Mahonoy) de virus de la poliomyélite et on soumet le mélange à l'incubation à 36- 37 C. jusqu'à destruction complète des cellules et mise en liberté de grandes quantités de nouveau virus, On recueille
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le fluide contenant le virus et on le fait passer sur une bougie en verre fritté ultra-fine. On essaie le filtrat con- tenant le virus vivant de la poliomyélite du type 1 quant à sa teneur en virus, sa stérilité bactérienne et sa pureté de souche.
On prépare un filfrat contenant du virus de la polio. myélite vivant du type 2 (souche MEF-1) par le procédé dé- crit ci-dessus en vue de la préparation d/u filtrat contenant le virus de la poliomyélite du type 1. On prépare également un filtrat contenant du virus vivant de la poliomyélite du type 3 (souche Saukett) par le même procédé.
Les virus vivants contenus dans les filtrats sé- parés sont désactivés par addition de formaldéhyde et soumis à l'incubation conformément au procédé décrit en dé- tail dans l'Amendement 2 du Minimum Rquirements of Poliomy- élitis Vaccine publié le 20 Mai 1954 par le United States Department of Health, Education and Welfare. On n'ajoute,pas de bisulfite pour neutraliser la formaldéhyde en excès.
On réunit des quantités à peu près égales de vaccins de virus tué anti-poliomyélitique des types 1, 2 et 3 et on divise l'ensemble en partie sialiquotes que l'on utilise dans la préparation des produits selon l'invention. On con- serve une partie. aliquote inaltérée comme échantillon témoin.
On ajoute lentement 0,75 cc. d'une solution à 1 % de chlorure'de benzéthonium sous agitation modérée, mais efficace, à 150 cc., de vaccin tué aqueux froid de la polio- myélite préparé comme indiqua ci-dessus. On place le produit ainsi obtenu dans des ampoules en quantités propres pour l'immunisation. Ce vaccin contre la poliomyélite, qui con- tient du chlorure de benzéthonium à une concentration de 1/20.000, conserve son activité dans les conditions normale,,. de magasinage (à la température du réfrigérateur) pendant
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au moins huit mois. Il reste également exempt de pollution par des bactéries, des moisissures et des mycètes dans les conditions normales d'usage et de magasinage.
Les essais d'activité effectués sur l'échantillon témoin et le vaccin selon l'invention sont indiqués dans la tableau I. Ces activités, sont déterminées par le procédé de neutralisation du sérum décrit par Salk, Youngner et Ward,
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auerican Journal of Hygiene, 60 , p. 214 (1951+). Les résul-t tats sont exprimés en titre moyen géométrique, En bref, la méthode d'essai comporte l'inoculation de singes au moyen de trois doses de 1 cc. du vaccin d'essai à des intervalles d'une semaine, la saignée des animaux au bout du traitement, la préparation d'un sérum à l'aide du sang cueilli, puis la détermination du nombre d'anticorps présents dans le sérum.
Cette détermination s'effectue par une série de di- lutions du sérum au moyen d'une solution saline et mélange des parties aliquotes diluées au moyen d'une solution normalisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses du type donné de virus poliomyélitique. Par exemple, pour déterminer l'activité du type 1, on utilise une solution normalisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses du virus poliomyélitique 'type 1 ; pour déterminer l'activité du type 2 ou du.type 3, on utilise une solution normalisée de virus infectieux des types correspondants.
Le point final du titrage est la dilution à laquelle le sérum Contient suffisamment d'anticorps pour neutraliser exacte- ment le nombre connu d'unités infectieuses du virus présent dans la solution normalisée, c'est-à-dire se combiner avec ces unités et les rendre Inoffensives. On utilise un cer- tain nombre de singes dans l'analyse de l'activité ou puissance de chaque type de virus poliomyélitique.
Les ré- sultats ainsi obtenus sont placés sous une forme permettant
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une évaluation comparative et statistique en prenant le 10- garithme à base 2 du point final de dilution du sérum pour chaque singe, faisant la moyenne des chiffres obtenus et prenant l'analogue de la moyenne ainsi obtenue..Cet analo- ' gue est dénommé le titre moyen géométrique des vaccins.et est naturellement différent, pour chaque type de virus pré- sent dans'le vaccin.
Etant donné que le titre moyen géomé- trique dépend de la puissance de la solution normalisée du virus infectieux de la poliomyélite utilisé dans l'essai, ' il est nécessaire de spécifier le nombre d'unités infectieu- ses du virus de la poliomyélite présent dans la solution normalisée pour qu'il reflète la signification exacte du titre moyen géométrique. Le procédé de calcul du titre moyen géométrique est indiqué en détail dans l'Amendement n 2 du Minimum Requirements of Poliomyelitis Vaccine cité pré- @@demment.
Pour déterminer la stabilité au magasinage des pro. priétés antigènes des vaccins selon l'invention, on chauffe le vaccin à 37 C. pendant une semaine, puis on le conserve à 4 C. pendant huit semaines. On détermine alors la puissan. ce bu activité de chacun des types comme ci-dessus. Etant donné qu'une semaine de chauffage à 37 C. produit le même effet sur l'activité du vaccin que six mois de-magasinage à.
4 C., le vaccin dans ces' conditions d'essai est conservé un temps équivalent à huit mois à 4 C. L'échantillon témoin est conservé à )+00'9.pendant neuf semaines, au bout desquel- les on détermine la puissance de chacune des souches.. de virus comme décrit ci-dessus.
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TABLEAU 1
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<tb> Echantillon <SEP> essayé <SEP> Tyne <SEP> virus <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> singes <SEP> Nombre <SEP> d'unités <SEP> infec-Echantillon <SEP> essayé <SEP> Type <SEP> de <SEP> virus <SEP> utilisés <SEP> tieuses <SEP> de <SEP> virus <SEP> neutra- <SEP> Titre <SEP> moyen
<tb>
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###¯¯##############........¯¯..¯¯JL## lisées . géométriaue- - - --- - ----- - - ------------------- --------------------------------------------------------------------Témoin 10 le6 256 .
10? 110 1,5
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<tb> @ <SEP> 8 <SEP> 102,8 <SEP> 41
<tb> Vaccin <SEP> contenant <SEP> 12 <SEP> 101,6 <SEP> 204
<tb> du <SEP> chlorure <SEP> de <SEP> benzéthonium <SEP> 12 <SEP> 101,5 <SEP> 540
<tb>
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conca 1/20.000 10 2 '} 8 103.8 Activité de la solution normalisée Utilisée dans'les essais.
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Ainsi qu'il ressort des résultats ci-dessus, le vaccin selon l'invention conserve la puissance à l'égard des trois types de virus pour une durée de magasinage équi- valent à huit mois à 4 C. Au contraire, les vaccins préser- vés au thiomérosal perdent complètement leur activité à l'é- gard des trois types de virus dans les mêmes conditions de magasinage. C'est ce que montrent les'essais suivants.
On prépare un vaccin désactivé au moyen de formaldé' hyde contenant les types 1, 2 et 3 de virus poliomyélitique comme il est décrit ci-dessus et on le divise en parties a- liquotes. On conserve une partie aliquote comme témoin et on ajoute suffisamment de thiomérosal à une autre partie aliquote pour que la concentration en cet agent de préser- %ration soit de 1/100.000. On chauffe à 37 C. les deux échantillons pendant une semaine, on les conserve à 4 C. pendant une semaine puis on détermine la puissance ou ac- tivité de chaque type de virus par le procédé décrit ci-' dessus. Le chauffage et le magasinage de ces échantillons équivalent à un magasinage de six mois environ à 4 C.
Les résultats de ces essais d'activité figurent dans le tableau
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TABLEAU 2
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<tb> Nombre <SEP> d'unités <SEP> infecNombre <SEP> de <SEP> singes <SEP> tieuses <SEP> de <SEP> virus <SEP> neu- <SEP> Titre <SEP> moyen
<tb>
EMI11.2
EchRntillon Rssa9é Type de viriis . utilisés tralisées x géométrique
EMI11.3
<tb> Témoin <SEP> 1 <SEP> 11 <SEP> 101,5 <SEP> 284
<tb> 2 <SEP> 11 <SEP> 101,5 <SEP> 809
<tb> 3 <SEP> 11 <SEP> 100,8 <SEP> 773
<tb> Vaccin <SEP> contenant <SEP> du <SEP> 1 <SEP> 12 <SEP> 101,5 <SEP> < <SEP> 4
<tb> chlorure <SEP> de <SEP> benzéthonium, <SEP> c. <SEP> 1/100.000 <SEP> 2 <SEP> 12 <SEP> 101,5 <SEP> 26
<tb> 3 <SEP> 12 <SEP> 100,8
<tb>
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1a Activité de la solution normalisée ut'1.IJtT ..Jill 'fi 8.:1s.
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Exemple 2
On prépare un vaccin désactivé à la formaldéhyde contenant les types 1, 2 et 3 de virus de la poliomyélite comme il est décrit dans l'exemple 1 et on le divise en par- ties aliquotes. On conserve une partie aliquote à l'état inaltéré comme échantillon.,témoin..
On convertit une autre partie aliquote du vaccin en vaccin selon l'invention en ajoutant goutte à goutte à chaque litre de vaccin en l'espace de deux minutes environ 5 ce. d'une solution 1/200 de chlorure de benzétho- nium, à froid, avec agitation efficace. La solution ainsi ob, tenue, contenant le chlorure de benzéthonium à la concentra- tion de 1/40.000, constitue le vaccin selon l'invention.
Pour déterminer la stabilité au magasinage des propriétés antigènes du vaccin selon l'invention, on conserva le vaccin à 4 C. pendant quatre semaines. On détermine alors l'activité de chaque type de virus comme il est décrit ci- dessus. L'échantillon témoin est conservé en même temps à 4 C. pendant quatre semaines, puis l'activité de chaque type de virus est déterminée comme il est dit ci-dessus.
Les résultats de ces essais de puissance sont indiqués dans le tableau 3.
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TABLEAU 3
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<tb> Nombre <SEP> Nombre <SEP> d'unités <SEP> infecEchantillon <SEP> essaye <SEP> Type <SEP> (le <SEP> virus <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> singes <SEP> tieuses <SEP> du <SEP> virus <SEP> neu- <SEP> Titre <SEP> moyen
<tb> Echantillon <SEP> essayé <SEP> Type <SEP> de <SEP> virus <SEP> utilisé <SEP> tralisées <SEP> @ <SEP> géométrique
<tb>
EMI13.2
.¯----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
EMI13.3
<tb> Témoin <SEP> 1 <SEP> 12 <SEP> 101,36 <SEP> 178
<tb> 2 <SEP> 12 <SEP> 101,5 <SEP> 316
<tb> 3 <SEP> 12 <SEP> 101,86 <SEP> 107
<tb> Vaccin <SEP> contenant <SEP> du <SEP> 10 <SEP> 101,36
<tb>
EMI13.4
Vaccin contenant du 10 152 chlorure de benzétho- nium conc.
1/40.000 10 1 g
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<tb> 3 <SEP> 10 <SEP> 101,86 <SEP> 60
<tb>
Activité de la solution normalisée utilisée dans les essais.
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A titre de comparaison, on a indiqué dans le tableau )+ les résultats des essais d'activité d'un autre 'échantillon témoin et du vaccin selon l'invention, préparé conformément au procédé décrit ci-dessus à l'aide de différents vaccins désactivés par la formaldéhyde contenant les types 1, 2 et 3 du virus de la poliomyélite,
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TABLEAU 4
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Echantillon essayé Type virus Nombre de singes Nombre d'unités infec- Titre moyen Echantillon essayé SYPe dé virus utilisé tieuses de virus neutra- géométrique - -"" - lisées K -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Témoin 1. 11 la'' 3 68 2 11 10' 141 8 11 10 1186 76 Vaccin contenant du 1 12 lOl?36 71 chlorure de benzétho- sium, c.
= 1/40<000 ,¯ 2 1 10 ? 71 3 12 10 1386 76 Activité'de la solution normalisée utilisée dans les essais.
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Ainsi qu'il ressort des tableaux 3 et 4, les vac- cins selon l'invention contenant du chlorure de benzétho- nium à la concentration de 1/40.000 conservent leur puissan- ce eu égard aux trois types de virus pendant un magasinage de quatre semaines à 4 C. Les échantillons témoin conservent leur puissance dans les mêmes conditions de magasinage mais sont susceptibles de pollution par des moisissures et des mycètes. Il est également évident qu'il n'y a pas de différence nette entre la puissance des vaccins contenant le chlorure de benzéthonium et celle des échantillons té- moins.
REVENDICATIONS
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1* Un vaccin anti-poliomyélitique comprenant une solution aqueuse contenant au moins un type de virus de la poliomyélite tué mais antigène, et du chlorure de benzé- thonium à une concentration de l'ordre de 1/20.000 à 1/50.000
2. Un vaccin anti-poliomyélitique comprenant une- solution aqueuse de virus tués .mais antigènes des types 1, 2 et 3 de la poliomyélite et du chlorure de benzéthonium à
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une concentration"de l'ordre de 1/20.000 à 1/0.000. 3. Un vaccin anti-poliomyélitique comprenant une solution aqueuse de virus! de la poliomyélite des types 1, 2 et 3, tués mais '-antigènes., contenant moins de 18 à 20 gamma ' par centimètre cube d'azote protéique, et du chlorure de benzéthonium à une concentration de l'ordre de 1/20.000 à 1/50. 000.
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4. Un vaccin anti-poliomyélitique comprenant une solution aqueuse de virus des types 1, 2 et 3 de la poliomyé- lite, tués mais antigènes,\contenant moins de 18 à 20 gamma par centimètre cube d'azote protéique et du chlorure de ben- zéthonium à une concentration de 1/20.000.
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56 Un vaccin ant1-poliomyélitique comprenant une
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.