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Procédé pour la préparation d'un sel d'argent de la cyclosériné La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un sel d'argent de la cyclosérine, notamment à partir d'un milieu nutritif dans lequel cet antibiotique s'est formé.
La cyclosérine est un agent bactéricide à spectre étendu dont l'activité s'exerce vis-à-vis des bactéries Gram négatives et des bactéries Gram positives, y compris des mycobactéries telles que le Mycobacte- rium ranae. La cyclosérine est produite à partir du Streptomyces orchidaceaus. Cet antibiotique est une substance amphotère possédant des groupes faiblement acides et des groupes faiblement basiques, très soluble dans l'eau, partiellement soluble dans les glycols, dans l'alcool isopropylique, dans le méthanol, dans l'éthanol et dans l'acétone.
Il est insoluble dans l'hexane, le benzène, le chloroforme, l'éther, l'éther de pétrole, le dioxane, le 1 butanol, l'acétate d'éthyle et le dichloréthylène. Il fond avec décomposition à environ 153 C, et s'hydrolyse à 140 C avec de l'acide chlorhydrique 1 N.
Lors de la production de la cyclosérine, on cultive le microorganisme Streptomyces orchidaceaus dans un milieu nutritif contenant une source appropriée de protéine et une source appropriée d'hydrate de carbone, de l'air étant fourni au milieu que l'on met à incuber à une température comprise entre environ 20() et environ 300 C.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on ajoute du nitrate d'argent à une solution aqueuse impure de cyclosérine, à un pH compris entre 5,5 et 9,0 et qu'on recueille la cyclosérine d'argent précipitée.
Pour mettre en couvre l'invention, on opère avantageusement comme suit On filtre en premier lieu la solution aqueuse impure de cyclosérine et on la décolore avec du charbon animal activé. On adsorbe ensuite l'antibiotique à partir de la solution aqueuse sur une résine échan- geuse d'anions fortement basique sous forme hydroxyde.
Des résines échangeuses d'anions fortement basiques que l'on peut utiliser comprennent les produits marque Dowex 1 et Dowex 2 qui sont tous deux fabriqués par la Société Dow Chemical Company (Midland, Michigan) et les produits marque Amberlite XE-75 , Amberlite XE-98 , Amberlite IRA-400 , Amberlite IRA-410 , qui sont fabriqués par Rohm & Haas Company, à Philadelphie (Pennsylvanie).
Après l'adsorption de l'antibiotique sur une résine échangeuse d'anions fortement basique, on procède ensuite à l'élution de l'antibiotique en utilisant une solution aqueuse d'une matière dont l'anion est capable de déplacer la cyclosérine de la résine, cet anion étant autre que OH.
Des matières d'élution appropriées comprennent des sulfates, des chlorures, des acétates, des formiates, des phosphates, des citrates, des oxalates, etc., solubles dans l'eau, ainsi .que l'acide sulfurique, l'acide chlorhydrique, l'acide acétique, l'acide formique, l'acide phosphorique, l'acide citrique, l'acide oxalique, etc.
Après l'élution de l'antibiotique à partir de la résine échangeuse d'anions, on décolore le produit d'élution avec du charbon activé, si cela est nécessaire et, ensuite, on précipite l'antibiotique à partir de la solution aqueuse par addition à celle-ci de nitrate d'argent. Avant l'addition du nitrate d'argent on règle le pH de la solution de cyclosérine à une valeur comprise entre 5,5 et 9,0 et on règle à nouveau le pH à une valeur comprise dans cette gamme
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après l'addition du sel métallique. On préfère utiliser un pH de 6,5.
Bien entendu, il y a des cas où l'on peut précipiter l'antibiotique sous forme de sel d'argent à partir d'un milieu nutritif clarifié sans qu'il soit nécessaire de l'adsorber préalablement sur une résine échangeuse d'anions et de l'en extraire par élution. On filtre alors le milieu nutritif dans lequel l'antibiotique est produit, on clarifie ce milieu en utilisant du charbon activé, dont on forme une suspension dans le milieu nutritif filtré et que l'on filtre ensuite pour le séparer de ce milieu afin d'obtenir une solution aqueuse partiellement purifiée de l'antibiotique.
Les exemples suivants illustrent la présente invention.
Exemple 1 On filtre 288 litres d'un milieu nutritif dans lequel la cyclosérine a été produite et qui contient 4,8 unités de cyclosérine par cm3 et on les fait passer dans une colonne contenant 10 litres de Dowex-2 (résine échangeuse d'anions fortement basique) sous la forme OH, avec un débit de 1200 cm3 par minute.
On lave ensuite la colonne avec de l'eau et on sépare la cyclosérine de la résine par élution avec de l'acide sulfurique 0,2 N avec un débit de 1200 cm3 par minute, le produit d'élution étant recueilli en dix-huit fractions de 2 litres.
On règle ensuite le pH des fractions du produit d'élution à environ 7,0, après quoi on mélange 1 % en poids de charbon décolorant avec les fractions du produit d'élution, puis on l'en sépare par filtration. On ajoute ensuite au produit d'élution décoloré, 0,5 mg de nitrate d'argent par unité d'activité antibiotique du produit d'élution, le pH étant maintenu à 6,5 avec de la soude caustique.
Un sel cristallisé d'argent de la cyclosérine précipite à partir du produit d'élution et on le filtre, on le lave avec de l'acétone et on le sèche sous vide. Le tableau suivant mentionne les résultats obtenus pour neuf des fractions de produits d'élution mentionnés ci-dessus.
EMI2.48
<tb> Produit <SEP> Filtrat
<tb> Produit <SEP> Activité <SEP> Activité <SEP> Grammes <SEP> Activité
<tb> d'élution <SEP> No <SEP> d <SEP> élucion <SEP> Unités <SEP> cm.
<SEP> décoloré <SEP> Unités <SEP> cm3 <SEP> A <SEP> NO <SEP> Produit <SEP> gr <SEP> Unités/mg
<tb> Vol/cm3 <SEP> / <SEP> Vol/cm3 <SEP> / <SEP> g <SEP> a
<tb> 10 <SEP> 2260 <SEP> 15 <SEP> 2400 <SEP> 12 <SEP> 22,6 <SEP> 12,8 <SEP> 1,92
<tb> 11 <SEP> 2280 <SEP> 27 <SEP> - <SEP> 21 <SEP> 24,0 <SEP> 24,4 <SEP> 1,23
<tb> 12 <SEP> 2180 <SEP> 34 <SEP> 2340 <SEP> 31 <SEP> 35,0 <SEP> 33,9 <SEP> 1,80
<tb> 13 <SEP> 2020 <SEP> 47 <SEP> 2120 <SEP> - <SEP> 43,4 <SEP> 29,7 <SEP> 2,12
<tb> 14 <SEP> 2220 <SEP> 55 <SEP> 2400 <SEP> - <SEP> 53,3 <SEP> 38,2 <SEP> 2,5
<tb> 15 <SEP> 2160 <SEP> 32 <SEP> 2465 <SEP> 28 <SEP> 36,7 <SEP> 29,4 <SEP> 2,4
<tb> 16 <SEP> 2130 <SEP> 25 <SEP> 2370 <SEP> 20 <SEP> 28,8 <SEP> 24,4 <SEP> 2,0
<tb> 17 <SEP> 2050 <SEP> 17 <SEP> 2220 <SEP> 13 <SEP> 22,6 <SEP> 21,8 <SEP> 1,18
<tb> 18 <SEP> 1960 <SEP> 11 <SEP> 2100 <SEP> 8 <SEP> 12,7 <SEP> 10,
4 <SEP> 0
Exemple 2 On mélange une portion de 102 cmB d'un milieu nutritif contenant 5 unités par cm3 de cyclosérine avec 4 % de charbon activé, on agite le mélange et on le filtre. On ajoute 170 mg de nitrate d'argent au filtrat et le sel, d'argent de la cyclosérine précipite sous la forme de petits cristaux blancs. On filtre les cristaux et on les sèche pour obtenir 160 mg de sel d'argent cristallisé de la cyclosérine.
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Process for the preparation of a silver salt of cycloserine The present invention relates to a process for the preparation of a silver salt of cycloserine, in particular from a nutrient medium in which this antibiotic is obtained. form.
Cycloserine is a broad spectrum bactericidal agent with activity against Gram negative bacteria and Gram positive bacteria, including mycobacteria such as Mycobacterium ranae. Cycloserine is produced from Streptomyces orchidaceaus. This antibiotic is an amphoteric substance having weakly acidic groups and weakly basic groups, very soluble in water, partially soluble in glycols, in isopropyl alcohol, in methanol, in ethanol and in acetone.
It is insoluble in hexane, benzene, chloroform, ether, petroleum ether, dioxane, 1 butanol, ethyl acetate and dichlorethylene. It melts with decomposition at about 153 C, and hydrolyzes at 140 C with 1 N hydrochloric acid.
In the production of cycloserine, the microorganism Streptomyces orchidaceaus is cultured in a nutrient medium containing a suitable source of protein and a suitable source of carbohydrate, with air being supplied to the medium which is incubated at a temperature between about 20 () and about 300 C.
The process according to the invention is characterized in that silver nitrate is added to an impure aqueous solution of cycloserine at a pH of between 5.5 and 9.0 and that the precipitated silver cycloserine is collected. .
To cover the invention, the procedure is advantageously as follows. The impure aqueous solution of cycloserine is first filtered off and it is decolorized with activated animal charcoal. The antibiotic is then adsorbed from the aqueous solution onto a strongly basic anion exchange resin in hydroxide form.
Strongly basic anion exchange resins which can be used include the Dowex 1 and Dowex 2 brand products which are both manufactured by The Dow Chemical Company (Midland, Michigan) and the Amberlite XE-75, Amberlite XE brand products. -98, Amberlite IRA-400, Amberlite IRA-410, which are manufactured by Rohm & Haas Company, in Philadelphia, Pennsylvania.
After adsorption of the antibiotic onto a strongly basic anion exchange resin, the antibiotic is then eluted using an aqueous solution of a material the anion of which is capable of displacing cycloserine from the cell. resin, this anion being other than OH.
Suitable eluting materials include water soluble sulfates, chlorides, acetates, formates, phosphates, citrates, oxalates, etc., as well as sulfuric acid, hydrochloric acid, etc. acetic acid, formic acid, phosphoric acid, citric acid, oxalic acid, etc.
After elution of the antibiotic from the anion exchange resin, the elution product is decolorized with activated charcoal, if necessary, and then the antibiotic is precipitated from the aqueous solution by addition to it of silver nitrate. Before the addition of the silver nitrate, the pH of the cycloserine solution is adjusted to a value between 5.5 and 9.0 and the pH is again adjusted to a value within this range.
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after the addition of the metal salt. It is preferred to use a pH of 6.5.
Of course, there are cases where the antibiotic can be precipitated in the form of a silver salt from a clarified nutrient medium without the need to be adsorbed beforehand on an anion exchange resin. and to extract it by elution. The nutrient medium in which the antibiotic is produced is then filtered, this medium is clarified using activated charcoal, which is formed into a suspension in the filtered nutrient medium and which is then filtered to separate it from this medium in order to obtain a partially purified aqueous solution of the antibiotic.
The following examples illustrate the present invention.
Example 1 288 liters of a nutrient medium in which cycloserine has been produced and which contains 4.8 units of cycloserine per cm3 are filtered and passed through a column containing 10 liters of Dowex-2 (anion exchange resin strongly basic) in the OH form, with a flow rate of 1200 cm3 per minute.
The column is then washed with water and the cycloserine is separated from the resin by elution with 0.2N sulfuric acid at a flow rate of 1200 cm3 per minute, the elution product being collected in eighteen. fractions of 2 liters.
The pH of the elution fractions is then adjusted to about 7.0, after which 1% by weight decolorizing carbon is mixed with the elution fractions and filtered off. 0.5 mg of silver nitrate per unit of antibiotic activity of the elution product is then added to the decolorized elution product, the pH being maintained at 6.5 with caustic soda.
A crystallized silver salt of cycloserine precipitates from the elution product and is filtered, washed with acetone and dried in vacuo. The following table mentions the results obtained for nine of the elution product fractions mentioned above.
EMI2.48
<tb> Product <SEP> Filtrate
<tb> Product <SEP> Activity <SEP> Activity <SEP> Grams <SEP> Activity
<tb> elution <SEP> No <SEP> d <SEP> elucion <SEP> Units <SEP> cm.
<SEP> discolored <SEP> Units <SEP> cm3 <SEP> A <SEP> NO <SEP> Product <SEP> gr <SEP> Units / mg
<tb> Vol / cm3 <SEP> / <SEP> Vol / cm3 <SEP> / <SEP> g <SEP> a
<tb> 10 <SEP> 2260 <SEP> 15 <SEP> 2400 <SEP> 12 <SEP> 22.6 <SEP> 12.8 <SEP> 1.92
<tb> 11 <SEP> 2280 <SEP> 27 <SEP> - <SEP> 21 <SEP> 24.0 <SEP> 24.4 <SEP> 1.23
<tb> 12 <SEP> 2180 <SEP> 34 <SEP> 2340 <SEP> 31 <SEP> 35.0 <SEP> 33.9 <SEP> 1.80
<tb> 13 <SEP> 2020 <SEP> 47 <SEP> 2120 <SEP> - <SEP> 43.4 <SEP> 29.7 <SEP> 2.12
<tb> 14 <SEP> 2220 <SEP> 55 <SEP> 2400 <SEP> - <SEP> 53.3 <SEP> 38.2 <SEP> 2.5
<tb> 15 <SEP> 2160 <SEP> 32 <SEP> 2465 <SEP> 28 <SEP> 36.7 <SEP> 29.4 <SEP> 2.4
<tb> 16 <SEP> 2130 <SEP> 25 <SEP> 2370 <SEP> 20 <SEP> 28.8 <SEP> 24.4 <SEP> 2.0
<tb> 17 <SEP> 2050 <SEP> 17 <SEP> 2220 <SEP> 13 <SEP> 22.6 <SEP> 21.8 <SEP> 1.18
<tb> 18 <SEP> 1960 <SEP> 11 <SEP> 2100 <SEP> 8 <SEP> 12.7 <SEP> 10,
4 <SEP> 0
Example 2 A 102 cmB portion of a nutrient medium containing 5 units per cm3 of cycloserine is mixed with 4% activated charcoal, the mixture is stirred and filtered. 170 mg of silver nitrate are added to the filtrate and the silver salt of cycloserine precipitates in the form of small white crystals. The crystals were filtered and dried to obtain 160 mg of crystallized silver salt of cycloserine.