CH343349A - Procédé de préparation d'une enzyme protéolytique - Google Patents

Description

  Procédé de préparation d'une enzyme protéolytique    La présente invention concerne l'obtention d'une  nouvelle enzyme protéolytique.  



  Les enzymes protéolytiques, encore désignées  sous le nom de     protéases,    provoquent la dégradation  des protéines en     protéoses,    peptones et acides aminés.  Un     certain    nombre de ces enzymes sont connues et  très utilisées dans l'industrie. On peut indiquer  comme exemples la trypsine, qui se trouve dans le  suc pancréatique, la pepsine qui se forme dans la  muqueuse gastrique, la     rennine    qui est sécrétée dans  la caillette des jeunes veaux, et la papaïne que l'on  peut obtenir à partir de la sécrétion du     papaïe     exotique.  



  Les enzymes protéolytiques que l'on vient de citer  et celles de nature et d'origine semblables présentent  différents inconvénients évidents. La trypsine a une  courte demi-vie (une demi-heure), elle est instable,  coûteuse à purifier et exige un pH neutre ou légè  rement alcalin pour montrer une activité protéoly  tique optima. La pepsine n'est active qu'à des pH  très acides de 1,5 à 4,5. La     rennine    n'a que des  applications industrielles très limitées,     n'offrant     comme seul intérêt que de cailler rapidement le lait  en transformant la caséine en para-caséine. Le     papaïe,     dont on obtient la     papaïne    à partir de son latex, est  une plante des climats tropicaux.

   On doit donc  importer la papaïne brute de pays lointains comme  Ceylan et l'Afrique. Bien qu'on puisse le cultiver  dans certaines parties méridionales des Etats-Unis,  les frais de     main-d'oeuvre    pour l'extraction et le trai  tement du latex sont prohibitifs.  



  Un autre inconvénient     important    de la papaïne  comme enzyme industrielle est son extrême sensibilité  du point de vue chimique. La molécule de     papaïne       renfermant un groupe     sulfhydryle,    les oxydants agis  sent facilement sur cette enzyme. Ainsi en exposant  le latex à l'air, même pendant une courte durée, il se  forme des groupes     dithioniques    qui diminuent l'acti  vité du latex. L'addition d'un agent réducteur comme  la     cystéine    est donc nécessaire pour obtenir l'acti  vité protéolytique maxima.  



  Les enzymes protéolytiques dont on dispose  actuellement étant de structure chimique inconnue et  ne pouvant donc être obtenues par synthèse, leurs  sources principales sont des sources naturelles comme  les estomacs d'animaux, les glandes pancréatiques et  les sécrétions des plantes.  



  Des     efforts    considérables ont été tentés ces der  nières années du côté des moisissures et     mycètes     comme source bon marché et d'accès aisé d'enzymes  protéolytiques. Des recherches limitées ont été entre  prises sur des méthodes de fermentation, des formules  de milieux, et sur les conditions appropriées à une  production et une obtention les meilleures d'enzymes  protéolytiques. Ainsi Maxwell     (Australian    Journal       Scientific    Research, série B, 5, 42 - 55, 1952) a  montré que lorsqu'on cultivait une moisissure d'As  <I>pergillus</I>     oryzae    sur un milieu de     Raulin    modifié, il  s'élaborait une enzyme protéolytique.

   On trouve dans  la littérature d'autres publications détaillées d'essais  effectués sur cette moisissure ainsi que sur d'autres.  



  La     plupart    des recherches antérieures sur la  culture des     mycètes    dans des conditions convenant  pour une production industrielle d'enzymes protéoly  tiques n'ont eu qu'un succès modéré. Les méthodes  découvertes     précédemment    sont d'un intérêt très  limité en raison du coût prohibitif des milieux pres  crits pour la culture, du temps prolongé nécessaire à      la fermentation, ou de l'absence de méthodes conve  nables pour séparer et purifier     l'enzyme.    En outre,  les enzymes qui se forment dans les conditions indi  quées par     ces    chercheurs possèdent une activité pro  téolytique très limitée,

   à la fois en ce qui concerne  le champ de     cette    activité et son degré. D'autre     part,     l'intervalle de pH dans lequel     elles    sont stables est  extrêmement étroit, comme pour la trypsine et pour  la pepsine.  



  Selon la présente invention, on obtient une nou  velle enzyme protéolytique en faisant fermenter un  ou plusieurs     mycètes    de l'un ou l'autre des genres de  l'ordre des     Entomophthorales    dans un milieu nutritif  aqueux, en aérobie.  



  Cette nouvelle enzyme protéolytique se prête à  une grande variété d'applications : dans l'industrie  du cuir par exemple, pour préparer les cuirs à     partir     de peaux     brutes    ; pour attendrir la viande en en  modifiant     partiellement    les protéines.

   Cette enzyme  peut encore être employée dans d'autres domaines,  par exemple dans l'industrie du nettoyage à sec, en       particulier    pour enlever les taches de blanc     d'aeuf,     etc., dans l'industrie textile pour le     désapprétage    des  tissus, dans l'industrie de la boulangerie pour obtenir  un pain de meilleure     texture,    et dans l'industrie des  matières alimentaires pour jeunes enfants en vue de  faciliter la digestion des protéines.  



  Cette nouvelle enzyme est une substance     pro-          téinique    de structure chimique inconnue. Un volume  de 1 cc du mélange de fermentation brut offre une  activité protéolytique non inférieure à 15 000 unités       Azocoll,    déterminée par la méthode de     Bidwell    et       Oakley    décrite plus loin.

   Des échantillons de la subs  tance solide amorphe, tels que ceux obtenus     comme     indiqué plus loin et d'un titre moyen non inférieur à  1000 unités     Azocoll    par     gamma    d'azote, montrent  une notable activité protéolytique vis-à-vis de la  caséine dans un domaine de pH compris entre 4,0  et 11,0 environ, le pH     optimum    étant de 9,0. L'en  zyme a un point isoélectrique d'environ 10,2.

   Une       solution    à 1     %        de        la        substance        dans        un        tampon     d'acétate à pH 6,3 extrapolée à la concentration zéro  et     corrigée    à 200 C, dans l'eau,     possède    une constante  de sédimentation égale à 2,5 X     10-r3.    Une solution  à     0,4        %        de        l'enzyme        corrigée    à     20,

  1        C        dans        l'eau     possède une constante de     diffusion    de 8,2 X     10-7.     Une solution aqueuse de degré ionique 0,13 à pH 8,5  dans un tampon au     véronal    présente une mobilité       électrophorétique    de 0,43 X     10-5.    Une solution de  même degré ionique à pH 10,5 dans un tampon de  glycine présente une mobilité     électrophorétique    de  0,08 X     10-5.    En supposant un volume spécifique       partiel    égal à 0,75,

   les constantes de sédimentation  et de diffusion correspondent à un poids moléculaire  d'environ 30 000. Des volumes de 5 cc d'une solution  aqueuse de l'enzyme à une concentration d'environ  0,5 0/0, injectés par voie intraveineuse à un lapin  à des intervalles de 4 jours, produisent après 4 ou 5  injections environ un     antisérum    d'une teneur satis  faisante en anticorps.

       L'antisérum    spécifique ainsi    obtenu donne une réaction positive à la     précipitine          avec        1/20        cc        d'une        solution        aqueuse    à     0,5        %        de     l'enzyme, à une dilution non inférieure à 1 : 1000.  L'enzyme est stable dans le domaine de pH compris  entre 4,0 et 11,0 environ.  



  Les champignons phycomycètes de l'ordre des       Entomophthorales    utilisables dans le procédé selon  l'invention sont décrits par     Bessy        (Morphology    and       Taxonomy    of     Fungi,    pages 172 - 177,     Blakiston     Company, Philadelphie, l950).

   L'ordre comprend  une seule famille, la famille des     Entomophthoraceae     qui comprend six genres :     Entomophthora,        Bnsidio-          bolus,        Cohidiobolus,        Completoria,        Massaspora    et       Ancylistes.     



  Parmi les divers genres de cette famille, les genres       Entomophthora,        Basidiobolus    et     Conidiobolus    ont  été reconnus les plus intéressants. Les espèces des  genres se montrant actives comprennent par exemple  les espèces     Entomophthora        apiculata,        coronata,          sphaerosperma,    et les espèces     Basidiobolus        ranarum     et     Conidiobolus        brefeldianus.     



  Bien que les espèces de la famille désignée sous  le nom     d'Entomophthoraceae    soient très actives  comme productrices de l'enzyme protéolytique, on  préfère pour des raisons de productivité les espèces  des genres     Entomophthora    et     Conidiobolus.     



  Il est préférable pour la mise en     oeuvre    de l'in  vention que le milieu nutritif contienne des sources  assimilables de carbone et d'azote, et des traces de  sels inorganiques. On peut faire varier entre de larges  limites les conditions de fermentation telles que le  temps, la température et la concentration en ions  hydrogène. A la fin de la période de fermentation  on peut extraire l'enzyme du mélange de fermentation  par     différentes    méthodes, par exemple par adsorption  sur -des terres d'infusoires, ou du silicate de magné  sium, puis     élution    par des milieux aqueux à pH sen  siblement alcalin.  



  On peut employer une grande variété de subs  tances comme sources de carbone du     milieu    nutritif.  Ces substances peuvent être solubles ou insolubles  dans l'eau et il est seulement souhaitable que les  composés utilisés soient aisément assimilables par  le champignon.

   On peut citer comme exemples les  pentoses comme     l'arabinose,    le ribose et le     xylose    ;  les monosaccharides comme le     mannose,    le lévulose  et le galactose ; les     disaccharides    comme le     tréhalose,     le maltose, le lactose, le     cellobiose    et le     sucrose    ; les  polysaccharides comme l'amidon ;les alcools comme  la glycérine, la mannite, la     sorbite    et     l'inosite    ; et des  sources diverses comme l'alcool éthylique et le carbo  nate de calcium.  



       Le        milieu        préféré        est        un        milieu        contenant    5     %     en poids environ de source de carbone. La présence  de sucre est essentielle au développement de la moi  sissure si l'on désire avoir une production élevée de  mycélium. Bien qu'il soit possible de cultiver le      champignon avec succès dans un milieu nutritif  auquel on n'a pas ajouté d'hydrates de carbone, la  production d'enzyme est faible dans ces conditions  et de peu d'intérêt industriel.  



  L'azote assimilable peut être apporté par des  protéines animales ou végétales, la farine de soja, la  caséine, les peptones, polypeptides ou acides aminés.  On peut indiquer comme exemples spécifiques la  liqueur obtenue par cuisson à la vapeur sous pression  de résidus de graisses et issues d'abattoirs et de bou  cherie (ou liqueur animale de collage), le nitrate de  sodium, l'asparagine, l'urée, l'histidine et la guanine.       Une        proportion        de        11%        d'hydrolysat        de        caséine,        seul     ou avec un sucre comme le dextrose, fournit des quan  tités appréciables d'enzyme.

   On peut si l'on veut  ajouter différentes proportions de sels inorganiques,  soit à une combinaison d'hydrolyse de caséine et de  sucre, soit au sucre seul. On a constaté avec la liqueur  animale de collage comme source d'azote, que l'on  obtenait les meilleurs résultats en présence également  d'un sucre dans le milieu, bien que l'on ait égale  ment de bons rendements sans ajouter d'hydrates de  carbone.  



  Les conditions de pH pour le développement de  l'enzyme protéolytique peuvent être de pH 5,0 à 9,0  environ, mais on a trouvé que le domaine compris  entre 6,0 et 8,0 environ donnait de meilleurs résultats.  On peut ajuster le pH par toute base convenable  comme la soude, un tampon au phosphate, le citrate  de sodium, l'acétate de sodium, ou tout autre com  posé approprié portant le pH à la valeur désirée.  



  On peut maintenir la température du milieu  nutritif au cours de la fermentation du     mycète    entre       20,,    C et 30  C environ, les températures comprises  entre 25 et     30     C environ étant préférables.  



  On peut faire varier dans de larges limites le  temps nécessaire à l'obtention d'une quantité maxima  d'enzyme protéolytique, selon la nature des consti  tuants particuliers du milieu nutritif. Toutefois, une  durée de 24 à 90 heures environ est généralement  considérée comme bonne pour la production de  quantités optima d'enzyme.  



  Dans le mode de réalisation préféré de la présente  invention, on ajoute un germe de 24 heures du     mycète     à 50 cc de milieu en quantité suffisante pour avoir       une        concentration        de        0,5        %    à     1,0        0/0,        puis        on        place     le flacon sur une machine à secousse et on fait  incuber entre     26,)    C et     29()    C pendant 48 à 96 heures  environ.

   On fait passer de l'air stérilisé dans le milieu  pendant la fermentation, cet air servant en même  temps de moyen d'agitation. On évalue alors le degré  d'activité de l'enzyme protéolytique élaborée par un  essai de titre     Azocoll    modifié, de la façon décrite  en détails plus loin. On observe en général une pro  duction maxima en 48 à 72 heures.  



  On peut cultiver la moisissure utilisée comme  germe sur un milieu convenable tel que l'agar-agar.  Pour obtenir un germe de 24 heures on peut prendre  une certaine quantité de mycélium végétatif à partir  de     l'agar-agar,    le déposer dans 50 ce environ de    milieu nutritif, puis faire incuber pendant 24 heures  entre     201,    C et     30     C environ.  



  On peut ajouter     aseptiquement    des agents     anti-          mousse    au milieu de fermentation. On a trouvé que  1     ID/o        d'octadécanol    dans de l'huile de saindoux était  préférable dans ce but, bien que l'on puisse égale  ment employer une grande variété d'autres produits.  On peut indiquer comme exemples de ces produits  l'huile de soja, l'huile de ricin, l'oléine, les huiles  sulfonées, l'huile de saindoux, l'huile de ricin bromée.  On peut en ajouter de 0,1 à 1     ;O/o.     



  On obtient le meilleur résultat avec un     milieu     liquide contenant des sels inorganiques. On opère  donc de préférence avec un     milieu    liquide renfermant  des traces de constituants minéraux, ajoutés ou natu  rellement présents. On peut utiliser des nitrates, phos  phates, sulfates, chlorures de métaux lourds, de  métaux-alcalino-terreux ou de métaux alcalins, par  exemple de calcium, cobalt, sodium, potassium,  magnésium ou manganèse. On entend par traces des       proportions        variant        entre        0,001        et        0,0001        %.     



  A la fin de l'opération de fermentation, et après  avoir déterminé par le titre en unités     Azocoll    que  l'on a obtenu le rendement maximum en     protéase,     on sépare et on purifie l'enzyme. Du fait de la nature  instable de celle-ci la méthode de purification utilisée  doit être nécessairement sélective et assurer le mini  mum de destruction et la meilleure séparation du  reste des constituants du bouillon de fermentation.  



  De préférence, la substance active est adsorbée  sur une matière adsorbante appropriée à un pH de  la bouillie compris entre 6,5 et 8,5 environ. L'ad  sorption peut avoir lieu soit avant, soit après sépa  ration des cellules de la bouillie. On sépare la matière  adsorbante contenant l'enzyme du mélange de fermen  tation par tout moyen approprié, par exemple par  filtration ou centrifugation, et l'on écarte le filtrat ou  le liquide surnageant. On récupère la substance active  protéolytique en formant une bouillie avec l'adsor  bant et un alcali en solution aqueuse     comme    l'am  moniaque, la soude ou la potasse à un pH compris  entre 9,0 et 11,5 environ, et de préférence de 10,5  environ. On filtre la bouillie et on lave le gâteau avec  l'alcali aqueux pour récupérer le maximum de subs  tance.

   On réunit le liquide de lavage et     l'éluat,    et si  on le désire on les soumet à d'autres séparations et  purifications.  



  Les matières adsorbantes préférées sont des terres  d'infusoires purifiées, par exemple les produits marque        Attasorb      ou       Superfiltrol         .    On peut également  se servir de silicate de magnésium, par exemple des  produits marque       Magnésol      ou       Florisil         .    D'au  tres adsorbants appropriés sont la terre à foulon, le  charbon actif, le noir de fumée, l'oxyde de titane, les  catalyseurs de cracking synthétiques, etc. On peut  également employer avec un bon résultat les zéolites  artificielles, par exemple le produit marque       Per-          mutite         .     



  Avec un adsorbant du type silicate de magnésium  on obtient les meilleurs résultats en lavant au préa-           lable    cet adsorbant avec une solution aqueuse diluée  d'acide minéral comme l'acide chlorhydrique ou sulfu  rique, puis en     éliminant    l'acide par lavage à l'eau et  en séchant avant emploi.  



  Pour obtenir la meilleure     élution    on met l'adsor  bant en suspension dans l'eau, on ajuste à un pH  élevé, on agite, puis on filtre ou on centrifuge. On  élue généralement à pH 10,5 environ, mais ce pH  peut varier de 9,0 à 11,5 environ. Dans le cas d'un  adsorbant faible, comme par exemple un catalyseur  de cracking synthétique, le pH     d'élution    peut des  cendre à la valeur 7,4.  



  La présence d'une petite quantité de chlorure de  sodium est généralement favorable à     l'élution    maxima.  Ainsi, avec un     éluant    de pH 10,5 il est préférable  d'avoir une concentration d'environ 2     a/o    en chlorure  de sodium.  



       Immédiatement    après la filtration on abaisse le  pH de     l'éluat    (renfermant l'enzyme protéolytique)  entre 6,0 et 8,0 environ, l'enzyme étant le plus stable  à cette concentration en ions hydrogène. On peut  commodément y parvenir en ajoutant de la neige  carbonique ou en faisant passer du gaz carbonique  dans la solution jusqu'à ce que l'on obtienne le pH  désiré.  



  L'enzyme     brute    obtenue par cette méthode est à  peu près exempte d'impuretés et peut être employée  telle quelle dans nombre d'opérations industrielles  comme le nettoyage à sec., le     chipage    des peaux ou  le     désapprêtage    des tissus. Toutefois, dans d'autres  domaines comme l'industrie pharmaceutique, la fabri  cation du pain ou des matières     alimentaires    pour  bébés, il peut être souhaitable d'avoir un produit le  plus pur possible. A cet effet, on précipite l'enzyme  de sa solution aqueuse par addition d'acétone, de  préférence 2,5 à 3 volumes. On rassemble le préci  pité obtenu par centrifugation, ou par     filtration    sur  une matière filtrante appropriée comme une terre  d'infusoires.

   Il est nécessaire dans ce     dernier    cas de  séparer l'enzyme de la matière filtrante par lavage  à l'aide d'un solvant aqueux convenable, par exemple  d'une solution à 1     a/o    de     chlorure    de sodium.  



  On peut aisément mettre sous une forme stable  commerciale l'enzyme précipitée à l'acétone par un  certain nombre de procédés simples, parmi lesquels  sont la dissolution dans une solution aqueuse à 1 %  de     chlorure    de sodium suivie d'une stérilisation, la  lyophilisation en un produit solide stable, ou le  séchage par mise en suspension dans de l'acétone  anhydre et filtration.  



  Il a été     reconnu    bon d'employer un agent protec  teur pour le séchage de la substance protéolytique  active. Un tel produit auxiliaire est souhaitable si  l'on opère par lyophilisation ou par séchage à l'aide  d'un solvant comme l'acétone ou des solvants analo  gues. Des adjuvants protecteurs s'étant montrés satis  faisants sont la     sorbite,    le sirop de grain, le lactose,  le dextrose, la gélatine et la gomme arabique. On    peut ajouter le protecteur à la solution d'enzyme  juste avant la lyophilisation ou le traitement à  l'acétone.  



  Si l'on effectue le séchage à l'aide d'acétone,  l'adjuvant seul tend à donner un précipité gommeux  que l'on ne peut obtenir à l'état sec. Il est avanta  geux dans ces cas-là d'employer avec l'adjuvant un  agent de gonflement avant d'ajouter l'acétone, ce qui  permet la formation d'un précipité solide que l'on  peut facilement sécher. Comme produits qui se sont  montrés     particulièrement    satisfaisants dans ce but,  on peut citer l'amidon, la pulpe de bois, le silicate  de magnésium, la terre d'infusoires, et les composés  de semblable nature. On ajoute l'adjuvant protecteur  et les agents de gonflement à une solution aqueuse  de l'enzyme protéolytique, puis on agite le mélange.  On additionne ensuite de 2 à 5 volumes d'acétone,  puis on rassemble le précipité actif sur un filtre et  on le lave à -l'acétone froid.

   On met le précipité en  suspension dans de l'acétone anhydre, on filtre, on  sèche à l'air et on pulvérise. On peut employer le  produit obtenu tel quel dans un domaine de pH  étendu allant de 4,0 à 11,0 environ, le domaine  optimum et préféré étant compris entre 8,0 et 9,0  environ.  



  On peut si on le désire sécher l'enzyme avec des  solvants autres que l'acétone, miscibles à l'eau, et  dans lesquels l'enzyme est insoluble. Des exemples  de solvants sont le     dioxane,    et les alcools aliphatiques  inférieurs comme les alcools méthylique, éthylique,  propylique,     isopropylique,    butylique et     isobutylique.     



  Si l'enzyme protéolytique est destinée à un usage  non médicinal, comme par exemple le tannage de  cuir, il n'est pas nécessaire de soumettre le bouillon  de fermentation à des séparations coûteuses et  ennuyeuses. Ainsi on peut précipiter la substance  protéolytique active du bouillon par l'acide tannique  ou d'autres composés précipitant les protéines,  comme l'acide     phosphotungstique,    le chlorure de zinc,  le     chlorure    ferrique, etc. Cette méthode permet la  préparation très simple d'un produit utilisable à     partir     des mélanges de fermentation.

   On ajoute simplement  le composé précipitant la protéine directement au  bouillon exempt de cellules, puis on sépare le préci  pité de la liqueur mère, on le mélange avec un  agent de gonflement comme la sciure de bois et on  le sèche. On peut opérer avec ou sans adjuvants  protecteurs, tels que le sirop de grain, etc.  



  Quand on effectue la purification par précipitation  par un acide, comme par exemple l'acide tannique,  le complexe obtenu peut être utilisable tel quel, mais  il peut être avantageux de séparer la nouvelle enzyme  de l'acide tannique afin d'obtenir un produit plus pur.  Il est donc préférable de former une bouillie avec  avec une petite quantité d'eau et le précipité obtenu  par l'acide tannique, puis d'ajouter 2 volumes d'un  solvant organique comme l'acétone ou un alcool, par  exemple l'alcool méthylique, éthylique, propylique  ou butylique. Le complexe d'acide tannique et de  protéine se décompose et l'acide tannique passe en      solution dans le solvant, l'enzyme restant insoluble.  On peut aisément séparer les deux fractions par  centrifugation ou par filtration, puis reprendre par  une solution saline la substance active du produit  solide.  



  Ainsi qu'il a été indiqué plus haut, on peut déter  miner la présence et le degré d'activité protéolytique  de l'enzyme par l'essai     Azocoll,    la méthode employée  dans la présente invention étant une variante de celle  décrite par     Bidwell        (Biochemical    Journal, 46, pages  589 - 598 (1950)), et par     Oakley    et ses collaborateurs  (Journal of     Pathology    and     Bacteriology,    58, pages  229 - 235 (Avril 1946)). Cet essai est basé sur le  pouvoir que présente l'enzyme protéolytique d'hydro  lyser de la poudre de peau teinte par un colorant  azoïque. Au contact de l'enzyme, la molécule de  protéine est détruite et le colorant libéré passe dans  le milieu liquide.

   Plus le pouvoir hydrolysant de  l'enzyme est élevé, plus grande est l'intensité de la  teinte produite par la libération du colorant, que l'on  compare avec celle donnée par un essai à blanc.  L'enzyme obtenue conformément à la présente inven  tion montre un titre caractéristique d'au moins 15 000  unités     Azocoll    par     cm3    de bouillon de fermentation.  Dans des conditions convenables de durée, de tempé  rature, de pH, d'aération, de sources d'azote et de  carbone, on est arrivé jusqu'à 75 000 unités par     cm3.     



  Pour effectuer l'essai     Azocoll    modifié, on prépare  une poudre de peau teinte par un colorant azoïque  de la façon indiquée par     Oakley    et collaborateurs  (voir ci-dessus). On prépare un tampon de pH 7,4  à 7,5 comprenant 85 parties de     Na.HP04    '     12H,0,     8 parties de     KH2P04    et 40 parties     àe        NaCl,    com  plétées à 9000     parties    avec de l'eau distillée.

   On  porte à     37     C une pipette de 10     cm3,    la poudre       Azocoll    et le tampon, et on dilue l'échantillon d'en  zyme à l'aide du tampon de façon qu'après digestion  de     l'Azocoll    on fasse une lecture égale ou inférieure  à 700 au     photocolorimètre    de     Klett-Summerson,    en  employant un filtre vert No 54. On place 0,1 cc  d'échantillon d'enzyme dilué et 9,9 cc de tampon  dans un flacon     Azocoll    contenant 50 mg de poudre       Azocoll,    puis on fait incuber pendant 15 minutes à       37 C    sur une machine à secousse.

   On filtre le  mélange et on effectue la lecture sur le filtrat, à  l'appareil de     Klett    préalablement mis au zéro à  l'aide du tampon. On effectue un essai à blanc de  la même façon en employant 10 cc de tampon au  lieu de 0,1 cc de solution diluée d'enzyme et 9,9 cc  de tampon. On soustrait la lecture faite dans cet     essai-          témoin    de celle correspondant à l'échantillon d'en  zyme et on multiplie la différence obtenue par 10  fois le facteur de dilution ; on a ainsi une valeur  donnant le nombre d'unités     Azocoll    par     cm3    d'échan  tillon primitif.

   On va supposer, à titre d'exemple,  qu'avec un échantillon d'enzyme dilué de 1 à 8 on  fasse une lecture de 500, et que la lecture soit 115  pour l'essai     Azocoll    à blanc. On multiplie la diffé  rence, soit 385, par 10 X 8, ce qui donne 30 800  unités     Azocoll    par     cm-;.       Les exemples suivants servent à     illustrer    le pro  cédé selon la présente invention ; sauf spécification  contraire, toutes les parties représentent des parties  en poids.

      <I>Exemple 1</I>    On complète à 12 litres avec de l'eau ordinaire       un        milieu        comprenant    1     %        d'hydrolysat        de        caséine,     1     %        de        glucose,        0,3        %        de        NaNO3,        0,1        %        de          K,HP04,        0,

  05%        de        KCI,        0,05        '0        /0        de        M9S04.        7H.,0          et        0,001        %        de        FeS04.        7H,0,

          puis        on        stérilise.        On     ajoute au bouillon de culture un germe     d'Entomo-          phthora        apiculata    d'une culture en flacon de 30 heu  res, et on fait incuber à 27 - 280 C en agitant. Au  bout de 96 heures le bouillon titre 50 000 unités       Azocoll    d'activité protéolytique par     cm@3.       <I>Exemple 2</I>    On complète à 12 litres le milieu de l'exemple 1,  puis on stérilise pendant 30 à 40 minutes à 115   120  C, dans un récipient approprié.

   On ajoute un  germe de     Conidiobolus        brefeldinnus    au bouillon de  culture, puis on fait incuber entre 27 et     280#C.    On  fait passer de l'air stérilisé dans le mélange de fer  mentation et on agite par un moyen mécanique  39 heures. Après le début de l'incubation le milieu  titre 57 000 unités     Azocoll    d'activité protéolytique  par     cm3.       <I>Exemple 3</I>    On complète à 100 parties avec de l'eau ordi  naire un     milieu    comprenant 2 parties de liqueur  animale de collage et 3 parties de glucose, puis on  stérilise.

   On place dans des récipients convenables  des lots de 50 parties de ce milieu et on les ense  mence à l'aide d'une culture de 24 heures de     Coni-          diobolus        brefeldianus.    On fait incuber à 280 C pen  dant 3 jours sur une machine à secousse.

   A la fin  de cette période le milieu titre 78 000 unités     Azocoll     d'activité protéolytique par     cm3.       <I>Exemple 4</I>    On ajoute un germe de     Conidiobolus        villosus    au  même milieu _ que celui de l'exemple 1, complété à       100        '%        avec        de        l'eau        ordinaire,        puis        fait        incuber        le     mélange entre 26 et     28()    C.

   On fait passer de l'air       stérilisé    et on agite par un moyen mécanique. On  obtient au bout de trois jours environ de bons rende  ments en enzyme protéolytique.    <I>Exemple 5</I>    On ajoute un germe de     Basidiobolus        ranarum    au       milieu        de        l'exemple        1,        complété    à     100        %        avec        de     l'eau ordinaire et fait incuber le mélange entre 26  et     28(l    C.

   On fait passer de l'air stérilisé dans le  mélange et agite par un moyen mécanique. On obtient  au bout de 48 heures environ un bon rendement en  enzyme protéolytique.      <I>Exemple 6</I>  On ajoute un germe     d'Entomophthora        coronata     au même milieu que celui employé à l'exemple 1 et       complété    à     100        %        avec        de        l'eau        ordinaire,        puis        fait     incuber le mélange entre 26 et     28     C. On fait passer  de l'air stérilisé et on agite par un moyen mécanique.

    On obtient au bout de 36 heures environ un bon  rendement en enzyme protéolytique.    <I>Exemple 7</I>    Au milieu utilisé à l'exemple 3 et complété à  100 parties avec de l'eau ordinaire, on ajoute des  germes de     Conidiobolus        villosus    ou de     Basidiobolus          rauarum,    ou     d'Entomophthora        sphaerosperma,    ou       d'Entomophthora        coronata.    On obtient de bons ren  dements en enzyme protéolytique après une incu  bation de 3 jours à     28o    C sur une     secoueuse     mécanique.

      <I>Exemple 8</I>    On ajoute 15 parties en poids de silicate de  magnésium lavé à l'acide sulfurique à 1000 parties  en volume d'un bouillon exempt de cellules et pré  paré selon l'exemple 2, puis on agite le mélange.  On filtre la suspension et on lave le gâteau filtré  avec 100 parties en volume d'eau distillée. On forme  une bouillie avec le gâteau et une solution froide de  100 parties en volume d'ammoniaque aqueux con  centré et 100 parties en volume d'eau, puis on filtre  le mélange. On lave le gâteau avec une petite quan  tité de solution ammoniacale froide, puis on réunit  le filtrat et le liquide de lavage.

   Le bouillon exempt  de cellules titre, avant adsorption et     élution,    environ  25 millions d'unités     Azocoll    d'activité protéolytique  pour 1000     parties    en volume de liquide. Après  adsorption et     élution        l'éluat    titre 18 millions d'unités       Azocoll    d'activité protéolytique par 1000 parties en  volume de liquide.    <I>Exemple 9</I>    On filtre sur 2000     parties    en poids de terre  d'infusoires un volume du bouillon fermenté obtenu  selon l'exemple 2, ce qui donne 140 000 parties en  volume de bouillon exempt de cellules.

   On ajoute à       ce        bouillon    1     %        de        silicate        de        magnésium        lavé    à  l'acide et on agite le mélange. Lorsque le solide s'est  déposé, on siphonne le liquide     surnageant,    puis on  lave à l'eau le gâteau filtré. On forme une bouillie  avec     ce    gâteau et 5000 à 6000     parties    en volume  d'eau froide, puis on ajoute une solution aqueuse de  soude à la     bouillie    agitée jusqu'à ce que l'on atteigne  et maintienne un pH d'environ 10,5.

   On agite la  bouillie alcaline, puis on filtre le mélange. On ajuste  le pH de     l'éluat    à 8,0 environ à l'aide de gaz carbo  nique. 140 000     parties    en volume de bouillon exempt  de cellules titrent avant purification environ 1,9 mil  liard d'unités     Azocoll    d'activité protéolytique. Les  6000 parties en volume     d'éluat    titrent 1,7 milliard  d'unités     Azocoll    d'activité protéolytique.    On ajoute environ 18 000 parties en volume  d'acétone froide à     l'éluat    ci-dessus et on laisse reposer  le mélange pendant plusieurs heures à     4-,    C environ.

    On rassemble le précipité par centrifugation et on le  dissout dans 2500 parties en volume environ de       solution        aqueuse    à 1     %        de        chlorure        de        sodium.        6000     parties en volume de     l'éluat    titrent 1,7 milliard  d'unités     Azocoll    d'activité protéolytique et 2500  parties en volume de solution saline titrent au mini  mum 1,7 milliard d'unités d'activité protéolytique.  



  On dissout environ 70 parties en poids de     sorbite     cristalline sèche dans 1400 parties en volume de cette  solution saline. On congèle des parties aliquotes et  on les lyophilise.  



  On ajoute environ 182 parties en volume de       solution        aqueuse    à     70        %        de        sorbite        et        520        parties     en poids d'amidon de pomme de terre à l'autre  partie de la solution saline, puis on agite le mélange  tout en ajoutant 7800 parties en volume d'acétone  froide (à -     30     C environ), et on poursuit l'agita  tion. On laisse déposer les solides et on décante le  liquide surnageant. On filtre les produits solides, on  les sèche à l'acétone froide, puis avec de l'acétone  à la température ordinaire et à l'air.

      <I>Exemple 10</I>    On ajoute environ 1000 parties en poids de sili  cate de magnésium humide lavé à l'acide à 180 000       parties    en volume de bouillon exempt de cellules  préparé selon l'exemple 2, puis on agite le mélange.  On ajoute encore 200 parties en poids de silicate de  magnésium humide lavé à l'acide et on poursuit  l'agitation pendant encore 1 heure. On sépare les  produits solides à l'aide d'une     supercentrifugeuse,    on  les met en bouillie dans 200 parties en volume d'eau  distillée et on filtre. On forme une bouillie avec le  gâteau filtré lavé et 840 parties en volume de solution  aqueuse à 70      /o    de     sorbite,    puis on congèle la  bouillie et on la lyophilise.

   On peut utiliser le produit  sec sous cette forme et l'ajouter simplement au sup  port, on ne peut toutefois pas titrer ce produit par  l'essai     Azocoll    ; on effectue le calcul par compa  raison avec du     caséinate    de sodium.<B>10000</B>     parties     en volume de bouillon exempt de cellules titrent 3,1  milliards d'unités d'activité     protéolytique.    Le produit  sec titre 2,7 milliards d'unités d'activité protéolytique.

      <I>Exemple 11</I>    On ajoute 5000     parties    en volume d'une solution       aqueuse    à     10        %        d'acide        tannique        et    à 5     %        de     bisulfite de sodium à 465000     parties    en volume  environ de bouillon exempt de cellules obtenu selon  l'exemple 2. On agite le mélange, puis on laisse  déposer.

   On décante le liquide surnageant et on  sépare les produits solides dans une     supercentrifu-          geuse.    On agite le gâteau avec 5000     parties    en  volume d'eau auxquelles on a ajouté environ 1000       parties    en poids de sirop de grain. On agite le  mélange, on ajoute 6000     parties    en poids de sciure  de bois, on brasse à fond et on sèche.

   Le bouillon      exempt de cellules (465 000     parties    en volume) titre  11,4 milliards d'unités     Azocoll    d'activité protéoly  tique, et le produit sec, 7200     parties    en poids de  poudre moulue, titre 6,2 milliards d'unités     Azocoll     d'activité protéolytique.

      <I>Exemple 12</I>    On ajoute environ 10     parties    en volume d'une  solution aqueuse à 10 % d'acide tannique et à  5     %        de        bisulfite        de        sodium    à     1000        parties        en        volume     de bouillon exempt de cellules obtenu selon l'exem  ple 2. On agite le mélange, puis on sépare la subs  tance solide par centrifugation. On agite ensuite cette  substance avec 30     parties    en volume d'eau distillée  et on ajoute 6 parties en volume d'acétone froide.  On agite la bouillie et on la centrifuge.

   On remet  les produits solides en bouillie avec 30     parties    en  volume d'eau et 60     parties    en volume d'acétone,  puis on centrifuge à nouveau. On réunit les deux  parties liquides, la solution obtenue donne une réac  tion     importante    au chlorure ferrique. On brasse à  fond le produit solide dans 100 parties en volume       d'une        solution        aqueuse    à 2     %        de        chlorure        de        sodium     et on centrifuge.

   Le bouillon exempt de cellules titre  18 millions d'unités     Azocoll    d'activité protéolytique,  et la solution aqueuse saline surnageante 15 millions  d'unités d'activité protéolytique.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé d'obtention d'une enzyme protéolytique, caractérisé en ce qu'on fait fermenter un ou plusieurs mycètes de l'un ou l'autre des genres de l'ordre des Entomophthorales dans un milieu nutritif aqueux, en aérobie. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on utilise des espèces des genres Entomo- phthora et Conidiobolus. 2. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient des sources assi milables de carbone et d'azote. 3.

   Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 2, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient également des traces de sels inorga niques. 4. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on effectue la fermentation à un pH com pris entre 5,0 et 9,0. 5. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on effectue la fermentation entre 20 C et 30 C. 6. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que la durée de fermentation est comprise entre 24 et 90 heures. 7.

   Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on sépare l'enzyme protéolytique en ajoutant une matière adsorbante à la liqueur de fermentation, puis en séparant cette matière adsorbante et en éluant l'enzyme de l'adsorbant à l'aide d'une solution aqueuse d'alcali. 8. Procédé suivant la revendication,' caractérisé en ce qu'on sépare l'enzyme protéolytique en ajou tant à la liqueur de fermentation une substance qui précipite les protéines, comme l'acide tannique, puis en séparant le complexe qui précipite et en décom posant ce complexe pour libérer l'enzyme.