CH344180A - Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique - Google Patents

Description

  Procédé de     préparation    d'un -nouvel     antibiotique       Le brevet principal a pour objet un procédé pour  la préparation de     tétracycline,    dans lequel on ino  cule et fait fermenter sous des conditions d'aérobiose  un milieu nutritif aqueux renfermant des     substances     minérales et des matières qui fournissent, sous forme  assimilable, du carbone et de l'azote, avec un micro  organisme du genre Streptomyces capable de pro  duire de la     chlortétracycline    dans un milieu nutritif  contenant des ions chlorure,

   ce     procédé    étant carac  térisé en ce qu'on règle la teneur du milieu nutritif  en ions chlorure de manière à obtenir un produit  antibiotique renfermant en majeure partie de la tétra  cycline.  



  Le présent brevet a pour objet un procédé pour  la préparation de tétracycline selon la revendication  du brevet principal, ce procédé étant     caractérisé    par  le fait qu'on règle la teneur en ions chlorure du mi  lieu nutritif en soumettant une solution aqueuse d'au  moins un     constituant    hydrosoluble dudit     milieu    à un  traitement préalable par une matière     échangeuse     d'ions     pour    en réduire la teneur en ions chlorure.  



  On poursuit le traitement par échange d'ions de  préférence jusqu'à ce que la quantité des ions chlo  rure dans ledit constituant soit réduite à     une    valeur  telle que la teneur en ions chlorure du     milieu    nutritif  global ne dépasse pas 17 parties pour 1 million de  parties du milieu.  



  Les microorganismes utilisés comprennent des  souches, des variantes ou des mutantes de Strepto  myces     aureofaciens,    particulièrement     celles    qui don  nent des rendements relativement élevés en tétracy  cline, par exemple plus de 500     microgrammes    par  ce, dans la liqueur de fermentation.    On peut citer comme exemple un     organisme    nom  mé     UV    8, qui est une mutante du     microorganisme     Texas. Cette mutante est une souche     nouvelle,    non  décrite jusqu'à présent.

   La souche     UV-8,    lorsqu'on  la cultive sur l'agar-agar Waksman     (Journal    of     Bacte-          riology    : 7 : 339-341, 1922), présente une forte pro  duction de mycélium, d'abord blanchâtre, devenant  jaune, et se couvrant graduellement d'un mycélium  aérien blanc poudreux, qui sporule par la suite. Les  vieilles cultures sont d'un noir de jais, avec de petites  taches de mycélium blanc. Cette végétation noire est  constituée par une masse de corps à     chaînes        courtes     qui se rompent facilement. Ces corps sont de gran  deur et de forme variables, allant approximativement  de 0,5 à 4,5 microns, et leur forme peut varier de  l'ovale à un globe sphérique légèrement angulaire.

   La  grandeur moyenne est un peu supérieure à celle trou  vée chez le Streptomyces     aureofaciens        (NRRL-2209),     et il y a une plus grande variété de grandeurs et de  formes.  



  On a observé de nombreuses souches différentes  de Streptomyces qui ont la faculté de produire à la  fois de la     chlorotétracycline    et de la tétracycline, et  l'on pense qu'elles peuvent toutes être raisonnable  ment classées     comme    Streptomyces     aureofaciens,    mal  gré des différences assez marquées dans leurs habi  tudes de croissance et leurs besoins nutritifs, comme  le signalent     Duggar    et al. dans       Annals    of the New  York     Academy    of Sciences      ,    volume 60, pages 71 à  101, publié le 29 octobre 1954 ;

   pourtant, certains  pourraient être portés, pour une raison ou     pour    une  autre, à     affirmer    que leurs microorganismes produc  teurs de     tétracycline    appartiennent à une espèce dif  férente.     Etant    donné ce     conflit    possible de terminolo-           gie,    la titulaire     désire    inclure ici l'emploi de tous les  microorganismes du genre     Streptomyces    qui présen  tent les     qualités    de production de     tétracycline    indi  quées ci-dessus.  



  On a constaté que les milieux de     fermentation     synthétiques, tels que décrits en page 3 de l'exposé  du brevet     principal    sont très coûteux, et manquent de  certains     principes    essentiels de métabolisme du pro  cessus de fermentation permettant d'obtenir des ren  dements élevés en tétracycline. Pour     cette    raison et  pour d'autres imparfaitement connues, il est préféra  ble d'utiliser dans la préparation des     milieux    de fer  mentation, des matières de     provenance    naturelle, par  exemple,     liqueur    de macération du maïs, caséine di  gérée, etc.

   Non seulement ces matières sont moins  coûteuses que les matières synthétiques, mais elles       donnent    des rendements bien plus élevés en antibio  tique désiré. Ces matières contenant des quantités  appréciables d'ions chlorure, il faut les éliminer par  échange d'ions avant de constituer le milieu nutritif.  



  Ces matières     naturelles,    telles qu'une liqueur de  macération du maïs, peuvent être diluées avec de  l'eau jusqu'à une concentration appropriée pour les  faire passer à travers une couche d'échangeurs d'ions  et     éliminer    les ions chlorure dans la mesure néces  saire. On peut alors ajouter, à la liqueur de macéra  tion du maïs     désionisée,    les quantités supplémentai  res d'azote, de carbone et d'éléments minéraux né  cessaires au     milieu    de fermentation.

   Les     liqueurs    de  macération du maïs contiennent des quantités     appré-          ciables        d'ions        chlorure,        de        l'ordre        de        0,15    à     0,5        %     en poids.  



  La caséine, qui est une matière très utile pour  préparer des liqueurs de     fermentation,    est suscepti  ble de contenir de grandes quantités d'ions chlorure,  suivant les méthodes de préparation. On rencontre  fréquemment des quantités d'ions chlorure     allant        jus-          qu'à        0,30        %.        Les        produits        de        digestion        enzymatique     de la caséine, utiles aussi pour la préparation des mi  lieux de fermentation, peuvent contenir des concen  trations encore plus élevées en ions chlorure.  



  La poudre de viande, et les poudres de poisson  digérées, ainsi que diverses autres matières, particu  lièrement d'origine     animale,    contiennent aussi de  grandes quantités d'ions     chlorure.     



  Les substances présentant une viscosité élevée ne  traversent que     difficilement    les couches d'échangeurs  d'ions, et par suite il convient de les diluer avec de  l'eau jusqu'à une fluidité qui permette un écoulement       suffisant    à travers la couche.  



  Dans     certains    cas, où il faut ajouter également des  matières insolubles au milieu de     fermentation,    on peut  les laver avec de l'eau     désionisée    pour éliminer les  ions chlorure avant d'ajouter ces matières au milieu  de     fermentation.        Evidemment,    la nature de la     matière     déterminera le traitement convenable.

   Pour l'amidon       cru    par exemple, qui contient souvent des     quantités     considérables d'ions     chlorure,    on peut le laver à l'eau       désionisée,    l'ajouter au     milieu    de fermentation, et  alors le faire cuire ou le traiter autrement pour le    rendre assimilable pour le microorganisme de fermen  tation. Par     dilution    convenable, on peut faire passer  de l'amidon soluble à travers la couche d'échangeurs  d'ions pour     éliminer    les ions chlorure.  



  La     farine    de soja contient souvent des     quantités     excessives d'ions chlorure pour la     préparation    de la  tétracycline, et quand on utilise des matières de ce  genre en quantités importantes, il faut aussi les trai  ter par la technique d'échange d'ions comme décrit  ci-dessus.  



  Les souches de Streptomyces     aureofaciens    pro  ductrices de tétracycline qui produisent plus de 500       microgrammes    d'antibiotique par     cm3,    sont préféra  bles. En pareil cas, le milieu de fermentation peut  contenir 10 parties par million d'ions chlorure, bien  que des quantités inférieures soient préférables. D'au  tre part, les perfectionnements     apportés    à la sélection  des souches de Streptomyces productrices de tétracy  cline ont amené des augmentations notables du ren  dement en tétracycline, de     sorte    qu'il est maintenant  possible d'obtenir facilement 5000     microgrammes    de  tétracycline par     cm3,    et même plus.

   Si l'on utilise des  souches de Streptomyces     aureofaciens    capables de  produire des quantités de tétracycline supérieures à  500     mïcrogramrnes    par     em3,    dans des milieux de fer  mentation dont la teneur en ions chlorure a été ré  duite,     conformément    au présent procédé, à une va  leur aussi basse que possible, on peut obtenir des  moûts de fermentation bruts dans lesquels une faible  proportion seulement du produit antibiotique global  est constituée par de la     chlortétracycline.     



  La présence d'une     proportion    de     chlortétiacycline          représentant        jusqu'à        10        %        du        poids        du        produit        anti-          biotique    global présent dans le moût de fermenta  tion ne gêne pas.

   Un moût de fermentation conte  nant 5000     microgrammes    de tétracycline par     cm3,     pourrait donc renfermer jusqu'à 500     microgrammes     par cors de     chlortétracycline,    ce cas se produisant,  par exemple, lorsque le milieu nutritif contient de 40  à 50 parties d'ions chlorure pour 1 million de par  ties et lorsqu'on     utilise    un microorganisme présen  tant une     forte        affinité    pour les ions chlorure.

   Si le  microorganisme utilisé pour la     fermentation    possède  une     affinité    plus faible pour les ions chlorure et ne  les consomme pas entièrement, on peut utiliser un mi  lieu nutritif dont la teneur en ions chlorure est quel  que peu plus élevée.  



  Ainsi qu'il est commun à d'autres processus de  fermentation pour la production d'antibiotiques, les  liqueurs de fermentation contiennent des sources de  carbone, d'azote et de sels minéraux assimilables.  Beaucoup de ces sources sont relativement exemptes  d'ions chlorure, et on les     utilise    pour compléter les       matières    citées plus haut qui sont     traitées    par des  échangeurs d'ions conformément à la présente inven  tion.

   Elles comprennent notamment le saccharose, le  glucose, la dextrine, les alcools de sucres, l'acide ci  trique,     l'amidon,    la farine de graine de coton, de  maïs, de soja, d'arachide et d'autres substances car  bonées et azotées qui sont utilisées en quantité varia-           bles,    à     raison        de        0,5    à 5     %        en        poids        ou        davantage     par rapport au poids total du     milieu    de fermentation.

    Pour     accroitre    le rendement et l'économie, on     utilise     souvent des mélanges de ces matières en même temps  que les produits de provenance naturelle mentionnés  plus haut, qui ont été traités par des échangeurs  d'ions.  



  Des sels minéraux sont aussi ajoutés au     milieu    de  fermentation, en quantités variables, pour favoriser  la croissance du microorganisme et obtenir des ren  dements élevés en tétracycline. Parmi     ces    sels, on  peut mentionner le phosphate d'ammonium, le phos  phate de potassium, le     sulfate    de magnésium, le car  bonate de calcium, et divers oligo-éléments compre  nant le cobalt, le cuivre, le zinc, le manganèse, le fer,  le chrome, etc. L'usage de ces oligo-éléments pour  favoriser la fermentation est bien connu du spécia  liste.  



  Comme on le verra, lorsqu'on traite des solutions  aqueuses contenant des matières nutritives destinées  au processus de fermentation, pour en éliminer les  ions chlorure, l'absorption non sélective d'anions par  certains échangeurs d'anions, tend parfois à éliminer  une partie des anions désirables contenus dans la  liqueur de fermentation. Par exemple, dans     certaines     conditions les ions phosphates peuvent être éliminés  de la solution. De même, l'anion sulfate peut aussi  être éliminé. Pour éviter cette possibilité, et pour ré  duire la charge imposée à la colonne d'échangeurs  d'ions, il est préférable que la majeure partie des élé  ments minéraux, par exemple les phosphates. et les  sulfates, ainsi que les oligo-éléments, soient ajoutés  après l'élimination des chlorures par le traitement  d'échange d'ions.

    



  Dans certaines conditions, il peut être désirable  d'éliminer aussi     certains    cations avant la fermenta  tion. En     conséquence,    on peut utiliser des couches  mixtes qui éliminent à la fois des cations et des  anions.  



  Les échangeurs d'ions peuvent être des résines  synthétiques contenant des groupements     amino    libres,  par exemple des condensais     phénol-formaldéhyde-          polyamine,    des résines     mélamine-guanidine-formaldé-          hyde,    et des résines     polyalcoylène-polyamine.     



       Certaines    couches d'échangeurs d'ions peuvent  fonctionner de manière à éliminer seulement des  anions de la solution. Dans d'autres, il peut y avoir  remplacement. Par exemple, dans une résine     échan-          geuse    d'ions fonctionnant sous la forme de sulfate,  des ions chlorure sont éliminés et des ions     sulfate     sont libérés     pour    les remplacer dans la solution. Bien  que ce ne soit habituellement pas nécessaire,     ces    ions  sulfate peuvent être adsorbés par une deuxième cou  che d'échangeurs d'ions, fonctionnant     simultanément          i    avec la première.

   Il peut en être de même en ce qui  concerne d'autres ions qui peuvent être en cause.  Pour ces raisons, il est     important,    après le traitement  d'échange d'ions, d'ajuster les besoins anioniques des  milieux nutritifs, spécialement en phosphate.    Après avoir traité par des résines     échangeuses     d'ions certains des constituants des milieux de fer  mentation, on peut ajouter au     liquide    traité les au  tres matières nécessaires qui sont     utilisées    dans le  processus de fermentation,     stériliser    le tout, et ense  mencer avec des     mocroorganismes    producteurs de  tétracycline. On conduit alors la fermentation suivant  la manière usuelle.  



  La fermentation et l'isolement de la tétracycline  peuvent être effectués comme indiqué en détail au  brevet     N     324085.    <I>Exemple 1</I>    On prend 17,8 kg d'       Amberlite        IR-4B     , résine       échangeuse    faiblement anionique du type     phénol-          formaldéhyde-polyamine    vendue par     Rohm    et     Haas,     on neutralise par l'acide sulfurique 1 N, on tasse  dans une colonne de 15 cm jusqu'à une hauteur de  1,90 m, et on lave à l'eau jusqu'à     ce    que le pH du  liquide d'écoulement soit de 2,0.

   On dilue 15,0 kg  de liqueur de macération du maïs avec 45 litres d'eau,  et on filtre à 500 C. On lave le tourteau avec 15 litres  d'eau. On fait passer la solution de là liqueur de ma  cération du maïs à travers la colonne à raison de 40  litres     par    heure. On obtient un test de chlorure posi  tif dans le liquide     d'élution    après avoir traité l'équi  valent de 13,5 kg. de     liqueur.    On ajuste la liqueur       traitée,    exempte de chlorures à pH 4,0, avec de  l'hydroxyde d'ammonium concentré, et elle est alors  prête à l'usage.  



  On prépare un milieu de fermentation avec les  constituants suivants    Liqueur de macération du maïs traitée par les rési  nes : 20 g/1 (solides)  
EMI0003.0052     
  
    Amidon <SEP> de <SEP> mais, <SEP>   <SEP> fluidifié <SEP>   <SEP> par <SEP> traitement <SEP> à <SEP> l'acide
<tb>  sulfurique:

   <SEP> 55 <SEP> g/1
<tb>  Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>......</B> <SEP> 8,0 <SEP> g/1
<tb>  Farine <SEP> de <SEP> graines <SEP> de <SEP> coton <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,5 <SEP> g/1
<tb>  Sulfate <SEP> d'ammonium, <SEP> spécial
<tb>  à <SEP> faible <SEP> teneur <SEP> en <SEP> chlorures <SEP> 6,0 <SEP> g/1
<tb>  Acide <SEP> phosphorique <SEP> (850/0 <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,24 <SEP> g/1
<tb>  Huile <SEP> de <SEP> saindoux <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0 <SEP> 'o/o <SEP> (envol.)
<tb>  Oligo-éléments <SEP> S04Fe.2H20 <SEP> . <SEP> . <SEP> 41 <SEP> mg/1
<tb>  S04Zn.7H20 <SEP> .. <SEP> 100 <SEP> mg/1
<tb>  S04Mn.4Hz0.. <SEP> 50 <SEP> mg/1
<tb>  Eau <SEP> du <SEP> robinet, <SEP> q.s. <SEP> pour <SEP> . <SEP> .

   <SEP> 1000 <SEP> cm3       On stérilise le milieu pendant 15     minutes    à       125o    C et on dilue alors avec 3 volumes d'eau du ro  binet. Ce milieu contient approximativement 24 par  ties par     million    d'ions chlorures.

   On l'inocule alors       avec        2'%        de        son        volume        d'un        inoculum        de        Strepto-          myces        aureofaciens    (souche S-77), contenant (calculés  en poids sous forme solide) 1     'O/o    de liqueur de     ma-          cération        du        maïs,    3     1%        de        dextrine,

          0,625%        de        car-          bonate        de        calcium        et        0,2        %        de        sulfate        d'ammonium.     On conduit la fermentation à 26-270 C pendant 112  heures sous agitation mécanique et aération, à rai  son d'environ 0,5 volume d'air par volume de milieu  et par minute.

        A la récolte, on trouve que le moût     fermenté    con  tient plus de 5000     microgrammes    de tétracycline par       cm3,    avec une quantité de     chlorotétracycline    infé  rieure à 5     n/o    de cette quantité.  



  Pour régénérer la colonne, on fait passer à tra  vers celle-ci de l'acide sulfurique 1N, à raison de  100 1/h, jusqu'à ce que le liquide d'écoulement ne  contienne plus d'ions chlorure (il faut 2001 d'acide).  On fait passer de l'eau à raison de 1001/h jusqu'à ce  que le     pn    s'élève au-dessus de 2,0.     Il    faut 450 litres  d'eau.     .La    colonne est alors prête à resservir. On peut  réutiliser cette colonne quinze fois sans diminution  de sa capacité d'élimination d'ions chlorure, ni dimi  nution de la valeur nutritive de la liqueur de macé  ration du maïs traitée.

      <I>Exemple 2</I>    On opère exactement comme à l'exemple 1, sauf  qu'on utilise une colonne d'       Amberlite,    IRA-400  ,  résine     échangeuse    d'ions     fortement    anionique du type       phénol-formaldéhyde-polyamine,    fabriquée     par        Rohm     et     Haas.    Le     milieu    de fermentation contient alors en  viron 18     parties    par million d'ions chlorure.  



  Quand on fait la récolte du moût, on trouve qu'il  contient 3510     mcg/cm3    de tétracycline, et 255     micro-          grammes    de     chlorotétracycline    par     cm3.       <I>Exemple- 3</I>    On prépare une couche     mixte    de résine     échan-          geuse        cationique-anionique,    avec des     parties    égales  d'       Amberlite    IRA-400   et       IR-120         ,

          cette    der  nière étant une résine     échangeuse        fortement        cationi-          que    du type acide     sulfonique    vendue par     Rohm    et       Haas,    et on traite par le sulfate d'ammonium 1N de  façon similaire à celle indiquée pour la préparation de  la colonne dans l'exemple 1.  



  Pour tout le reste, on opère comme à l'exemple  1. Le     milieu    de fermentation, au début de la fermen  tation, contient     environ    28     parties    par     million    d'ions  chlorure.

   On trouve que le moût fermenté     contient     4670     microgrammes    de     tétracycline    par     cm-9    et 390       microgrammes    de     chlorotétracycline    par     cm3.       <I>Exemple 4</I>    Dans des essais en     flacons    agitateurs, en utilisant  le     milieu    de fermentation de l'exemple 1 additionné  de 200     mg/1    d'acide phosphorique;

   on obtient 2830       microgrammes    par     cm3    de tétracycline et 210     micro-          grammes    par     cm3    de     chlorotétracycline.     



  Quand, à titre comparatif, on     conduit    la fermen  tation comme dans le paragraphe précédent, en uti  lisant de la liqueur de macération du maïs non traitée  à     raison        de    1     %        de        solides        totaux,

          on        trouve        que        le     moût fermenté contient     environ    1600     microgrammes     de tétracycline par     cm3    et 1600     microgrammes    de       chlorotétracychne    par     cm3,

      ce qui montre que l'utili  sation de l'ion     chlorure    disponible dans la liqueur de  macération du maïs produit des proportions plus éle  vées de     chlorotétracycline.       <I>Exemple 5</I>  La résine     échangeuse        anionique    peut fonction  ner sous diverses     formes,    telles que     sulfate,    nitrate,  hydroxyde, etc.

   Quand on répète le processus décrit à  l'exemple 1 avec la résine     échangeuse    d'ions sous  forme de nitrate, préparé par traitement avec de  l'acide nitrique 1N au lieu d'acide     sulfurique,    deux  opérations différentes donnent 3590     microgrammes     de tétracycline par     cm3et    210     microgrammes    de     chlo-          rotétracycline    par     cm3    dans une     première    opération,

    et 4460     microgrammes    de tétracycline par     cm3    et 230       microgrammes    de     chlorotétracycline    par     cm3    dans  une deuxième opération.  



  Dans les deux opérations qui précèdent, la liqueur  de fermentation contient de 15 à 30     parties    environ  par     million    d'ions chlorure et ceux-ci sont pleine  ment utilisés par le microorganisme Streptomyces       aureofaciens    pour produire toute la     chlorotétracycline     possible, compte tenu de la teneur du milieu en chlo  rures.

   Mais étant donné les rendements élevés d'anti  biotique obtenus, on observe que la     proportion    de       chlorotétracycline    dans ces opérations, dans lesquelles  on utilise des résines     échangeuses    d'ions pour traiter  la liqueur de macération du maïs, est inférieure à       8'%        dans        tous        les        cas.  

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé de préparation de tétracycline selon la revendication du brevet principal, caractérisé en ce qu'on règle la teneur en ions chlorure du milieu nu tritif en soumettant une solution aqueuse d'au moins un constituant hydrosoluble dudit milieu à un trai tement préalable par une matière échangeuse d'ions pour en réduire la teneur en ions chlorure. SOUS-REVENDICATIONS 1.

   Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on poursuit le traitement par échange d'ions jusqu'à ce que la quantité d'ions chlorure dans ledit constituant soit réduite à une valeur telle que la te neur en ions chlorure du milieu nutritif global ne dé passe pas 17 parties pour 1 million de parties du mi lieu. 2. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on ajoute des ions phosphate au milieu nutritif aqueux après le traitement par échange d'ions. 3. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on utilise une liqueur de macération du maïs comme constituant du milieu nutritif. 4.

   Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que la matière échangeuse d'ions est un lit mixte d'échangeurs d'anions et de cations. 5. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le microorganisme utilisé est le Strepto myces aureofaciens.