Procédé de préparation d'une Céphalosporine insensible à la pénicillinase provenant de B. subtilis On a déjà constaté que quand on fait fermenter un milieu nutritif avec une moisissure du genre auquel appartient le Cephalosporium IMI. 49137 (American Type Culture Collection No 11550), ce milieu acquiert une activité antibiotique. On a déjà décrit en détail l'isolement de deux antibiotiques différents à partir de ce milieu.
L'un de ces anti biotiques est actif principalement contre les bactéries gram-positives, et est connu comme Cephalospo- rine P. L'autre, connu sous le nom de Céphalospo rine N, est une substance sensible à la pénicillinase, et qui est actif contre les bactéries gram-négatives et les bactéries gram-positives.
Dans le brevet anglais No 745.208, il est décrit un procédé de fermentation pour la production de Céphalosporine N et des méthodes pour l'obtention de Céphalosporine N à un état très purifié.
La présente invention est fondée sur l'observa tion que la Céphalosporine N ainsi produite et encore impure, lorsqu'on la maintient à un pH de 2,5 à 5,5, donne un mélange d'acide pénillique de Céphalo sporine N avec une substance antibiotique inconnue jusqu'à présent.
Cette troisième substance antibio tique, qui sera appelée Céphalosporine C, est, comme la Céphalosporine N, active contre les bactéries gram-positives et gram-négatives, mais, contrairement à la Céphalosporine N, elle est insensible à la péni- cillinase préparée à partir de<I>B.</I> subtilis. Elle est soluble dans l'eau et presque insoluble dans l'éthanol et l'éther.
Elle peut être identifiée à l'aide de son spectre d'absorption dans l'ultraviolet, l'antibiotique sous la forme d'une solution aqueuse de son sel de sodium ayant un pouvoir rotatoire spécifique de [ ]D -f- 1030 et présentant un maximum d'absorption dans l'ultraviolet à 260 millimicrons. La présente invention a donc pour objet un pro cédé de préparation de la Céphalo:
sporine C, carac térisé en ce que de la Céphalosporine N provenant de la culture d'une moisissure de l'espèce Céphalo- sporium et contenant en mélange de ladite Cépha- losporine insensible à la pénicillinase, est maintenue à un pH de 2,5 à 5,5<B>_</B>pendant un temps suffisant pour transformer au moins en partie la Céphalospo rine N en acide pénillique de Céphalosporine N, et en ce que l'on isole la Céphalosporine désirée.
La Céphalosporine C est de caractère acide. Tant l'acide libre que son sel de sodium sont aisé ment solubles d'ans l'eau, mais insolubles dans l'acé tone et l'éther. Une solution aqueuse du sel de sodium, de pouvoir rotatoire [cc]D -I- 1030, montre une absorption à 260 ml, de E 1 o/m = 200.
La Céphalosporine C contient du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène, de l'azote et du soufre, mais pas d'halogène ni de phosphore. L'analyse élé mentaire de son sel de sodium et de l'acide libre a donné les résultats suivants <I>Sel de sodium</I> Trouvé: C 39,5, 40,0 ; H 4,8, 5,2 ; N 8,9 ; S 6,2 ; Na 4,9 %. Equi. (titration) 480 15. P.M. déterminé par analyse cristallographique aux rayons X : 470 15.
C16H2oO8N3SNa, 2H20 correspond à : C40,5; H 5,1 ; N 8,9 ; S 6,7 ; Na 4,9 %. P.M. 473. <I>Acide libre</I> Trouvé<B>:</B> C 44,4 ; H 5,6 ; N 9,8 ; S 7,3 CioH210sN3S, H20 correspond à : C 44,5 ; H 5,3 ; N 9,7 ; S 7,4 /o.
Les résultats d'analyse donnent donc à supposer que la Céphalosporine C a la formule moléculaire C16H2108N3S.
La Céphalosporine C donne la réaction à la ninhydrine. La titration électromagnétique indique qu'elle est un acide monoaminodicarboxylique, ayant deux groupes acides avec des valeurs de pH de moins de 2,6 et de 3,1, et un groupe basique avec un pi,, de 9,8. Quand on la soumet à la ionophorèse sur papier, dans un tampon d'acétate de collidine à un pH de 7, elle se déplace vers l'anode à une vitesse à peu près la même que celle de la Céphalospo rine N.
Le spectre infrarouge du sel de sodium de la Céphalosporine C (en pâte de paraffine) montre des bandes aux longueurs d'ondes suivantes: 2,94 3,06 I, (NH), 5,77 1, (groupe ester ou lactone), 6,05 @, et 6,57 R. (C = O d'amide monosubstituée), 6,29 (-C00 ), 7,17 li et 7,36 [, (groupe isopropyle)
. Les indications entre parenthèses ne sont que dies inter- prétations possibles. Le sel de sodium de la Cépha losporine C montre aussi une bande à 5,61 R,. La Céphalosporine N et le benzylpénicillinate de sodium donnent aussi une bande dans cette région, bande que l'on a attribuée, pour ce dernier composé, au C = O du système de noyaux condensés P-lactame thiazolidine (Thompson,
Brattain, Randall et Ras mussen, The Chemistry of Penicillin, Chapitre 13, Princeton University Press, 1949).
Contrairement à la Céphalosporine N et à la benzylpénicilline, la Céphalosporine C est stable en solution aqueuse d'un pH de 2,5. Elle est cependant rapidement rendue inactive à un pH de 12. Après l'avoir maintenue à un pH de 12 pendant deux heu res, une titration en retour a montré qu'il s'était formé deux groupes acides par molécule.
Dans des conditions semblables, il n'est libéré qu'un seul groupe acide de la Céphalosporine N et de la benzyl- pénicilline. La Céphalosporine C est plus stable en présence de certains ions de métaux lourds, tels que C,++, pb++ et Zn++, que ne le sont la Céphalo- sporine N ou la benzylpénicilline.
Par hydrolyse avec un acide (HCl, 1 N, pendant huit heures à 110o C), la Céphalosporine C, comme la Céphalosporine N, donne du dioxyde de carbone et un aminoacide qui se comporte comme l'acide a-aminoadipique à la chromatographie sur papier.
Le produit obtenu en faisant réagir la Céphalo sporine C avec du 1,3,4-fluorodinitrobenzène donne par hydrolyse un produit qui se comporte comme le dérivé dinitrophénolique de l'acide a-ami- noadipique. Il semble donc que le groupe a-amino de l'acide a-aminoadipique est libre dans la Cépha losporine C et que (puisque ce groupe amino montre une valeur de pK de 9,8) le groupe a-carboxyle est aussi libre.
On n'a pas pu avoir la certitude de la formation d'une quantité notable de pénicillamine ((i-thiolva- line) par hydrolyse de Céphalosporine C, mais l'hy drolyse du produit obtenu par hydrogénolyse de cette dernière avec du nickel Raney a donné des aminoacides qui se comportaient comme l'acide a-aminoadipique, respectivement la valine, à la chro matographie sur papier.
La Céphalosporine C montre une activité d'un même ordre de grandeur envers un certain nombre de bactéries gram-positives et gram-négatives. Elle est moins efficace que la Céphalosporine N contre le Staph. aureus et le Salm. typhi, in vitro, ayant une activité de 8-10 unités par Meg. (l'unité étant celle indiquée par Abraham, Newton et Hale, 1954. Biochem. J. 58, 94).
Elle a une activité semblable à celle de la Céphalosporine N contre une espèce de Bact. coli. Sa toxicité n'a pas encore été évaluée par des essais biologiques complets, mais on croit qu'elle est faible, puisqu'on peut donner à des souris au moins 10 mg de la substance purifiée, par injection intraveineuse, sans que celles-ci paraissent en souffrir.
Pour mettre en aeuvre le présent procédé, on peut faire fermenter un milieu approprié avec une moisissure de l'espèce Cephalosporium, par exemple comme d'écrit dans le brevet anglais mentionné, enlever le mycélium du liquide fermenté, mettre ce liquide en contact avec du charbon activé, éluer la matière adsorbée par ce charbon, mettre l'éluat en contact avec de l'alumine, et éluer de l'alumine la substance antibiotique adsorbée.
La Céphalosporine C est présente avec la Céphalosporine N dans l'éluat obtenu à partir de l'alumine.
Par élimination du solvant, on peut obtenir un mélange brut contenant les céphalosporines N et C. Ainsi qu'on l'a dit, la Céphalosporine N est instable à des pH au-dessous de 5,5, tandis que la Céphalo- sporine C est stable même à des pH aussi faibles que 2,5.
La séparation de la Céphalosporine C peut donc être effectuée en convertissant la Céphalosporine N du mélange en acide pénillique de Céphalosporine N, puis en traitant le mélange résultant pour en séparer la Céphalosporine C, par exemple par fractionnement par solvant, par adsorption fractionnée sur un adsor bant solide tel que l'alumine ou une substance échan- geuse d'anions, par conversion de l'acide pénillique en un dérivé insoluble, ou par une combinaison de ces méthodes.
La conversion de la Céphalosporine N en son acide pénillique peut être effectuée simple ment en maintenant le mélange pendant deux heures à un pH de 3 et une température de 370 C.
Les façons suivantes de séparation de la Cépha losporine C d'avec l'acide pénillique de la Cépha losporine N ont donné de bons résultats. 1. On fait couler une solution aqueuse du mélange dans une colonne d'une résine échangeuse d'anions, telle que la résine Amberlite IR4B(XE-59) (le terme Amberlite est une marque de fabrique enregistrée), et on effectue l'élution avec un acide dilué, une solution tampon convenable telle qu'un formiate d'ammonium aqueux ou d'acétate d'ammonium aqueux d'un pH de 3,2 à 5,0, ou une solution aqueuse d'une base tertiaire, telle que la pyridine,
partiellement neutralisée avec de l'acide sulfurique ou oxalique. Une bande consistant en acide pénillique de Céphalosporine N sort de la colonne avant une bande consistant en Céphalosporine C.
2. On soumet une solution aqueuse du mélange, dans une machine de répartition, à une réparti tion à contre-courant à des conditions faiblement acides dans un système solvant à deux phases obtenu à partir d'eau et de phénol (ou d'un phé nol substitué convenable tel qu'un crésol ou un xylénol). Si désiré, les coefficients de partage dans ce système peuvent être modifiés par addi tion d'une quantité convenable d'un solvant orga nique, par exemple le tétrachlorure de carbone. Le pH du système est amené à une valeur de 2 à 5 par addition d'acide acétique ou d'acétate d'ammonium ou de formate d'ammonium for mant tampon.
On fait des transferts jusqu'à ce que la Céphalosporine C et l'acide pénillique de Céphalosporine N aient formé des bandes sépa rées. De préférence les conditions sont réglées de telle façon que la Céphalosporine C soit reti rée de la machine dans la phase aqueuse.
3. Une solution aqueuse du mélange est ajoutée à une colonne d'alumine lavée à l'acide, et l'élution est effectuée avec un alcali aqueux dilué, tel que de l'hydroxyde de sodium 0,01 N. La Cépha- losporine C sort de la colonne, sous forme d'une solution de son sel de sodium, avant l'acide pénillique de la Céphalosporine N.
4. On ajoute une solution aqueuse de chlorure mercurique à une solution contenant un mélange brut de Céphalosporine C et d'acide pénillique de Céphalosporine ; ce dernier composé est con verti en une pénillamine qui est précipitée comme mercaptide. La solution surnageante contient de la Céphalosporine C brute.
Après sa séparation d'avec l'acide pénillique de la Céphalosporine N, la Céphalosporine C peut être purifiée par l'une ou l'autre des méthodes pouvant être employées pour la purification de la Céphalo sporine N. En général, ces méthodes sont plus faciles à appliquer, vu la stabilité de la Céphalosporine C dans les solutions acides.
Si la méthode de purification comprend l'emploi d'acétate ou de formiate d'ammonium comme tam pons, ceux-ci peuvent être enlevés de la solution de Céphalosporine C résultante par évaporation et subli- mation sous un vide élevé ou par électrophorèse (en employant, par exemple, la cellule à quatre compar timents de Synge, Biochem. 7. 1951, 49, 642) ou en employant une résine d'échange d'ions convenable.
Les solutions de Céphalosporine C libre, obte nues soit en employant une colonne d'échange d'anions, soit la répartition à contre-courant, peuvent être évaporées à siccité dans le vide, et on peut faire passer la Céphalosporine C à travers une autre colonne d'échange d'anions pour la purifier encore. La Céphalosporine C purifiée peut être convertie en son sel de sodium, si désiré, en la dissolvant dans de l'eau et en amenant le pH à 6,0 avec de l'hydroxyde de sodium.
Les solutions du sel de sodium de la Céphalo sporine C obtenues par l'une de ces méthodes peu vent si nécessaire être décolorées à l'aide de charbon activé, et concentrées dans le vide. Le sel de sodium de la Céphalosporine C forme des cristaux mono- cliniques contenant de l'eau de cristallisation. Il peut être recristallisé dans de l'éthanol aqueux ou du pro panol aqueux. Par séchage dans le vide à la tem pérature ordinaire, il perd de son eau de cristalli sation, qui peut être rapidement regagnée par expo sition à l'air.
<I>Exemple 1</I> On a introduit 6,41 de liqueur de macération de blé, contenant un total de 256g d'azote organique, 6,4 kg de sucrose et 1,408 kg d'acétate d'ammonium, dans une cuve de fermentation d'une capacité de 45001. On a porté le contenu à 3201 avec de l'eau, 108 ml de citrate de triamyle et 30 ml de chloro forme contenant 6 g d'un agent antimousse connu dans le commerce sous la marque Dow Corning Silicone A .
On a stérilisé le milieu et la cuve au moyen de vapeur à 1 atm. pendant 20 min., on a refroidi à 300 C et on a ensemencé avec 81 d'une culture de 72 h de Cephalosporium I.M.I. <I>49137</I> cultivée dans un récipient de verre contenant le même milieu.
On a laissé fermenter à une température de 28-300 C avec une vitesse d'agitation de 400 t/min., tout en faisant passer de l'air dans le milieu à un débit de 4201/min.
Au bout de 48 h, on a refroidi le bouillon à moins de 20 C et on l'a filtré pour en éliminer le mycélium et les spores. On a ajusté le bouillon Iim- pide à un pH de 5,7 au moyen d'acide chlorhydri que et on en a fait descendre 3001,à un débit d'en viron 21/min., à travers une colonne garnie de 301 de carbone granulé, préalablement tamponné avec une solution de phosphate de sodium au pH 6,0 et bien lavé à l'eau.
Après l'adsorption, on a fait descendre de l'acé- tone aqueuse (60% d'acétone en vol.), on l'a recueil- lie par fractions de 41,
puis on a porté chaque frac- tion à 70 % en vol. d'acétone et on a ajusté le pH de manière à obtenir une valeur de 5,8 avec une électrode de verre. On a dosé l'activité antibiotique des fractions et on a séché et pesé les échantillons dosés pour en déterminer la teneur totale en matiè res solides.
On a réuni les meilleures fractions et on a obtenu 361 d'acétone à 70 % en vol., avec un titre de 30 unités par ml.
On a fait descendre un échantillon des 361 d7acé- tone à 70 'o/o en vol. à travers une petite colonne d'alumine activée (60 à 120 mailles) préalablement équilibrée avec de l'eau au pH 4,6. On a estimé qu'il faudrait 51 de cette alumine pour adsorber toute l'activité du restant des 361.
Par conséquent, on a fait descendre le tout à travers une colonne conte nant cette quantité de la même alumine. Après l'ad sorption, on a élué la colonne avec de l'acétone aqueuse à 20 a/o en vol., on a recueilli des fractions, on a réuni les meilleures fractions et on les a ajustées de manière à obtenir une lecture de pH de 5,8 au moyen d'uns électrode de verre.
On a chassé l'acétone de la solution par distil lation sous vide, puis on a congelé la solution aqueuse et on l'a séchée sous vide. La Céphalospo rine brute ainsi obtenue et donnant à l'essai 20 uni tés/mg, a été dissoute dans 110 ml d'eau. Un échan tillon a été prélevé pour servir de témoin dans des mesures spectroscopiques subséquentes. On a ajouté de l'acide chlorhydrique 10N (en général environ 1 ml) jusqu'à ce que la réaction de cette solution corresponde à un pH entre 2,7 et 3,0. La solution a alors été chauffée à 370 C et on en a pris des échan tillons à intervalles de demi-heure.
Ces échantillons ont été dilués avec de l'eau de façon à avoir des solutions contenant 0,075 mg/ml, et on a mesuré la densité optique de ces solutions à 240 mut par rapport à une solution du témoin qui a été diluée de la même manière. La réaction a été considérée comme com plète quand on n'a plus constaté d'augmentation de la densité optique à 240 ml. (120-180 minutes). L'augmentation de densité à 240 m[, était générale ment d'environ 0,3 unité de densité quand on employait une cellule de 1 cm et une concentration de 0,075 mg/ml.
Quand la transposition du compo sant Céphalosporine N en acide pénillique fut ter minée, la solution a été séchée à froid, ce qui a donné 7,0 g de mélange.
Une résine échangeuse d'anions ( Amberlite XE 59), tamponnée avec du formiate d'ammo nium 0,2 M à un pH de 3,0-3,2, a été préparée comme décrit par Hirs, Moore et Stein (l952, J. Biol. Chem., <I>195,</I> 699).
On a garni une colonne de 59 X 4 cm avec cette résine, puis on a fait pas ser de haut en bas à travers la colonne 500 ml de formiate d'ammonium 2 M contenant 0,5'% de thiodiglycol.
On a dissous 3,5 g du mélange de Céphalospo rine C et d'acide pénillique de Céphalosporine N dans 30 ml du tampon 0,2 M et on a ajusté la réac tion de la solution de façon qu'elle soit de 0,2 unité de pH supérieure à celle du tampon dans la colonne. Cette solution a été appliquée à la colonne en trois portions de 10 ml. La vitesse d'écoulement dans la colonne était réglée de façon que chaque portion de 10 ml prenne 10-15 minutes pour pénétrer dans la colonne.
La solution a alors été lavée dans la colonne avec deux fois 10 ml de tampon 0,2 M con tenant 0,5 11/o de thiodiglycol. La colonne a alors été remplie avec la même solution tampon et reliée à un réservoir à niveau constant. La vitesse d'écoulement de la colonne était réglée de façon à recueillir une fraction de 20 ml toutes les 30 minutes.
Des échantillons de chaque quatrième fraction ont été prélevés et dilués dix fois avec de l'eau. On a mesuré les densités, optiques de ces solutions diluées à 240 m#t et 260 mR par rapport à un échantillon semblablement dilué de la solution tampon. La Céphalosporine C se trouvait principalement dans les fractions 96 à 118.
Les fractions 96 à 118 ont été assemblées et concentrées jusqu'à environ 60 ml dans un évapo rateur rotatif à vide à une température au-dessous de 25() C. Le concentre a été évaporé dans un appa reil de séchage à froid de façon à donner un sirop épais. Ce sirop a été lavé deux fois avec de l'acétone pour éliminer le thiodiglycol. Il est resté un mélange de formiate d'ammonium et du sel d'ammonium de Céphalosporine C. Le formiate d'ammonium a été éliminé soit par (A) sublimation sous un vide poussé, ou (B) par électrophorèse.
A) La masse solide restant après lavage avec l'acé tone a été dissoute dans quelques ml d'eau et transférée à un appareil de sublimation. Cette sublimation est effectuée comme décrit par Hirs, Moore et Stein (1952, J. Biol. Chem.,195, 699). Le résidu de la sublimation consistait surtout en sel d'ammonium de Céphalosporine C. Ce sel a été dissous dans 2-3 ml d'eau et on a fait pas ser la solution à travers une petite colonne (0,5 X 0,5 cm) de charbon activé, pour en enle- vers les pigments.
En faisant évaporer doucement le percolat, le produit a cristallisé.
B) La masse solide restant après le lavage avec l'acétone a été dissoute dans 25 ml d'eau et versée dans le compartiment neutre d'une cellule à quatre compartiments (Synge, 1951, Biochem. J. 49, 642). La cellule était munie d'un serpentin de refroidissement à travers lequel on pompait de l'alcool à -50 C. Les compartiments à acide acétique et ammoniaque étaient changés toutes les 3 heures. Le désalage était ordinairement terminé en 12-16 heures quand on employait des voltages jusqu'à 500 volts. Les solutions prove nant des compartiments à acide acétique ont été réunies et séchées à froid.
Le produit, qui con sistait en l'acide libre de Céphalosporine C, con taminé par des traces d'acide acétique, a été libéré de l'acide acétique en le dissolvant dans une faible quantité d'eau, en le reprécipitant avec un grand excès d'acétone et en secouant le précipité avec de l'acétone sec. L'acide libre de la Céphalosporine C a alors été dissous dans de l'eau et neutralisé avec NaOH 2N (0,3-0,2 ml). En laissant évaporer doucement, le sel de sodium a précipité.
Les cristaux ont été débarrassés de toute gomme non cristalline par lavage avec de l'éthanol à 70 %, puis recristallisés dans de l'al- cool aqueux. Le rendement en substance recris- # n tallisée a été de 100 mg. A 260 m#t, E l% était 200.
<I>Exemple 2</I> De la Céphalosporine brute (400 mg) obtenue par fermentation comme décrit à l'exemple 1, don nant à l'essai 22 unités/mg, a été dissoute dans de l'eau (30 ml) et le pH de la solution a été ajusté à 3,0 avec de l'HC12N. La solution a été maintenue à 37 C pendant 21/2 heures, puis on l'a faite passer à travers une colonne de 14 cm de long, contenant 10 g d'alumine (Savory & Moore Ltd., Londres. Pour analyse chromographique)
. L'alumine avait été préalablement agitée avec suffisamment de HCl dilué pour amener le pH du liquide surnageant à l'équilibre à un pH de 4,8. Quand toute la solution eut été ajoutée à l'alumine, il y avait une mince bande brune au sommet de la colonne et une bande jaune pâle s'étendait au-dessous sur les deux tiers de la longueur de la colonne.
Dans le percolat, il n'y avait qu'une trace de substance ninhydrine-positive. La colonne a été lavée avec de l'eau (20 ml) et on en a commencé l'élution avec du NaOH 0,01N, le liquide sortant étant recueilli en fractions de 5 ml, le taux d'écoulement était de 1 ml par minute. L'extinction de ces fractions à 240 ml, et 260 mu a été mesurée dans un spectrophotomètre de Beck- man. A partir de la fraction 13, l'absorption aux deux longueurs d'onde a commencé à augmenter nettement.
Avec les fractions 13 à 17, contenant la Céphalosporine C, l'absorption est restée plus grande à 260 m#t qu'à 240 ml,. A la fraction 18, il y a eu un accroissement subit de l'absorption relative à 240 mu, dû à l'apparition dans l'éluat d'acide pénil lique de Céphalosporine N. A la fraction 21, un pigment jaune est apparu dans l'éluat.
Les fractions 13-17 (pH 5,0) ont été réunies et concentrées dans le vide à 2 ml. Le pigment a été enlevé de la solution résultante en la faisant passer à travers une petite colonne de charbon activé (0,5 cm de diamètre X 3 cm de haut) qui avait été préalablement lavée avec de l'eau. Par concentration du percolat dans le vide, il s'est pris en une masse cristalline de Céphalosporine C. Ce produit pesait 33 mg. Il contenait un peu de gomme non cristal line, et la mesure de son absorption à 260 m[, a indiqué la présence de 25 mg de Céphalosporine C. Les cristaux ont été séparés de la gomme par agi tation avec un peu d'éthanol à 70 0/0, et filtration. Le produit cristallin a été recristallisé dans du pro panol aqueux.
<I>Exemple 3</I> On a dissous un mélange (7,3 g) d'acide pénil- lique de Céphalosporine N et de Céphalosporine C, obtenu comme décrit à l'exemple 1, dans 80 ml de la phase du haut et 40 ml de la phase de fond d'un système solvant préparé comme suit De l'eau saturée de phénol (51), du phénol saturé d'eau (4,51) et de l'acide acétique glacial (0,451) ont été mélangés, et on a laissé le mélange se mettre en équilibre à 200 C. La réaction de la couche supérieure au point d'équilibre correspondait à un pH de 2,6 (à l'électrode de verre).
De la phase de fond (20 ml) et de la phase de sommet (40 ml) de cette solution ont été placées dans les tubes 'O' et 'l' d'une machine de répartition à contre-courant en verre (Craig et Craig, 1950, Technique & Organic Chemistry, vol. 3, chapitre 4). Cent transferts de la couche du haut (40 ml) ont été effectués en opérant selon la méthode fondamentale, lesquels ont été suivis par trois cents retraits de la couche supérieure (40 ml) du tube '100'.
<I>Analyse des fractions:</I> On a prélevé un échan tillon (0,2 ml) de chaque dixième fraction de la série des extraits et on a mesuré photométriquement la densité de couleur développée par chauffage avec de la ninhydrine (0,5 ml), par la méthode de Moore et Stein, 1948, J. Biol. Chem. <I>176,</I> 367. En faisant le graphique des densités optiques obtenues de cette manière en regard du nombre de la fraction, on a constaté une bande contenant de l'acide pénillique de Céphalosporine N dans les fractions 51 à 100 et une bande contenant de la Céphalosporine C dans les fractions 190 à 300.
La valeur du coefficient de partage
EMI0005.0056
de la Céphalosporine C calculée d'après la position du sommet de la bande était de 0,2 et celle calculée pour l'acide pénillique de Céphalosporine N était 0,63.
Les fractions tirées 200-300 ont été rassemblées et concentrées jusqu'à environ 500 ml (400 ml de couche aqueuse et 100 ml de couche de phénol) dans un évaporateur rotatif à vide. Le concentré a été placé dans un entonnoir de séparation et secoué avec 400 ml de tétrachlorure de carbone. Après que les couches se furent séparées, la phase tétrachlorure de carbone a été mise de côté et la phase aqueuse a été extraite trois fois avec un égal volume de benzène. Le résidu aqueux a été concentré à environ 100 ml dans l'évaporateur rotatif, puis séché à froid.
Des traces d'acide acétique ont été éliminées du produit en dissolvant celui-ci dans un faible volume d'eau et précipitant la Céphalosporine C (acide libre) avec un excès d'acétone. Le précipité a été lavé avec de l'acétone sec.
L'acide libre a été dissous dans un petit volume d'eau, puis neutralisé avec de la soude caustique 2 N (0,5-0,6 ml). Le sel de sodium de la Céphalospo rine C a cristallisé quand on a évaporé lentement la solution neutralisée. Les cristaux ont été lavés avec de l'éthanol à 70 Vo, qui en a enlevé la substance non cristalline. Rendement: 168 mg. Cette substance a été recristallisée dans du propanol aqueux.
<I>Exemple 4</I> Une solution aqueuse de Céphalosporine brute éluée d'une colonne à échange d'anions, colonne chargée elle-même à partir d'un bouillon de culture, a été acidifiée à un pH de 2,5 et maintenue à 370 C pendant 2 heures. L'inactivation de la Céphalospo rine N a été complète. La solution a été séchée à froid après qu'on eut ajusté son pH à 5,0. Le pro duit (600 mg, 0,45 unités par mg) a été ajouté à 3 ml d'un tampon d'acétate de pyridine de pH 5,0 [acide acétique 2 M (150 ml), pyridine N (250 ml) et eau (600 ml)], et un peu de substance insoluble a été enlevée par centrifugation.
La solution claire résultante (pH 5,0) a été ajoutée lentement en deux portions au sommet d'une colonne (1,9 X 20 cm) d' Amberlite JR4B (200-400 mailles). La résine avait été amenée à un pH de 5,0 avec de l'acétate de pyridine en lavant la forme acétate de la résine avec le tampon acétate de pyridine (préparé comme indiqué ci-dessus) sur un filtre jusqu'à ce que le tampon versé dessus et celui en sortant aient le même pH, soit 5,0.
Après que la solution de Céphalosporine C brute se fut écoulée dans la colonne, elle a été suivie de deux additions de 2 ml de tampon<B>.</B> acétate de pyri- dine, et on a relié le sommet de la colonne avec un réservoir à niveau constant contenant le tampon acétate de pyridine. La hauteur du réservoir a été ajustée pour donner la vitesse d'écoulement désirée (9 ml/heure). Cette vitesse d'écoulement était obte nue quand la hauteur du tampon dans le réservoir était seulement de quelques centimètres au-dessus de la plaque de fond de la colonne.
L'effluent a été recueilli en fractions de 3 ml toutes les 20 minutes.
Des fractions ont été analysées en mesurant l'ac tivité antibactérienne envers le S.<I>typbi,</I> d'échantil lons qui avaient été neutralisés avec une solution d'hydroxyde de sodium, et aussi par la méthode photométrique à la ninhydrine (Moore et Stein, 1948, J. Biol. Chem. <I>176,</I> 367).
La Céphalosporine C a été éluée dans les frac tions 72-108. Ces fractions ont été réunies et con centrées dans le vide (à 300 C, température du bain) dans un évaporateur rotatif. Le résidu a été dissous dans un petit volume d'eau, transféré dans une cuvette et séché jusqu'au lendemain dans le vide sur de la KOH et du l'@0,;, après quoi on ne pouvait plus percevoir d'odeur de pyridine ou d'acide acé tique. Il a alors été dissous dans un petit volume d'eau (0,3 ml) et on y a ajouté 10 ml d'acétone.
Le précipité a été séparé par centrifugeage, agité avec quelques ml d'acétone, recentrifugé et séché dans le vide; on a obtenu une poudre blanche légè rement teintée, d'acide libre Céphalosporine C. L'acide libre a été dissous dans de l'eau (2 ml) en donnant une solution de pH 3,0, et on lui a ajouté avec soin du NaOH 0,1N (0,49 ml) à l'aide d'une burette jusqu'à ce que le pH se soit élevé à 6,5. La solution résultante de sel de sodium de Céphalospo rine C a été séchée à froid. La substance sèche a été cristallisée en la dissolvant dans un petit volume d'eau et en évaporant lentement cette solution.
La matière sèche cristalline (39 mg) a été débarrassée d'impuretés non cristallines en la lavant avec un petit volume d'éthanol à 70 O/o (v/v). <I>Exemple 5</I> Une solution de Céphalosporine brute éluée d'une colonne échangeuse d'anions, chargée elle-même à partir d'un bouillon de culture, a été acidifiée à un pH de 2,5 et maintenue à 37 pendant 2 heures, durant lesquelles toute l'activité de la Céphalospo rine N a. été détruite. La solution a été séchée à froid après qu'on eut ajusté son pH à 5,0.
Le produit (4 g, 0,08 unité par mg) a été secoué avec 8 ml d'acétate de pyridine pH 5,0 (voir exemple 4). On a ajouté quelques gouttes de pyridine pour maintenir la réaction de la solution à pH 5,0. Après environ 20 minutes, la solution a été centrifugée, et le liquide surnageant a été décanté.
On a secoué le précipité avec encore 4 ml de tampon, recentrifugé, et le second liquide surnageant (12 ml) a été introduit en 4 portions de 3 ml dans une colonne de 2 cm X 42 cm d' Amberlite JR4B (79'0/0 40-60 mail- les, et 20'% 60-100 mailles)
. La résine avait été traitée avec du tampon acétate de pyridine (pH 5,0) comme décrit à l'exemple 4. La solution de Cépha losporine C a été suivie de 2 portions de 3 ml du tampon acétate de pyridine, puis la colonne a été traitée comme décrit à l'exemple 7.
La Céphalo.sporine C se trouvait dans le volume d'effluent entre 280 à 500 ml. La substance dans le volume d'effluent 387 m1-443 ml a été débarrassée du tampon acétate de pyridine et précipitée avec de l'acétone comme décrit à l'exemple 4, ce quia donné 18 mg de Céphalosporine C impure, à l'état d'acide libre. Ce dernier a été dissous dans l'eau (2,0 ml) et on y a ajouté du NaOH 0,1N (0,14 ml) jusqu'à ce que le pH se soit élevé à 6,5. Cette solution a été évaporée lentement et de la matière s'est séparée en cristaux.
Le mélange de substance cristalline et non cristalline a été lavé sur un filtre avec de l'éthanol à 70'% (v/v), ce qui a donné 2 mg du sel cristallisé de sodium de la Céphalosporine C. Le liquide de lavage à l'éthanol a donné 14 mg d'une substance à 2,5 unités/mg. La solution restante du volume effluent 280 m1-500 ml a été trouvée contenir 23 mg d'une substance à 2,5 unités/mg.
Chacun des systèmes de solvants employés pour séparer la Céphalosporine C de l'acide pénillique de la Céphalosporine N par répartition à contre- courant peut être adapté au partage chromatogra- phique, l'une des phases étant adsorbée sur un sup port tel que le Kieselguhr, ou peut être utilisé dans une colonne d'extraction à écoulement continu de solvant telle que celle décrite par Scheibe1 & Karr (Ing. Eng. Chem. 42, p.
1048 - (1950).) Il a été indiqué ci-dessus que la Céphalosporine C est insensible à la pénicillinase, c'est-à-dire qu'elle n'est pas sensiblement attaquée par celle-ci. Cela constitue la propriété avantageuse 1a plus importante du nouvel antibiotique, puisqu'elle le rend utilisable contre les micro-organismes qui produisent de la pénicillinase et qui, de ce fait, sont plus ou moins résistants à la pénicilline. La Céphalosporine C peut donc agir pour protéger la pénicilline contre son inactivation par de tels micro-organismes.
Des essais ont montré que la Céphalosporine C n'est pas sensiblement affectée par la pénicillinase pure produite par des genres de<I>B.</I> subtilis et<I>B.</I> cereus <I>;</I> la table I montre les quantités de dif férentes préparations de pénicillinase qui sont néces saires pour produire une inactivation à 50 %, expri mées en termes de la quantité requise pour la Cépha losporine C divisée par la quantité requise pour une quantité égale de Céphalosporine N.
EMI0007.0011
Table <SEP> I
<tb> Pénicillinase <SEP> Quantité <SEP> relative
<tb> Source <SEP> Pureté <SEP> C <SEP> / <SEP> N
<tb> <I>B. <SEP> subtilis</I>
<tb> (genre <SEP> 749) <SEP> Brute <SEP> . <SEP> 100
<tb> <I>B. <SEP> cereus</I>
<tb> (NRRL <SEP> 569) <SEP> Brute <SEP> 5
<tb> <I>B. <SEP> cereus</I>
<tb> (NRRL <SEP> 569) <SEP> Purifiée <SEP> 30
<tb> <I>B. <SEP> cereus</I>
<tb> 5/B. <SEP> En <SEP> cristaux <SEP> <B>10000</B> Les quantités relatives plus faibles nécessaires de préparations de pénicillinase moins pure sont proba blement dues à la présence d'impuretés ayant un effet nuisible sur la Céphalosporine C.
EMI0007.0013
Table <SEP> II
<tb> Concentration <SEP> la <SEP> plus
<tb> Organisme <SEP> basse <SEP> empêchant <SEP> le
<tb> développement <SEP> en
<tb> <U>24 <SEP> heures, <SEP> #Lg/ml</U>
<tb> <I>Staph. <SEP> aureus,</I> <SEP> genre <SEP> Heatley,
<tb> sensible <SEP> à <SEP> la <SEP> pénicilline <SEP> 50-100
<tb> <I>Staph. <SEP> aureus,</I> <SEP> résistant <SEP> à <SEP> la
<tb> pénicilline <SEP> 25
<tb> <I>Str. <SEP> pyogenes <SEP> 25</I>
<tb> <I>B. <SEP> anthracis <SEP> 25</I>
<tb> <I>N. <SEP> meningitidis</I> <SEP> 1,6
<tb> <I>N.gonorrhoeae</I> <SEP> 1,6
<tb> <I>H. <SEP> pertussis</I> <SEP> 1,6
<tb> <I>H. <SEP> influenzae <SEP> 12,5</I>
<tb> <I>S. <SEP> typhi <SEP> 25</I>
<tb> <I>S. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 25</I>
<tb> <I>S. <SEP> typhimurium</I> <SEP> 50
<tb> <I>V. <SEP> cholerae</I> <SEP> 50
<tb> <I>Bact.
<SEP> friedlünderi</I> <SEP> 50
<tb> <I>8act. <SEP> coli</I> <SEP> I <SEP> 200 L'efficacité de la Céphalosporine C contre divers micro-organismes est indiquée dans la table II, laquelle ne doit cependant pas être considérée comme exposant son spectre bactérien entier, et n'est qu'un exposé de cette activité antibiotique telle qu'elle a été constatée jusqu'à présent.
Les caractères de la Céphalosporine C sont illus trés au dessin annexé, dans lequel la fig. 1 est la courbe d'absorption dans l'ultra violet ; -la fig. 2 est le spectre dans l'infrarouge.
Process for preparing a penicillinase insensitive cephalosporin from B. subtilis It has already been found that when a nutrient medium is fermented with a mold of the kind to which Cephalosporium IMI belongs. 49137 (American Type Culture Collection No. 11550), this medium acquires antibiotic activity. The isolation of two different antibiotics from this medium has already been described in detail.
One of these anti-biotics is active primarily against gram-positive bacteria, and is known as Cephalosporin P. The other, known as Cephalosporin N, is a penicillinase sensitive substance, and is active against gram-negative bacteria and gram-positive bacteria.
In British Patent No. 745.208 there is disclosed a fermentation process for the production of Cephalosporin N and methods for obtaining Cephalosporin N in a highly purified state.
The present invention is based on the observation that the cephalosporin N thus produced and still impure, when maintained at a pH of 2.5 to 5.5, gives a mixture of penillic acid of Cephalosporin N with a antibiotic substance unknown so far.
This third antibiotic substance, which will be called Cephalosporin C, is, like Cephalosporin N, active against gram-positive and gram-negative bacteria, but, unlike Cephalosporin N, it is insensitive to penicillinase prepared from it. of <I> B. </I> subtilis. It is soluble in water and almost insoluble in ethanol and ether.
It can be identified by its absorption spectrum in the ultraviolet, the antibiotic in the form of an aqueous solution of its sodium salt having a specific optical rotation of [] D -f-1030 and exhibiting maximum absorption in the ultraviolet at 260 millimicrons. The present invention therefore relates to a process for the preparation of cephalo:
sporin C, characterized in that the Cephalosporin N obtained from the culture of a mold of the species Cephalosporium and containing as a mixture of the said cephalosporin insensitive to penicillinase, is maintained at a pH of 2.5 at 5.5 <B> _ </B> for a time sufficient to convert at least part of the Cephalosporin N into the penillic acid of Cephalosporin N, and in that the desired cephalosporin is isolated.
Cephalosporin C is acidic in character. Both the free acid and its sodium salt are readily soluble in water, but insoluble in acetone and ether. An aqueous solution of the sodium salt, of optical rotation [cc] D -I-1030, shows an absorption at 260 ml, of E 1 o / m = 200.
Cephalosporin C contains carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen and sulfur, but no halogen or phosphorus. Elemental analysis of its sodium salt and free acid gave the following results <I> Sodium salt </I> Found: C 39.5, 40.0; H 4.8, 5.2; N 8.9; S 6.2; Na 4.9%. Equi. (titration) 480 15. M.P. determined by X-ray crystallographic analysis: 470 15.
C16H20O8N3SNa, 2H20 corresponds to: C40.5; H 5.1; N 8.9; S 6.7; Na 4.9%. M.p. 473. <I> Free acid </I> Found <B>: </B> C 44.4; H 5.6; N 9.8; S 7.3 C10H210sN3S, H2O corresponds to: C 44.5; H 5.3; N 9.7; S 7.4 / o.
The analytical results therefore suggest that Cephalosporin C has the molecular formula C16H2108N3S.
Cephalosporin C gives the ninhydrin reaction. Electromagnetic titration indicates that it is a monoaminodicarboxylic acid, having two acid groups with pH values of less than 2.6 and 3.1, and a basic group with a pI ,, of 9.8. When subjected to iontophoresis on paper, in collidine acetate buffer at pH 7, it moves towards the anode at about the same speed as that of Cephalosporin N.
The infrared spectrum of the sodium salt of Cephalosporin C (in paraffin paste) shows bands at the following wavelengths: 2.94 3.06 I, (NH), 5.77 1, (ester or lactone group) , 6.05 @, and 6.57 R (C = O of monosubstituted amide), 6.29 (-C00), 7.17 li and 7.36 [, (isopropyl group)
. The indications in parentheses are only possible interpretations. The sodium salt of Cephalosporin C also shows a band at 5.61 R 3. Cephalosporin N and sodium benzylpenicillinate also give a band in this region, a band that has been attributed, for the latter compound, to the C = O of the P-lactam thiazolidine condensed ring system (Thompson,
Brattain, Randall and Ras mussen, The Chemistry of Penicillin, Chapter 13, Princeton University Press, 1949).
Unlike Cephalosporin N and benzylpenicillin, Cephalosporin C is stable in aqueous solution with a pH of 2.5. However, it is quickly rendered inactive at a pH of 12. After having maintained it at a pH of 12 for two hours, a back titration showed that two acid groups had formed per molecule.
Under similar conditions, only one acid group of Cephalosporin N and benzylpenicillin is released. Cephalosporin C is more stable in the presence of certain heavy metal ions, such as C, ++, pb ++ and Zn ++, than are Cephalosporin N or benzylpenicillin.
Upon hydrolysis with an acid (HCl, 1N, for eight hours at 110oC), Cephalosporin C, like Cephalosporin N, yields carbon dioxide and an amino acid which behaves like α-aminoadipic acid on chromatography on paper.
The product obtained by reacting Cephalosporin C with 1,3,4-fluorodinitrobenzene yields on hydrolysis a product which behaves like the dinitrophenolic derivative of α-aminoadipic acid. It therefore appears that the α-amino group of α-aminoadipic acid is free in Cephalosporin C and that (since this amino group shows a pK value of 9.8) the α-carboxyl group is also free.
It has not been possible to be certain of the formation of a significant amount of penicillamine ((i-thiolvaline) by hydrolysis of Cephalosporin C, but the hydrolysis of the product obtained by hydrogenolysis of the latter with Raney nickel yielded amino acids which behaved like α-aminoadipic acid, respectively valine, on chromatography on paper.
Cephalosporin C shows activity of the same order of magnitude towards a number of gram-positive and gram-negative bacteria. It is less effective than Cephalosporin N against Staph. aureus and Salm. typhi, in vitro, having an activity of 8-10 units per Meg. (the unit being that indicated by Abraham, Newton and Hale, 1954. Biochem. J. 58, 94).
It has activity similar to that of Cephalosporin N against a species of Bact. coli. Its toxicity has not yet been evaluated by full bioassays, but it is believed to be low, since mice can be given at least 10 mg of the purified substance, by intravenous injection, without the mice. appear to suffer.
In order to carry out the present process, a suitable medium can be fermented with a mold of the species Cephalosporium, for example as described in the mentioned English patent, removing the mycelium from the fermented liquid, bringing this liquid into contact with activated charcoal, eluting the material adsorbed by this charcoal, contacting the eluate with alumina, and eluting the adsorbed antibiotic substance from alumina.
Cephalosporin C is present with Cephalosporin N in the eluate obtained from alumina.
By removal of the solvent, a crude mixture can be obtained containing cephalosporins N and C. As stated, Cephalosporin N is unstable at pH values below 5.5, while Cephalosporin C is stable even at pH as low as 2.5.
The separation of Cephalosporin C can therefore be carried out by converting the Cephalosporin N of the mixture into the penillic acid of Cephalosporin N, then processing the resulting mixture to separate the Cephalosporin C therefrom, for example by solvent fractionation, by fractional adsorption on an adsorber. A solid such as alumina or an anion exchange substance, by converting penillic acid to an insoluble derivative, or by a combination of these methods.
The conversion of Cephalosporin N to its penillic acid can be done simply by keeping the mixture for two hours at a pH of 3 and a temperature of 370 C.
The following ways of separating Cepha losporin C from the penillic acid of Cephalosporin N have given good results. 1. An aqueous solution of the mixture is poured through a column of an anion exchange resin, such as Amberlite IR4B resin (XE-59) (the term Amberlite is a registered trademark), and performed. elution with dilute acid, a suitable buffer solution such as aqueous ammonium formate or aqueous ammonium acetate having a pH of 3.2 to 5.0, or an aqueous solution of a tertiary base, such as pyridine,
partially neutralized with sulfuric or oxalic acid. A band consisting of Cephalosporin N penillic acid exits the column before a band consisting of Cephalosporin C.
2. An aqueous solution of the mixture is subjected in a distribution machine to countercurrent distribution under weakly acidic conditions in a two-phase solvent system obtained from water and phenol (or a suitable substituted phenol such as cresol or xylenol). If desired, the partition coefficients in this system can be changed by adding a suitable amount of an organic solvent, for example carbon tetrachloride. The pH of the system is brought to a value of 2 to 5 by adding acetic acid or ammonium acetate or ammonium formate as a buffer.
Transfers are made until the Cephalosporin C and Cephalosporin N penillic acid have formed separate bands. Preferably the conditions are adjusted such that the Cephalosporin C is removed from the machine in the aqueous phase.
3. An aqueous solution of the mixture is added to an acid washed alumina column, and elution is performed with a dilute aqueous alkali, such as 0.01 N sodium hydroxide. Cephalosporin C leaves the column, in the form of a solution of its sodium salt, before the penillic acid of Cephalosporin N.
4. An aqueous solution of mercuric chloride is added to a solution containing a crude mixture of Cephalosporin C and Cephalosporin penillic acid; the latter compound is converted into a penillamine which is precipitated as a mercaptide. The supernatant solution contains crude Cephalosporin C.
After its separation from the penillic acid of Cephalosporin N, Cephalosporin C can be purified by any of the methods that can be employed for the purification of Cephalosporin N. In general, these methods are more easy to apply, given the stability of Cephalosporin C in acidic solutions.
If the purification method involves the use of acetate or ammonium formate as buffers, these can be removed from the resulting Cephalosporin C solution by evaporation and sublimation under high vacuum or by electrophoresis (in employing, for example, the four-compartment cell of Synge, Biochem. 7. 1951, 49, 642) or by employing a suitable ion exchange resin.
Solutions of free Cephalosporin C, obtained either by employing an anion exchange column or countercurrent partitioning, can be evaporated to dryness in a vacuum, and the Cephalosporin C can be passed through another. anion exchange column to further purify it. Purified Cephalosporin C can be converted to its sodium salt, if desired, by dissolving it in water and bringing the pH to 6.0 with sodium hydroxide.
The solutions of the sodium salt of Cephalosporin C obtained by one of these methods can, if necessary, be decolorized using activated charcoal, and concentrated in a vacuum. The sodium salt of Cephalosporin C forms monoclonal crystals containing water of crystallization. It can be recrystallized from aqueous ethanol or aqueous propanol. On drying in a vacuum at room temperature, it loses some of its water of crystallization, which can be quickly regained by exposure to air.
<I> Example 1 </I> 6.41 of wheat maceration liquor, containing a total of 256 g of organic nitrogen, 6.4 kg of sucrose and 1.408 kg of ammonium acetate, were introduced into a fermentation tank with a capacity of 45001. The contents were brought to 3201 with water, 108 ml of triamyl citrate and 30 ml of chloroform containing 6 g of an antifoam agent known commercially under the trademark Dow Corning Silicone A.
The medium and the vessel were sterilized with steam at 1 atm. for 20 min., cooled to 300 ° C and seeded with 81 of a 72 h culture of Cephalosporium I.M.I. <I> 49137 </I> grown in a glass container containing the same medium.
It was left to ferment at a temperature of 28-300 C with a stirring speed of 400 rev / min., While passing air through the medium at a flow rate of 4201 / min.
After 48 h, the broth was cooled to less than 20 ° C and filtered to remove mycelium and spores. The clean broth was adjusted to a pH of 5.7 with hydrochloric acid and 3,001 of it was lowered, at a flow rate of about 21 / min., Through a column packed with 301 of. granulated carbon, previously buffered with sodium phosphate solution at pH 6.0 and washed well with water.
After adsorption, aqueous acetone (60% acetone by vol.) Was taken down, collected in fractions of 41%.
then each fraction was brought to 70 vol%. acetone and the pH was adjusted to obtain a value of 5.8 with a glass electrode. The fractions were assayed for antibiotic activity and the assayed samples were dried and weighed to determine their total solids content.
The best fractions were combined and 361 of 70% by vol. Acetone was obtained with a titer of 30 units per ml.
A sample of the 361 acetone was dropped to 70% in flight. through a small column of activated alumina (60 to 120 mesh) previously equilibrated with water at pH 4.6. It was estimated that 51 of this alumina would be required to adsorb all of the activity of the remainder of the 361.
Consequently, the whole was made to descend through a column containing this quantity of the same alumina. After adsorption, the column was eluted with 20 v / o aqueous acetone by vol., Fractions were collected, the best fractions were pooled and adjusted to obtain a reading of pH 5.8 by means of a glass electrode.
Acetone was removed from the solution by vacuum distillation, then the aqueous solution was frozen and dried in vacuo. The crude cephalosporin thus obtained and giving the test 20 units / mg, was dissolved in 110 ml of water. A sample was taken to serve as a control in subsequent spectroscopic measurements. 10N hydrochloric acid (generally about 1 ml) was added until the reaction of this solution corresponded to a pH between 2.7 and 3.0. The solution was then heated to 370 C and samples were taken at half hour intervals.
These samples were diluted with water so as to have solutions containing 0.075 mg / ml, and the optical density of these solutions was measured at 240 µm against a control solution which was diluted in the same manner. . The reaction was considered complete when no further increase in optical density was observed at 240 ml. (120-180 minutes). The increase in density at 240 µm was generally about 0.3 density units when using a 1 cm cell and a concentration of 0.075 mg / ml.
When the conversion of the cephalosporin N component to penillic acid was complete, the solution was cold dried to give 7.0 g of mixture.
An anion exchange resin (Amberlite XE 59), buffered with 0.2 M ammonium formate at pH 3.0-3.2, was prepared as described by Hirs, Moore and Stein (1952, J. Biol. Chem., <I> 195, </I> 699).
A 59 X 4 cm column was packed with this resin, and then 500 ml of 2 M ammonium formate containing 0.5% thiodiglycol was passed through the column from top to bottom.
3.5 g of the mixture of Cephalosporin C and Cephalosporin N penillic acid were dissolved in 30 ml of the 0.2 M buffer and the reaction of the solution was adjusted to be 0.2. higher pH unit than the buffer in the column. This solution was applied to the column in three 10 ml portions. The flow rate through the column was adjusted so that each 10 ml portion took 10-15 minutes to enter the column.
The solution was then washed in the column with twice 10 ml of 0.2 M buffer containing 0.5 11% of thiodiglycol. The column was then filled with the same buffer solution and connected to a constant level reservoir. The column flow rate was adjusted so as to collect a 20 ml fraction every 30 minutes.
Samples of every fourth fraction were taken and diluted tenfold with water. The optical densities of these diluted solutions at 240 m # t and 260 mR were measured against a similarly diluted sample of the buffer solution. Cephalosporin C was mainly found in fractions 96 to 118.
Fractions 96 to 118 were combined and concentrated to about 60 ml in a rotary vacuum evaporator at a temperature below 25 () C. The concentrate was evaporated in a cold dryer so to give a thick syrup. This syrup was washed twice with acetone to remove thiodiglycol. A mixture of ammonium formate and the ammonium salt of Cephalosporin C remained. The ammonium formate was removed either by (A) sublimation under high vacuum, or (B) by electrophoresis.
A) The solid mass remaining after washing with acetone was dissolved in a few ml of water and transferred to a sublimation apparatus. This sublimation is carried out as described by Hirs, Moore and Stein (1952, J. Biol. Chem., 195, 699). The residue from the sublimation consisted mostly of the ammonium salt of Cephalosporin C. This salt was dissolved in 2-3 ml of water and the solution was passed through a small column (0.5 X 0.5 cm) of activated carbon, to remove pigments.
By slowly evaporating the percolate, the product crystallized.
B) The solid mass remaining after washing with acetone was dissolved in 25 ml of water and poured into the neutral compartment of a four-compartment cell (Synge, 1951, Biochem. J. 49, 642). The cell was fitted with a cooling coil through which alcohol was pumped at -50 ° C. The acetic acid and ammonia compartments were changed every 3 hours. Desalting was usually completed in 12-16 hours when voltages up to 500 volts were used. The solutions from the acetic acid compartments were combined and dried in the cold.
The product, which con- sisted of the free acid of Cephalosporin C, con sifted by traces of acetic acid, was liberated from acetic acid by dissolving it in a small amount of water, reprecipitating it with a large amount of water. excess acetone and shaking the precipitate with dry acetone. The free acid of Cephalosporin C was then dissolved in water and neutralized with 2N NaOH (0.3-0.2 ml). On allowing to evaporate slowly, the sodium salt precipitated.
The crystals were freed of any non-crystalline gum by washing with 70% ethanol, then recrystallized from aqueous alcohol. The yield of recrystallized substance was 100 mg. At 260 m # t, E 1% was 200.
<I> Example 2 </I> Crude cephalosporin (400 mg) obtained by fermentation as described in example 1, giving in the test 22 units / mg, was dissolved in water (30 ml ) and the pH of the solution was adjusted to 3.0 with HC12N. The solution was kept at 37 C for 21/2 hours, then passed through a 14 cm long column, containing 10 g of alumina (Savory & Moore Ltd., London. For chromographic analysis).
. The alumina had been previously stirred with sufficient dilute HCl to bring the pH of the supernatant liquid to equilibrium at pH 4.8. When all of the solution had been added to the alumina, there was a thin brown stripe at the top of the column and a pale yellow stripe extended below two-thirds the length of the column.
In the percolate, there was only a trace of ninhydrin-positive substance. The column was washed with water (20ml) and elution started with 0.01N NaOH, the exiting liquid being collected in 5ml fractions, the flow rate was 1ml per. minute. The extinction of these fractions at 240 ml, and 260 μm was measured in a Beckman spectrophotometer. From fraction 13, the absorption at both wavelengths began to increase markedly.
With fractions 13 to 17, containing Cephalosporin C, the absorption remained greater at 260 m # t than at 240 ml. In fraction 18, there was a sudden increase in relative absorption to 240 mu, due to the appearance in the penile acid eluate of Cephalosporin N. In fraction 21, a yellow pigment appeared in the eluate. the elected official.
Fractions 13-17 (pH 5.0) were combined and concentrated in vacuo to 2 ml. Pigment was removed from the resulting solution by passing it through a small column of activated charcoal (0.5 cm diameter x 3 cm high) which had been previously washed with water. On concentration of the percolate in a vacuum, it set into a crystalline mass of cephalosporin C. This product weighed 33 mg. It contained some non-crystal line gum, and measurement of its absorption at 260 m [, indicated the presence of 25 mg of Cephalosporin C. The crystals were separated from the gum by stirring with a little ethanol at 70%, and filtration. The crystalline product was recrystallized from aqueous propanol.
<I> Example 3 </I> A mixture (7.3 g) of penillic acid, Cephalosporin N and Cephalosporin C, obtained as described in Example 1, was dissolved in 80 ml of the phase of top and 40 ml of the bottom phase of a solvent system prepared as follows Water saturated with phenol (51), phenol saturated with water (4.51) and glacial acetic acid (0.451) have was mixed, and the mixture was allowed to equilibrate at 200 ° C. The reaction of the top layer at equilibrium point corresponded to a pH of 2.6 (at the glass electrode).
Bottom phase (20 ml) and top phase (40 ml) of this solution were placed in tubes 'O' and 'l' of a glass countercurrent distribution machine (Craig et al. Craig, 1950, Technique & Organic Chemistry, vol. 3, chapter 4). One hundred top layer (40ml) transfers were performed using the basic method, which was followed by three hundred top layer (40ml) removals from the '100' tube.
<I> Analysis of the fractions: </I> A sample (0.2 ml) was taken from every tenth fraction of the series of extracts and the developed color density was photometrically measured by heating with ninhydrin (0 , 5 ml), by the method of Moore and Stein, 1948, J. Biol. Chem. <I> 176, </I> 367. By plotting the optical densities obtained in this way against the number of the fraction, a band containing cephalosporin N penillic acid was found in fractions 51 to 100 and a band containing Cephalosporin C in fractions 190-300.
The value of the partition coefficient
EMI0005.0056
Cephalosporin C calculated from the position of the top of the band was 0.2 and that calculated for Cephalosporin N penillic acid was 0.63.
The drawn fractions 200-300 were combined and concentrated to about 500 ml (400 ml aqueous layer and 100 ml phenol layer) in a vacuum rotary evaporator. The concentrate was placed in a separatory funnel and shaken with 400 ml of carbon tetrachloride. After the layers separated, the carbon tetrachloride phase was set aside and the aqueous phase was extracted three times with an equal volume of benzene. The aqueous residue was concentrated to about 100 ml on the rotary evaporator, then dried in the cold.
Traces of acetic acid were removed from the product by dissolving it in a small volume of water and precipitating Cephalosporin C (free acid) with excess acetone. The precipitate was washed with dry acetone.
The free acid was dissolved in a small volume of water, then neutralized with 2N caustic soda (0.5-0.6 ml). The sodium salt of Cephalosporin C crystallized when the neutralized solution was slowly evaporated. The crystals were washed with 70 Vo ethanol, which removed the non-crystalline substance. Yield: 168 mg. This material was recrystallized from aqueous propanol.
<I> Example 4 </I> An aqueous solution of crude cephalosporin eluted from an anion exchange column, column itself loaded from a culture broth, was acidified to a pH of 2.5 and maintained at 370 C for 2 hours. The inactivation of Cephalosporin N was complete. The solution was cold dried after adjusting its pH to 5.0. The product (600 mg, 0.45 units per mg) was added to 3 ml of a buffer of pyridine acetate pH 5.0 [2 M acetic acid (150 ml), pyridine N (250 ml). and water (600 ml)], and some insoluble substance was removed by centrifugation.
The resulting clear solution (pH 5.0) was slowly added in two portions to the top of a column (1.9 X 20 cm) of Amberlite JR4B (200-400 mesh). The resin had been brought to a pH of 5.0 with pyridine acetate by washing the acetate form of the resin with the pyridine acetate buffer (prepared as above) on a filter until the buffer poured over and the one leaving have the same pH, ie 5.0.
After the crude Cephalosporin C solution had flowed through the column, it was followed by two additions of 2 ml of <B>. </B> pyridine acetate buffer, and the top of the column was connected. with a constant level reservoir containing the pyridine acetate buffer. The height of the reservoir was adjusted to give the desired flow rate (9 ml / hour). This flow rate was obtained when the height of the buffer in the reservoir was only a few centimeters above the bottom plate of the column.
The effluent was collected in 3 ml fractions every 20 minutes.
Fractions were analyzed by measuring the antibacterial activity towards S. <I> typbi, </I> of samples which had been neutralized with sodium hydroxide solution, and also by the photometric method at ninhydrin (Moore and Stein, 1948, J. Biol. Chem. <I> 176, </I> 367).
Cephalosporin C eluted in fractions 72-108. These fractions were combined and concentrated in vacuum (at 300 ° C., bath temperature) in a rotary evaporator. The residue was dissolved in a small volume of water, transferred to a cuvette and dried overnight in vacuo over KOH and, 0,; after which no more odor could be perceived. pyridine or acetic acid. It was then dissolved in a small volume of water (0.3 ml) and 10 ml of acetone was added thereto.
The precipitate was separated by centrifugation, stirred with a few ml of acetone, recentrifuged and dried in vacuo; A slightly tinted white powder was obtained, of free acid Cephalosporin C. The free acid was dissolved in water (2 ml) to give a solution of pH 3.0, and carefully added to it 0.1N NaOH (0.49 ml) using a burette until the pH has risen to 6.5. The resulting solution of Cephalosporin C sodium salt was dried in the cold. The dry substance was crystallized by dissolving it in a small volume of water and slowly evaporating this solution.
The crystalline dry matter (39 mg) was freed of non-crystalline impurities by washing it with a small volume of 70 O / o (v / v) ethanol. <I> Example 5 </I> A solution of crude cephalosporin eluted from an anion exchange column, itself loaded from a culture broth, was acidified to a pH of 2.5 and maintained at 37 for 2 hours, during which all the activity of Cephalosporin N a. been destroyed. The solution was cold dried after adjusting its pH to 5.0.
The product (4 g, 0.08 units per mg) was shaken with 8 ml of pyridine acetate pH 5.0 (see Example 4). A few drops of pyridine were added to maintain the reaction of the solution at pH 5.0. After about 20 minutes, the solution was centrifuged, and the supernatant liquid was decanted.
The precipitate was shaken with a further 4 ml of buffer, recentrifuged, and the second supernatant liquid (12 ml) was added in 4 portions of 3 ml to a 2 cm X 42 cm column of Amberlite JR4B (79'0 / 0 40-60 meshes, and 20 '% 60-100 meshes)
. The resin had been treated with pyridine acetate buffer (pH 5.0) as described in Example 4. The Cephalosporin C solution was followed by 2 portions of 3 ml of the pyridine acetate buffer, then the column was removed. was treated as described in Example 7.
Cephalo.sporin C was found in the effluent volume between 280 to 500 ml. The substance in the effluent volume 387 ml - 443 ml was freed from the pyridine acetate buffer and precipitated with acetone as described in Example 4, to give 18 mg of impure Cephalosporin C, as free acid. The latter was dissolved in water (2.0ml) and 0.1N NaOH (0.14ml) was added thereto until the pH rose to 6.5. This solution was slowly evaporated and material separated into crystals.
The mixture of crystalline and non-crystalline material was washed on a filter with 70% (v / v) ethanol to give 2 mg of the crystalline sodium salt of Cephalosporin C. ethanol gave 14 mg of a substance at 2.5 units / mg. The remaining solution of the effluent volume 280 ml - 500 ml was found to contain 23 mg of a substance at 2.5 units / mg.
Each of the solvent systems used to separate Cephalosporin C from penillic acid from Cephalosporin N by countercurrent distribution can be adapted for chromatographic partitioning, one of the phases being adsorbed on a medium such as Kieselguhr. , or can be used in a continuous flow solvent extraction column such as that described by Scheibe1 & Karr (Ing. Eng. Chem. 42, p.
1048 - (1950).) It has been stated above that Cephalosporin C is insensitive to penicillinase, that is to say that it is not appreciably attacked by the latter. This constitutes the most important advantageous property of the new antibiotic, since it makes it usable against microorganisms which produce penicillinase and which, therefore, are more or less resistant to penicillin. Cephalosporin C can therefore act to protect penicillin against its inactivation by such microorganisms.
Tests have shown that Cephalosporin C is not significantly affected by pure penicillinase produced by genera of <I> B. </I> subtilis and <I> B. </I> cereus <I>; </ I> Table I shows the amounts of different penicillinase preparations that are required to produce 50% inactivation, expressed in terms of the amount required for Cephalosporin C divided by the amount required for an equal amount of Cephalosporin NOT.
EMI0007.0011
Table <SEP> I
<tb> Penicillinase <SEP> Relative <SEP> quantity
<tb> Source <SEP> Purity <SEP> C <SEP> / <SEP> N
<tb> <I> B. <SEP> subtilis </I>
<tb> (genre <SEP> 749) <SEP> Brute <SEP>. <SEP> 100
<tb> <I> B. <SEP> cereus </I>
<tb> (NRRL <SEP> 569) <SEP> Raw <SEP> 5
<tb> <I> B. <SEP> cereus </I>
<tb> (NRRL <SEP> 569) <SEP> Purified <SEP> 30
<tb> <I> B. <SEP> cereus </I>
<tb> 5 / B. <SEP> In <SEP> crystals <SEP> <B> 10000 </B> The lower relative amounts required of less pure penicillinase preparations are probably due to the presence of impurities which have an adverse effect on Cephalosporin C.
EMI0007.0013
Table <SEP> II
<tb> Concentration <SEP> the <SEP> plus
<tb> Body <SEP> low <SEP> preventing <SEP> the
<tb> development <SEP> in
<tb> <U> 24 <SEP> hours, <SEP> # Lg / ml </U>
<tb> <I> Staph. <SEP> aureus, </I> <SEP> genus <SEP> Heatley,
<tb> sensitive <SEP> to <SEP> the <SEP> penicillin <SEP> 50-100
<tb> <I> Staph. <SEP> aureus, </I> <SEP> resistant <SEP> to <SEP> the
<tb> penicillin <SEP> 25
<tb> <I> Str. <SEP> pyogenes <SEP> 25 </I>
<tb> <I> B. <SEP> anthracis <SEP> 25 </I>
<tb> <I> N. <SEP> meningitidis </I> <SEP> 1.6
<tb> <I> N..gonorrhoeae </I> <SEP> 1.6
<tb> <I> H. <SEP> pertussis </I> <SEP> 1.6
<tb> <I> H. <SEP> influenzae <SEP> 12.5 </I>
<tb> <I> S. <SEP> typhi <SEP> 25 </I>
<tb> <I> S. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 25 </I>
<tb> <I> S. <SEP> typhimurium </I> <SEP> 50
<tb> <I> V. <SEP> cholerae </I> <SEP> 50
<tb> <I> Bact.
<SEP> friedlünderi </I> <SEP> 50
<tb> <I> 8act. <SEP> coli </I> <SEP> I <SEP> 200 The efficacy of Cephalosporin C against various microorganisms is shown in Table II, which, however, should not be considered as exposing its entire bacterial spectrum, and is only an account of this antibiotic activity as it has been observed so far.
The characters of Cephalosporin C are illustrated in the accompanying drawing, in which FIG. 1 is the absorption curve in the ultra violet; -the fig. 2 is the infrared spectrum.