CH350075A - Procédé pour séparer une céphalosporine insensible à la pénicillinase provenant de B. subtilis, de son mélange avec de la céphalosporine N. - Google Patents

Description

  Procédé pour     séparer    une- céphalosporine  insensible à la     pénicillinase    provenant de B.     subtilis,     de son mélange avec de la céphalosporine N.    On a déjà constaté que quand on fait fermenter  un milieu nutritif avec une moisissure du genre au  quel appartient le     Cephalosporium    I. M. 1. 49137       (American    Type Culture     Collection    No 11550), ce  milieu     acquiert    une     activité    antibiotique. On a déjà  décrit en détail l'isolement de deux antibiotiques dif  férents à     partir    de     ce    milieu.

   L'un de ces antibioti  ques est actif principalement contre les bactéries  gram-positives, et     est    connu     comme    Céphalosporine  P. L'autre, connu sous le nom de Céphalosporine N,  est une     substance    sensible à la     pénicillinase,    et qui  est     actif    contre les bactéries gram-négatives et     les-          bactéries    gram-positives.  



  Dans le brevet anglais No 745208, il est décrit  un procédé de     fermentation    pour la production de  Céphalosporine N et des méthodes pour l'obtention  de Céphalosporine N à un état très     purifié.     



  On a découvert que les préparations brutes de  céphalosporine contiennent, outre la céphalosporine  N, une nouvelle céphalosporine qui est insensible à  la     pénicillinase    provenant de     bacillus        subtilis.     



  La présente invention a donc pour objet un pro  cédé pour séparer au moins en majeure partie une  céphalosporine insensible à la     pénicillinase    provenant  de     bacillus        subtilis,    d'un mélange avec de la cé  phalosporine N, provenant de la culture d'une moi  sissure de l'espèce     céphalosporium.    Ce procédé est  caractérisé en ce que l'on fait réagir ledit mélange  des céphalosporines ou un mélange de sels des  céphalosporines, avec une base organique     tertiaire     ou avec une résine     échangeuse    d'anions, formant  ainsi des sels desdites céphalosporines avec la base    organique tertiaire ou avec la résine     échangeuse     d'anions,

   et en ce que l'on sépare au moins en ma  jeure partie les sels des céphalosporines et de la  base organique tertiaire par partage entre solvants,  ou en ce que l'on soumet les sels des céphalosporines  et de la résine     échangeuse    d'anions à une     élution     sélective.    La nouvelle céphalosporine ainsi     isolée,    que l'on  appellera       céphalosporine    C   dans la suite de cet  exposé, est, comme la Céphalosporine N, active con  tre les bactéries gram-positives et     gram-négatives,     mais, contrairement à la     Céphalosporine    N, elle est  insensible à la     pénicillinase    préparée à partir de B.

         subtilis.    Elle est soluble dans l'eau et presque inso  luble dans l'éthanol et l'éther. Elle peut être     iden-          rifiée    à l'aide de son spectre d'absorption dans l'ultra  violet, l'antibiotique sous la     forme    d'une solution  aqueuse de son sel de sodium ayant un pouvoir rota  toire spécifique de     [a]D        -f-   <B>1030</B> et présentant un  maximum d'absorption dans l'ultraviolet à 260     milli-          microns.     



  La Céphalosporine C est de caractère acide. Tant  l'acide libre que son sel de sodium sont aisément  solubles dans l'eau, mais     insolubles    dans l'acétone et  l'éther. Une solution aqueuse du sel de sodium, de  pouvoir rotatoire     [a]D        -I-   <B>1030,</B> montre une absorp  tion à 260     mR    de     Ei em    = 200.  



  La Céphalosporine C contient du carbone, de  l'hydrogène, de l'oxygène, de l'azote et du soufre,  mais pas d'halogène ni de phosphore. L'analyse élé-           mentaire    de son sel de sodium et de l'acide libre a  donné les résultats suivants  <I>Sel de sodium</I>       Trouvé        (%)    :     C,        39,5,        40,0    ;     H,        4,8,        5,2    ;     N,     8,9 ; S, 6,2 ; Na, 4,9.     Equi.        (titration)    480   15.

         P.M.        déterminé    par analyse cristallographique aux  rayons X: 470<B> <I>15.</I></B>  



       C16H2oO.N3SNa,    2     H20    correspond à : C, 40,5 ;  H, 5,1 ; N, 8,9 ; S, 6,7 ; Na,     4,9-.        P.M.    473.    <I>Acide libre</I>    Trouvé     (o/o)    : C, 44,4 ; H, 5,6 ; N, 9,8 ; S, 7,3.  Pour     C16112108N8S.    H20, il faut: C, 44,5 ; H,5,3 ;  N, 9,7 ; S, 7,4.  



  Les résultats d'analyse donnent à supposer que  la Céphalosporine C a la formule moléculaire       CIGH21081,#3S.     



  La Céphalosporine C donne la réaction à la       ninhydrine.    La     titration        électrométrique    indique  qu'elle est un acide     mono-aminodicarboxylique,    ayant  deux groupes     acides    avec des valeurs de pH de  moins de 2,6 et de 3,1, et un groupe basique avec  un     p1    de 9,8. Quand on la soumet à la     ionophorèse     sur papier, dans un   tampon       d'acétate    de     colli-          dine    à un pH de 7, elle se déplace vers l'anode à une  vitesse à peu près la même que celle de la Céphalo  sporine N.  



  Le spectre infrarouge du sel de sodium de la  Céphalosporine C (en pâte de     paraffine)    montre des  bandes aux longueurs d'ondes suivantes : 2,94     Et,     3,06     1.        (NH),    5,77     #t    (groupe ester ou     lactone),    6,05     u     et 6,57 u (C = O d'amide     monosubstituée,    6,29 u       (-C00-),    7,17     [,    et 7,36     [,        (groupe        isopropyle).     Les indications entre parenthèses sont des interpré  tations possibles.

   Le sel de sodium de la Céphalo  sporine C montre aussi une bande de 5,61     [,.    La  Céphalosporine N et le     benzylpénicillinate    de sodium  donnent aussi une bande dans cette région, bande  que l'on a attribuée, pour ce     dernier    composé, au  C = O du système de noyaux condensés     (3-lactame          thiazolidine        (Thompson,        Brattain,        Randall    et Ras  mussen,     The        Chemistry    of     Penicillin,    Chapitre 13,  Princeton University Press, 1949).  



  Contrairement à la Céphalosporine N et à la       benzylpénicilline,    la Céphalosporine C est stable en  solution aqueuse d'un pH de 2,5. Elle est cependant  rapidement rendue inactive à un pH de 12. Après  l'avoir     maintenue    à un pH de 12 pendant deux heu  res, une     titration    en retour a montré qu'il s'était  formé deux groupes acides par molécule.

   Dans des  conditions semblables, il n'est libéré qu'un seul  groupe acide de la Céphalosporine N et de la     benzyl-          pénicilline.    La Céphalosporine C est plus stable en  présence de     certains    ions de métaux lourds, tels que       Cul--;-,        Pb++    et     Zn++,    que ne le sont la  Céphalosporine N ou la     benzylpénicilline.     



  Par hydrolyse avec un acide     (HCl,1N,    pendant  8 heures à<B>11<I>00</I></B> C), la Céphalosporine C comme la    Céphalosporine N, donne du dioxyde de carbone et  un     aminoacide    qui se     comporte    comme l'acide a  aminoadipique à la chromatographie sur papier.

   Le  produit obtenu en faisant réagir la Céphalosporine C  avec du     1,3,4-fluorodinitrobenzène    donne par hydro  lyse un produit qui se     comporte    comme le dérivé       dinitrophénolique    de l'acide     a-aminoadipique.    Il sem  ble donc que le groupe     a-amino    de l'acide     a-amino-          adipique    est libre dans la Céphalosporine C et que  (puisque ce groupe     amino    montre une valeur de  pK de 9,8) le groupe a-carboxyle est aussi libre.  



  On n'a pas pu avoir la     certitude    de la formation  d'une quantité notable de     pénicillamine        ((3-thiolva-          line)    par hydrolyse de Céphalosporine C, mais l'hy  drolyse du produit obtenu par     hydrogénolyse    de cette  dernière avec du nickel     Raney    a donné des amino  acides qui se     comportaient    comme l'acide     a-amino-          adipique,    respectivement la valine, à la chromato  graphie sur papier.  



  La Céphalosporine C montre une activité d'un  même ordre de grandeur envers un     certain    nombre  de bactéries gram-positives et gram-négatives. Elle  est moins efficace que la Céphalosporine N contre  le     Staph.        aureus    et le     Salm.        typhi,    in vitro, ayant une  activité de 8-10 unités par     Meg.    (L'unité étant celle  indiquée par Abraham,     Newton    et Hale, 1954.     Bio-          chem.    J.

   58, 94.) Elle a une activité semblable à  celle de la Céphalosporine N contre une espèce de       Bact.        coli.       Sa toxicité n'a pas encore été évaluée par des  essais biologiques complets, mais on croit qu'elle est  faible puisqu'on peut donner à des souris au moins  10 mg de la substance purifiée, par injection intra  veineuse, sans que celles-ci paraissent en souffrir.

      Pour mettre en     aeuvre    le présent procédé, on peut  faire fermenter un milieu approprié     avec    une moisis  sure de     l'espèce        Cephalosporium,    par exemple comme  décrit dans le brevet anglais mentionné, enlever le       rnycélium    du liquide fermenté, mettre     ce    liquide en  contact avec du charbon activé,     éluer    la matière  adsorbée par ce charbon, mettre     l'éluat    en     contact     avec de l'alumine, et     éluer    hors de l'alumine la subs  tance antibiotique adsorbée.

   La Céphalosporine C  est présente avec la Céphalosporine N dans     l'éluat     obtenu à     partir    de l'alumine. Par élimination du  solvant, on peut obtenir un mélange brut contenant  les Céphalosporines N et C.  



  Pour séparer     ces        céphalosporines,    dans un pre  mier mode opératoire, on les     convertit    en sels d'une  base organique     tertiaire,    par exemple la     diméthyl-          aniline,    la     pyridine,    une     lutidine    ou une     collidine,    et  on soumet les sels à un partage entre deux solvants,  par exemple deux mélanges phénol-eau, auxquels  on a ajouté une faible     proportion,    par exemple de  1 à 10 %, d'une base organique     tertiaire    semblable,  qui élève le pH à une valeur supérieure à 5,

   qui est  compatible avec la stabilité de la Céphalosporine N.      Le phénol peut être remplacé par un phénol subs  titué comme un     alcoylphénol    simple tel qu'un crésol  ou un     xylénol.     



  Ce mode opératoire exige un nombre considéra  ble d'étapes et est donc compliqué. Le mode opé  ratoire suivant est moins fastidieux    On met en contact une solution aqueuse brute  de fermentation ou une solution aqueuse purifiée,  contenant les deux céphalosporines, avec une subs-    tance     échangeuse    d'anions à un pH d'au moins 4,9,  qui retient les     céphalosporines    en les     .transfôrmant     en sels.  



  On peut     utiliser    pour ce but la résine marque        Amberlite        IIZ-4B    > qui est une résine     échangeuse     d'anions du type     phénolformaldéhyde,    contenant des  groupes     amino    faiblement basiques.

   A titre d'exem  ple, la réaction réversible qui intervient en présence  de la résine     échangeuse    d'anions peut être repré  sentée comme suit    (résine =     N.H)+CH;COO-        -!-    (Céphalosporine N ou     C)-Me        -.       (résine     =    N.     H)+(Céphalosporine    N ou     C)-        -3-        CHsC00-Me+       Me désignant un cation d'hydrogène ou un équi  valent d'un autre cation.  



  On élue progressivement les céphalosporines de  la résine     échangeuse    d'anions avec un tampon  aqueux au même pH, par exemple entre 4,9 et 8,0,  de préférence avec une solution aqueuse d'acide sul  furique ou d'acide oxalique contenant suffisamment  d'une base tertiaire soluble dans cette solution pour  produire un pH de 4,9 à 5,5, et on recueille sépa  rément une portion de     l'éluat    dans laquelle le rapport  de la Céphalosporine C à la Céphalosporine N est  moindre que dans ladite solution aqueuse, et une       portion    de     l'éluat    dans laquelle le rapport de la  Céphalosporine C à la Céphalosporine N est plus  grand que dans ladite solution aqueuse.

   On remar  quera que, à des valeurs du pH au-dessous de 4,9,  il y a probablement une augmentation de l'inactiva  tion de la Céphalosporine N, à cause de son insta  bilité vis-à-vis des acides, tandis qu'au-dessus du pH  8, la Céphalosporine C tend à devenir désactivée, et  qu'à un pH de 11, elle est complètement désactivée.  Aux pH inférieurs, la désactivation de la Céphalo  sporine N peut être retardée en opérant à de basses  températures, de telle     sorte    qu'il serait possible  d'opérer à un pH au-dessous de 4,9 en maintenant  la température au-dessous d'environ 70 ou     8o    C, mais  il y aurait alors encore une perte inévitable de  Céphalosporine N.  



       L'éluat    utilisé pour     l'élution    de la colonne  d'échange d'anions est donc de préférence une solu  tion d'acide sulfurique ou d'acide oxalique contenant  une quantité suffisante d'une base tertiaire faible,  soluble dans     cette    solution, pour assurer un pH de  4,9 à 5,5. Le caractère précis de cette base ter  tiaire n'a pas     d'importance.    Toutefois, un facteur à  prendre en considération quand on choisit la base,  est que celle-ci doit être susceptible d'être facilement  séparée des antibiotiques quand on veut les obtenir  sous une forme plus purifiée dans les dernières étapes  du procédé.  



  Un moyen convenable d'élimination de la base  est l'évaporation. Comme les antibiotiques tendent en  général à être     thermo-labiles,    il est avantageux d'em  ployer une base qui est volatile à des températures  relativement basses à des degrés de vide qui con  viennent à l'échelle industrielle. Dans la pratique,    la     pyridine    est appropriée à cet emploi. On a cepen  dant employé aussi comme bases la     collidine    et la       lutidine,    et on. les a éliminées par extraction dans  un solvant organique tel que le benzène.  



  Les deux produits ainsi obtenus, soit un     éluat     contenant principalement la Céphalosporine N, et un       éluat    contenant principalement la Céphalosporine C,  contiennent tous deux de l'acide     oxalique    ou de  l'acide sulfurique. Ces deux acides peuvent être pré  cipités de     l'éluat    à l'aide d'hydroxydes de métaux  alcalino-terreux, de préférence l'hydroxyde de ba  ryum.  



  Un traitement avec un excès d'hydroxyde de  métal alcalino-terreux pour éliminer l'acide oxalique  ou sulfurique a pour     effet    la conversion de l'anti  biotique en son sel de métal alcalino-terreux. On  désire avoir les antibiotiques en général sous la  forme de leurs sels de sodium, et ils peuvent être  mis sous cette forme en précipitant les ions du métal  alcalino-terreux par l'addition d'une     quantité    équiva  lente d'un     sulfate    de métal alcalin, ou d'une manière  bien préférable, en mettant en contact le liquide  surnageant avec une résine     échangeuse    de cations  ou une zéolite naturelle à l'état   sodium  .  



  La Céphalosporine N restant dans la fraction  riche en Céphalosporine C peut, bien entendu, être       éliminée    en la     convertissant    en son acide     pénillique     par hydrolyse à l'acide ou par une préparation de       pénicillinase,    à laquelle la Céphalosporine C est in  sensible, et en séparant l'acide     pénillique    formé de  la Céphalosporine C.    Après sa séparation de la Céphalosporine N ou  de son acide     pénillique,    la     Céphalosporine    C peut  être purifiée par l'une ou l'autre des méthodes pou  vant être employées pour la purification de la Cé  phalosporine N.

   En général     ces    méthodes sont plus  faciles à appliquer vu la     stabilité    de la Céphalospo  rine C dans les solutions acides.    Si la méthode de purification a compris l'emploi  d'acétate ou de     formiate    d'ammonium     comme    tam  pons, ceux-ci peuvent être enlevés de la solution de  Céphalosporine C résultante par évaporation et subli  mation sous un vide élevé ou par électrophorèse (en      employant par exemple, la cellule à quatre compar  timents -de Synge,     Biochem.    J. 1951, 49, 642) ou  en employant une résine d'échange d'ions conve  nable.  



  Les solutions de Céphalosporine C libre, obte  nues soit en employant une colonne     d'échange     d'anions, soit par partage entre deux solvants en  présence d'une base organique tertiaire, peuvent être  évaporées à siccité dans le vide, et on peut faire  passer la Céphalosporine C à travers une autre co  lonne d'échange d'anions pour la purifier encore.  La Céphalosporine C purifiée peut être convertie en  son sel de sodium, si désiré, en la dissolvant dans  de l'eau et en amenant le pH à 6,0 avec de l'hy  droxyde de sodium.         Les    solutions du sel de sodium de la Céphalo  sporine C obtenues par l'une de ces méthodes peu  vent si nécessaire être décolorées à l'aide de char  bon activé, et concentrées dans le vide.

   Le sel de  sodium de la Céphalosporine C forme des cristaux  monocliniques contenant de l'eau de cristallisation.  Il peut être recristallisé dans de l'éthanol aqueux ou  du propanol aqueux. Par séchage dans le vide à la  température ordinaire, il perd de son eau de cristal  lisation, qui peut être rapidement regagnée par expo  sition à l'air du laboratoire.    L'invention est illustrée par les exemples sui  vants, qui constituent des manières préférées de la  mettre à exécution.

      <I>Exemple 1</I>    <I>Système solvant</I>    De l'eau saturée de phénol (3,51), du phénol  saturé d'eau (0,4l), du     tétrachlorure    de carbone  (0,41), de la     2,4,6-triméthylpyridine    (71 ml) et du       H#,S0410N    (10 ml) ont été mélangés et on a laissé  le mélange se mettre en équilibre à 30 C. La réac  tion de la phase aqueuse correspondait à un pH de  6,1 (à l'électrode de verre).

      <I>Préparation des sels de</I>     2,4,6-triméthylpyridine     <I>des céphalosporines</I>    Un mélange des sels sodiques des céphalospori  nes (6 g) a été obtenu par neutralisation d'une solu  tion aqueuse des céphalosporines libres, obtenue  elle-même à     partir    d'un bouillon de culture, avec de  l'hydroxyde de sodium 2N, cristallisation par évapo  ration lente de la solution, lavage des cristaux avec  de l'éthanol à 70 % et recristallisation dans de  l'éthanol aqueux. Ce mélange a été converti en sels  de baryum (5,2 g) par la méthode décrite par  Abraham, Newton et Hale     (Biochem.    J. 58, 94  (l954)).

   On a dissous 5,2 g du mélange des sels de  baryum dans 10 ml d'eau, et on a ajouté environ  11-12 ml d'une solution normale de     sulfate    de     2,4,6-          triméthylpyridine,    jusqu'à ce qu'il ne précipite plus    de sulfate de baryum. On a filtré la solution des sels     5s     de     triméthylpyridine    des céphalosporines pour sépa  rer le sulfate de     baryum,    et on a évaporé la solu  tion sous congélation, obtenant ainsi 5,1 g du mé  lange des sels des céphalosporines.

      <I>Répartition</I>    4,4 g du mélange de sels susmentionné, donnant  à l'essai 30 unités/mg, ont été dissous dans 60 ml  de la phase supérieure et 40 ml de la phase infé  rieure du système solvant et répartis dans une ma  chine de     répartition    à contre-courant en verre, à  30 C, de la manière décrite par Abraham, Newton et  Hale (1954,     Biochem.   <I>J. 58, 94)</I> et dans le brevet  anglais NI 745208.

   A la fin de cette opération, on  avait fait nonante-cinq transferts, donnant 77 retraits  de couches supérieures (30 ml) et 17 retraits de  couches inférieures (0-16), une nouvelle adjonction  de couche supérieure n'ayant plus été faite au tube    0   après le 78e     transfert.    La Céphalosporine C  se trouvait dans les fractions 6-16 des couches infé  rieures retirées, le coefficient de partage  
EMI0004.0019     
    de la     Céphalosphorine    C étant 0,12, tandis que celui  de la Céphalosporine N était de 0,29.

   La Céphalo  sporine C a été récupérée sous forme de son sel de  baryum par la méthode décrite par     Araham   <I>et al</I>  (1954) sous la     rubrique      Détermination of     dry          weight.        System    1. (2) second     withdrawn    séries (phé  nol phase)      .       <I>Exemple 2</I>    La matière de départ utilisée dans cet exemple  est un mélange de Céphalosporines N et C obtenu,  à     partir    d'un bouillon de culture, par     élution    sur  alumine, comme décrit dans le brevet britannique  745208. Son activité est de 41 unités par mg.

   Une  solution tampon a été faite en ajoutant de la     pyri-          dine    1N (environ 450 ml) à 150 ml d'acide sulfu  rique 2N jusqu'à ce que le pH fût de 5,0, et en  diluant la solution résultante avec de l'eau de façon  à avoir 1800 ml.  



  Le mélange de céphalosporines (280 mg) a été  dissous dans 2 ml du tampon et introduit au som  met d'une colonne de résine       Amberlite          JR4B     (150-200 mailles) de 0,9 cm de diamètre et 120 cm  de hauteur, qui avait été mise en état d'équilibre  avec le tampon avant usage. La colonne était entou  rée d'une chemise d'eau courante à     -i-        5o    C. On a  alors commencé     l'élution    avec le tampon, le taux  d'écoulement étant de 3 ml par heure.     L'éluat    a été  recueilli en fractions de 1 ml en employant un col  lecteur automatique de fractions.

   Chaque fraction a  été neutralisée (pH 6) en la recueillant dans un tube  contenant deux gouttes de     pyridine.    L'activité anti  bactérienne est     apparue    dans     l'éluat    à la fraction 48.  Cette activité s'éleva nettement à un maximum à la      fraction 58, puis diminua pour arriver à zéro à la  fraction 90. Les fractions 52-65, contenant     surtout     de la Céphalosporine N, ont été réunies et on y a  ajouté une solution d'hydroxyle de baryum 0,3N  jusqu'à ce que le pH atteigne 7,6. Le précipité de  sulfate de baryum a été enlevé à la centrifugeuse et  la solution surnageante a été séchée à froid, ce qui  a donné 100 mg d'une poudre blanche.

   Pour élimi  ner les traces restantes de     pyridine,    on a dissous cette  poudre dans de l'eau (1 ml), et     reprécipité    par addi  tion de 20     ml    d'acétone. Le sel de baryum de Cé  phalosporine N résultant a donné à l'essai 58 unités  par mg.         sporine    C     était    concentrée dans les fractions 40-100.       Ces    fractions ont été     réunies    et débarrassées de tam  pon de la façon usuelle, ce qui a     fourni    70 mg de  produit.  



  Chacun des systèmes de solvants employés pour  séparer la Céphalosporine C de la Céphalosporine N  par répartition à     contre-courant,    peut être adapté  au partage     chromatographique,    l'une des phases étant  adsorbée sur un support tel que le     Kieselguhr,    ou  peut être utilisé dans une colonne d'extraction à  écoulement continu de solvant telle que celle décrite  par     Scheibel     &  Karr     (Ing.        Eng.        Chem.    42, p. 1048  (1950)).

      La Céphalosporine C était concentrée dans les  fractions 70-80.     Ces    fractions ont été combinées et  libérées de tampon de la manière décrite ci-dessus  pour les fractions 52-65. Le sel de baryum résultant  a été dissous dans de l'eau et on a fait passer la solu  tion à travers une colonne de résine     échangeuse    de  cations (      Dowex      50) à l'état sodium, de 1,2 cm  de diamètre et 1,5 cm de haut. Le     percolat    a été       concentré    dans le vide de façon à avoir un sirop, et  le sel de sodium de Céphalosporine C a commencé  à cristalliser.

   Après un lavage avec de l'éthanol à  70 0/0 pour enlever les impuretés non cristallines, le  produit pesait 5,5 mg ; il donnait à l'essai 10 unités  par mg. Il présentait le spectre d'absorption dans  l'ultraviolet caractéristique de la Céphalosporine C.    <I>Exemple 3</I>    La matière de départ utilisée dans cet exemple  est un mélange des Céphalosporines N et C titrant  2,3 unités/mg, obtenu par     élution    d'une colonne dé  charbon chargée au moyen d'un bouillon de cul  ture et évaporation de     l'éluat        comme    décrit dans le  brevet britannique No 745208.

   Un tampon a été  formé en ajoutant de la     pyridine    1N à 150 ml d'acide  sulfurique 2N jusqu'à ce que le pH fût 5,0, et en  diluant la solution résultante avec de l'eau jusqu'à  3,6 litres.    Le mélange de céphalosporines (2 g) a été dissous  dans 8 ml de tampon et ajouté au sommet d'une  colonne de résine       Amberlite          JR4B    (79 0/0 40-60  mailles ; 21 0/0 60-l00 mailles) de 1,95 cm de dia  mètre et 41 cm de haut, entourée d'une chemise  d'eau courante à     -f-        7     C.

   On a alors commencé       l'élution    avec le tampon, à une vitesse d'écoulement  de 9 ml par heure.     L'éluat    a été recueilli en frac  tions de 3 ml, chaque fraction étant neutralisée  (pH 6) en la laissant tomber dans un tube conte  nant 6 gouttes de     pyridine.    L'activité antibactérienne  est apparue dans     l'éluat    à la fraction 19, est montée  nettement à un maximum à la     fraction    21 puis s'est  abaissée graduellement pour arriver à zéro à la frac  tion 100. Les fractions. 20-40, qui contenaient la  Céphalosporine N presque exempte de Céphalospo  rine C, ont été réunies et libérées du tampon de la  manière décrite à l'exemple précédent.

   La Céphalo-    Il a été indiqué ci-dessus que la Céphalosporine  C est insensible à la     pénicillinase,    c'est-à-dire qu'elle  n'est pas sensiblement attaquée par celle-ci. Cela  constitue la propriété avantageuse la plus importante  du nouvel antibiotique, puisqu'elle le rend utilisable  contre les micro-organismes qui produisent de la       pénicillinase    et qui, de ce fait, sont plus ou moins  résistants à la pénicilline. .La Céphalosporine C peut  donc agir pour protéger la pénicilline contre son  inactivation par de tels micro-organismes.  



  Des essais ont montré que la Céphalosporine C  n'est pas sensiblement affectée par la     pénicillinase     pure produite par des genres de B.     subtilis    et B.       cereus    ; la table suivante montre les     quantités    de dif  férentes préparations de     pénicillinase    qui sont néces  saires pour produire une inactivation à 50 0/0, expri  mées en termes de la quantité requise pour la Cé  phalosporine C     divisée    par la quantité requise pour  une quantité égale de Céphalosporine N.

    
EMI0005.0043     
  
    <I>Table <SEP> I</I>
<tb>  Pénicillinase <SEP> Quantité <SEP> relative
<tb>  Source <SEP> Pureté <SEP> C <SEP> / <SEP> N
<tb>  B. <SEP> subtilis
<tb>  (genre <SEP> 749) <SEP> Brute <SEP> 100
<tb>  B. <SEP> cereus
<tb>  (NRRL <SEP> 569) <SEP> Brute <SEP> 5
<tb>  B. <SEP> cereus
<tb>  (NRRL <SEP> 569) <SEP> Purifiée <SEP> 30
<tb>  B. <SEP> cereus
<tb>  5/B. <SEP> En <SEP> cristaux <SEP> <B>10000</B>       Les quantités relatives plus faibles nécessaires  de préparations de     pénicillinase    moins pure sont pro  bablement dues à la présence d'impuretés ayant un  effet nuisible sur la Céphalosporine C.

      L'efficacité de la Céphalosporine C contre divers  micro-organismes est indiquée dans la table suivante,  laquelle ne doit cependant pas être considérée  comme exposant son spectre bactérien entier, et n'est  qu'un exposé de cette activité antibiotique telle  qu'elle a été constatée jusqu'à présent.

      
EMI0006.0001     
  
    Concentration
<tb>  la <SEP> plus <SEP> basse
<tb>  Organisme <SEP> empêchant
<tb>  i <SEP> le <SEP> développement
<tb>  en <SEP> 24 <SEP> heures,
<tb>  <U>ug</U>/ml
<tb>  Staph. <SEP> aureus, <SEP> genre <SEP> Heatley,
<tb>  sensible <SEP> à <SEP> la <SEP> pénicilline <SEP> 50-100
<tb>  Staph. <SEP> aureus, <SEP> résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> pé  nicilline <SEP> 25
<tb>  Str. <SEP> pyogenes <SEP> j <SEP> 25
<tb>  B. <SEP> anthracis <SEP> 25
<tb>  N. <SEP> meningitidis <SEP> j <SEP> 1,6
<tb>  N. <SEP> gonorrhoeae <SEP> 1,6
<tb>  H. <SEP> pertussis <SEP> I <SEP> 1,6
<tb>  H. <SEP> influenzae <SEP> 12,5
<tb>  S. <SEP> typhi <SEP> 25
<tb>  S. <SEP> paratyphi <SEP> B <SEP> 25
<tb>  S. <SEP> typhimurium <SEP> 50
<tb>  V. <SEP> cholerae <SEP> 50
<tb>  Baet. <SEP> friedliinderi <SEP> 50
<tb>  Bact.

   <SEP> coli <SEP> 200            Les    caractères de la Céphalosporine C sont illus  trés au dessin annexé, dans lequel  la     fig.    1 est la courbe d'absorption dans l'ultra  violet, et    la     fig.    2 est le spectre dans l'infrarouge.

Claims (1)

1. REVENDICATION Procédé pour séparer au moins en majeure par tie une céphalosporine insensible à la pénicillinase provenant de bacillus subtilis, d'un mélange avec de la Céphalosporine N, provenant de la culture d'une moisissure de l'espèce céphalosporium, carac térisé en ce que l'on fait réagir ledit mélange des céphalosporines ou un mélange de sels des céphalo sporines, avec une base organique tertiaire ou avec une résine échangeuse d'anions, formant ainsi des sels desdites céphalosporines avec la base organique tertiaire ou avec la résine échangeuse d'anions,

   et en ce que l'on sépare au moins en majeure partie les sels des céphalosporines et de la base organique tertiaire par partage entre solvants, ou en ce que l'on soumet les sels des céphalosporines et de la résine échangeuse d'anions à une élution sélective. 1. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que lesdits solvants sont constitués chacun par un mélange consistant au moins en partie en un phénol ou un alcoylphénol et en eau. 2. Procédé selon la sous-revendication 1, carac térisé en ce que lesdits solvants contiennent en outre une base organique tertiaire. 3.

   Procédé selon la sous-revendication 2, carac térisé en ce que l'on effectue le partage entre sol vants à un pH supérieur à 5. 4. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'on effectue ladite élution au moyen d'une solution aqueuse d'une substance tampon, la résine échangeuse d'anions et la solution tampon étant tou tes deux ajustées à un pH de 4,9 à 8,0. 5. Procédé selon la sous-revendication 4, carac térisé en ce que la substance tampon comprend un sel d'une base organique tertiaire, de préférence du sulfate de pyridine. 6.

   Procédé selon la sous-revendication 5, carac térisé en ce que l'on refroidit la résine échangeuse d'anions pendant les opérations d'adsorption et d'élu- tion. 7. Procédé selon la sous-revendication 5, carac térisé en ce que l'on traite l'éluat contenant au moins la majeure partie de la céphalosporine insensible à ladite pénicillinase, avec un métal alcalino-terreux pour précipiter l'acide de la solution tampon, et on convertit le sel de métal alcalino-terreux de ladite céphalosporine en le sel de sodium par contact avec une substance échangeuse de cations à son état sodium . 8.

   Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'on met un liquide brut de fermentation d'une moisissure de l'espèce Cephalosporium en con tact avec du charbon activé, on soumet le charbon activé à une élution, on met l'éluat en contact avec de l'alumine, on soumet l'alumine à une élution, obtenant ainsi une solution purifiée contenant en mélange lesdites céphalosporines.