Verfahren zur Dehydrierung von Steroiden Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Einführung einer Doppelbindung zwischen den Koh- lenstoffatomen Cl und C2 von Steroiden mittels Mikroorganismen der Gattung Bacillus oder entspre chenden Enzymen.
Das Verfahren eignet sich beson ders zur Überführung von ,d4-3-Keto-steroiden, wie J4-Pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol und A4-Pregnen- 3,20-dion-11ss,17a,21-triol, in die entsprechenden J1.4-3-Keto-steroide, z.
B. 4l,4-Pregnadien-3,11,20- trion-17a,21-diol bzw. d1.4-Pregnadien-3,20-dion- 11/3,17a,21-triol. Diese letzteren Verbindungen be sitzen Cortison-Aktivität, unterscheiden sich aber von Cortison dadurch, dass sie im wesentlichen frei von unerwünschten Nebenwirkungen, wie Ödembildung sind, da sie keine merkliche Natrium- oder Wasser retention bewirken.
Die Herstellung von 41,4-3-Keto-steroiden auf chemischem Wege war bisher unbefriedigend, weil die stattfindenden chemischen Reaktionen zu Ge mischen verschiedener Verbindungen führen. Eine Abtrennung der Zwischen- und Endprodukte aus derartigen Gemischen ist kostspielig und führt zu niedrigen Ausbeuten an den gewünschten 41,4-3-Keto- steroiden.
Bei dem vorliegenden Verfahren wird die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten weitgehend ver mieden, und man erhält z. B. :dl#4-3-Keto-pregnadiene direkt und mit hoher Ausbeute aus den entsprechen den J- 4-3-Keto-pregnenen.
Die Dehydrierung gelingt besonders gut mit der Art Bacillus sphaericus. Die Art Bacillus sphaericus, wie sie in Bergey's Manual for Determinative Bacte- riology, 6. Auflage definiert ist, umfasst mehrere Ab arten, wie die Abart rotans, die Abart fusiformus usw.;
in einigen Zusammenstellungen werden diese Abarten unter den Artbezeichnungen Bacillus rotans und Bacillus fusiformis erwähnt. Diese Mikroorga- nismen können beispielsweise von der American Type Culture Collection, Washington, D. C. bezogen wer den oder sie können aus natürlichen Vorkommen, z. B. aus dem Erdreich nach bekannten Verfahren isoliert werden.
Die Dehydrierung kann wie gesagt sowohl mit Mikroorganismen-Kulturen als auch mit den betref fenden isolierten Enzymsystemen erfolgen.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann allgemein auf 3-Keto-steroid'e angewendet werden, ohne Rück sicht auf die Substituenten oder den Grad der Unge- sättigtheit der Ringe<I>B,</I> C und<I>D.</I>
Besonders kommen jedoch als Ausgangsstoffe 3-Keto- und auch 3-Oxy-steroide mit einer vom C-Atom 5 ausgehenden Doppelbindung in Betracht, beispielsweise 44-3-Keto-pregnen-Verbindungen und entsprechende 9-Halogenderivate, wie 9-Halogen-44- Pregnen-3,20-dion-17,21-diol, 9-Fluor-d4-pregnen- 3,20-dion-17a,
21-diol und ähnliche. Anstelle von d4-3-Ketopregnenverbindungen kann man als Aus gangsstoffe andere C5 ungesättigte 3-sauerstoffhaltige Steroide benutzen, beispielsweise 45-3-Oxy-pregnen- verbindungen, wie 45-Pregnen-20-on-3-ol und mit niedrigen Alkanearbonsäuren veresterte d5-3-Oxy- pregnene, z.
B. 45-Pregnen-20-on-3-ol. Diese d5-3 Oxy- und Acyloxy-pregnene werden durch die De hydrierung in die entsprechenden 41.4 - 3 - Keto- pregnadiene umgewandelt, wobei angenommen wird, dass primär die 44-3-Keto-pregnene gebildet werden.
Bei den oben genannten Ausgangsstoffen ist die Oxy- gruppe in 3- und/oder 21-Stellung gewöhnlich mit Essigsäure verestert; es kommen aber auch Ester anderer niederer Carbonsäuren, wie die Propionate, Butyrate, tert. Butylacetate, Benzoate und derglei chen, in Frage.
Es können ferner auch 3-Keto- pregnane oder 3-Hydroxy-pregnane, wie Pregnan- 3,20-dion, Pregnan-3,20-dion-17a-01, Pregnan-3,20- dion-21-ol, Pregnan-3,20-dion-17a,21-diol und ähn liche verwendet werden, wobei die Hydroxylgruppe in 3- und/oder 21-Stellung ebenfalls in der angege benen Weise verestert sein können.
Die Dehydrierung kann so erfolgen, dass das Steroid als fester Stoff oder in einem Lösungsmittel, z. B. einem Dialkylketon, wie Aceton, einem Dialkyl- formamid, wie Dimethylformamid und dergleichen, gelöst, unter sterilen Bedingungen zu einer Kultur der Mikroorganismen in einer Nährlösung zugesetzt wird und indem das gebildete Gemisch geschüttelt wird. Das Steroid kann gleichzeitig mit der Impfung der Nährlösung zugegeben werden, oder es kann anderseits einer bereits .entwickelten Kultur zugesetzt werden.
Man kann auch die Mikroorganismen von der Nährlösung abfiltrieren, mit destilliertem Wasser waschen, dann in einer gepufferten wässrigen, das Steroid enthaltenden Lösung suspendieren und das erhaltene Gemisch schütteln bzw. rühren. Das de hydrierte Steroid lässt sich in diesem Fall leichter isolieren, als wenn die Dehydrierung direkt in der Mikroorganismenkultur erfolgt.
Für die Kultivierung der Mikroorganismen kann man dieselben Nährlösungen verwenden, wie sie ge wöhnlich bei der Züchtung von Bazillen gebraucht werden. Normalerweise enthalten diese Nährlösungen Stickstoff und Kohlenstoff liefernde Stoffe, anorga nische Salze und allenfalls Wuchsstoffe. Der Kohlen stoff kann von Verbindungen, wie Acetaten, Laktaten und dergleichen geliefert werden.
Kohlehydrate wer den von Bacilius sphaericus nur schlecht ausgenutzt, und sie können in der Lösung vorhanden sein oder fehlen, ohne dass dadurch die Steroiddehydrierung ernstlich beeinflusst wird.
Als Stickstofflieferanten können dienen: Ammoniumsalze und Aminosäuren oder Proteine .enthaltende Produkte, wie Sojabohnen, Hafer, Hefe, Hefeextrakte, Abbauprodukte von Casein, Fleischextrakt, Blutmehl, Protein-, Fleisch- und Knochenabfälle, Lachsmehle, lösliche Fisch abfälle, lösliche Destillationsrückstände und derglei chen.
Die Bazillen können unter Umständen allein mit Proteinen (oder Aminosäuren) ohne Kohlehydrate kultiviert werden; in diesem Falle liefern die Proteine oder Aminosäuren sowohl den von den Mikroorga nismen benötigten Kohlenstoff als auch den Stick stoff. Gewöhnlich wird vorgezogen, die zu dehydrieren den Steroide zu einer 24 Stunden alten Kultur von Bacillus sphaericus zuzugeben. Die günstigste Menge des Steroides hängt u. a. von der Art desselben ab; immerhin verwendet man das Steroid vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,005111a bis 0,204.
Die das Steroid enthaltende Kultur wird dann vorzugsweise etwa 10 und 50 Stunden geschüttelt oder gerührt. Im Hinblick auf die Tatsache, dass eine verlängerte Gärung zur Zersetzung eines Teiles des dehydrierten Steroids führen kann, wird gewöhn lich die Gärung nicht länger als höchstens 24 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Dehydrierung wird das Pro dukt aus der Gärflüssigkeit zweckmässig durch Extrak tion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungs mittel, wie z.
B. einem chlorierten Kohlenwasserstoff, beispielsweise Chloroform, einem Keton, beispiels weise Methylisobutylketon, einem Alkylalkanoat, bei spielsweise Äthylacetat und dergleichen, isoliert. Der Extrakt, der unter Umständen noch nicht umgesetztes Ausgangsmaterial enthält, wird zweckmässig durch Chromatographie unter Verwendung von Silicagel, aktiviertem Aluminiumoxyd und dergleichen, oder auch mittels absteigender Papierchromatogramme ge reinigt. Nach Abtrennung des nicht umgesetzten Ausgangsmaterials kann das Produkt weiter gereinigt werden, z.
B. durch Umkristallisation aus einem Lö sungsmittel, wie z. B. Äthylacetat, Äthylacetat-Petrol- äther und dergleichen.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren lassen sich aus d4-3-Keto-, A5-3-Oxy- und 45-3-Acyloxy- pregnenen u. a. folgende 41.4-Pregnadiene herstellen:
dl.4-3-Keto-pregnadiene, wie 41,4-Pregnadien-3,20-dion, dl#4-Pregnadien-3,20-dion-17a-ol, dl.4-Pregnadien-3,20-dion-21-ol, d1.4-Pregnadien-3,20-dion-17a,21-diol, A1,4_pregnadien-3,20-dion-17a-ol-2l-al, 41.4-Pregnadien-3,11,20-trion, d1,4-Pregnadien-3,11,20-trion-17a-ol, dl#4-Pregnadien-3,11,20-trion-21-ol, 41.4-Pregnadien-3,11,20-trion-17a,21-diol, Al,4-pregnadien-3,11,20-trion-17a-ol-21-al, dl >4-Pregnadien-3,
20-dion-11 ss-ol, 41.4-Pregnadien-3,20-dion-1 l ss-ol-21-al, 41.4-Pregnad'ien-3,20-dion-1 l ss,21-diol, d1,4-Pregnad'ien-3,20-d'ion-1 lss,17a-diol, dl,4-Pregnadien-3,20-d'ion-1 lss,17a,21-triol, 9-Halogen-d1,4-3-keto-pregnadiene, wie 9-Halogen-41.4-pregnadien-3,20-dion-17,21-diol, 9-Fluor-41.4-pregnadien-3,20-dion-17a,21-diol, 9-Halogen-d1,4-pregnadien-3,20-dion- 17,11,21-triol,
9-Halogen-41,4-pregnadien-3,11,20-trion- 17,21-diol, 9-Fluör-41,4-pregnadien-3,11,20-trion-17a,21-diol, 9-Fluor-41,4-pregnadien-3,20-dion- Ilss,17a,21-triol und dergleichen.
<I>Beispiel l</I> 50 cm3 einer Nährlösung folgender Zusammen setzung werden hergestellt:
EMI0002.0107
Cerelose <SEP> (handelsübliche <SEP> Dextrose) <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> (handelsüblicher <SEP> Laktalbu minauszug <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,25 <SEP> cm3
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 50 <SEP> cm3 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 cm3 einer Kultur, die durch Bebrüten von Bacillus sphaericus (MB 431) in derselben Lösung während 24 Stunden bei 28 erhalten wurde, geimpft; die geimpfte Lösung wird dann. bei einer Temperatur von 28 unter Schütteln 24 Stunden lang bebrütet.
Zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung, die 10 mg Hydrocortison (J4-Pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20- dion) in 0,1 cm3 Dimethylformamid gelöst enthält, zugesetzt. Die die Steroid'-Verbindung enthaltende Kultur wird dann unter Schütteln während einer Zeit dauer von etwa 10 Stunden bei 28 bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 em3 Äthyiacetat extrahiert, und die Äthyl,acetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 em3 :eingedampft. Die konzentrierte Lö sung wird dann zur Herstellung von Papierstreifen- chromatogrammen verwendet, die unter Verwendung von Formamid als stationärer flüssiger Phase und Chloroform als beweglicher flüssiger Phase entwickelt werden.
Zwei Zonen lassen sich feststellen, von denen die eine (entsprechend der beweglicheren Kom ponente) das für Hydrocortison charakteristische Ab sorptionsmaximum im Ultraviolett zeigt und die andere (die weniger bewegliche Komponente) ein Absorptionsmaximum im Ultraviolett bei etwa <I>242</I> mu. zeigt. Das Paperchromatogramm wird ge trocknet, und die der 242 mp-Absorption entspre chende Zone wird abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unter worfen, wobei Papier, das 48 Stunden mit Methanol extrahiert worden ist, und das vorher benutzte Chloro- form-Formamid-System verwendet werden. Das er haltene Chromatogramm zeigt nur eine Spur einer dem Ausgangsmaterial Hydrocortison entsprechende Zone, während die grössere Zone ein Absorptions maximum im Ultraviolett von<I>242</I> m,y hat. Das Papierchromatögramm wird gründlich getrocknet und die dem 242 my-Absorptionsmaximum entsprechende Zone abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne einge dampft und gibt A1.4-Pregnadien-11ss,17a,21-triol- 3,20-dion.
<I>Beispiel 2</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt: Cerelose . . . . . . . . 400 g Edamin . . . . . . . . 400 g Getreideaufschlämmung . . . . 100 ml Hefeextrakt . . . . . . . . 20 g mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter einer 24 Stunden alten Impfkultur von Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden be brütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g Hydrocortison in 40 ml Diinethylformamid zugegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln während einer zusätzlichen Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert, und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt .und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Eine Probe des Rückstandes wird in Aceton gelöst und auf ein Papierchromatogramm getüpfelt, das unter Verwendung von Formamid als, stationärer Phase und Chloroform als beweglicher Phase ent wickelt wird.
Es werden zwei getrennte Zonen erhal ten; die untere, dem nicht umgesetzten Hydrocortison entsprechende Zone wird abgeschnitten, die andere, dem A'-Dehydro-Derivat entsprechende wird gleich- falls abgeschnitten und mit Methanol eluiert. Die Ultraviolett-Absorptionsanalys.e dieses Methanol eluates zeigt, dass die obere Zone 1 g 41,4-Pregnadien- 11,17,21=triol-3;20-dion enthält.
Der Hauptteil des nach Eindampfen des Äthyl- acetatextrakts erhaltenen Rückstands wird einer Zwei phasentrennung mit 70 /aigem wässrigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige Ver unreinigungen in die Petrolätherphase gehen. Das Methanol wird im Vakuum von der wässrigen Methanolphase abgedampft, und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung wird mit Äthylacetat extra hiert.
Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton ge löst und der Papierstreifenchromatogr.aphie unter Ver wendung von Formamid als stationärer Phase und Chloroform als beweglicher Phase unterworfen. Die obere, dem A'-Dehydroderivat entsprechende Zone wird abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papier streifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Va kuum zur Trockne eingedampft.
Das zurückbleibende Material wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristalli siert; es werden annähernd 200 mg im wesentlichen reines d1.4-Pregnadien-11ss,17a,21-triol-3,20-dion er halten; Smp. 222-228 C.
<I>Beispiel 3</I> 20 Liter einer Nährlösung der folgenden Zusam mensetzung werden hergestellt:
EMI0003.0082
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400.g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 20 <SEP> 1 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter einer 24 Stunden alten Impfkultur von Bacillus sphaericus (MB 43l) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden be brütet und die erhaltene Kultur zu einer 4 g Cortison, in 40 ml Dimethylformamid gelöst, enthaltenden Lö sung hinzugegeben.
Die die Steroid-Verbindung ent- haltende Kultur wird unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert, und die Äthylacetabextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die Analyse einer Probe des zurückbleibenden Mate rials durch Papierchromatographie und anschliessende Messung der Ultraviolett-Absorption des in den bei den getrennten Zonen, die in dem Chromatogramm entwickelt wurden, enthaltenen Materials zeigt,
dass das zurückbleibende Material annähernd 3 g nicht umgesetztes Cortison und etwa ein Gramm d1,4- Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion enthält.
Der Hauptteil des nach Eindampfen des Äthyl- acetatextrakts erhaltenen Rückstands wird einer Zwei phasentrennung mit 70d/oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige Ver unreinigungen in die Petrolätherphase gehen. Das Methanol wird im Vakuum aus der wässerigen Methanolphase abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert.
Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand der Papierstreifen chromatographie unterworfen (wobei Aceton als Lö sungsmittel verwendet wird, um dieses Material in der Form von Streifen auf die Papierchromatogramme zu übertragen) unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Benzol als beweglicher Phase für die Entwicklung des Chromatogramms. Die obere, dem Jl-Dehydroderivat entsprechende Zone wird ab geschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papier streifenchromatographie unterworfen.
Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert und es werden annähernd 250 mg im wesentlichen reines Al.4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion erhalten; Smp. 232-236 C.
<I>Beispiel 4</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt:
EMI0004.0035
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter einer 24 Stunden alten Impfkultur von Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden be brütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g A4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben.
Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stun den bei einer Temperatur von 28 C bebrütet. Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert, und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70 o/cigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden.
Das Methanol wird im Vakuum von der wässerigen Methanolphase abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand wird in Aceton ge löst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Benzol als beweglicher Phase entwickelt werden.
Von jedem Chromatogramm werden die oberen, dem 41-Dehydroderivat entsprechenden Zo nen abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen.
Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrock net, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert und im wesentlichen reines Al.4-Pregnadien-17a,21-diol- 3,20-dion erhalten; Smp. 230-236 C.
<I>Beispiel 5</I> 20 Liter einer Nährlösung mit folgender Zusam mensetzung werden hergestellt:
EMI0004.0071
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 20 <SEP> 1 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter einer 24 Stunden alten Impfkultur von Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden be brütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g 9ad-Fluoro-d4-pregnen-11j3,17a,21-triol- 3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben.
Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kultur wird unter Scbüttein etwa 10 Stunden lang bei einer Tem peratur von 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte wer den vereinigt und im Vakuum zur Trockne einge dampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentren- nung mit 70-o/aigem wässerigem Methanol und Petrol- äther unterworfen, wodurch ölige, in der Petroläther- phase lösliche Verunreinigungen entfernt werden.
Das Methanol wird von der wässerigen Methanolphase im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthyl'acetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Aceton gelöst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Chloroform als beweglicher Phase entwickelt werden. Die oberen, dem dl-Dehydroderivat entspre chenden Zonen werden abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unter worfen.
Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne einge dampft. Der Rückstand wird aus Athylacetat-Petrol- äther umkristallisiert, wobei im wesentlichen reines 9 a-Fluoro-dl ,4-pregnadien-11 ss,17a,21-triol-3,20-dion erhalten wird.
Die Acetylierung dieses Materials mit Essigsäureanhydrid in Pyridin ergibt im wesentlichen reines 9a-Fluoro-dl>4-pregnadien-llss,17a,21-triol- 3,20-dion-21-acetat vom Smp. 236 C.
<I>Beispiel 6</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt:
EMI0005.0017
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>100M1</B>
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikro organismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden bebrütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g 44-Pregnen-1lss,21- diol-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzuge geben.
Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kul tur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden lang bei einer Temperatur von etwa 28 C bebrütet.
Das durch die Dehydrierungsaktivität von Bacillus sphaericus-Mikroorganismen gebildete 41A-Steroid wird mit Äthylacetat aus der Gärflüssigkeit extrahiert und gereinigt im wesentlichen unter Anwendung des selben Reinigungsverfahrens wie das oben in Beispiel 4 angegebene, einschliesslich (1) Zweiphasentrennung mit Petroläther und Methanol, um petrolätherlösliche ölige Verunreinigungen zu entfernen, (2) Papier streifenchromatographie unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Benzol als be weglicher Phase und (3)
Umkristallisieren aus Äthyl- acetat-Petroläther, um im wesentlichen reines Al,4- Pregnadien-llss,21-diol-3,20-dion zu erhalten; Smp. 231-234 C.<I>Beispiel 7</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt:
EMI0005.0043
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter eines 24 Stunden alten Wachstums. des Mikro organismus Baeillus sphaericus (MB 431) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden bebrütet, und zu der erhaltenen Kul tur wird .eine Lösung von 4 g 44-Pregnen-21-ol-3,20- dion in 40 n41 Dimethylformamid hinzugegeben. Die die Steroid'-Verbindung enthaltende Kultur wird unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 10 Stun den bei einer Temperatur von annähernd 28 C be brütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70o/oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden. Das Methanol wird im Vakuum von der wässerigen Methanolphase abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert.
Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton gelöst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Verwen- dung von 50 %. Methanol'-Formamid als stationärer Phase und 50 /o Benzol-Cyclohexan als beweglicher Phase entwickelt werden.
Die oberen, dem dl-De- hydroderivat entsprechenden Zonen jedes Chromato- gramms werden abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert und im wesentlichen reines 41.4-Pregnadien-21-ol-3,20- dion erhalten; Smp. 191-193 C.
<I>Beispiel 8</I> 50 ml einer Nährlösung mit der folgenden Zu sammensetzung werden hergestellt:
EMI0005.0094
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,25 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 50 <SEP> ml Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ml einer Kultur, die durch Bebrüten von Bacillus sphaericus-Mikroorganismen in derselben Lösung während 24 Stunden bei 28 C erhalten wurde, ge impft; die geimpfte Kultur wird dann bei einer Tem peratur von 28 C unter Schütteln während einer Zeit dauer von 24 Stunden bebrütet.
Zu der erhaltenen Kultur wird eine 10 mg 44-Pregnen-11ss-ol-3,20-dion in 0,1 ml Dimethylformamid enthaltende Lösung ge geben. Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kultur wird unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 ml eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird dann zur Herstellung von Papierstreifenchro- matogrammen benutzt, die unter Verwendung von 50 /c. Methanol-Formamid als stationärer flüssiger Phase und 501/u Benzol-Cyclohexan als beweglicher flüssiger Phase entwickelt werden.
Zwei Zonen wer den festgehalten, von denen eine (entsprechend der beweglicheren Komponente) das für llss-Hydroxy- progesteron charakteristische Absorptionsmaximum im Utraviolett zeigt und die andere (weniger beweg liche Komponente) ein Absorptionsmaximum im Ultraviolett bei etwa 241 mAc. Das Papierchromato- gramm wird getrocknet und die der weniger beweg lichen Komponente entsprechende Zone abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifen chromatographie unterworfen, wobei das vorher ver wendete Lösungsmittelsystem benutzt wird.
Das erhal tene Chromatogramm zeigt nur eine Spur der dem llss-Hydroxy-progesteron (Ausgangsmaterial) ent sprechenden Zone. Das Papierchromatogramm wird gründlich getrocknet, die grössere Zone, die ein Ab sorptionsmaximum im Ultraviolett bei 241 m/,c hat, wird abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne einge dampft und di.4-Pregnadien-llss-ol-3,20-dion er halten.
<I>Beispiel 9</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zu sammensetzung werden hergestellt:
EMI0006.0029
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>1001111</B>
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Litereines 24 Stunden asten Wachstums des Mikro organismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g 44-Pregnen-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid gegeben.
Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei einer Temperatur von annähernd 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl acetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70 /oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen :entfernt werden.
Das Methanol wird von der wässerigen Methanolphase im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Athylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Aceton gelöst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Ver wendung von 50 1/o Methanol-Formamid als stationä rer Phase und 50,119 Benzol-Cyclohexan als beweg licher Phase entwickelt werden.
Die oberen, dem 41-Dehydroderivat entsprechenden Zonen jedes Chromatogramms werden abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papierstreifenchromatographie unterwor fen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne ein gedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat- Petroläther umkristallisiert und im wesentlichen reines 41.4-Pregnadien-3,20-dion erhalten; Smp. 148 bis 150 C.
<I>Beispiel 10</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt:
EMI0006.0070
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikro organismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g d3-Pregnen-3-ol-20-on in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die die Steroid-Verbindungen enthal tende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei einer Temperatur von annähernd 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte werden ver einigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70o/aigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden. Das Methanol wird von der wässerigen Methanolphase im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässe rige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert.
Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne ein gedampft und der Rückstand in Aceton gelöst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Ver- wendung von 50%, Methanol-Formamid als statio- närer Phase und 50 /a Benzol-Cyclohexan als beweg licher Phase entwickelt werden.
Die oberen, dem dl-Dehydroderivat entsprechenden Zonen jedes Chromatogramms werden abgeschnitten, mit Metha nol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Mate rial wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abge schnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extra hiert und der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat - Petroläther umkristallisiert und im wesentlichen reines Jl,\\-Pregnadien-3,20-dion erhal ten; Smp. 148-150,C.
<I>Beispiel 11</I> 50 cm3, jeder der sieben verschiedenen Nährlösun gen mit Zusammensetzungen, wie sie in der nach stehenden Tabelle angegeben sind, werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120 C in einem Autoklaven steri lisiert, und jede Lösung wird mit einer Kultur von Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpften Kulturen werden bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu jeder der erhaltenen Kulturen wird eine Lösung von.
10 mg Hydrocortison in 0,1 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Hydrocortison enthaltenden Kulturen werden dann unter Schütteln für eine wei tere Dauer von etwa 24 Stunden bei 28 C bebrütet.
Jede einzelne so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Athylacetat extrahiert und die jeweils einer Flüssigkeit entsprechenden, aus einer besonderen Lösung stammenden Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne einge dampft. Jede der sieben so erhaltenen Rückstände wird polarographisch auf seinen Gehalt an 41,4-Pre- gnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion analysiert, indem die halbe Welle bei 1,52 Volt gemessen wird.
In der folgenden Tabelle sind die Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen und die Menge an 41,4- Pregnadien-11ss,17a,21-triol - 3,20 - dion (dl-Hydro- cortison), die mit jeder derartigen Lösung erhalten wurde, in Prozenten der theoretischen Ausbeute ange geben.
EMI0007.0032
Ausbeute <SEP> an
<tb> Nr. <SEP> Zusammensetzung <SEP> der <SEP> Lösung <SEP> dl-Hydrocortison
<tb> der <SEP> Theorie
<tb> 1 <SEP> wie <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 3711/o2 <SEP> 2'0l0 <SEP> lösliche <SEP> Destillationsrückstände <SEP> 37114,
<tb> 3 <SEP> 2% <SEP> HCl-Kaseinhydrolysat <SEP> 440/a
<tb> 4 <SEP> 1%
<tb> 31%
<tb> l <SEP> % <SEP> Sojamehl
<tb> 5 <SEP> 2%.
<SEP> Fischmehl <SEP> 30%
<tb> 6 <SEP> 2% <SEP> Getreideaufschlämmung <SEP> 34%
<tb> 7 <SEP> 2%- <SEP> Tankrückstände <SEP> 26% <I>Beispiel 12</I> 10 mg f4-Pregnen-llss,17a,21-triol-3,20-dion werden der Einwirkung einer Bacillus-sphaericus- Kultur (MB 431) ausgesetzt und das dehydrierte Produkt gemäss dem bei der Dehydrierung von d4- Pregnen-llss-ol-3,20-dion oben in Beispiel 8 be schriebenen Verfahren isoliert, wodurch 41,4-Pre- gnadien-11/3,17a,21-triol-3,20-dion erhalten wird.
<I>Beispiel 13</I> 10 mg A4-Androsten-3,20-dion werden der Ein wirkung von Bacillus sphaericus (MB 431) Mikro- oganis@men ausgesetzt und das dehydrierte Produkt gemäss dem bei der Dehydrierung von 44-Pregnen- llss-ol-3,20-dion oben in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren isoliert, wodurch 41,4-And'rostadien-3,20- dion erhalten wird.
<I>Beispiel 14</I> 50 ml der in Beispiel 8 beschriebenen Edamin- lösung werden auf einen pH-Wert von 7 .eingestellt, durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120 C in einem Autoklaven sterilisiert und die sterilisierte Lösung mit Bacillus sphaericus (A. T. C. C.-245) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Tempe ratur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und die erhaltene Kultur zu einer Lösung von 10 mg Hydrocortison in 0,1 ml Dimethylform- amid hinzugegeben.
Die das Hydrocortison enthal tenden Kulturen werden dann unter Schütteln für eine weitere Dauer von .etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert, die Äthylacetat- extrakte vereinigt und im Vakuum zur Trockne ein gedampft. Der .so erhaltene Rückstand wird polaro- graphisch analysiert, indem die halbe Welle bei 1,52 Volt gemessen wird, und enthält eine Menge an 41,4-Pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion, die einer Ausbeute von mehr als 50'a/9 der theoretischen entspricht.
<I>Beispiel 15</I> 50 ml der oben in Beispiel 8 beschriebenen Edaminlösung werden auf einen pH-Wert von 7 ein gestellt, durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120" C in einem Autoklaven sterilisiert und die sterili- sierte Lösung wird mit Bacillus sphaericus (A.T.C.C.- 7054) (Abart fusiformis, manchmal auch Bacillus fusiformis bezeichnet) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und dann eine Lösung von 10 mg Hydrocortison in 0,1 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Hydrocortison enthaltende Kultur wird dann unter Schütteln für eine weitere Dauer von etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert, die Äthylacetat- extrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird polarographisch analysiert, indem die halbe Welle bei 1,52 Volt gemessen wird, und es wird ein Gehalt an dl.4-Pregnadien-Ilss,17a,21-triol-3,20-dion gefunden, der einer Ausbeute von über<B>5001a</B> der theoretisch aus 10 mg Hydrocortison als Ausgangs material erhältlichen entspricht.
<I>Beispiel 16</I> 50 ml der in Beispiel 8 beschriebenen Edamin- lösung werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120 C in einem Autoklaven sterilisiert, die sterilisierte Lö sung mit Baeillus sphaericus (A. T. C. C.-7055) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Tempe ratur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu der erhaltenen Kultur eine Lösung von 10 mg 9a-Fluoro-d4-pregnen-llss,17a,21-triol- 3,20-dion in 0,1 ml Dimethyl-formamid _ hinzuge geben. Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kul tur wird unter Schütteln ;etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert, die Äthylacetat- extrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der so erhaltene Rückstand wird polarographisch analysiert, indem die halbe Welle bei 1,52 Volt gemessen wird, und es. wird ein Gehalt an 9a-Fluoro-d1#4-pregnadien-llss,17a,21- triol-3,20-dion gefunden, der einer Ausbeute von über 50% der theoretischen entspricht. <I>Beispiel 17</I> 13 Teile der in Beispiel 8 beschriebenen Edamin- lösung zu je 50 ml werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt,
durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120 C in einem Autoklaven sterilisiert und jede der sterilisierten Lösungen wird mit einer Kultur von Bacillus sphaericus (MB 834) geimpft. Die geimpften Kulturen werden bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet, und jede der dreizehn erhaltenen Kulturen wird mit einer Lö sung von 10 mg eines der in der nachstehenden Tabelle angeführten 3-Hydroxy- oder 3-Keto-steroide in 0,1 ml Dimethylformamid versetzt.
Die die 3-Keto- steroide enthaltenden Kulturen werden dann unter Schütteln für eine weitere Dauer von etwa 10 Stun den bebrütet.
Jede der so erhaltenen Gärflüssigkeiten wird für sich dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert, und die drei Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Jeder der so erhaltenen dreizehn Rückstände wird in Aceton ge löst und auf Papierchromatogramme gebracht, von denen jedes unter Verwendung der in der hier fol genden Tabelle angegebenen Lösungsmittelsysteme entwickelt wird.
Die oberen, den d1-Dehydroderivaten entspre chenden Zonen jedes Chromatogramms werden ab geschnitten, jede für sich mit Methanol extrahiert, und das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterwor fen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, dann- getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanol extrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. In der folgenden Tabelle sind ebenfalls die erhaltenen dl.4- 3-Keto-steroide angeführt.
EMI0008.0061
EMI0009.0001