Verfahren zur Herstellung von Dihydrostreptomycin Dihydrostreptomycin ist eine für medizinische Behandlung brauchbare Substanz, weil es ein starkes und breites antibakterielles Spektrum wie Strepto- mycin besitzt und weniger giftig und stabiler als das letztere ist.
Es ist bekannt, dass Dihydrostreptomycin, welches in seinen antibakteriellen Eigenschaften dem Streptomycin ähnlich ist, gegenüber dem letzteren den Vorteil besitzt, dass es weniger giftig auf das Nerven system wirkt. Dihydrostreptomycin wurde bis jetzt durch Hydrierung des Formylrestes von Streptomycin gewonnen und als Sulfat oder Hydrochlorid auf den Markt gebracht. Diese Salze sind farblose oder weisse kristalline oder pulverförmige Substanzen.
Sie sind geruchlos oder fast geruchlos, schmecken schwach bitter, und ihre wässrigen Lösungen sind linksdrehend; eine wässrige Lösung der Sulfatkristalle zeigt eine Drehung von [a]25 = -88 (c = 1). Es ist bekannt, dass Dihydrostreptomycin ein breites antibakterielles Spektrum gegen grampositive, gramne:gative und säurefeste Bakterien besitzt.
Bis anhin wurde Dihydrostreptomycin in der Weise hergestellt, dass man das aus dem Kultur medium von Streptomyces griseus isolierte S.trepto- mycin reduzierte (siehe USA-Patent Nr.2498574). Diese Methode erfordert sehr reines Streptomycin, sonst ist ein beträchtlicher Verlust bei der Reduktion unvermeidlich.
Es wurde bis jetzt kein Bericht über die direkte Herstellung von Dihydrostreptomycin durch Kultur Dihyd@rostreptomycin produzierenderM.ikroorganismen veröffentlicht.
Es wurde nun gefunden, dass man auf einfache Weise unter Verbesserung der Ausbeute und Senkung der Gestehungskosten zu Dihydrostreptomycin ge langt, wenn man einen Stamm eines Dihydrostrepto- mycin erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces in .einem wässrigen Nährmedium aerob kultiviert.
Das so erzeugte Dihydrostreptomycin kann aus dem Kulturmedium isoliert werden.
Es kann jeder Stamm von jeder zu den Strepto- myceten gehörenden Art, welcher Dihydrostrepto- mycin liefert, verwendet werden. So kann z. B. eine neue Art, welche die Bezeichnung Streptomyces. humi- dus nov. sp. Nr.<B>23572</B> erhalten hat, für diesen Zweck verwendet werden. Diese Art hat die in der folgen den Tabelle aufgeführten charakteristischen Eigen schaften.
(Die mit Rdg bezeichneten Farbnamen be ziehen sich auf Ridgways Color Standards and Nomenclature ).
EMI0002.0001
<I>Streptomyces <SEP> humidus <SEP> Stamm <SEP> 23 <SEP> 572</I>
<tb> Kultur-Eigenschaften
<tb> Medium <SEP> lösliches <SEP> Bemerkungen
<tb> Wachstum <SEP> Luft-Mycel <SEP> und <SEP> Sporen <SEP> Pigment
<tb> Czapek-Agar <SEP> farblos <SEP> weiss <SEP> keines <SEP> Reichlich <SEP> mit <SEP> kleinen <SEP> feuchten
<tb> Glukose-Asparagin- <SEP> farblos <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> rauchgrau <SEP> keines <SEP> schwarzen <SEP> Flecken <SEP> vermengt,
<tb> Agar <SEP> (Rdg <SEP> XLVI)
<SEP> 21"-d <SEP> welche <SEP> sich <SEP> allmählich <SEP> über
<tb> oder <SEP> weinrot- <SEP> die <SEP> ganze <SEP> Oberfläche <SEP> ausbrei rötlichgelb <SEP> ten. <SEP> Rückseite <SEP> creme-rötlich (Rd'g <SEP> XL, <SEP> 17"'-d) <SEP> gelb <SEP> (Rdg <SEP> XXX <SEP> 19"-d) <SEP> oder
<tb> gelblich-rotgelb <SEP> (Rd,- <SEP> XXX,
<tb> 19"-b) <SEP> später <SEP> sämisch-leder gelb <SEP> werdend <SEP> (Rd- <SEP> XXX
<tb> 19"-b).
<tb> Stärke-Agar <SEP> farblos <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> bleiches <SEP> keines <SEP> Rückseite <SEP> creme-rötlichgelb
<tb> Rauchgrau <SEP> (Rdg <SEP> XXX <SEP> 19"-b).
<tb> (Rdg <SEP> XLVI, <SEP> 21""-f) <SEP> Schwache <SEP> Hydrolyse.
<tb> Calcium-Maiat-Agar <SEP> farblos, <SEP> dürftig, <SEP> weiss <SEP> keines
<tb> später <SEP> rotgelb <SEP> gelb <SEP> werdend
<tb> (Rdg <SEP> IV <SEP> 19-d)
<tb> Glycerin-Nitrat <SEP> Agar <SEP> farblos <SEP> dürftig, <SEP> weiss <SEP> keines
<tb> Dextrose-Nitrat-Agar <SEP> farblos <SEP> dürftig, <SEP> weiss <SEP> keines
<tb> Bouillon-Agar <SEP> farblos <SEP> keines <SEP> keines
<tb> Gelatine <SEP> farblos <SEP> keines <SEP> keines <SEP> mässige <SEP> Verflüssigung.
<tb> Kartoffeln <SEP> farblos <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> rauchgrau <SEP> keines <SEP> feuchte <SEP> schwarze <SEP> Flecken
<tb> (Rdg <SEP> XLVI, <SEP> 21<B>1"</B>-d) <SEP> beobachtet.
<tb> Karotten <SEP> farblos <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> rauchgrau <SEP> keines
<tb> (Rd,- <SEP> XLVI, <SEP> 21<B>1"</B>-d)
<tb> Hefeextrakt-Agar <SEP> farblos <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> leichtes <SEP> keines <SEP> teilweise <SEP> feucht <SEP> werdend.
<tb> Gelblichgrau
<tb> (Rd<B>g</B> <SEP> XLVI, <SEP> 17""-b)
<tb> Ganzes <SEP> Ei <SEP> farblos <SEP> weiss <SEP> keines <SEP> schwache <SEP> Peptonisierung.
<tb> Milch <SEP> farblos <SEP> weiss <SEP> keines
<tb> Glycerin-Asparaginat- <SEP> farblos <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> rauchgrau <SEP> keines
<tb> Agar <SEP> (Rdg <SEP> XLVI, <SEP> 21""-d)
<tb> Pepton-Nitratbrühe <SEP> farblos <SEP> Nitratreduktion.
<tb> Das <SEP> Luftmycel <SEP> dieses <SEP> Stammes <SEP> zeigt <SEP> Spiralen <SEP> von <SEP> 0,8-12 <SEP> ,u, <SEP> und <SEP> ovale <SEP> Conidien <SEP> von <SEP> 1-1,5 <SEP> 1u <SEP> X <SEP> 1,5-2p..
Der Kohlenstoffverbrauch, gemessen nach der Methode Pridham, ist folgender:
EMI0002.0004
d(+)-Xylose <SEP> ++ <SEP> d(+)-Raffinose <SEP> - <SEP> Salicin <SEP> ++
<tb> 1(+)-Arabinose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Inulin <SEP> - <SEP> Na-acetat <SEP> 1(+)
-Rhamnose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> d-Mannit <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Na-citrat <SEP>
<tb> d-Fructose <SEP> +++ <SEP> d-Sorbit <SEP> - <SEP> Na-succinat <SEP> +
<tb> d-Galactose <SEP> +++ <SEP> Dulcit <SEP> Saccharose <SEP> - <SEP> dl-Inosit <SEP> - <SEP> Kontrolle <SEP> Maltose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> ++
<tb> - <SEP> = <SEP> kein <SEP> Wachstum <SEP> +++ <SEP> = <SEP> gutes <SEP> Wachstum <SEP> ++ <SEP> = <SEP> annehmbares <SEP> Wachstum
<tb> + <SEP> = <SEP> geringes <SEP> Wachstum <SEP> <SEP> = <SEP> fragliches <SEP> Wachstum Die mit den oben erwähnten Eigenschaften cha rakterisierte neue Art wurde von Nakazawa und Shibata Streptomyces humidus nov. <RTI
ID="0003.0006"> sp. genannt. In der folgenden Tabelle wird ein Vergleich dieser Art mit Streptomyces hygroscopicus, welcher in den Eigenschaften der vorerwähnten Art ähnlich ist, vor genommen:
EMI0003.0010
Medium <SEP> Str. <SEP> humidus <SEP> Str. <SEP> hygroscopicus
<tb> Nähragar <SEP> farblos <SEP> Wachstum <SEP> creme <SEP> gefärbt, <SEP> später <SEP> gelblich
<tb> mit <SEP> gelblich <SEP> brauner <SEP> Rückseite
<tb> Glucose-Asparagin <SEP> Rückseite <SEP> creme-rotgelb <SEP> oder <SEP> gelblich- <SEP> Wachstum <SEP> creme <SEP> gefärbt <SEP> bis <SEP> strohgelb,
<tb> rotgelb, <SEP> später <SEP> sämisch-lederfarben <SEP> wer- <SEP> später <SEP> schwach <SEP> chromgelb <SEP> bis, <SEP> bräunlich dend, <SEP> Luftmycel <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> rauchgrau <SEP> oder <SEP> orange, <SEP> Luftmycel <SEP> weiss <SEP> bis <SEP> hellgelblich weingelb- <SEP> rötlich-gelb <SEP> grau
<tb> Kartoffel <SEP> Wachstum <SEP> farblos <SEP> Luftmycel <SEP> weiss <SEP> Wachstum <SEP> creme <SEP> gefärbt,
<SEP> später <SEP> gelblich
<tb> bis <SEP> rauchgrau <SEP> grau <SEP> bis <SEP> ;schwach <SEP> bräunlich. <SEP> Kein <SEP> Luft mycel <SEP> oder <SEP> Spur <SEP> von <SEP> weiss Streptomyces hygroscopicus erzeugt Hygroscopin [siehe J. Agr. Chem. Soc. (Japan) 28, 296 (1954) und Antibiotics und Chemotherapie 3, 1268 1953)], Carbomycin [siehe Antibiotics and Chemotherapie 3, 899 (1953)], Angstmycin [siehe J.
Antibiotics, Japan 7, 113 (1954)] und Hygromycin [siehe Antibiotics and Chemotherapie 3, <B>1</B>268 (<B>1</B>953)].
Streptomyces humidus erzeugt dagegen Dihydro- streptomycin.
Der oben erwähnte zu Streptomyces humidus ge hörende Stamm ist hygroskopisch, aber einige Stämme, die zu der gleichen Art gehören, haben diese Eigen schaft nicht. Ebenso bilden einige kein Luftmycel, und andere produzieren Pigment.
Dihydrostreptomycin erzeugende Stämme anderer Arten können auch dann für den gleichen Zweck gebraucht werden, wenn sie in ihren Eigenschaften Streptomyces humidus nov. sp. nicht sehr ähnlich sind.
Wie bei Mikroörganismen, insbesondere bei Streptorayceten, beobachtet wird, wechselt ihr Ver halten im Kulturmedium leicht spontan oder sie wer den künstlich geändert. Deshalb ist die Identifizierung einer Art so schwierig, dass jegliche blosse Beschrei bung der Eigenschaften einer Art für die Identifi zierung dieser Art keine definitive Bedeutung hat. Es können auch Mutanten von Dihydrostreptomycin erzeugenden Arten, wie sie z. B. durch Behandlung mit Röntgenstrahlen, ultraviolette Strahlen und Che mikalien entstehen, verwendet werden.
Charakteristische Eigenschaften einiger aus Streptomyces humidus durch die üblichen Mutations- mittel, wie ultraviolette Bestrahlung, erzeugte Mutan ten mit Abtrennung einzelner Sporen, werden in der folgenden Tabelle gezeigt:
EMI0003.0050
<I>Mutanten <SEP> von <SEP> Streptomyces <SEP> humidus <SEP> nov. <SEP> sp. <SEP> Nr. <SEP> 23 <SEP> 572</I>
<tb> Medium <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> G <SEP> I <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> Y <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> W
<tb> Glucose-Asparagin-Agar <SEP> teegrün <SEP> hellorangegelb <SEP> weiss
<tb> Stärke-Agar <SEP> weiss <SEP> hellorangegelb <SEP> weiss
<tb> Dextrose-Nitrat <SEP> Agar <SEP> weiss <SEP> cremefarben <SEP> weiss
<tb> Kartoffel <SEP> teegrün <SEP> kapuzinerfarben-rötlichgelb
<tb> später <SEP> orangegelb
<tb> Glycerin-Asparaginat-Agar <SEP> weiss <SEP> helles <SEP> Orangegelb <SEP> weiss Die meisten Dihydrostreptomycin erzeugenden Stämme gleichen in ihren Eigenschaften nicht dem Streptomyces griseus und sind sowohl gegen
Dihydro- streptomycin als auch Streptomycin resistent. Zum Unterschied von den Antibiotica, die durch Reduk tion von Streptomycin erhalten werden, sind die durch Kultivierung von Dihydrostreptomycin erzeu genden Mikroorganismen erhaltenen Antibiotica im allgemeinen negativ gegenüber der Maltolreaktion. Die Maltolreaktion ist eine Farbreaktion des Strepto- mycins mit Phenolreagens,
die durch Hydrolyse des Streptomycins mittels Alkali erzeugt wird [Schenk et a1., J. Amer. Chem. Soc. 67, 2277 (1945), Boxer, J. Biol. Chem. 169, 153 (1947), Eiseman et a1., Anal. Chem. 21, 1507 (1949)]. Diese Eigenschaften können vorteilhaft zur Trennung verschiedener Stämme zur Anwendung gebracht werden. Es können z.
B. die gewünschten Stämme selektiv durch die Verdün nungsmethode oder durch Kultivierung in einem Dihydrostreptomycin enthaltenden Medium getrennt werden.
Als Kohlenstoffquelle können z. B. Stärke, Lac- tose, Saccharose, Dextrin, Glycerin und Maltose ge braucht werden. Als Stickstoffquelle können orga nische oder anorganische, Stickstoff enthaltende Substanzen verwendet werden, wie z. B. Sojabohnen mehl, Fleischextrakt, Peptone, Erdnusspulver; Kasein, Aminosäuren, Hefe, Kleie, Maismaische, Baumwoll- samenpulver, Nitrate, Harnstoff oder Ammonium verbindungen.
Es können auch kleine Mengen von anorganischen Salzen und das Wachstum fördernde Substanzen der Nährlösung zugesetzt werden. Andere geeignete Wachstumsquellen sind Mycelien eines zu Penicillium gehörenden Stammes oder z. B. dessen Kulturmedium. Jedes für die Kultivierung von Streptomyces griseus geeignete Nährmedium erfüllt den gleichen Zweck. Eine geeignete Muttersubstanz kann, wenn notwendig, beigefügt werden.
Das Kulturmedium kann fest oder flüssig sein; eine submerse und aerobe Kultivierung ist für industrielle Zwecke am vorteilhaftesten.
Wenn Streptomyces humidus als der Dihydro- streptomycin liefernde Mikroorganismus verwendet wird und die Kultivierung unter submersen aeroben Bedingungen durchgeführt wird, so kann dieselbe vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 24 bis 30 C in einer Zeitperiode von 3 bis 8 Tagen vollzogen werden. Aber- die Temperatur und die Zeitperiode muss den anderen Kulturbedingungen angepasst wer den. Bei Verwendung anderer Dihydrostreptomycin erzeugenden Mikroorganismen werden jeweils die für deren Kultivierung geeignetsten Bedingungen gewählt.
Das so erzeugte Dihydrostreptomycin kann mit Hilfe verschieden physikalischer oder chemischer Methoden in optimaler Reinheit aus einem Dihydro- streptomycin enthaltenden Nährmedium isoliert wer den. Hierbei wird ein für den Gebrauchszweck hoher Reinheitsgrad erzielt.
Zur Isolierung des Dihydrostreptomycins aus dem Nährmedium und Abtrennung von den Verunreini gungen kann man z. B. von den Verschiedenheiten zwischen Dihydrostreptomycin oder seinen Salzen und den Verunreinigungen in bezug auf die Adsor- bierbarkeit, die Löslichkeit, den Verteilungskoeffi zienten zwischen zwei Lösungsmitteln und der Stärke, mit der Ionen gebunden werden, Gebrauch machen.
Im Falle der Kultivierung in flüssigem Medium kann das Antibiotikum bis zu einer Konzentration von mehreren tausend Mikrogramm pro em3 im Kultur medium angereichert werden; man kann jedoch das Dihydrostreptomycin schon aus einer nur 10 y/em3 enthaltenden Lösung isolieren.
Die roh aus dem Kulturmedium gewonnene Sub stanz enthält neben Dihydrostreptomycin natürlich verschiedene Verunreinigungen, wie Kohlehydrate, Proteinsubstanzen, Salze, tierische und vegetabilische Substanzen, Mycele von Mikroorganismen und deren Umwandlungsprodukte. Jede dieser Verunreinigun gen enthält z. B. die folgenden Substanzen: Kohlehydrate: Stärke, Zucker, wasserlösliches Kohle hydrat.
Proteinsubstanzen: Aminosäuren, Kasein, Fleisch extrakt, Protein, Peptone.
Tierische und vegetabilische Substanzen: Protein substanzen, Fette, Fettsäuren, Lipoide, Cellulose. Salze: Ammoniumsalze und Amine, Salze von Alkali metallen, von Calcium, Magnesium, Eisen, Mangan, Kupfer, Zink. Umwandlungsprodukte von Mikroorganismen: Enzyme, Proteinsubstanzen, Zucker, mehrwertige Alkohole, Fettsäuren.
Ausser diesen Substanzen können durch Synthese Verbindungen wie Harnstoff erhalten werden.
Die Zusammensetzung der Verunreinigungen ist sehr verwickelt, aber diese variiert in Qualität und Quantität je nach Ausmass und Art der verwendeten Ausgangsstoffe. Im Nährmedium können auch noch andere Verunreinigungen, wie pH-Regulierungsmittel, Fäl#lungsmittel, Adsorbierungsmittel, enthalten sein.
Die Abtrennung des Dihydrostreptomycins aus der Mischung von den genannten Verunreinigungen kann auf verschiedene Weise erfolgen.
Eines dieser Mittel macht von dem Unterschied zwischen Dihydrostreptomycin und den Verunreini gungen in bezug auf Löslichkeit Gebrauch. Bei der flüssigen Kultur wird eine Dihydrostreptomycin- lösung durch Filtration des Gärungsgemisches gewon nen, weil sich dasselbe vorzugsweise im flüssigen Teil befindet. Aber ein kleinerer Anteil der aktiven Ver bindung wird in den Festbestandteilen gefunden und kann durch Extraktion mit heissem Wasser daraus gesammelt werden.
In diesem Falle können Ver unreinigungen der Proteinreihe dadurch eliminiert werden, dass man das pH auf den isoelektrischen Punkt des Proteins einstellt oder indem man vor, nach oder mit gleichzeitiger Entfernung des Mycels Substanzen zusetzt, welche die Verunreinigungen fällen. Wenn das pH des Gärungsgemisches hoch ist, ist der Zusatz einer sauren Substanz angebracht, um das Protein leichter zu fällen. Wenn die Konzentra tion des Dihydrostreptomycins in der Lösung genü gend hoch ist, kann das Antibiotikum durch blosses Zufügen eines geeigneten Fällungsmittels gefällt wer den.
Wenn die Konzentration des Dihydrostrepto- mycins nichtgenügend ist, wird ein Teil des Lösungs mittels verdampft. Als Fällungsmittel werden z. B. Phosphorwolframsäure, Alkyl- oder Aralkylsulfon- säuren, saure Azoverbindungen und Polyhalogen phenolverbindungen verwendet. Alle diese bilden mit Dihydrostreptomycin Salze.
Es können manche andere Verbindungen verwendet werden, und die meisten von ihnen sind saure Verbindungen mit Carboxylresten. In manchen Fällen können die so gebildeten Salze des Dihydrostreptomycins Doppel- oder Komplexsalze sein. Es können auch, wie später beschrieben wird, als eine Art von Fällungsmittel Ionenaustauscher verwendet werden. Um die Fällung der aktiven Substanz oder der Verunreinigungen zu beschleunigen, kann man auch, wenn notwendig, aussalzen.
Wenn feste Kulturen verwendet werden, so wird das Festmaterial mit Wasser, einem wässrigen Lö sungsmittel oder einem anderen geeigneten Lösungs mittel extrahiert, um eine Lösung von Dihydro- streptomycin zu erhalten. Wenn das Gärungsgemisch vorher in eine Festsubstanz übergeführt worden ist, so kann diese, wie oben beschrieben, aufgearbeitet werden; in diesem Falle wird aber die Extraktion bei einem geeigneten pH durchgeführt.
Ein anderes Mittel für die Abtrennung des Di- hydrostreptomycins besteht darin, dass man von der Verschiedenheit zwischen der antibiotisch aktiven Verbindung und den Verunreinigungen in bezug auf die Adsorbierbarkeit Gebrauch macht. Dihydro- streptomycin wird im Kulturfiltrat z. B. durch Zusatz eines geeigneten Adsorbierungsmittels adsorbiert. Wenn notwendig, kann von der Adsorptionschromato- graphie Gebrauch gemacht werden. Als Adsorptions- mittel werden z. B.
Aktivkohle, Alaunerde und Silicagel verwendet. Wenn man das Adsorptions- mittel abtrennt, bleibt der grösste Teil der Verunrei nigungen im flüssigen Anteil. Das Adsorptionsmittel wird dann mit einem geeigneten Lösungsmittel elu fiert, wobei die nicht eluierbaren Verunreinigungen im Ad sorptionsmittel bleiben. Die El:uierung wird im allge meinen mit einem sauren Lösungsmittel durchgeführt. Chromatographie bewirkt eine exaktere Trennung, aber diese Methode erfordert kompliziertere Ver fahren.
Unterschiede zwischen der antibiotisch aktiven Verbindung und den Verunreinigungen in bezug auf den Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Lösungs mitteln können ebenfalls für die Trennung verwendet werden. Als Lösungsmittel können Wasser oder ein wässriges Lösungsmittel und ein organisches mit dem letzteren nicht mischbaren Lösungsmittel verwendet werden. In diesem Falle ist die aktive Verbindung geneigt, sich im wässrigen Lösungsmittel zu verteilen, wenn die Lösungsmittel stark sauer sind. Wenn die Lösungsmittel anderseits neutral oder basisch sind und eine höhere Fettsäure, Pikrinsäure und derglei chen mit zugegen sind, so geht die aktive Verbindung in die organische Lösungsmittelschicht über.
Dem gemäss ist es möglich, die aktive Verbindung im Mate rial in ein organisches Lösungsmittel aufzunehmen und dann in Wasser oder ein wässriges Lösungs mittel zu übertragen. Als organische Lösungsmittel werden z. B. Butanole, Pentanole, Phenole, niedere Fettsäureester, Methylisobutylketon, Diäthyläther und halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Tetrachlo:rkohlenstoff, verwendet.
Diese Methode kann in Form einer Verteilungschromatographie oder einer Gegenstromverteilungsmethode zur Anwendung gebracht werden. Die Trennung kann auch so durchgeführt werden, dass von den Unterschieden zwischen der anti biotisch aktiven Verbindung ,und den Verunreinigun gen in bezug auf die Stärke des lonenbindungsver- mögens Gebrauch gemacht wird. Dies wird z. B. da durch erreicht, dass man eine Lösung der aktiven Verbindung mit einem Ionenaustauscher in Kontakt bringt.
In diesem Falle adsorbiert ein Anionen- austauscher anionische Verunreinigungen und belässt die aktive Verbindung in der Lösung, während ein Kationenaustauscher die antibiotisch aktive Verbin dung adsorbiert. Im letzten Falle werden kationische Verunreinigungen ebenfalls adsorbiert, aber letztere Adsorption kann, wenn man einen ,geeigneten Ionen- austauscher verwendet,
möglichst klein gehalten wer den. Die Harze des Sulfonsäuretyps adsorbieren z. B. leicht die Verunreinigungen, aber die Harze des Carboxylsäuretyps haben eine geringe Tendenz hier für. Die Zugabe der Ionenaustauscher kann nach der Mischungsmethode erfolgen, der Gebrauch einer Kolonne für das Harz ist in manchen Fällen eine passende Methode. Diese Methode kann für eine verdünnte Lösung der antibiotisch aktiven Verbin dung wie für das Kulturfiltrat gebraucht werden.
Man kann auch die Dialyse verwenden, um die Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht zu entfernen, aber dieser Prozess ist kompliziert.
Die oben erwähnten Mittel können getrennt für sich oder je nach der Qualität des Materials und dem Verwendungszweck des Produktes, in Kombination zur Anwendung .gelangen. Man kann auch so vor gehen, dass man z. B. das Kulturmedium vorerst filtriert, um die Testbestandteile oder die nach der Kultivierung niedergeschlagenen Substanzen zu ent fernen.
Die antibiotisch aktive Verbindung im Filtrat wird an einen Kationenaustauscher adsorbiert und dann mit einem sauren Lösungsmittel eluiert. Es wird so eine konzentrierte Lösung der aktiven Ver bindung erzielt, welche nur eine kleine Menge von Verunreinigungen enthält. Die Lösung wird, wenn notwendig, weiter konzentriert und einer Adsorptions- Chromatographie unterworfen, um fast alle Verun reinigungen zu entfernen. Aus der konzentrierten Lösung kann das Antibiotikum mit einem geeigne ten Mittel gefällt werden.
Der Niederschlag wird dann in einem geeigneten organischen Lösungsmittel ge löst und eine Säure zugesetzt, worauf das entspre chende saure Salz des Dihydrostreptomycins erhal ten wird. Wenn das Produkt umkristallisiert wird, wird das saure Salz in fast reinem Zustand erhalten.
Alle Arbeitsprozesse, wie Filtrieren, Waschen, Heizen, Kühlen, Mischen, Destillieren, Verdampfen und Trocknen, können nacheinander oder gleich zeitig durchgeführt werden.
Um die Zersetzung der antibiotisch aktiven Ver bindung zu verhindern., wird zweckmässig unter nicht extrem sauren oder .extrem alkalischen Bedingungen gearbeitet. Man kann zwar, wenn notwendig, erhitzen; aber es ist vorzuziehen, nicht allzulange zu erhitzen. Im Vergleich mit anderen Antibiotika ist Dihydro- streptomycin im Kulturmedium verhältnismässig stabil, so dass alle Manipulationen ohne Schwierigkeit durch geführt werden können.
Das so erhaltene Dihydrostreptomycin wurde auf Grund folgender Daten identifiziert: <I>A. Physikalische und chemische Eigenschaften</I> 1. Das Infrarotabsorptionsspektrum wurde von den folgenden Derivaten sowohl des erfindungs gemäss erhältlichen Dihydrostreptomycins (im folgen den als Antibiotikum 21<B>572</B> bezeichnet) als auch des Dihydrostreptomycins des Handels bestimmt. I.
Sulfat, II. Streptidinpicrat, <B>111.</B> a-Methyl-pentaacetyldihydrostreptobio@aminid. Die IR-Spektren der Derivate des erfindungs gemäss erhaltenen Dihydrostreptomycins sind mit den IR-Spektren der entsprechenden Derivate des Di- hydrostreptomycins des Handels identisch.
Alle Spektren sind in Nujolparaffinöl mit einem Natriumchlorid Prisma gemessen.
2. Die ultravioletten Spektren vom Sulfat des Antibiotikums 23 572 und diejenigen eines handeln üblichen Musters von Dihydrostreptomycinsuifat stimmen gut überein, es wurde keine spezifische Ad sorption beobachtet.
3. Die analytischen Werte des Sulfates vom Antibiotikum 23 572 stimmen mit den theoretischen Werten des Dihydrostreptomycinsulfates gut überein. Die Werte für Dihydrostreptomycinsulfat (C21H41012N7)2 - 3 H2S04) sind: Berechnet: C 34,42'%; H 6,0511/G; N 13,3804; S 6,561/0 Gefunden:
C 34,45"/ü; H 6,4211/o; N 12,981/o,; S 6,43% 34,110/0; 6,54 0/0 4. Das Sulfat des Antibiotikums 23 572 zeigt eine Drehung von (a)25 - 87,4 (C = 1, H,0), während das Dihydrostreptomycinsulfat eine Drehung von (a)<B>17</B> - 86,0 zeigt.
Die spezifische Drehung von Dihydrostrepto- mycin wurde von I. A. Solomons et a1. in Science 109, 515 (1949) mit (a)D - 88 und von F. J. Wolf et a1. in J. Am. Chem. Soc. 68, 2163 (1946) mit (a)D - 88,5 angegeben.
5. Das Sulfat des Antibiotikums 23 572 schmilzt unter Zersetzung und Schwarzfärbung bei 250 bis 255 C, das Dihydrostreptomycinsulfat schmilzt eben falls unter Zersetzung und Schwarzfärbung bei 250 bis 255 C.
6. Sowohl das Antibiotikum 23 572 als auch das Dihydrostreptomycin verhalten sich gegenüber der Maltol-Reaktion negativ, Streptomycin spricht da gegen an.
7. Das Antibiotikum<B>23572,</B> das Dihydro- ,streptomycin und Streptomycin verhalten sich gegen über der Sakabguschi-Reaktion positiv.
B. Lösungen des Sulfates vom Antibiotikum <B>23572</B> des Dihyd,rostreptomycinsulfates und des Streptomycinsulfates in 0,1n NaOH in einer Kon zentration von 5 mg/cm3 wurden bei Raumtempe ratur 24 und 48 Stunden lang stehengelassen und die antibakterielle Wirksamkeit jedes Antibiotikums nach der Verdünnungsmethode bestimmt.
Es ergaben sich folgende Werte:
EMI0006.0073
unmittelbar <SEP> nach <SEP> nach <SEP> 24 <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> 48 <SEP> Stunden
<tb> Auflösung
<tb> Sulfat <SEP> des <SEP> Antibiotikums <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> <B>10000</B> <SEP> E/cm3 <SEP> > <SEP> <B>10000</B> <SEP> E/cm3 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> E/cm3
<tb> Dihydrostreptomycinsulfat <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> E/cm3 <SEP> > <SEP> 10000 <SEP> E/cm3 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> E/em3
<tb> Streptomycinsulfat <SEP> 10000 <SEP> E/em3 <SEP> < <SEP> 100 <SEP> E/cm3 <SEP> 75 <SEP> E/cm3 Unter alkalischen Bedingungen ist also das Sulfat des Antibiotikums<B>23572</B> ebenso stabil als das. Di- hydrostreptomycinsulfat.
9. 30 mg/cm3 Semicarbazid wurde zu jeder der wässrigen Lösungen des Sulfates des Antibiotikums <B>23572,</B> des Dihydrostreptomycinsulfats und des Streptomycinsulfates zugefügt und nach 4stündigem Stehen bei Raumtemperatur die antibakterielle Wirk samkeit jedes Antibiotikums gegenüber B. subtilis durch die Verdünnungsmethode bestimmt.
Es wur den folgende Resultate erreicht:
EMI0006.0082
kein <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 4 <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> Zusatz
<tb> Semicarbazid <SEP> des <SEP> Semicarbazids
<tb> Sulfat <SEP> des <SEP> Antibiotikums <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> <B>35000</B> <SEP> E/cm3 <SEP> 35 <SEP> 000 <SEP> E/em3
<tb> (10 <SEP> mg/cm3)
<tb> Dihydrostreptomycinsulfat <SEP> 35 <SEP> 000 <SEP> E/cm3 <SEP> <B>50000</B> <SEP> E/cm3
<tb> (10 <SEP> mg/cm3)
<tb> Streptomycinsulfat <SEP> (10 <SEP> mg/cm3) <SEP> 35 <SEP> 000 <SEP> E/cm3 <SEP> < <SEP> 5 <SEP> 000 <SEP> E/cm3 Eine Lösung von 30 mg/cm3 Semicarbazid zeigt eine Wirksamkeit von 75 E/cm3.
10.1 mg/cm3 Cystein wurde zu jeder der wäss- rigen Lösungen des Sulfates des Antibiotikums 23 572, des Dihydrostreptomycinsulfates und des Streptomycinsulfates zugesetzt und nach 4stündigem Stehen bei Raumtemperatur die antibakterielle Wirk samkeit jedes Antibiotikums .gegenüber B. subtilis durch die Verdünnungsmethode bestimmt. Es wurden folgende Resultate ,erzielt:
EMI0007.0015
kein <SEP> Zusatz- <SEP> von <SEP> 4 <SEP> Stunden <SEP> nach <SEP> Zusatz
<tb> Cystein <SEP> des <SEP> Cysteins
<tb> Sulfat <SEP> des <SEP> Antibiotikums <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> E/cm3 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> E/cm3
<tb> (5 <SEP> mg/cm3)
<tb> Dihydrostreptomycinsulfat <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> E/cm3 <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> E/cm3
<tb> (5 <SEP> mg/cm3)
<tb> Streptomyeins.ulfat <SEP> (5 <SEP> mg/cm3) <SEP> 15 <SEP> 000 <SEP> E/cm3 <SEP> 7 <SEP> 500 <SEP> E/cm3
<tb> Eine <SEP> -Lösung <SEP> von <SEP> 1 <SEP> mg/cm3 <SEP> Cystein <SEP> zeigte <SEP> eine <SEP> Wirksamkeit <SEP> von <SEP> 100 <SEP> E/cms.
Das Sulfat des Antibiotikums 23 572 verliert also durch den Zusatz von Semicarbazid oder Cystein nichts von seiner Wirksamkeit, es verhält sich gleich wie Dihydrostreptomycinsulfat. 11.
Die qualitative Reaktion auf den Formyl- rest ist negativ, wie aus der folgenden Tabelle ersicht lich ist:
EMI0007.0021
Fehlingsches <SEP> Phenolkonz. <SEP> Silberspiegel Reagens <SEP> <B>H@so°</B> <SEP> reaktion
<tb> Sulfat <SEP> des <SEP> Antibiotikums <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> negativ <SEP> keine <SEP> Verfärbung <SEP> braun, <SEP> klar
<tb> Dihydrostreptomycinsulfat <SEP> negativ <SEP> keine <SEP> Verfärbung <SEP> braun, <SEP> klar
<tb> Streptomycinsulfat <SEP> brauner <SEP> tief <SEP> braune <SEP> Farbe <SEP> schwarzbrauner
<tb> Niederschlag <SEP> Niederschlag 12. Streptidinpicrat wurde aus dem Antibiotikum 23 572 nach dem Verfahren von F. H. Stodola et a1. [J.
Am. Chem. Soc. 73, 2290 (1951)] in folgender Weise erhalten: 2 g des Hydrochlorides vom Anti biotikum<B>23572</B> wurden in<B>100</B> cm3 wasserfreiem Methanol, welches 10/9 Chlorwasserstoff enthielt, aufgelöst. Nach 48stündigem Stehen bei Raumtempe ratur wurden zur Lösung unter Rühren 200 cm3 Äther zugesetzt und die entstandenen weissen Kristalle (Streptidinhydrochlorid) durch Zentrifugieren abge trennt. Die Kristalle wurden in 20 cm3 Wasser gelöst und eine gesättigte Picrinsäurelösung zugegeben.
Nach mehrstündigem Stehen wurden die niedergeschlage nen Kristalle abgetrennt und aus Wasser umkristalli- siert. Es wurden als gelbliche Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 271-273 C 400 mg Streptidin- pikrat erhalten.
Die Analyse für C8H1$O4N6 - 2 C6HH3N307 zeigte: Berechnet: C 33,340/9; H 3,360/0; N 23,33% Gefunden: C 33,46%; H 3,440;9;
N 23,49% Das Infrarotabsorptionsspektrum des Picrates stimmte mit dem des aus Dihydrostreptomycin her gestellten Picrates wie unter 1 beschrieben überein.
Die über obigem Streptidinhydrochlorid befind liche Flüssigkeit wurde mit einer Lösung von Na- triumhvdroxyd in Methylalkohol neutralisiert, das entstandene Natriumchlorid durch Zentrifugieren ab getrennt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Es hinterblieb ein weisses Pulver. Dieser Rückstand wurde in 20 cm3 Pyridin aufgelöst und 7 cm' Es:sigsäureanhydrid zugesetzt.
Nach Stehen über Nacht wurde zur Reaktionsmischung Wasser zugesetzt und das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Methanol umkristal isiert. Es wurde in Form von weissen Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 194,5 C a-Methyl-pentaacetyldi- hydrostreptobiosaminid erhalten. Die Ausbeute be trug 700 mg.
Die Analyse für C13H19NO8(CH.C0)5(OCH3) ergab: Berechnet: C 51,15%-; H 6,62%; N 2,490/0 Gefunden: C 51,09'%-; H 6,l3'0/9;
N 2,40%. Die Drehung (a) = -120,0 (c = 1%, D in Chloroform).
Das Infrarotabsorptionsspektrum der erhaltenen Verbindung war in guter übereinstimmung mit dem aus Handels-Dihydrostreptomycin erhaltenen a Methyl-pentaacetyldihydrostreptobiosaminid, wie be reits unter 1 beschrieben ist.
Das ss-Methyl-pentaacetyldihydrostreptobiosaminid wurde aus Antibiotikum 23 572 nach dem Verfahren von N. G. Brink [J. Am. Chem. Soc. <B>68,2557</B> (1946)] in folgender Weise erhalten:
10 g Hydrochlorid des Antibiotikums 23 572 wurden in 500 cm3 Methanol, das 1 % Chlorwasserstoff enthielt, aufgelöst. Nach- dem die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht gestanden hatte, wurde das Lösungsmittel unter ver mindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in 750 cm3 Methanol aufgelöst und 450 cm3 Äther zugesetzt.
Die Lösung wurde durch eine Kolonne geschickt, die mit 210 g sauer gewaschener Alaunerde beschickt war, die mit einer Methanol-Äther- Mischung im Verhältnis 2: 1 imprägniert war. Die Kolonne wurde mit 1000 cm3 einer Methanol-Äther- Mischung im Verhältnis<B>3:2</B> gewaschen. Die ausge flossene Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand wurde acety- liert, indem man mit 10 cm3 Essigsäureanhydrid und 10 cm3 Pyrid'in bei Raumtemperatur über Nacht stehen liess. Es wurde dann Wasser dazugegeben und die Lösung im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und die Chloroformlösung mit Wasser, verdünnter Schwefel säure und schliesslich mit Wasser gewaschen.
Nach dem das Chloroform abdestilliert war, wurde der bräunliche feste Rückstand 2 Minuten lang mit <B>100</B> cm3 Äther gekocht und die Ätherlösung durch Dekantieren abgetrennt. Das gleiche Verfahren wurde nochmals wiederholt. Die in Äther unlösliche Frak tion wurde aus Methanol kristallisiert und liefert a - Methyl - pentaacetyldihydrostreptobiosaminid mit einem Schmelzpunkt von 194,5 C.
Die Ätherlösung wurde auf ungefähr 50 cm3 eingeengt und Petroläther zugesetzt, wobei sich weisse Kristalle ergaben. Um kristallisation aus Methanol ergab ungefähr 100 mg ss - Methyl- pentaacetyldihydrostreptobiosaminid mit einem Schmelzpunkt von 155-156 C. Es wurde keine Schmelzpunktdepression beobachtet, wenn es mit dem ss-Isomeren gemischt wurde, das aus Di- hydrostreptomycin nach dem eben angegebenen Ver fahren hergestellt war.
Die Analyse .ergab für C"H19NOs(CH.C0)5(OCH3): C 50,710/0; H 6,620/a; N 2,6511/o. Die berechneten. Werte sind: C 51,15%; H 6,620/0; N 2,4911/o. (a)= - 36 . (C = 1/Chloroform).
D Das Infrarotspektrum des erhaltenen Produktes war in guter Übereinstimmung mit dem des aus Dihydro- streptomycin erhaltenen ,ss - Methyl - pentaacetyldi- hydrobiosaminid.
Eine Lösung von 260 mg a-Methyl-pentaacetyl- dihydrostreptobiosaminid, das aus dem Antibiotikum <B>23572</B> erhalten war, in 20 cm3 einer 10 n/odgen Salzsäure wurde 3 Stunden lang unter Rückfluss ge kocht. Nach Abkühlen wurde die bräunliche Lösung mit Holzkohle entfärbt und im Vakuum zur Trockne verdampft.
Der Rückstand wurde bei Raumtempe ratur mit 1 cm3 Essigsäureanhydrid und 3 em3 Pyridin acetyliert. Nach Zusatz von Wasser wurde die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 cm3 Benzol-Petroläther-Mischung im Verhältnis 7 : 3 gelöst.
Die Lösung wurde durch eine Kolonne gelassen, welche mit 4 g einer sauer ge waschenen, mit Petroläther imprägnierten Alaunerde beschickt war, wobei das Acetylierungsprodukt auf der sauer gewaschenen Alaunerde adsorbiert wurde.
Die Kolonne wurde mit 100 cm3 einer Benzol Chloroform-Mischung im Verhältnis 7: 3 behandelt, um die betreffende Substanz zu eluieren. Das Effluans wurde auf ungefähr 10 cm3 eingeengt und 30 cm3 Äther zugesetzt, wobei sich Kristalle ergaben.- Um kristallisation aus Chloroform-Äther ergab 25 mg Nadeln von Pentaacetyl-N-methyl-L-glucosamin mit einem Schmelzpunkt von 158-159 C.
Die Analyse ergab: C 50,71'%; H 6,14 11/a; N 3,25 0/0. Die berechneten Werte für C17H"N010 sind:
C 50,62%; H 6,250/0; N 3,4711/o. (a) D = -102 (c = 0,7'% in Chloroform). Das Infrarotabsorptionsspektrum des erhaltenen Produktes war in völliger übereinstimmung mit dem des Pentaacetyl-N-methyl-L-glucosamins,
das nach der beschriebenen Methode aus Dihydrostreptomycin erhalten war. Es wurde keine Schmelzpunktsdepres- sion beobachtet, wenn es mit Pentaacetyl-N-methyl- L-glucosamin gemischt wurde, das aus Dihydro- streptomycin erhalten war.
13. Antibiotikum 23 572 wurde mit Alkali unter ähnlichen Bedingungen hydrolysiert, wie es für die Hydrolyse von Hydroxystreptomycin verwendet und von F. H. Stodola et a1. [J. Am. Chem. Soc. 73, 2290 (1951)] beschrieben wurde. Demgemäss wurde eine Lösung von 2 g Hydrochlorid des Antibiotikums 23 572 in 40 cm3 l11 NaOH 3 Stunden lang auf 100 C erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde mit Salzsäure angesäuert und aufgearbeitet.
Es konnte aber weder eine Substanz mit positiver Reaktion gegenüber Maltot noch eine unter sauren Bedingungen extrahier bare Substanz gefunden werden, das heisst das Anti biotikum 23 572 verhält sich bei dieser Prüfung anders als Streptomycin und Hydroxystreptomycin. Die gleiche Prüfung ergab mit Dihydrostreptomycin das gleiche Resultat.
14. Zu einer wässrigen Lösung von 50000 y/em3 des Antibiotikums 23 572 wurde eine warme Lösung von Methylorange zugesetzt, bis kein Niederschlag mehr gebildet wurde. Der Niederschlag wurde abfil- triert und aus Methanol-Wasser (1 :3) umkristalli siert. Es wurde in Form von Schuppen mit einem Schmelzpunkt von 222-225 C das Helianthat ge wonnen (Wirksamkeit: 340 Streptomycin-Einheiten pro mg).
Die Analyse für Dihydrostreptomycin- helianthat (C03H$00.,1N10s3) ergab: Berechnet: C 50,46%; H 5,7911/o; N 14,95%; S 6,4011/o Gefunden:
C 50,19%; H 5,93%; N 14,93%; S 6,801/0 50,84114; 5,95% 15. Die Papierverteilungschromatographie von Streptomycin und Dihydrostreptomycin wurde von F. H. Stodola et a1. [J. Am. Soc. 73, 2290 (1951)] geprüft.
Es wurde mit Wasser gesättigtes Butanol mit 2 /o p-Toluolsulfonsäure und 2 /o Piperidin als Lö sungsmittel verwendet. Beide Verbindungen wurden mit Hilfe des Bioautogrammes unterschieden.
Nach der gleichen Methode wurde die Papier chromatographie auf die beiden obigen Verbindungen und das Antibiotikum 23 572 angewandt. Die Bio- autogramme wurden mit B. subtilis als Prüfungs- Mikroorganismen geprüft. Es ergab sich, dass das Antibiotikum an der gleichen Stelle eine das Wachs tum verhindernde Zone zeigte, wie das Dihydro- streptomycin.
16. Die kristallographischen Konstanten des Sul fates vom Antibiotikum 23 572 wurden im Vergleich mit denen des von F. J. Wolf et a1. [Science 109, 515 (1949)] berichteten Dihydrostreptomycinsulfates un tersucht.
EMI0009.0025
Sulfat <SEP> vom <SEP> Dihydrostreptomycinsulfat
<tb> Antibiotikum <SEP> 23 <SEP> 572
<tb> 1,545 <SEP> <SEP> 0,002 <SEP> 1,552 <SEP> <SEP> 0,002
<tb> 1,556 <SEP> <SEP> 0,005 <SEP> 1,558 <SEP> <SEP> 0,004
<tb> y <SEP> 1,564 <SEP> <SEP> 0,002 <SEP> 1,566 <SEP> <SEP> 0,002
<tb> <I>B.
<SEP> Chemotherapeutische <SEP> Wirksamkeit</I> Die das Wachstum hemmende Wirkung des Anti biotikums auf Streptomycin empfindliche Stämme von menschlichen Tuberkelbazillen (H 37 Rv) war fast von der gleichen Grössenordnung wie die des Dihydrostreptomycins, es tritt in vitro eine Hem mung des Wachstums in .einer Konzentration von 1-2 y pro ml ein.
Es zeigt sich aber keine Hem mung des Wachstums auf die gegen Streptomycin resistenten Stämme des menschlichen Tuberkelba- cillus. Die antibakterielle Wirkung des Antibiotikums 23 572 auf Tuberkelbazillen in vitro war beträchtlich hoch.
<I>Giftigkeit</I> Die LD.ö Werte an Mäusen (CFi) des Anti- biotikum-Sulfates und des Dihydrostreptomycin- sulfates wurden nach der Methode Litchfield und Wilcoxon errechnet.
EMI0009.0047
Applikation <SEP> Sulfate <SEP> von <SEP> Antibiotikum <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> Dihydrostreptomycinsulfat
<tb> LDso <SEP> LD6o
<tb> Intravenöse <SEP> Injektion <SEP> 250 <SEP> (219-285) <SEP> mg/kg <SEP> 240 <SEP> (215-268) <SEP> mg/kg
<tb> Subkutane <SEP> Injektion <SEP> 2000 <SEP> (1710-2340) <SEP> mg/kg <SEP> 1800 <SEP> (1450=2250) <SEP> mg/kg
<tb> Intraperitoneale <SEP> Injektion <SEP> <B>1900</B> <SEP> (1500-2390) <SEP> mg/kg <SEP> 1700 <SEP> (1430-2020) <SEP> mg/kg
<tb> <I>C. <SEP> Antibakterielles <SEP> Spektrum</I> Das Sulfat des Antibiotikums 23 572 wurde mit dem Dihydrostreptomycinsulfat des Handels darauf hin verglichen, welche Gewichtsmenge eine völlige Hemmung der zur Prüfung verwendeten Mikroorga- nismen ergab.
Es wurden folgende Resultate erzielt:
EMI0009.0051
<I>Antibakterielles <SEP> Spektrum</I>
<tb> Sulfat <SEP> vom <SEP> Dihydrostreptomycinsulfat
<tb> Mikroorganismen <SEP> Antibiotikum <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> des <SEP> Handels
<tb> mcg/cm3 <SEP> mcg/cm3
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Terajima
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> (PCI-219) <SEP> 0,5 <SEP> 0,5
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 64 <SEP> 64
<tb> Shigella <SEP> dysenteriae <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> Protews <SEP> vulgaris <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 4 <SEP> 4
EMI0010.0001
<I>Antibakterielles <SEP> Spektrum</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Sulfat <SEP> vom <SEP> Dihydrostreptomycinsulfat
<tb> Mikroorganismen <SEP> Antibiotikum <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> des <SEP> Handels
<tb> mcg/cm3 <SEP> mcg/cm3
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 32 <SEP> 32
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> notatum <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Mycobacterium <SEP> 607 <SEP> 2,0 <SEP> 2,0
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 1,0 <SEP> 1,0 In den folgenden Beispielen wurde die Wirkung der Antibiotika mit der Zylinder-Platten-Methode bestimmt,
wobei Bacillus subtilis (PCI 219) als Prä- fungs-Organismus verwendet wurde, mit Ausnahme der Fälle, wo die Prüfungsmethode besonders ver merkt wurde. <I>Beispiel 1</I>
EMI0010.0008
Glukose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,0%
<tb> Fleischextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,6%
<tb> Pepton <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>1,0()/o</B>
<tb> Kochsalz <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,6%
<tb> Calciumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,6'0/0 500 Liter einer Nährlösung mit den obigen Kom ponenten wurden durch Erhitzen in einem Gärgefäss sterilisiert.
Ein zu Streptomyces humidus gehörender Stamm wurde eingeimpft und 96 Stunden lang bei 27-28 C unter Rühren aerob kultiviert. Das Kultur medium zeigte folgende antibakterielle Wirkung:
500 mcg/cm3 gegenüber B. subtilis. <I>Beispiel 2</I>
EMI0010.0016
Kornmaische <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,01/o
<tb> Stärke <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,011/o
<tb> Pepton <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,51/o
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> . <SEP> 0,1%
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,05% <SEP> .
<tb> Calciumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,3% 50 cm3 dieser Nährlösung wurden in einem Schüttelgefäss in üblicher Weise sterilisiert. Ein zu Streptomyces humidus gehörender Stamm wurde eingeimpft und 4 Tage lang unter Schütteln bei 27 1 C aerob kultiviert.
Die antibakterielle Wirk samkeit des Kulturmediums erreichte 1200 mcg/cm3 gegenüber B. subtilis. <I>Beispiel 3</I> Stamm H-120, welcher zur Streptomyces humi- dus gehört, wurde in verschiedenen Nährlösungen, die aus Siebabfällen von Cerealien bestanden, aerob kultiviert. Die Resultate werden in der folgenden Tabelle gezeigt.
Jede der in den Beispielen 3 bis 8 beschriebenen Kulturen wurde mit 50 cm3 des Kul turmediums in einem Gefäss mit 300 cm3 Fassungs raum unter Schütteln bei 26-28 C durchgeführt.
EMI0010.0036
' <SEP> Maximale <SEP> Zeit <SEP> bis <SEP> zum
<tb> Medium <SEP> Wirkung <SEP> von <SEP> Erreichen <SEP> der <SEP> maximalen
<tb> Dihydrostreptomycin <SEP> Wirkung
<tb> mcg/cm3 <SEP> Stunden
<tb> Stärkebouillon <SEP> 78 <SEP> 120
<tb> Glucosebouillon <SEP> 225 <SEP> 120
EMI0011.0001
(Fortsetzung)
<tb> Maximale <SEP> Zeit <SEP> bis <SEP> zum
<tb> Medium <SEP> Wirksamkeit <SEP> von <SEP> Erreichen <SEP> der <SEP> maximalen
<tb> Dihydrostreptomycin <SEP> Wirkung
<tb> mcg/cm3 <SEP> Stunden
<tb> Stärkebouillon <SEP> 211 <SEP> 144
<tb> + <SEP> 3,0% <SEP> CaC03
<tb> Glucosebouillon <SEP> 286 <SEP> 120
<tb> + <SEP> 3 <SEP> % <SEP> <B>CaCO3</B>
<tb> 1. <SEP> 227 <SEP> 120e
<tb> 2. <SEP> 246 <SEP> 96
<tb> 3. <SEP> 329 <SEP> 120
<tb> 4. <SEP> 242 <SEP> 120
<tb> 2. <SEP> + <SEP> Hefeextrakt <SEP> 315 <SEP> 120
<tb> <B>950/0</B>
<tb> 1. <SEP> Glukose <SEP> 1,0% <SEP> 2. <SEP> Kornmaische <SEP> 3,0% <SEP> 3. <SEP> Glukose <SEP> 2,0% <SEP> 4. <SEP> Stärke <SEP> 0,5%
<tb> Sojabohnen- <SEP> Stärke <SEP> 3;
0% <SEP> Fleisch- <SEP> Fleischextrakt <SEP> 0,3 <SEP> %
<tb> mehl <SEP> 1,00/0 <SEP> Pepton <SEP> 0,50/a <SEP> extrakt <SEP> 0,60/a <SEP> Hefeextrakt <SEP> 0,5%
<tb> Pepton <SEP> 0,5% <SEP> K2HP04 <SEP> 0,1% <SEP> Pepton <SEP> 1,0% <SEP> Pepton <SEP> 0,50/0
<tb> NaCl <SEP> <B><I>0,5110</I></B> <SEP> mgS04 <SEP> * <SEP> 7 <SEP> H@O <SEP> 0,051/o <SEP> NaCl <SEP> <B>0,61V0</B> <SEP> Glukose <SEP> <B>1,011/0</B>
<tb> CaC0.;
<SEP> 0,3% <SEP> CaCO3 <SEP> <B>0,31)4</B> <SEP> CaCO<B>3</B> <SEP> 0,6% <SEP> NaCI <SEP> <B>0,3%</B> <I>Beispiel 4</I>
EMI0011.0002
<I>Ausgangsmedium</I>
<tb> Stärke <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,0%
<tb> K.,HP04 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,10/0
<tb> M-S04 <SEP> * <SEP> <B>711</B>2<B>0</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> CaC03 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,3 <SEP> %
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 7,0 Kornmaische und Sojabohnenmehl wurden als Stickstoffquelle mit verschiedenen Geschwindigkeiten zum wässrigen Ausgangsmedium zugesetzt, Stamm H-120 von Streptomyces humidus zugegeben und aerob kultiviert.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle er sichtlich:
EMI0011.0007
Stickstoffquelle <SEP> Maximale <SEP> Zeit <SEP> bis <SEP> zum
<tb> Wirkung <SEP> von <SEP> Erreichen <SEP> der <SEP> maximalen
<tb> Kornmaische <SEP> Sojabohnenmehl <SEP> Dihydrostreptomycin <SEP> Wirkung
<tb> % <SEP> o <SEP> mcg/cm3 <SEP> Stunden
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> 468 <SEP> 120
<tb> - <SEP> 3,0 <SEP> 288 <SEP> 144
<tb> 3,0 <SEP> 2,0 <SEP> 499 <SEP> 144
<tb> 1,5 <SEP> 1,0 <SEP> 417 <SEP> 120
<tb> 3,0 <SEP> 0,5 <SEP> 372 <SEP> 144
<tb> 3,0 <SEP> 1,0* <SEP> 968 <SEP> 144
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> wurde <SEP> durch <SEP> Erhitzen <SEP> auf <SEP> 100o <SEP> 1 <SEP> Stunde <SEP> lang <SEP> mit <SEP> dem <SEP> zehnfachen <SEP> Volumen <SEP> an
<tb> 5 ,öiger <SEP> Salzsäure <SEP> hydrolysiert.
<I>Beispiel 5</I>
EMI0011.0008
<I>Ausgangsmedium</I>
<tb> Stärke <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,0%
<tb> K@HP04 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,10/0
<tb> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,0511/o
<tb> CaCO3 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,3%
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0 Stamm H-120 von Streptomyces humidus wurde auf verschiedenen.
wässrigen Medien, welche ausser dem Ausgangsmedium als wesentliche Stickstoff- quellen Kornmaische, Sojabohnenmehl sowie andere organische und anorganische Stickstoffquellen be sassen, aerob kultiviert. In einigen Fällen wurde Soja bohnenmehl weggelassen.
Die Resultate werden in der folgenden Tabelle gezeigt:
EMI0012.0001
Stickstoffquelle <SEP> Maximale <SEP> Zeit <SEP> bis
<tb> Wirkung <SEP> von <SEP> zum <SEP> Erreichen
<tb> Kornmaische <SEP> Sojabohnenmehl <SEP> Andere <SEP> Dihydrostreptomycin <SEP> der <SEP> maximalen
<tb> (HCl-Hydrolysat) <SEP> Wirkung
<tb> Mycel <SEP> von <SEP> 23 <SEP> 572 <SEP> (feucht) <SEP> mcg/cm3 <SEP> Stunden
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> 2,0%, <SEP> 660 <SEP> 144
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> NH4N03 <SEP> 0,10/0 <SEP> 326 <SEP> 120
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> CO(NH2)2 <SEP> 0,10/0 <SEP> 55 <SEP> 96
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> CO(NH2)2 <SEP> 0,1% <SEP> 60 <SEP> 96
<tb> Specköl <SEP> <B>1,01/0</B>
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> (NHIHP04 <SEP> 0,10/0 <SEP> 411 <SEP> 120
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> KN03 <SEP> 0,10/0 <SEP> 600 <SEP> 96
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> NH4C<B>1</B> <SEP> 0,
10/0 <SEP> 327 <SEP> 120
<tb> 3,0 <SEP> 1,0 <SEP> <B>(NH4)2S04</B> <SEP> 0,10/0 <SEP> 396 <SEP> 144
<tb> 3,0 <SEP> - <SEP> Kasein <SEP> <B>1,00/0</B> <SEP> 500 <SEP> 120
<tb> 3,0 <SEP> - <SEP> Kasein:-'-- <SEP> 1,0 <SEP> 0/0 <SEP> 1000 <SEP> 144
<tb> 1,0 <SEP> 1,0 <SEP> Reiskleie <SEP> 2,00/a <SEP> 30 <SEP> 168
<tb> - <SEP> Kasein <SEP> wurde <SEP> 1 <SEP> Stunde <SEP> lang <SEP> bei <SEP> 100a <SEP> C <SEP> mit <SEP> dem <SEP> ungefähr <SEP> zehnfachen <SEP> Volumen <SEP> an <SEP> <B>5111"</B> <SEP> HCl <SEP> hydrolysiert.
<I>Beispiel 6</I>
EMI0012.0002
<I>Ausgangsmedium</I>
<tb> Kornmaische <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,0%
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> (HCl-Hydrolysat) <SEP> . <SEP> 1,0%
<tb> K2HP04 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,10/0
<tb> MgS04 <SEP> * <SEP> 7H20 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0;05 <SEP> %
<tb> <B>CaCO3</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,3%
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0 Stamm Q-97 von:
Streptomyces humidus wurde auf dem wässrigen Ausgangsmedium, in welchem die Kohlenstoffquelle verschiedentlich geändert wurde, aerob kultiviert.
Die Ergebnisse werden in der folgen den Tabelle gezeigt:
EMI0012.0009
Maximale <SEP> Zeit <SEP> bis <SEP> zum
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> Wirksamkeit <SEP> von <SEP> Erreichen <SEP> der <SEP> maximalen
<tb> Dihydrostreptomycin <SEP> Wirksamkeit
<tb> mcg/cm3 <SEP> Stunden
<tb> Dextrin <SEP> 3,0% <SEP> 1127 <SEP> 120
<tb> Stärke <SEP> 1,00/<B>0</B> <SEP> 600 <SEP> 120
<tb> Stärke <SEP> 3,0% <SEP> 844 <SEP> 120
<tb> Glukose <SEP> 1,00/0, <SEP> 592 <SEP> 120
<tb> Glukose <SEP> <B>3,0%,</B> <SEP> 440 <SEP> 120
<tb> Glycerin <SEP> <B>3,0%.</B> <SEP> 1050 <SEP> 144
<tb> Lactose <SEP> 3,0% <SEP> 90 <SEP> 96
<tb> Mannose <SEP> 3,00/0 <SEP> 1368 <SEP> 144
<tb> Maltose <SEP> 3,0%.
<SEP> 90 <SEP> 120
<tb> Galactose <SEP> 3,0% <SEP> 1870 <SEP> 144
<tb> Fructose <SEP> <B>3,0(1/@</B> <SEP> 1390 <SEP> 144
<tb> Saccharose <SEP> 3,0 <SEP> /0 <SEP> 63 <SEP> 144 <I>Beispiel 7</I> Stamm Q-97 von Streptomyces humidus wurde auf verschiedenen wässrigen Medien, in welchen Kornmaische und Sojabohnenmehle die Stickstoff quellen waren und Dextrin die Kohlenstoffquelle war, aerob kultiviert. Es wurde aber die Zusammen setzung der anorganischen Salze verschiedentlich geändert.
Die Resultate werden in der folgenden Ta belle gezeigt:
EMI0013.0010
<I>Ausgangsmedium</I>
<tb> Dextrin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,0%
<tb> Kornmaische <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,011/o
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> (HCl-Hydrolysat) <SEP> . <SEP> 1;
00/0
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0
EMI0013.0011
Anorganische <SEP> Salze <SEP> Maximale <SEP> Zeit <SEP> bis
<tb> Wirksamkeit <SEP> von <SEP> zum <SEP> Erreichen
<tb> K <SEP> IHPO,4 <SEP> <U>M9S04.7H20 <SEP> CaC03</U> <SEP> Dihydrostreptomycin <SEP> der <SEP> maximalen
<tb> Wirksamkeit
<tb> Andere <SEP> mcg/cm3 <SEP> Stunden
<tb> - <SEP> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> - <SEP> 717 <SEP> 120
<tb> 0,1 <SEP> - <SEP> 0,3 <SEP> - <SEP> 675 <SEP> 120
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 0,6 <SEP> - <SEP> 1230 <SEP> 144
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> -'@ <SEP> 700 <SEP> 144
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 1,0 <SEP> - <SEP> 1260 <SEP> 120
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> ZnS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> 0,0010/0 <SEP> 639 <SEP> 144
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> MnS04 <SEP> * <SEP> 7H20 <SEP> 0,
002% <SEP> 555 <SEP> 144
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> FeS04 <SEP> * <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 0,0021/o <SEP> 1165 <SEP> 120
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> Na.s04 <SEP> 0,10/<B>0</B> <SEP> 1099 <SEP> 144
<tb> (wasserfrei)
<tb> 0,1 <SEP> 0,05 <SEP> 0,3 <SEP> CuS04 <SEP> ' <SEP> 5 <SEP> H20 <SEP> 0,0020/0 <SEP> <B>1038</B> <SEP> 120
<tb> Neutralisation <SEP> des <SEP> Hydrolysates <SEP> von <SEP> Sojabohnenmehl <SEP> und <SEP> Einstellung <SEP> des <SEP> pH <SEP> wurde <SEP> mit <SEP> Kaliumhydroxyd <SEP> durchgeführt.
<I>Beispiel 8</I>
EMI0013.0012
<I>Medium</I>
<tb> Dextrin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,0 <SEP> %
<tb> Kornmaische <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,0%
<tb> HCl-Hydrolysate <SEP> des <SEP> Sojabohnen mehls <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0%
<tb> K2HP04 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,10I0
<tb> MgS04 <SEP> * <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,0511/o
<tb> CaCO3 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,3711/9</B>
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 7,0 Die durch Behandlung des Streptomyces humidus auf verschiedene Weise erhaltenen Mutanten wurden im obigen Medium nerob kultiviert. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle gezeigt:
EMI0013.0018
Maximale <SEP> Zeit <SEP> bis <SEP> zum
<tb> Stämme <SEP> Wirksamkeit <SEP> von <SEP> Erreichen <SEP> der <SEP> maximalen
<tb> Dihydrostreptomycin <SEP> Wirksamkeit
<tb> meg/cm3 <SEP> Stunden
<tb> 23 <SEP> 572 <SEP> (Original) <SEP> 660 <SEP> 144
<tb> B <SEP> - <SEP> 9 <SEP> 460 <SEP> 144
<tb> A <SEP> - <SEP> 113 <SEP> 846 <SEP> 120
EMI0014.0001
(Fortsetzung)
<tb> Maximale <SEP> Zeit <SEP> bis <SEP> zum
<tb> Stämme <SEP> Wirkung <SEP> von <SEP> Erreichen <SEP> der <SEP> maximalen
<tb> Dihydrostreptomycin <SEP> Wirksamkeit
<tb> mcg/cm3 <SEP> Stunden
<tb> C <SEP> - <SEP> 46 <SEP> 792 <SEP> 120
<tb> E <SEP> - <SEP> 96 <SEP> 433 <SEP> 144
<tb> H <SEP> - <SEP> 106 <SEP> 1220 <SEP> 144
<tb> K <SEP> - <SEP> 34 <SEP> 1248 <SEP> 144
<tb> UD- <SEP> 1 <SEP> 1308 <SEP> 144
<tb> Q <SEP> - <SEP> 97 <SEP> 1296 <SEP> 144
<tb> VD <SEP> 886 <SEP> 144
<tb> N <SEP> 931 <SEP> 144
<tb> Tu <SEP> 574 <SEP> 120
<tb> <B>VP</B> <SEP> 976 <SEP> 120
<tb> Vu <SEP> 1235 <SEP> 144
<tb> L <SEP> 840 <SEP> 120
<tb> Y <SEP> 966 <SEP> 120
<tb> G <SEP> 374 <SEP> 120
<tb> Q <SEP> 1085 <SEP> 120 <I>Beispiel 9</I>
EMI0014.0002
<I>Medium</I>
<tb> Glukose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,0()/o
<tb> Fleischextrakt <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,6%
<tb> Pepton <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0%
<tb> NaCl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,6-/,</B>
<tb> CaC0, <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>0,611/0</B>
<tb> pH <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7,0 Ein zu Streptomyces humidus gehörender Stamm wurde 96 Stunden lang submers. und aerob in einem Tankkultiviert.
Zu 700 Liter des, Filtrates des Kultur mediums [pH: 8,5, Wirksamkeit: 35 E/cm3 (Ver dünnungseinheit) gegen E. coli] wurden 7 kg (10/0) aktive Kohle zugesetzt und die Mischung 30 Mi nuten lang gerührt, um die aktive Verbindung zu adsorbieren. Die aktive Kohle wurde mit der 10fachen Menge ihres Volumens an methanolischem Chlor wasserstoff 30 Minuten lang bei einem pH von 2,0 eluiert. Es wurden so 140 Liter Eluat mit einer Wirksamkeit von 100 E/cm3 gewonnen.
Die Eluierung wurde noch einmal' wiederholt, wobei 70 Liter Eluat von einer Wirksamkeit von 35 E/cm3 gewonnen wur den. Die vereinigten Eluate wurden mit n NaOH bis zu einem pH von 6,5 fast neutral gestellt und im Vakuum bei niederer Temperatur bis auf etwa 300 cm3 eingeengt. Während dieser Arbeitsweise wurde das abgeschiedene Natriumchlorid entfernt und dann 3 Liter wasserfreies Aceton zur konzentrierten Lösung zugesetzt.
Die niedergeschlagene aktive Ver bindung wurde im Vakuum getrocknet und ergab ein weisses Pulver. Die Ausbeute betrug 147 g oder 6011/o mit einer Wirksamkeit von 100 E/mg. Das erzielte Produkt ist gegenüber .der Maltolreaktion negativ, gegenüber der Sakaguchireaktion aber positiv.
<I>Beispiel 10</I> Reinigung durch Ionenaustauscher a) 500 Liter des Kulturfiltrates [pH 7,7, Wirk samkeit: 350 E/cm3 (Verdünnungseinheit) gegenüber E. Coli], das wie in Beispiel 9 erhalten wurde, wurden durch einen Turm, der mit 30 Liter Amberlite IRC-50 (H-Typ, eingetragene Marke) gefüllt war, mit einer Geschwindigkeit von 1,8 Liter pro Minute laufen gelassen.
Die Wirksamkeit des Effluens war gegenüber E. coli geringer als 10 E/cm3. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen, mit 0,5 n HCl eluiert und 36 Liter des gefärbten Eluates mit einer Wirk samkeit von 3500 E/cms gegenüber E. coli gesam- melt. Das Eluat wurde mit n NaOH auf ein pH von 6,5 eingestellt und bei niederen Temperaturen unter gelegentlicher Entfernung des abgeschiedenen Na triumchlorides auf 1 Liter eingeengt.
Die Wirksam- keit war 160000 E/cm3, die Ausbeute betrug 91,5 %-.
b) Zu 748 Liter des nach Beispiel 9 erhaltenen Filtrates der Züchtung (Gehalt an Dihydrostrepto- mycin ungefähr 2,200 meg/cm3) wurden 4,1 kg Oxal- säure zugesetzt und der erhaltene Niederschlag durch einen De-Laval-Separator abgeschieden. Das pH wurde mit einer Natriumhydroxydlösung auf ungefähr 7,0 ein gestellt und der dabei erhaltene Niederschlag wurde ebenfalls abgetrennt.
Die Lösung wurde durch einen Turm, der mit 6,3 Liter Amberlite IRC-50 (Na-Typ) gefüllt war, mit einer Geschwindigkeit von 40 Liter/ Stunde durchgelassen, worauf das Effluens nur eine Wirksamkeit von 12-6 meg/cm3 zeigte. Das Herz wurde mit Wasser gewaschen und in aktive Verbin dung eluiert, indem man 4 /oige Salzsäure mit einer Geschwindigkeit von 3 Liter/Stunde durchschickte.
20 Liter des so erhaltenen Eluates wurden durch Zusatz von Amberlite IR-45 (OH-Typ) oder Amberlite IRA-400 (OH-Typ) neutralisiert und auf 2,5 Liter unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur eingeengt. Die Wirksamkeit betrug <B>368000</B> meg/cm3.
<I>Beispiel 11</I> Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel zu 1 Liter des nach Beispiel<B>10'</B> b) erhaltenen Filtrates der Züchtung mit einer Wirksamkeit von 1001 meg/em3 gegenüber B. subtilis wurden 400 cm3 n-Butylalkohol oder Isoamylalkohol, welcher 3 1/o Laurinsäure enthielt, zugesetzt, die wässerige Schicht wurde auf ein pH von 7,5 eingestellt und die Mi schung 20 Minuten lang geschüttelt.
Nach Abtren nung der Butylal:kohol- oder der Isoamylalkohol- Schicht wurde die gleiche Extraktion noch einmal vorgenommen. Die vereinigten Butylalkohol- oder Isoamylalkohol-Lösungen wurden mit verdünnter Schwefelsäure in Wasser derartig geschüttelt, dass die resultierende wässrige Schicht 120 cm3 betrug und deren pH 2,0 war. Nach Wiederholung der glei chen Extraktion wurden die vereinigten Extrakte mit Äther geschüttelt, um die darin enthaltene Laurin- säure zu entfernen.
Die Wirksamkeit der so erhaltenen Lösung von 25 cm3 war gegenüber B. subtilis 2891 mcg/cm3, die Ausbeute betrug 72,5 %. <I>Beispiel 12</I> Chromatographie auf aktiver Kohle. 1 Liter einer nach Beispiel 10 cz) erhaltenen Lösung mit einer Wirksamkeit von 160000 E/cm3 (Verdünnungsem- heften) gegen E.
coli wurde mit n HCl auf ein. pH von 3,5 eingestellt und durch einen 8 cm breiten und 50 cm hohen Turm geschickt, der mit 50<B>0</B> g aktiver, mit Wasser vom pH 3,5 imprägnierter Kohle beschickt war. Das Effluens wurde in Teile von 300, cm3 geteilt. Der Turm wurde mit destilliertem Wasser behandelt, das mit Salzsäure auf ein pH von 3,5 eingestellt war. Die Fraktionen 1-11 enthielten Natriumchlorid und Verunreinigungen, während die anderen die aktive Verbindung enthielten, wie unten gezeigt wird.
Die Fraktionen 13-21 wurden vereinigt, durch Zusatz von Amberlite IRA-400 (OH-Typ) auf ein pH von 6,5 eingestellt und unter vermindertem Druck bei niederer Temperatur :eingeengt. Zu der konzen trierten Lösung wurde die zehnfache Menge ihres Volumens wasserfreien Acetons zugesetzt, der ent standene Niederschlag durch Dekantieren von der Flüssigkeit getrennt und getrocknet. Es wurden 101 g des Hydrochlorides als eine farblose amorphe Sub stanz gewonnen.
Dies entspricht 783,3 mcg/mg an Dihydrostreptomycin. Zu einer Lösung von 10 g dieses Produktes in 50 cm3 Wasser wurde :eine Lö sung von 6 g M9S04. 7H20 in 7 cm3 Wasser gege ben. Die Mischung wurde mit verdünnter Schwefel säure auf ein pH von 6,0 gestellt, filtriert, tropfen weise unter Rühren mit Methanol versetzt, bis sich die Lösung trübte, und die Temperatur der Mischung bei 50-55 C gehalten.
Zur trüben Lösung wurden einige Kristalle von Dihydrostreptomycinsulfat gege ben und die Lösung bei 50-55 C stehengelassen, worauf die Lösung in kurzer Zeit (etwa 5 Minuten) Kristalle abschied und gleichzeitig klar wurde. Es wurde weiterhin Methanol zugesetzt, bis die Lösung wieder schwach trübe wurde, und die Mischung wie oben stehengelassen. Das Verfahren wurde in, dieser Weise fortgesetzt, bis die Menge des Methanols 100 cm3 erreichte und die Lösung klar wurde.
Dann wurde die Temperatur der Lösung auf Raumtempe ratur herabgesetzt, die Kristalle abfiltriert und diese 5 Minuten lang in 50 %igem Methanol gerührt. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit Methanol gewaschen und bei 50 C unter vermindertem Druck getrocknet.
Die Ausbeute betrug 8,9 g (738 mcg/mg als Dihydro- streptomycin). Mehrere Umkristallisationen .erhöhten die Wirksamkeit auf ungefähr 780 mcg/mg als Di- hydrostreptomycin. Es wurde bei dem obigen Prozess gefunden, dass M9S04 :die Wirkung besitzt, im Mate rial befindliche, dem Histamin ähnliche Substanzen zu zerstören.
<I>Beispiel 13</I> 5 cm3 des in Beispiel 10 b) erhaltenen Konzen trates der aktiven Verbindung (Wirksamkeit 368000 mcg/cm3) wurden mit Wasser bis .auf 50 cm3 ver dünnt und eine warme gesättigte Lösung von Methylorange zugesetzt, bis kein Niederschlag mehr gebildet wurde. Nach Kühlen wurde :der Niederschlag abfiltriert und wiederholt aus wässrigem Methanol umkristallisiert, worauf 2,1 g des Helianthates der aktiven Verbindung gewonnen wurden.
Eine Suspen sion des Helianthates in einer kleinen Menge Wasser wurde mit verdünnter Schwefelsäure auf ein pH von 2,0 :eingestellt, worauf sich die aktive Verbindung unter Bildung des Sulfates löste. Die Lösung wurde filtriert, um das ausgeschiedene Methylorange zu ent fernen, und mit einer kleinen Menge Aktivkohle be handelt. Zu der :erhaltenen farblosen Lösung wurde das Zehnfache ihres Volumens an wasserfreiem Aceton zugesetzt, worauf sich 0,6 g des Sulfates der aktiven Verbindung abschieden.