Procédé de préparation d'un vaccin antipoliomyélitique
La présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'un vaccin antipoliomyélitique à partir de virus vivant de la poliomyélite.
Jusqu'ici, on a préparé les vaccins à base de virus de poliomyélite, en procédant à l'inactivation des virus de poliomyélite par traitement à l'aide soit de formaldéhyde, soit de lumière ultraviolette. Ce traitement a pour but de rendre le virus non infectieux en le tuant mais sans détruire en même temps de manière sensible sa propriété antigène inhérente, c'est-à-dire, la propriété que possède le virus de provoquer la production d'anticorps lorsqu'on l'introduit dans le sang ou dans le tissu de l'homme ou d'autres mammifères.
L'une des difficultés que l'on rencontre avec le procédé connu qui consiste à tuer les virus de poliomyélite par la formaldéhyde, réside dans le fait qu'il existe une gamme de sécurité relativement étroite entre la concentration de formaldéhyde nécessaire pour tuer le virus et la concentration qui détruit la propriété antigène dudit virus.
Il a également été signalé que le traitement par la formaldéhyde donne des résultats variables et dans certains cas, tue le virus de manière incomplète. De manière analogue, le procédé utilisant seulement l'inactivation à la lumière ultraviolette donne des résultats variables du fait qu'ou bien il ne tue pas de manière satisfaisante tout le virus, ou bien il a tendance à détruire la propriété antigène du virus.
Ainsi, si l'on emploie l'irradiation dans la mesure requise pour tuer complètement le virus, le pouvoir antigène est à peu près complètement détruit.
Le procédé selon Invention vise à remédier aux inconvénients précités. Il est caractérisé en ce que l'on n soumet un milieu aqueux contenant du virus de poliomyélite vivant à un traitement d'atténuation comprenant une phase de traitement par rayonnement ultraviolet et une phase de traitement par la chaleur et la formaldéhyde, ce dernier réactif réagissant chimiquement sur la portion protéinique du virus en amenant la formation de ponts méthylène et/ou de groupes hydroxyméthyle,
ledit traitement étant exécuté dans des conditions telles que la première phase de traitement soit suffisamment efficace pour tuer une forte proportion mais non la totalité du virus de poliomyélite vivant qui se trouve dans le milieu aqueux initial et que la ou les phases suivantes soient suffisamment efficaces pour tuer tout le virus de poliomyélite vivant qui reste dans le milieu, aucune desdites phases de traitement, appliquée individuellement au milieu aqueux initial, n'étant à elle seuls suffisamment efficace pour tuer tout le virus de poliomyélite vivant présent dans ledit milieu. Le vaccin obtenu par ce procédé est non seulement exempt de virus de poliomyélite vivant mais possède également un degré de pouvoir antigène supérieur à ceux des vaccins obtenus par des procédés connus.
I1 présente en outre l'avantage supplémentaire que le virus de poliomyélite tué présent ne montre aucune tendance à redevenir actif lors du stockage.
L'ordre des phases du traitement d'atténuation n'est pas critique. Par exemple, on peut tout d'abord soumettre le milieu aqueux contenant le virus de poliomyélite vivant à l'action de la formaldéhyde et de la chaleur et avoir recours ensuite au rayonnement ultraviolet, l'irradiation étant éventuellement suivie d'un traitement par la chaleur seule. On peut au contraire soumettre tout d'abord le milieu à l'action du rayonnement ultraviolet et avoir recours ensuite à l'action de la chaleur et de la formaldéhyde.
On peut appliquer le procédé selon la présente invention d'une manière générale aux virus de poliomyélite isolés ou en combinaisons. Les virus de poliomyélite les plus couramment utilisés sont ceux des types 1, 2 et 3 et, en général, on traite séparément chaque type de virus et on combine ensuite en un seul les vaccins ainsi préparés.
Le milieu aqueux contenant le virus vivant de poliomyélite, auquel on a recours comme matière première, est aordinaire un extrait aqueux d'une suspension de tissu sur lequel le virus de la poliomyélite a été ensemencé. Comme exemple d'un tel milieu, on peut citer celui qu'on obtient par filtration d'une culture de virus de poliomyélite sur du tissu de rein de singe, comme cela est décrit par Dulbecco et al dans le Journal of Experimental Medicine , volume 99, page 1o7 (1954). Selon ces auteurs, on procède à la trypsinisation de tissus de reins de singe macérés en vue d'éliminer le tissu étranger, on laisse les cellules résiduelles se multiplier, on inocule le milieu avec du virus de poliomyélite, on fait incuber le milieu et on recueille le fluide.
On peut omettre l'opération de trypsinisation si on le désire. Dans ce dernier cas, toutefois, la teneur du vaccin en protéines peut être excessivement forte et il faut la vérifier avant usage afin d'éviter la production de vaccins susceptibles de déterminer des réactions protéiniques. Dans la préparation de vaccins mixtes, c'est-à-dire de vaccins contenant plus d'un type de virus de poliomyélite, on peut mélanger les fluides recueillis contenant les différents types avant de mettre en oeuvre le procédé selon la présente invention mais, comme indiqué cidessus, il est généralement préférable de mélanger les vaccins obtenus individuellement.
De préférence, le titre d'infectiosité du milieu aqueux est d'un ordre élevé, c'est-à-dire d'au moins 10-5. Dans des conditions normales de stockage, on conserve le milieu aqueux sous réfrigération, par exemple à une température variant entre 5o et 100 C. En général, on prépare le milieu aqueux contenant le virus de poliomyélite vivant dans des conditions aseptiques et ledit milieu est stérile du point de vue bactériologique.
Toutefois, dans la pratique générale, on assure la stérilité bactérienne en soumettant le milieu à une filtration bactérienne avant de l'utiliser dans la mise en ouvre du présent procédé. En outre, on peut procéder à la concentration et (ou) à la purification partielle du virus vivant et on peut employer ces suspensions ou solutions comme matières premières.
L'irradiation par la lumière ultraviolette peut être réalisée en exposant une pellicule ou un courant peu épais du milieu aqueux contenant du virus de poliomyélite à de la lumière ultraviolette dont la longueur d'onde varie entre 2000 et 3000 angströms et possédant une intensité suffisamment forte pour réduire le titre d'infectiosité à une valeur extrêmement basse en un court espace de temps. Afin de garantir les résultats désirés, l'épaisseur moyenne de la pellicule ou du courant que l'on expose est, en général, non supérieure à 100 microns et de préférence inférieure ou égale à 50 microns. On peut utiliser une épaisseur un peu supérieure à 100 microns mais dans ce cas on a besoin de durées d'exposition plus importantes et la perte du pouvoir antigène qui en résulte est également plus importante.
La source de lumière ultraviolette utilisée émet une forte proportion, de préférence atteignant 95 o, d'énergie sur une longueur d'onde de 2537 angstroms. Les sources de lumière émettant une proportion d'énergie un peu plus faible sur cette longueur d'onde désirée sont satisfaisantes mais moins efficaces. Les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant une source uniforme de lumière émettant 95 /o d'énergie sur une longueur d'onde de 2537 angströms et possédant une puissance totale comprise entre 10 et 25 watts. I1 convient d'utiliser la source de lumière à une distance d'environ un centimètre de la surface du milieu aqueux qui doit être exposé.
En termes d'intensité de rayonnement pour des spécifications ordinaires, la source de lumière est telle qu'elle fournisse environ 12 500 à 32 000 micro-watts par centimètre carré de surface de contact de pellicule soumise à l'exposition. Lorsqu'on a recours à un milieu aqueux de virus ayant un titre d'infectiosité compris entre 10-5 et 10-s comme matière première et que l'on a recours aux conditions d'irradiation indiquées, une proportion extrêmement forte d'organismes vivants est tuée en l'espace de quelques secondes d'exposition. On peut faire varier considérablement la durée d'exposition, mais en général, il est avantageux de réduire au minimum la durée d'exposition afin d'éviter toute destruction excessive du pouvoir antigène inhérent du virus.
On préfère que la durée d'exposition soit inférieure à 10 secondes et pour l'obtention des meilleurs résultats qu'elle soit d'environ 0,5 à 2 secondes. Par exemple, lorsqu'on utilise de la lumière ultraviolette ayant une longueur d'onde de 2537 angströms et ayant une intensité d'environ 25 000 micro-watts par centimètre carré, le fait d'exposer le milieu de virus vivant sous la forme d'une pellicule ayant une épaisseur moyenne de 50 microns pendant une seconde réduit le titre d'infectiosité de 10-7 jusqu'à environ 10-t. D'ordinaire, les conditions d'exposition sont telles qu'elles réduisent le titre d'infectiosité jusqu'à une valeur variant dans la gamme comprise entre 10-0 et 10-25.
Un appareil que l'on préfère pour la mise en oeuvre de la présente invention est un appareil réalisant la mise sous forme de pellicule par centrifugation, du type décrit dans le brevet des
Etats-Unis d'Amérique No 2725482. Un autre appareil convenable est celui décrit dans le brevet des
Etats-Unis d'Amérique N" 2588716.
La température du milieu aqueux pendant l'irradiation n'est pas critique. A moins que l'on n'applique de la chaleur extérieure, le milieu est ordinairement à la température ambiante ou à une température inférieure. Toutefois, on obtient les meilleurs résultats lorsque l'irradiation est effectuée sur des milieux aqueux ayant une température comprise entre environ 30 et 420 C, et de préférence entre 35 et 400 C, et il en découle qu'il est préférable d'effectuer la phase d'irradiation du procédé après avoir chauffé le milieu à la température susmentionnée.
Lorsqu'on procède à un traitement final par la chaleur, on chauffe le milieu aqueux à une température comprise entre 300 et 500 C pendant environ deux à vingt jours; la gamme de températures de traitement préférée va d'environ 35O à 400 C et la durée de traitement préférée est comprise entre trois et dix jours. Afin d'obtenir l'action destructrice maximum, il est avantageux de mettre le milieu aqueux à chauffer rapidement, c'est-à-dire moins de deux à trois heures après le traitement précédent.
Le traitement par la chaleur et par la formaldéhyde peut être effectué en ajoutant de la formaldéhyde dans le milieu aqueux sous une concentration comprise entre environ '/-uoo et'/looo et de préférence dans la gamme comprise entre 1 : 3000 et 1 : 5000 et en chauffant le mélange ainsi obtenu à une température comprise entre 30 et 420 C. La température de chauffage préférée est comprise entre 35 et 400 C et la durée de chauffage préférée est comprise entre deux et six jours. Lorsqu'on applique cette phase du procédé au milieu aqueux initial, on réduit le titre d'infectiosité à une valeur qui est de l'ordre de 10-1 ou inférieure.
La présence de quantités non toxiques de formaldéhyde est désirable dans le produit final, en vue de mettre obstacle aux réactions éventuelles nuisibles de décomposition enzymatique et en vue d'empêcher la formation de levures, de moisissures, de bactéries, etc. On ajoute de préférence la formaldéhyde dans le milieu sous la forme d'une solution aqueuse stérile, à froid et tout en agitant vigoureusement.
On a constaté que l'on obtient les meilleurs résultats si l'on soumet le milieu aqueux initial contenant le virus vivant de poliomyélite soit à une filtration bactérienne, c'est-à-dire à une filtration sur filtre de
Seitz ou sur du verre fritté ultra-fin, soit à un traitement de chauffage préalable juste avant d'effectuer la première phase du traitement d'atténuation. Si l'on a recours à un traitement de chauffage préalable, la température préférée est comprise entre 48 et 520 C et on effectue le chauffage pendant une période allant de cinq minutes jusqu'à plusieurs heures. On peut aussi utiliser une telle filtration bactérienne et (ou) un tel traitement de chauffage entre différentes phases du procédé.
Si on le désire, on peut incorporer dans les vaccins obtenus grâce au présent procédé des agents microbicides et (ou) des agents stabilisants. Par exemple, on peut ajouter dans les vaccins obtenus du chlorure de benzéthonium sous une concentration d'environ 1 : 20 000 à 1 : 50 000 et de préférence 1 : 40 000.
Les vaccins obtenus par le présent procédé ne contiennent pas de virus de poliomyélite vivant. Ils sont d'ordinaire également stériles sous tous les autres rapports, c'est-à-dire qu'ils ne contiennent pas de bactéries, de levures ni de moisissures vivantes, et peuvent être administrés par injection sous-cutanée, intradermique ou intramusculaire. On peut utiliser ces vaccins pour préparer d'autres vaccins à base de virus de poliomyélite, tels que des vaccins de virus précipités par l'alun ou par le phosphate d'aluminium. Si on le désire, on peut administrer les produits sans les diluer, mais dans la plupart des cas, il est préférable de les diluer avec un milieu aqueux stérile en proportion de un à quatre volumes. Des exemples de diluants convenables sont la solution stérile de
Hank's, de l'eau salée stérile et l'eau distillée stérile.
Exemple 1 :
On prépare soixante litres d'un milieu aqueux contenant des virus vivants de poliomyélite des types 1, 2 et 3, et possédant un titre d'infectiosité de O-Gn0 en procédant comme suit:
On prépare des cellules pour la oulture de virus de poliomyélite par la méthode de Dulbecco, Journal of Experimental Medicine , NO 99, page 167 (1954). D'une manière résumée, cela consiste dans la préparation en premier lieu d'une suspension de cellules épithéilales de reins de singe (voir Dulbecco
Ploc. Nat. Acad. Sci. 38, page 747 (1952), en traitant des tissus macérés de rein de singe, provenant de singes Rhésus ou Cynomoigus en bonne santé par de la trypsine en vue d'éliminer les matières étrangères et de libérer les cellules individuelles.
On laisse ces cellules se mutiplier sur une surface de verre convenable dans l'un quelconque d'un certain nombre de milieux de culture pour tissus. On inocule ensuite la couche de cellules de rein ainsi obtenue avec une culture d'ensemencement de virus de poliomyélite du type 1 (souche Mahoney) et on soumet le mélange à incubation à 36-370 C jusqu'à ce que la destruction des cellules soit complète et que des quantités importantes de nouveau virus aient été libérées: on recueille le fluide contenant le virus et on le fait passer à travers une bougie de verre fritté ultra-fine.
On détermine la teneur en virus et on vérifie la stérilité bactérienne et la pureté de souche du filtrat contenant le virus vivant de poliomyélite du type 1. De la même manière, on prépare un filtratcontenant le virus du type 2 (souche MEF-1) et un filtrat contenant le virus du type 3 (souche
Saukett) et on combine les trois filtrats.
On fait passer une partie aliquote des filtrats combinés contenant les virus de poliomyélite des types 1, 2 et 3 dans un appareil de mise sous forme de pellicule par centrifugation suivant un débit de 600 cm5 par minute, en les exposant à un rayonnement ultraviolet d'une puissance de 20 watts.
L'appareil de mise sous forme de pellicules employé, du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique
No 2725482 précité et fabriqué par le Research
Laboratory Division of General Motors Corporation,
Detroit, Michigan comprend une chambre en forme de godet cylindrique, susceptible de tourner autour de son axe et disposée verticalement, un dispositif pour faire tourner cette chambre à la vitesse normale de fonctionnement, à savoir 1700 tours par minute, et un assemblage tubulaire disposé axialement à l'intérieur de la chambre et formé de six lampes ultra violettes régulièrement réparties, Le diamètre intérieur du pourtour de la chambre au sommet est approximativement de 9,5 cm et la paroi intérieure de la chambre présente à partir du sommet un angle vers l'intérieur de 40 par rapport à la verticale.
La hauteur de la paroi intérieure de la chambre est approximativement de 40 cm. La surface extérieure de l'assemblage de lampes est placée à une distance de 1 cm de la paroi intérieure de la chambre et l'intensité utile du rayonnement ultraviolet au niveau de la surface intérieure de la chambre est approximativement de 25 000 microwatts par cm2. L'épaisseur moyenne de la pellicule du milieu exposé au rayonnement est approximativement de 75 microns et la durée totale d'exposition au rayonnement est d'une seconde. Le titre d'infectiosité du milieu après exposition au rayonnement est de 10-t84. On mélange ce milieu avec une solution aqueuse stérile de formaldéhyde de manière à obtenir une concentration en formaldéhyde de 1: 4000, puis on le soumet à une incubation à 370 C pendant trois jours.
On chauffe une autre partie aliquote des filtrats combinés à 520 C pendant environ une heure, on la refroidit à une température comprise entre environ 37 et 400 C, on l'irradie de façon semblable, puis on la mélange avec une solution aqueuse stérile de formaldéhyde de manière à obtenir une concentration de formaldéhyde de 1 : 4000 et on la soumet à une incubation à 370 C pendant trois jours.
On détermine de la manière suivante le pouvoir antigène des produits obtenus comme il est indiqué ci-dessus: on inocule à des cobayes trois doses de 0,5 cm3 de vaccin à des intervalles d'une semaine par voie intradermique, on saigne les animaux une semaine après la fin du cycle d'inoculation, on prépare un sérum à partir du sang recueilli et on détermine le nombre d'anticorps qui se trouvent dans le sérum. On effectue cette détermination en diluant le serum avec de l'eau salée et en mélangeant les parties aliquotes diluées ainsi obtenues avec une solution normalisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses de virus de poliomyélite du type donné.
Par exemple, quand on effectue la détermination de l'activité du type 1 on fait usage d'une solution normalisée contenant un nombre connu d'unités infectieuses de virus de poliomyélite du type 1; quand on procède à la détermination de l'activité du type 2 et du type 3, on fait usage d'une solution normalisée d'unités infectieuses de virus du type 2 et du type 3.
Le point final de la titration est la dilution pour laquelle le sérum contient assez d'anticorps pour neutraliser exactement le nombre connu d'unités infectieuses de virus contenus dans la solution, c'est-à-dire pour se combiner avec ces unités et les rendre non infectieuses. On fait usage d'un certain nombre de cobayes dans la détermination de l'activité de chaque type de virus poliomyélite. On met les résultats ainsi obtenus sous une forme permettant une comparaison commode et une évaluation statistique en prenant le logarithme de base 2 de la dilution au point final pour le sérum de chaque cobaye, en faisant la moyenne de ces logarithmes et en prenant ensuite l'antilogarithme de la moyenne ainsi obtenue. Cet antilogarithme est appelé le titre géométrique moyen des vaccins et naturellement il est différent pour chaque type de virus présent dans le vaccin.
Puisque le titre géométrique moyen dépend de l'activité de la solution normalisée de virus infectieux de poliomyélite appliquée dans l'essai, il est nécessaire de spécifier le nombre d'unités infectieuses du virus de poliomyélite présent dans la solution normalisée pour faire apparaître la signification propre du titre géométrique moyen. La méthode de calcul du titre géométrique moyen est exposée en détail dans l'amendement No 2 aux spécifications minimums pour vaccin antipoliomyélitique, publié le 20 mai 1954 par le Département de la Santé, de l'Education et de la Prévoyance sociale du gouvernement des Etats-Unis d'Amérique.
Les résultats de la détermination du pouvoir antigène sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Nombre d'unités
Nombre de cochons Titre géométrique infectieuses de
Echantillons soumis à l'essai Type de virus d'Inde utilisés moyen virus neutralisées *
Vaccin préparé par irradiation et
traitement par la formaldéhyde et
la chaleur 1 3 40 101.15
2 3 158 lor. 44
3 3 22 l0X.
Vaccin préparé par chauffage préala
ble, irradiation et traitement par
la formaldéhyde et la chaleur 1 4 62 101-5
2 4 168 101444
3 4 16 lotis
Matière première non traitée 1 2 30 101.15
2 2 89 101.44 3 3 2 14 101.15
puissance des solutions standardisées utilisées dans les essais.
Exemple 2:
On filtre à travers un filtre ultra-fin en verre fritté pour bactéries 30 litres d'un milieu aqueux contenant du virus vivant de poliomyélite du type 1 (titre d'infectiosité 10-67) préparé comme décrit dans l'exemple 1. On ajoute à la solution froide, et tout en agitant, suffisamment de formaline pour obtenir une concentration en formaldéhyde de 1 : 4000 et on soumet le mélange à une incubation à 370 C pendant quatre jours.
On soumet la suspension ainsi obtenue, qui présente un titre d'infectiosité inférieur à 10-1, à une centrifugation dans une centrifugeuse du type conique ( De Laval Clarifier ) suivant un débit de 600 cm3 par minute et on expose le produit limpide qui sort de la centrifugeuse à la lumière ultraviolette en ayant recours à l'appareil de mise sous forme de pellicule par centrifugation du type décrit dans l'exemple 1. Le débit appliqué est de 600 cm3 par minute avec une énergie ultraviolette incidente de 16-18 watts. L'épaisseur de la pellicule pendant l'exposition est approximativement égale à 50 microns et la durée d'exposition est légèrement inférieure à une seconde. I1 y a approximativement 21 000 micro-watts d'énergie ultraviolette incidente par centimètre carré de pellicule.
Si l'on a recours à un débit de 150 ou de 300 cm3 par minute, il faut réduire l'énergie de manière correspondante. On filtre de nouveau la solution de virus ainsi obtenue à travers un filtre ultra-fin en verre fritté pour bactéries et on soumet un échantillon aux essais normalisés de sécurité. A ce stade, le vaccin ne contient pas de virus vivant, comme l'indique un résultat négatif obtenu dans l'essai de sécurité. Toutefois, on fait alors incuber la suspension filtrée à 37o C pendant trois jours et on soumet un autre échantillon aux essais de sécurité.
Les essais effectués sur cet échantillon montrent également l'absence totale de virus vivant,
On prépare 30 litres d'un milieu aqueux contenant du virus de poliomyélite de type 2 (ayant un titre d'infectiosité de 10-7ç7) comme dans l'exemple 1 et on les soumet au même traitement que celui décrit ci-contre.
On prépare 30 litres d'un milieu aqueux contenant du virus vivant de poliomyélite du type 3 (ayant un titre d'infectiosité de 10-65) comme décrit dans l'exemple 1 et on le soumet au même traitement que celui décrit ci-dessus, sauf qu'on applique pendant l'irradiation un débit de 600 cm3 par minute, en même temps qu'une énergie incidente de 14 à 16 watts.
On mélange les trois suspensions de vaccins ainsi préparées et on les dilue avec trois volumes d'une solution stérile de Hank. On soumet le vaccin obtenu, contenant les virus tués Nos 1, 2 et 3 de la poliomyélite, aux esssais de sécurité avant et après la dilution.
Dans les deux cas, ces essais indiquent l'absence totale de virus vivant. On ajoute du chlorure de benzéthonium, sous la forme d'une solution aqueuse froide, tout en agitant, en quantité suffisante pour amener la concentration finale à 1:40 000 et on essaie la puissance du vaccin obtenu par rapport à chaque type de virus sur des singes, en appliquant l'essai standard de l'institut National de la Santé des
Etats-Unis d'Amérique (NIH), lequel comporte la comparaison avec l'essai aux sérums témoins normalisés 2A. Les résultats de cet essai sont consignés dans le tableau ci-dessous.
Tableau 2
* Facteur de puissance pour le singe
Nombre de singes (comparaison aux sérums témoins
Echantillon soumis à l'essai Type de virus utilisés normalisés 2A du NIH )
Vaccin obtenu par irradiation et par
traitement par la formaldéhyde et
la chaleur 1 12 1,0
2 12 2,0
3 12 2,4
* Le facteur de puissance pour le singe est calculé dans chaque cas en divisant le titre géométrique moyen des sérums de singes soumis à l'essai pour un type de virus particulier par le titre géométrique moyen des sérums témoins 2A du NIH ou National Institute of Health des Etats-Unis d'Amérique, en ce qui concerne le même type de virus.
Les facteurs minima de puissance acceptables pour le singe pour les différents types de virus de poliomyélite sont: Type 1 0,29 - Type 2: 0,25 et Type 3 : 0,16 (pour plus de détails consulter les spécifications minima du NIH du 1 1 novembre 1955).
Une fois les essais de puissance et de sécurité achevés, on verse le vaccin préparé ci-dessus dans des fioles en opérant dans des conditions stériles et on ferme hermétiquement les fioles. On choisit au hasard un certain nombre de fioles préparées de cette manière et on soumet leur contenu à l'essai de sécurité. Cet essai de sécurité indique l'absence totale de virus vivant de poliomyélite. Le vaccin ainsi obtenu est apte à être appliqué pour l'immunisation des êtres humains contre l'infection par les types 1, 2 et 3 de virus vivants de poliomyélite. Si on le désire, on peut également avoir recours au vaccin obtenu pour produire d'autres vaccins, par exemple des vaccins de poliomyélite précipités par de l'alun ou du phosphate d'aluminium.
Exemple 3:
On filtre à travers un filtre ultra-fin en verre fritté pour bactéries 30 litres d'un milieu aqueux contenant du virus vivant de poliomyélite du type 1 et présentant un titre d'infectiosité de 10-6, 7 que l'on a préparé comme il a été décrit dans l'exemple 1.
On ajoute à la solution froide et tout en agitant suffisamment de formaline pour obtenir une concentration en formaldéhyde de 1 : 4000 et on fait incuber le mélange à 37O C pendant quatre jours. On soumet la solution ainsi obtenue, qui présente un titre d'infectiosité de 10-1, à une centrifugation dans une centrifugeuse du type conique De Lavai Clarifier suivant un débit de 600 cm5 par minute et on expose le produit limpide qui sort de la centrifugeuse à la lumière ultraviolette en ayant recours à un appareil de mise sous forme de pellicule par centrifugation analogue à celui décrit dans l'exemple 1. La source de lumière ultraviolette a une énergie incidente de 20 watts et on a recours à un débit de 600 cm3 par minute.
L'épaisseur de la pellicule pendant l'exposition est approximativement de 50 microns et la durée d'exposition est légèrement inférieure à 1 seconde. La puissance en microwatts de l'énergie ultraviolette incidente est approximativement de 21 000 microwatts par centimètre carré de pellicule. On soumet 600 cm3 du vaccin ainsi obtenu aux essais normalisés de sécurité et on constate qu'il ne contient aucun virus vivant de poliomyélite.
On prépare comme on l'a décrit dans l'exemple 1 30 litres d'un milieu aqueux contenant du virus vivant de poliomyélfte du type 2, et on le traite comme décrit ci-dessus. Les essais de sécurité portant sur les vaccins ainsi obtenus démontrent qu'il ne contient pas de virus de poliomyélite vivant.
On prépare comme on l'a décrit dans l'exemple 1 30 litres d'un milieu aqueux contenant du virus vivant de poliomyélite du type 3 et on le traite comme décrit ci-dessus. Des essais de sécurité portant sur le vaccin obtenu démontrent qu'il ne contient pas de virus vivant de poliomyélite.
On mélange les trois vaccins préparés comme décrit ci-dessus et après avoir séparé un échantillon de 900 cm5 destiné à l'essai de sécurité, on dilue le mélange avec trois volumes de solution stérile de