Verfahren zur Herstellung von Prednisolon Die vorliegende Erfindung betrifft .ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Prednisolon (dl-Cortisol) durch fermentative Dehydnlerung von Cortisol (Hydrocortison) mit Corynebaeterium sim pler (wobei gegebenenfalls auch natürliche und künstliche Mutanden verwendet werden), das da- durch gekennzeichnet ist,
dass man unter aeroben Bedingungen und in Abwesenheit von organischen Lösungsmitteln fermentiert und dass man das Cortisol in festem Zustand zusetzt.
Prednisolon (hiernach als d-CL bezeichnet) besitzt eine anticollagenische Wirkung, welche die jenige von Cortison oder CL um -ein Mehrfaches übertrifft, und ist zur Zeit ein wichtiges, Arzneimittel. Es ist bekannt, dass d-CL erhalten werden kann durch fermentative Dehydrogenierung von CL mit einer Kultur von :
gewissen Mikroorganismen, wie Bacillus sphaericus, Corynebacterium simpler oder Didymella lycopersici [siehe Experientia, <B>11,</B> 465 (1955)].
Dieser Prozess wird jedoch durch die allge- meinen Eigenschaften dies Mikroorganismen und der Steroide in ungünstiger Weise beeinflusst. Die ersteren entwickeln :
sich nämlich am besten .in einem wässe rigen Medium, während die letzteren im albgemeinen in Wasser unlöslich und in organischen Lösungs mitteln löslich sind.
So führt man die Fermentierunig von CL im allgemeinen unter Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels aus, beispiels weise eines niedrigen aliphatischen Alkohols oder Ketons, welcheis jedoch im allgemeinen für Mikro organismen giftig ist.
Im weiteren wird der Zusatz des Steroids zur Fermentie.rungsbrühe begrenzt durch die Konzentration .dies verwendeten organischen Lö- sungsmittels. Bei der Fermenti.erung von CL nach der bisherigen Methode beträgt praktisch die maxi- male Konzentration
der genannten Substanz etwa 0,1 Oh, das heisst 1 g Steroid auf 1 Liter Fermen- tierungsbrühe. Deshalib müssen in einem solchen Fall die Fermentierungst.anks, Extraktionsapparate, Des!tü= Tierapparate und andern Apparate für die ind;
'ustrielle Herstellung notwendigerweise grosse Dimensionen aufweisen, und ausserdem ist die Gewinnung von d-CL, weiches in der Fermentierungsbrühe in solch geringer Konzentration vorliegt, ziemlich schwierig. Schliesslich wird, nebst diesen Nachteilen,
eine be trächtliche Menge des als Rohmaterial verwendeten CL bei Verwendung igewisser Mikroorganismen über oxydiert. Das Extrahieren und Isolieren des ge- wünschten d-CL aus- der Fermentierungsbrühe ist sehr mühsam, da, wie gesagt, grosse Mengen Fermen tierungsbrühe aufgearbeitet werden müssen, welche überdies auch noch andere Reaktionsprodukte als d-CL ,
enthalten. Zur überwindung dieser Mängel wur den verschiedene Verbesserungen in der Verwendung von Lösungsmitteln versucht. Die bisher erzielten Erfolge waren jedoch trotz dieser Studien unbefrie digend, das heisst die toxische Wirkung des Lösungs mittels macht sich im allgemeinen bemerkbar, sobald die Lösunggmittelkorzentration in der Fermentie- rungsbrühe wenige Prozent überschreitet, weshalb die Fermentierung in vielen Fällen allmählich unterbro chen wird.
Als Ergebnis ausgedehnter Untersuchungen wurde nun das erfindungsgemässe Fermentierungsverfahren entwickelt, gemäss welchem es gelingt, die Dehydrie- rung von CL zu d-CL in einer im Vergleich zu den bisherigen Verfahren ausserordentlich hoch konzen trierten Ferrnentierungsbrühe durchzuführen, das heisst, dass die CL-Menge nicht kleiner ist als.
1 gjUter Brühe und in der Regel einige bis 100 lg/Liter Brühe ausmacht. Dabei kann das CL in der Briihe gelöst oder suspendiert vorliegen.
Auf Grund der Untersuchungen wurde klar, dass das fermentative Bakterium Coryne simpler, CL voll- ständig zu d-CL dehydriert, und zwar auch dann, wenn man der Kultur über ihr Lösungsvermögen festes CL zusetzt, ebcnsogut wie im Falle, wo alles CL in der Kultur gelöst wird, und dass das gebildete d-CL sich in der Brühe allmählich in kristalliner Form anhäuft.
Wenn man beispielsweise 5 g kristallines CL in 1 Liter der Kultur von Corynebacterium simplex mit 100 cm3 Methanol oder Aceton löst und das Gemisch unter Sch'üttel'n bei -optimalen Bedingungen hält, so steht die Entwicklung des genannten Bakteriums nach einiger Zeit still und das als Ausgangsmaterial verwendete CL bleibt zum grössten Teil in seiner ur sprünglichen Form.
Fügt man hingegen einer gleichen Brühe, jedoch ohne organisches Lösungsmittel, kri stallines oder pulverisiertes CL zu, .so geht die Fer- mentierung nicht zurück, sondern ist nach etwa 10 bis 20 Stunden beendet, wobei in der Brühe 4-CL ausfällt. Durch Belüften der Kultur wird die Fermen- tierungsdauer weiter verkürzt. Das gebildete d-CL lässt sich aus dieser Brühe leicht gewinnen durch Filtrieren:, Zentrifugieren oder nach einem andern einfachen Verfahren.
Es hat sich gezeigt, dass dieses hervorragende Ergebnis ganz spezifisch ist für die Kombination von CL und Corynebacterium simplex. Eine fermentative Dehydrierung in der 1-Stellung eines Steroids lässt sich mit Mengen, die über das Lösungsvermögen der Fermentbrühe hinausgehen, weder mit Hilfe von andern Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen, noch bei andern analogen Steroiden, wie Cortison, bewirken,
und hier auch nicht durch Corynebacterium simpl.ex. Dementspre chend muss die Entdeckung, auf welcher die vorle gende Erfindung beruht, auf ein spezifisches Ferment zurückgeführt werden, welches nur für die Behand lung von CL durch Corynebacterium simplex zutrifft.
Mit dem erfindungsgemässen Verfahren sind also weit grössere Um ätze möglich als bei den bekannten Verfahren. Der Brühe können 20=30 Gew /o CL, das heisst 20-30 g/100 cm-' Brühe, zugesetzt werden., und selbst bei derart hohen Konzentrationen wird die Fermentierung nicht völlig aufgehalten.
In diesem Falle wird die Fermentierungsbrühe infolge des aus fallenden kristallinen d-CL trübe. Dadurch eine höhere Konzentration des Substrats in der Brühe, infolge der hohen Viskosität, die Belüftung erschwert wird,
wird die Konzentration des der Fermentierungs- brühe zugesetzten CL in natürlicher Weise durch die Viskosität begrenzt. Indessen lässt sich gewöhnlich eine Ausbeute an rohem d-CL von über 95 % mit Bezug auf das verwendete CL erzielen,
wenn man eine Kultur unter Beachtung der obengenanntcn Be grenzung während 4 Tagen schüttelt (mit 130 Vibra- tionen/Minute und einem Weg von 5 cm).
Wie zahlreiche Versuche mit andern Bakterien und auch mit Pilzen zeigten, gelingt eine praktisch vollständige Dehydrierung mit Mengen,
die über das Lösungsvermögen der Brühe hinausgehen nur mit dem Bacterium Coryne sim-plex. Die mycologischen Eigenschaften dieser Bakterienart werden im Ber- gey's manual of Determinative Bacteriology (6. Auf lage, 1948) auf Seite 397 beschrieben.
Die Gattung Coryne umfasst viele pathogene Bakterien, doch zeigt Corynebacterium simplex keine pathogenen Eigenschaften. Das Bakterium kann ent weder durch die American Type Culture Collection, Washington D.
C., oder durch andere öffentliche Quellen bezogen werden. Über fermentative Dehydrie- rung von CL und andern Steroiden zu d-CL bzw. andern entsprechenden 1,2-Dehydro-Verbindungen mit Hilfe von Coryn,ebacterium simplex hat Nobile et a1 in Journal of the American Chemical Society, <I>71,</I> 4184 (1955) berichtet.
Auch in diesem Fall wur den jedoch die Ausgangsmaterialien vor der Zugabe zur Fermentierungsbrühe in organischen Lösungs mitteln :gelöst. Somit tritt auch in diesem Falle die oben erwähnte schädliche Einwirkung der organischen Lösungsmittel auf den Fermentierungsprozess auf, be sonders wenn man die Lösungsmittel in zu grossen Mengen verwendet, um die Konzentration des Sub strats in der Brühe zu erhöhen. Demgegenüber kann durch -das erfindungsgemässe Verfahren in Abwesen heit von Lösungsmitteln theoretisch eine fast unbe grenzte Menge Ausgangsmaterial verwendet werden.
Dieses stellt somit ein neuartiges und bisher nirgends erwähntes Verfahren dar, welches weder auf dem Steroidgebiet noch auf dem Gebiet irgendwelcher anderer chemischer Substanzen angewendet wurde.
Das erfindungsgemässe Verfahren bietet die fol genden Vorteile: a) Die CL-Konzentration kann sehr stark erhöht werden, was eine entsprechende Verkleinerung der Apparatur gestattet.
b) Eine Zersetzung des Ausgangsmaterials und des Produktes durch überfermentierung kann ver hindert werden, und die benötigte Fermentierungszeit wird abgekürzt.
c) Die Gewinnung und Isolierung von d-CL wird stark vereinfacht, und das Produkt wird in hoher Ausbeute .erhalten.
d) Der Verlauf der Fermentierung kann durch, mikroskopische Beobachtung leicht verfolgt werden, wie hiernach näher beschrieben wird.
Das Fermenroierungmedium kann in üblicher Weise hergestellt werden, wie dies bei Kulturen von Corynebakterien gebräuchlich ist. Beispielsweise kann man das Inoculum des Bakteriums einer 1%igen Basamin-Busch -Lösung einimpfen und schütteln oder belüften ( Basamin-Busch ist die Handels marke für ein enzyanatisch.es
Hydrolysat von Pflanzen eiweiss, hergestellt durch Virginia Barrel Company, USA). Jedoch können mit Vorteil auch andere wäss- rige Medien benutzt werden, beispielsweise ein Me- dium, bestehend aus 0,5 % Getreideweiche und 0,5 0/0 Glukose. Das Belüften oder Schütteln,
erfolgt in g@ei- cher Weise, wie dies bei aeroben Bakterien üblich ist.
Bei der Vorbereitung der Kultur lässt sich der richtige Zeitpunkt für die Zufügung des CL mit Hilfe eines Trübungsmessers oder eines ähnlichen Instrumentes bestimmen. Im allgemeinen kann man aber das Ausgangsmaterial der Kultur 20 Stunden nach erfolgter Impfung ohne Gefahr eines Misslingens zusetzen. Auch wenn das CL vor Ablauf von 20 Stun den nach der Impfung zur Fermentierungsbrühe zuge setzt wird, kann es gut fermentiert werden. In diesem Fall erfordert die vollständige Fermentierung jedoch mehr Zeit.
Das CL kann der Fermentierungsbrühe in (grob) kristalliner Form zugesetzt werden, indessen ist es zweckmässig, das CL vor der Fermentierung gut zu pulverisieren.
Eine Sterilisierung des CL vor der Fermentierung ist nicht nötig. Das Bakterium entwickelt sich .in der Fermen:tierungsbrühe vor der Zugabe des CL ge wöhnlich gut, weshalb das Substrat die Brühe nicht infiziert und die Fermentierung relativ kurze Zeit nach Zugabe des Ausgangsmaterials beendet ist.
Im erfindungsgemässen Verfahren ist die CL- Menge, welche der Fermentierungsbrühe zugesetzt wird, sozusagen keinen Beschränkungen unterworfen, und zwar z. T. deswegen, weil kein Lösungsmittel ver wendet wird. Eine praktische Begrenzung der CL- Konzentration wird jedoch bedingt durch das. Erfor dernis der Belüftung, zumal Bakterium und Fermen- tierung aerobe Bedingungen fordern, weshalb eine übermässige Konzentration vermieden werden soll, da dadurch die Belüftung beeinträchtigt wird.
Ausserdem wird durch zu hohe Konzentration die Durchführung des Verfahrens wegen der hohen Viskosität erschwert. In Betracht dessen ergibt sich vorzugsweise eine obere Zusatzgrenze von 400 g CL/Liter Kultur. Im kleinen Massstab verläuft die Fermentierung ohne irgend welche Behinderung vollständig, ,selbst bei Verwen dung von grossen CL-Mengen, welche die oben ange gebene Grenze überschreiten.
Wie aus den obigen Ausführungen hervorgeht, besteht für die CL-Konzentration auch keine untere Grenze. Es versteht sich jedoch, dass extrem. geringe Konzentrationen, beispielsweise von 0,10/0, bei der industriellen Durchführung nicht zu empfehlen sind.. Dementsprechend gilt eine Konzentration von 1<B>g</B> CL/Liter Kultur als praktisch unterste Grenze. Inner halb dieser aus den experimentellen Untersuchungen hervorgegangenen Grenzen l:ässt sich CL leicht fer mentieren unter Bildung von d-CL, unabhängig von der Grössenordnung der Anlage.
Beim erfindungsgemässen Fermentierungsverfah- ren wird das gebildete d-CL sukzessive aus der Fer- mentierungsbrühe abgeschieden und häuft sich in Form roher Kristalle an. Somit bestehen während der Fermentierun:g in der Brühe nebeneinander sowohl CL wie auch d-CL. Nach Massgabe des Fortschrei tens der Fermentierung nimmt jedoch, die Menge des ersteren langsam ab und umgekehrt diejenige des letzteren zu.
Die beiden Kristallarten können durch ihre verschiedenartige Kristallform voneinander unter schieden werden, indem d-CL Nadeln oder lange Säulen bildet, während CL in vergleichsweise kurz- säuli,ger oder flacher Form kristallisiert. Somit lässt sich der Fortschritt der Fermentierung leicht fest stellen durch mikroskopische Beobachtung der Brühe mit einer 100-150fachen Vergrösserung.
Ein ge übter Beobachter kann sogar die verhältnismässigen Anteile von CL und d-CL in der Brühe sowie die zur Beendigung der Fermentierung noch nötige Zeit ab schätzen. Diese Tatsache bedeutet einen; weiteren Vor teil des erfindungsgemässen Verfahrens im Vergleich mit den früheren Messmethoden, bei welchen die Brühe extrahiert und polarographiert und das Aus mass der erfolgten Fermentierung anhand der erhal tenen Kurven bestimmt werden musste.
Wenn bei der mikroskopischen Untersuchung keine Kristalle des als Ausgangsmaterial verwendeten CL mehr beobachtet werden können, so ist die Fer- mentierung beendet, und das gebildete d-CL ist im Fermentierungsgefäss in Form von schönen langen Nadeln oder Prismen z. T. suspendiert.
Indem man die Brühe stehen l:ässt oder zentrifugiert, kann man d-CL leicht in Form eines Kristallbreis gewinnen, welcher getrocknet wird, wobei man eine Rohsubstanz mit ungefähr 80 % d-CL erhält,
in welcher als haupt- sächliche Verunreinigungen die Feststoffe des Me diums und die Zellen des Fermentierungsbakteriums auftreten. Das so erhaltene rohe d-CL wird z. B. durch Umkristallisieren aus Aceton oder Methanol nach dem üblichen Verfahren gereinigt.
Die Ausbeute an d-CL gemäss dem .erfind#unigs- gemässen Verfahren ist ausgezeichnet. Bei einer CL- Konzentration von 0,1-0,2 % beträgt die Ausbeute an rohem d-CL etwa 70=75 %,
wie bei der üblichen Fermentierung. Sie nimmt jedoch allmählich zu in dem Masse, wie die Konzentration des Ausgangsmate- rials zunimmt, und macht 85 bis über<B>9004</B> d-CL aus, wenn man von einem Medium ausgeht,
welches zu Beginn 51/o bzw. 10-30% CL enthält. Im letzteren Falle beträgt die Ausbeute .an gereinigtem d-CL mit einer Reinheit von über 95% mehr als 700/9 mit Bezug auf das
aufgewendete CL. <I>Beispiel l</I> 0,5g Pepton, 0,5 -g Getreideweiche und 0,5 .g Glukose wurden in 100 cm3 destilliertem Wasser ge löst. Die Lösung wurde auf pH 7,3-7,4 ;gestellt, in einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen vorn 500 cm3 :gegossen und im Autoklaven 20 bis 30 Minuten lang bei 120 C sterilisiert.
Dieses Me dium impfte man mit Corynebacterium simplex, wel ches vorher auf .einem geeigneten Inoculum., wie Bouillon-Agar, gezüchtet worden war, und schüttelte bei 25-30 C 24 Stunden lang (mit 130 Vibrationen/ Minute über eine Strecke von 5 cm). Die Lösung wurde trübe und nahem; mit dem Fortschritt der Kultur einen besonderen Geruch an.
Hierauf setzte man pulverisiertes CL zu und fermentierte unter den ,glei chen Bedingungen weiter. Erfahrungsgemäss bewirkt die Zugabe von CL zur Kultur im allgemeinen eine starke Zunahme .der Schaumbildung. Die Verwen dung eines Antis!chaummittels ist jedoch, ausser in Sonderfällen, nicht nötig, in welchen die bekannten Antischaummittel, wie Siliconöl, wirkungsvoll ver wendet wenden können.
Die Ferrnentierungsdauer hängt in. erster Linie von der Konzentration des CL und teilweise auch noch von weiteren Bedingungen ab. Im allgemeinen jedoch dauert die Fermentierung nach dem Impfen ungefähr 24-48 Stunden. Die Fermentierungsbrühe wurde verschiedentlich mikro- skopisch untersucht, um eine Zersetzung des.
Pro duktes infolge 1Jberfermentierung zu verhindern. Die Fermentierung wurde abgebrochen, sobald die CL, Kristalle verschwunden waren. Die Fermentierungs- brühe wurde trübe infolge der in Suspension gegan genen winzigen Kristalle von d-CL. Zur Ausfällung dieser Kristalle gab man wenige Tropfen Siliconöl als Antischaum'bildungsmittel zur Brühe und liess diese dann stehen.
Die überstehende Lösung, aus welcher sich die d-CL-Kristalle abgeschieden hatten, wurde dekantiert, und der kristalline Bodensatz wurde zen- trifugiert, mit Äther gewaschen und getrocknet zur Gewinnung der rohen d=CL-Kristalle. In der Mutter lösung, aus welcher die d-CL-Kristalle und andere Feststoffe abgeschieden wurden, verbleiben 50 bis 100 mg d-CL/100 arn3 Lösung in gelöstem Zustand zurück.
Dieser Anteil kann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, beispielsweise mit einem gleichen Volumen Chloroform, extrahiert wer den. Der Auszug wird in üblicher Weise aufgearbeitet, indem man trocknet, eindampft und umkristallisiert zur Gewinnung des. d-CL.
Die Ausbeuten an d-CL, welche man auf Grund des beschriebenen Verfahrens erzielt, sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt:
EMI0004.0046
Ausbeute <SEP> an
<tb> CL-Zusatz <SEP> rohem <SEP> Prednisolon/100 <SEP> cm3 <SEP> Brühe
<tb> Versuch <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP> Fermentierungs- <SEP> aus <SEP> dem <SEP> Bxei <SEP> Total
<tb> Nr. <SEP> (CL <SEP> z. <SEP> T. <SEP> gelöst <SEP> und <SEP> dauer <SEP> g/100 <SEP> cm3 <SEP> aus <SEP> der <SEP> Mutterlösung <SEP> g/100 <SEP> cm3
<tb> z. <SEP> T.
<SEP> suspendiert)
<tb> (% <SEP> der <SEP> theoretischen <SEP> mg/100 <SEP> cm3
<tb> Menge)
<tb> 13 <SEP> 1 <SEP> 24 <SEP> 0,93 <SEP> (94%) <SEP> 55 <SEP> 0,985
<tb> 19 <SEP> 1,5 <SEP> 26-28 <SEP> 1,48 <SEP> <B>(990/9)</B> <SEP> 60 <SEP> 1,54
<tb> 25 <SEP> 2 <SEP> 44 <SEP> 1,6 <SEP> (80%) <SEP> 58 <SEP> 1,658
<tb> 36 <SEP> 3 <SEP> 63 <SEP> 2,5 <SEP> <B>(830/(,)</B> <SEP> 63 <SEP> 2,563
<tb> 38 <SEP> 3 <SEP> 40 <SEP> 2,7 <SEP> (77%) <SEP> 75 <SEP> 2,778
<tb> 43 <SEP> 4 <SEP> 47 <SEP> 3,6 <SEP> <B>(900/9)</B> <SEP> 85 <SEP> 3,685
<tb> 51 <SEP> 5 <SEP> 40 <SEP> 4,3 <SEP> (86%) <SEP> 56 <SEP> 4,38
<tb> 62 <SEP> 6 <SEP> 43 <SEP> 5,4 <SEP> (900/a) <SEP> 64 <SEP> 5,464
<tb> 74 <SEP> 7,5 <SEP> 45 <SEP> 6,8 <SEP> (87 <SEP> <B>%</B>) <SEP> 80 <SEP> 6,88
<tb> 82 <SEP> 8 <SEP> 45 <SEP> 6,8 <SEP> (86%) <SEP> 77 <SEP> 6,977
<tb> 101 <SEP> 10 <SEP> 45 <SEP> 9,4 <SEP> (94%)
<SEP> 50 <SEP> 9,45
<tb> 153 <SEP> 15 <SEP> 51 <SEP> 13,8 <SEP> (920/a) <SEP> 59 <SEP> <B>1</B>3,859
<tb> 302 <SEP> 30 <SEP> 94 <SEP> 27,6 <SEP> <B>(920/9)</B> <SEP> 65 <SEP> 27,665 Da die so erhaltenen rohen d-CL-Kristalle noch einige Zellen und andere Verunreinigungen enthalten, können sie in diesem Zustand nicht für medizinische Zwecke verwendet werden. Eine Reinigung ist leicht durchführbar durch Umkristallisieren aus einem.geeig neten Lösungsmittel, wie Chloroform oder Aceton.
Wenn man beispielsweise die rohen Kristalle mit. 20 bis 30 Volumteilen heissem Aceton in Anwesenheit von Holzkohle für Entfärbungszwecke umkristallisiert, so erhält man gewöhnlich ein d-CL mit einer Reinheit von 95 oder mehr Prozent (gemäss polarographischer Untersuchung)
in einer Ausbeute von 80 % mit Bezug auf das Rohprodukt.
<I>Beispiel 2</I> 5 Liter einer<B>1</B> 4/Olgen wässerigen Basamin-Busch - Lösung (Markenbezeichnung) wurden in, einen Ver suchS Fermentierüngstank mit einem Fassungsvermö- gen; von 10 Liter gegeben und sterilisiert. Das reine Inoculum von Coryneb:
acterium simplex wurde auf das Medium genmpft und während 24 Stunden bei 28 C gezüchtet, wobei man durch Durchblasen von 20-30 Liter steriller Luft/Minute konstant belüftete. Anschlie- ssend gab man 100 g Hydnocortison zu.
Die Fermen- tierurig enfollgte unter den gleichen Zuchtbedingungen während 48 Stunden, worauf man die Fermentserungs- brühe wie im vorhergehenden Beispiel aufarbeitete. Man erhielt 71,5 g gereinigtes d-CL mit einer Rein- heit von über 95 %.