CH364504A - Verfahren zur Aufspaltung von d,l-Steroiden - Google Patents

Description

  Verfahren     zur        Aufspaltung    von     d,l-Steroiden       Es ist     bekannt,    mit     Hilfe    von Mikroorganismen  in Steroidverbindungen mit der natürlichen Konfigu  ration     Hydroxyl-    in     Oxogruppen    zu     verwandeln.    Es  wurde nun die überraschende Beobachtung gemacht,  dass     d,1-Steroide    sich diesen     Mikroorganismen    gegen  über verschieden verhalten, indem im     wesentlichen     nur die     d-Form,

      das heisst die den natürlichen  Steroiden entsprechende     enantiomorphe    Form oxy  diert wird, und die     1-Form        unverändert    bleibt. Auf  dieser Beobachtung     basiert    nun das Verfahren gemäss  der Erfindung     zur    Aufspaltung von     d,l-Steroiden,    bei  welcher neben den oxydierten     d-Steroiden    die bisher  nur in einzelnen Fällen bekannt gewordenen 1 Steroide  erhalten werden.  



  Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,  dass man auf     Oxygruppen        enthaltende        d,1-Steroide          aerobe    Kulturen von oxydierend wirkende     Enzyme     produzierenden     Mikroorganismen    oder die entspre  chenden     Enzyme,    welche     Hydroxylgruppen    in     Oxo-          gruppen    zu     verwandeln    vermögen, einwirken lässt,  wobei praktisch nur die     d-Form    oxydiert wird,

   und  dass man     das    unveränderte     1-Steroid        undioder    das       d-Oxosteroid    isoliert.  



  Als     Ausgangsstoffefür    das neue Verfahren kommen  allgemein gesättigte und ungesättigte, beliebig sub  stituierte     d,l-Steroide,    die eine freie     Hydroxylgruppe     aufweisen, beispielsweise solche der     Cholestan-,          Koprostan-,        Cholan-,        Spirostan-,        Furostan-,        Butan-          olid-,        Cardanolid-,        Östran-,    insbesondere solche der       Pregnan-,        Androstan-    und     Testanreihe,

      sowie ihre  höheren und niederen Homologen, beispielsweise  entsprechende     A-Nor,        D-Homo-    und     19-Norver-          bindungen    in Betracht. Doppelbindungen können sich  z. B. in 1-     und/oder    4-, 5-, 6-, 7-, 9-,     11"    14-,     15-          und/oder        16-Stellung    befinden.

   Als weitere     Substi-          tuenten        kommen    besonders in Frage freie bzw. funk  tionell abgewandelte     Oxo-    oder     Carboxylgruppen,    wie    Ester-, Äther-,     Thioester-,        Thioäther-b        Thiol-    und       Thionester-,        Acetal-,        Mercaptal-,        Ketal-,        Hydrazon-,          Semicarbazon-    und     Enolgruppen,    z.

   B. in 2-, 3-, 6-,  7-, 11-, 12-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20- und     21-Stellung,     ferner Halogenatome, insbesondere Chlor oder Fluor,  z. B. in 9- und     17-Stellung.    Hierzu besonders geeig  nete     d,l-Steroide    sind z. B.     d,l-Pregnenolon,        d,l-          Androstendiol,        d,1-17-Methyl-androstendiol,        d,l-An-          drosteron,        d,1-a-Östradiol    oder ihre     funktionellen     Derivate.  



  Das Verfahren wird     vorteilhaft    in der Weise       durchgeführt,    dass man auf den Ausgangsstoff die       aerobe        Kultur    eines einzigen     Mikroorganismus    ein  wirken lässt. Es kann aber auch so vorgegangen  werden, dass man in einem     Arbeitsgang    mehrere  Kulturen auf den     Ausgangsstoff        einwirken    lässt, wobei  es sich als     vorteilhaft    erwiesen hat, die     Einwirkung     der     einzelnen    Kulturen zeitlich     nacheinander    vorzu  nehmen.

      Es sind diejenigen Mikroorganismen für das Ver  fahren     geeignet,    die     in        Steroidverbindungen        Hydr-          oxylgruppen        in        Oxogruppen    zu     verwandeln    vermögen,  z. B. eine     Hydroxylgruppe    in 3- und/oder     17-Stellung,     wie z.

   B. die folgenden Arten:         Proactinomyces        erythropolis          Proactinomyces        aquosus          Proactinomyces        restrictus          Proactinomyces        roseus          Azotobacter          Mycobakterien          Micrococcus        dehydrogenans          Corynebacterium        mediolanum          Alcaligenes        faecahs     Hefe und oxydierende Bakterien       Pseudomonas          

      Flavobacterium        androstenedionicum          Flavobaeterium        carbonilicum          Actinomyces        albus          Aspergillus        niger          Phycomyces        blakesleeanus          Penicillium        chrysogenum       Zur     Durchführung    des Verfahrens kann man     im          einzelnen    wie folgt vorgehen:

   Die Ausgangsstoffe  werden mit Kulturen der genannten Mikroorganismen  unter an sich bekannten     aeroben    Bedingungen irrku  biert. Das Wachstum erfolgt in Oberflächenkultur  oder,     technisch    vorteilhafter,     submers,    wobei man       schüttelt    oder     rührt.    Die Kulturen enthalten     assimifier-          baren        Kohlenstoff,    insbesondere Kohlenhydrate, sowie  gegebenenfalls     Wuchsstoffe,    beispielsweise Maisquell  wasser oder Bierwürze,     und    anorganische Salze.

   Es  sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthe  tische     Nährlösungen    brauchbar. Das     praktisch    ein  fachste Verfahren ist im folgenden     geschildert:    Man  züchtet die Organismen in Apparaturen und unter  ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotika  Fabrikation als sogenannte     Tieftankverfahren    be  kannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man  die     d,l-Steroide    in feiner Dispersion oder Lösung,  beispielsweise     in    Methanol, Aceton oder     Äthylen-          glykol    zu und irrkubiert weiter.

   Schliesslich trennt man  vom     Mycel    ab, extrahiert das     Filtrat    und/oder die       Mycelmasse    und     isoliert    aus dem Extrakt die     d-Oxo-          steroide        und/oder    die     1-Steroide    in an sich     bekannter     Weise, z.

   B. durch     Entmischungsverfahren,        Adsorp-          tion,        Chromatographie,    Kristallisation,     überführung     in     funktionelle    Derivate, wie     Girard-Verbindungen     und dergleichen. Man kann auch die wirksamen  Enzyme aus den Kulturen der genannten Orga  nismen abtrennen und unter     Aüsschluss    der wach  senden Kulturen verwenden. So kann man z.

   B. das       Mycel    abtrennen, in Wasser oder Pufferlösungen       suspendieren,    die     d,l-Stcroide    diesen     Aufschräm-          mungen    zugeben und     inkubieren.     



  Sollen in einem Arbeitsgang mehrere Mikro  organismen zur     Einwirkung    gelangen, so kann man  beispielsweise wie folgt vorgehen: Nach Entwicklung  der Kulturen des ersten Organismus gibt man die       d,l-Steroide    in feiner Dispersion oder Lösung, bei  spielsweise in Methanol, Aceton oder     Äthylenglykol     zu und irrkubiert weiter, bis die     maximale    Reaktion  erreicht ist.

   Dann gibt man, ohne vorher zu     filtrieren     oder das Oxydationsprodukt zu isolieren, zum Reak  tionsgemisch eine ausgewachsene Kultur des     zweiten     Organismus und nötigenfalls entsprechende Nähr  substanzen und     Wuchsstoffe    zu     und    fährt mit der  Inkubation fort. Gegebenenfalls wird diese Operation  mit einem dritten Mikroorganismus wiederholt. Der  Verlauf der     einzelnen    Oxydationen kann     papierchro-          matographisch    verfolgt werden.  



  Die     Verfahrensprodukte    können     als        Heilmittel     Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu  ihrer Herstellung dienen.         Allgemein    ist die     Racematspaltung    nach dem  neuen Verfahren besonders einfach, weil die oxy  dierten     Derivate    des einen Antipoden sich vom un  veränderten anderen Antipoden infolge ihrer höheren  Polarität leicht abtrennen lassen.  



  Bereits seit den     klassischen    Untersuchungen von       Pasteur    hat man zwar gelegentlich     mikrobiologische     Methoden zur Gewinnung des einen Antipoden aus       Racematen    angewandt. Dabei wurden gewöhnlich       Pilze    oder Bakterien verwendet, die die Ausgangs  stoffe assimilierten, und zwar den     natürlichen        (d)     Antipoden rascher als den     unnatürlichen    (b).

   Nach  diesem     Verfahren    musste also, um ein optisch reines       Präparat    zu     erhalten,    so lange mikrobiologisch be  handelt werden, bis mindestens die eine Form, und  zwar meist die biologisch interessantere völlig zer  stört war. Demgegenüber liefert das neue Verfahren  auch bei nur teilweiser Umsetzung den umgewan  delten Antipoden, der meist den biologisch inter  essanteren darstellt, in optisch reiner Form, und zwar  als Derivat, das an sich oder für weitere Synthesen  zwecke praktisch wertvoll sein und chemische Um  wandlungen ersparen     kann.    Wird beim neuen Ver  fahren der eine Antipode völlig umgesetzt, so fällt  auch der     andere    in optisch reiner Form an.  



  <I>Beispiel 1</I>  In einem Schüttelgefäss werden 200     cm3    einer       Nährlösung,    die auf 1 Liter Leitungswasser 10 g Roh  glucose, 5 g     Pepton,    3 g Fleischextrakt     ( Oxo    Lab.       Lemco         Markenprodukt),    5     gNatriumchlorid    und 10 g       Calciumcarbonat    enthält und auf     pH    7,5 gestellt wird,  sterilisiert und mit einer Kultur eines Stammes von       Streptomyces        albus    beimpft.

   Man lässt 2 Tage bei 27   schütteln und gibt dann unter sterilen Bedingungen  eine     Lösung    von 50 mg     d,1-a-Östradiol    in 2     cm3          Dioxan    zu. Es wird weitere 3 Tage bei 27  geschüttelt,  worauf das     Mycel    abgetrennt und das     Kulturfiltrat    mit       Methylenchlorid    extrahiert wird. Der Extraktions  rückstand besteht gemäss     papierch:romatographischer     Untersuchung aus     a-Östradiol    und     Östron    entspre  chenden Verbindungen.

   Mittels     präparativer    Papier  chromatographie wird das Gemisch aufgetrennt, und  man erhält durch Kristallisation aus     wässrigem    Metha  nol einerseits     1-ar,Östradiol,    F. =     175-17811,        [a]D     =-81 , und anderseits     d-Östron,    F. = 257-259        [a]D    =     -I-161 .     



  <I>Beispiel 2</I>  Zu 200     cm"-    einer gut entwickelten     Schüttelkultur     von     Pseudomonas    gibt man unter sterilen Bedin  gungen eine Lösung von 50 mg     d,l-Androsteron    in  2     eins        Dioxan.    Man lässt 48 Stunden bei 27  schüt  teln und extrahiert dann die Kultur mit     Methylen-          chlorid.        Der    Extraktionsrückstand verhält sich ge  mäss     papierchromatographischer    Untersuchung wie       Androsteron    und     3,

  17-Diketo-androstan.    Er wird  mittels     präparativer        Papierchromatographie    aufge  trennt, und man erhält durch     Kristallisation    aus       wässrigem    Methanol     1-Androsteron,    F. = 180 -182 ,           [a]D        =-92 ,    und     d-3,17-Diketo-androstan,    F. _  130 -132 ,     [a]D    = + 109 .  



  <I>Beispiel 3</I>  Zu 200     cm-'    einer gut gewachsenen     Schüttelkultur     eines Stammes von     Streptomyces        fradiae        gibt    man  unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg       d,l-Pregnenolon    in 2     em3    Aceton.     Man    lässt 24 Stun  den bei 27  schütteln und extrahiert dann die     Kultur     mit     Methylenchlorid.    Der     Extraktionsrückstand    ver  hält sich gemäss     papierchromatographischer    Unter  suchung wie     Pregnenolon    und Progesteron.

   Er wird  mittels     präparativer        Papierchromatographie    aufge  trennt, und man erhält durch     Kristallisation    aus       Aceton-Petroläther-Gemischen        1-Pregnenolon,    F. =  187 -189 ,     [a]D    = -25 , und     d-Progesteron,    F. =  125 -127 ,     [a]D    = +     190 '.     



  <I>Beispiel 4</I>  Wird im obigen Beispiel zur Umsetzung von     d,l-          Pregnenolon    anstelle der Kultur des Stammes von       Streptomyces        fradiae    eine solche von     Aspergillus        niger     verwendet und wird in der angegebenen     Art    und  Weise     inkubiert    und aufgearbeitet, so kann man eben  falls     1-Pregnenolon,    F. = 185     -188 ,        [a]D    = -23 ,  und     d-Progesteron,    F. = 123 -126 ,     [a].D    = + 191   isolieren.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Racematspaltung von Oxygruppen enthaltenden d,1 Steroiden, dadurch gekennzeichnet, dass man auf die d,l-Steroide aerobe Kulturen von oxydierend wirkende Enzyme produzierenden Mikro organismen oder die entsprechenden Enzyme, welche Hydroxylgruppen in Oxogruppen zu verwandeln ver mögen, einwirken lässt, wobei praktisch nur die d-Form oxydiert wird,

   und dass man das unveränderte 1-Steroid und'oder das d-Oxosteroid isoliert. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dass man Mikroorganismen oder ent sprechende Enzyme verwendet, die eine Hydroxyl- gruppe in 3- und/oder 17-Stellung zu oxydieren ver mögen. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff d,1 östron verwendet. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff d,l-Pregnen olon verwendet. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Ausgangsstoff d,l-Andro- steron verwendet.