Verfahren zur Herstellung von Oxytetracyclin Die Erfindung betrif f t :ein Verfahren zur Her- stellung von Oxytetracycln, das einen grossen ant- bakteriellen Wirkungskreis aufweist, welches dadurch gekennzeichnet ist,
dass ein Stamm von Acünomyees varsovicnsis sp. nov. submers und aerobi in einem flüssigen Nähnnediium, welches Quellen von: Stick- stoff, Kohlenstoff, Mineralsalze und Spurenelemente enihält, kultiviert wird.
Die neue, bisher ;nicht beschriebene, Art des Strahlenpilzes, für welche die Benennung Actiroo@myces varsoviensis sp. nov. vorgeschlagen worden ist, und von welcher ein Staunen unter der in ATTC 1463 beider amerikanischen Kulturensaanmlung, Washihg- ton, deponiert ist,
wurde taxonoznisch untmucht (vgl. N. A. Krdsilnik(5w: Opredielntiel bakterü i akti- nomycetaw, Izd. Ak. Nauk SSSR, Moskau, 1949;
sowie Bergeys Manual of Deteaninative Bactarjology, Williams, Wilkins, Baltimore, 1948) und als ein zu der Gattung Actinomyees (Krasidinik6w) gehöriger Mikroorganism#uis klassifiziert.
Das Antibiotikum Oxytetracyclin wird von zahl reichen Strahlenpilzen gebildet. Die HersteRung von Oxytetnacyclin ist in der Literatur vielfach beschrie ben worden.
Zum Beispiel ist in der amerikanischen Patentschrift Nr.<B>2516080,</B> in der deutschen Patent- schrift Nr. 862647 und in der britischen Patentschnift Nr.
648417 ein Verfahren zur Herstellung vom Oxy- tetracyclin auf dem biosynthetischen Wage bei An wendung Lies Strahlenpilzstammeis Streptomyces mimo- .suIs beschrieben.,
der sich hinsichtlich der Zucht und morphologischen Merkmale der im Jahre 1894 be- schiriebenen Art Streptomyces albus (Rossi: Doris T.: Ann. Ist. Ig. Spetr. Roms N.
S. 1894, 1, 399) Waks- man, Henrici, nähert. In der britischen Patentschrift Nr.
713795 und in. der kanadischen Patentschrift Nr. 520836 ist ein Verfahren zur Gewinnung von Oxytetracyclin aus der Fermentationsflüssvgkeit des Streptomyces platensis -genannten StrabI!enpilzes -be- schrieben. In der
schweizerischen Patentschnft Nr. 331988 ist ein, Verfahren zur Herzstellung von Oxytetracyclin mittels eines neuem Stna#hlenpilzes; des Streptomyces vendargensis sp. nov., beschrieben.
Auch in der französischen wissenschaftlichen Literatur ist eine neue Arteines Oxytetracychm pro- dozierenden Strahlenpizes beschrieben.
Diese Art erhielt den Namen Streptomyces -armillatus .(Mancy- Co 'i 1 eit, Pinert-Sindico: Ann. Inst. Pastaur, 1954, 87380). In denn Werk von: S. A. Waksman und H.
A. Leehevaher: Actinomycetes and. their anti- biotics, Williams, Willcins,-Baltimore 1953, erwähnen die Verfasser bei der Beschreibung der Art Strepto- mycas @griseoflamus (vgl. Krainsky A.:
ZbT. f. Bakt. II, 1914, 41639), deren stark antagonistischen Eigen- sehalten und stellen fest, dass dieser Stamm Produ- zerrt des Oxytetracyclins und des Rimocidins ist. Über die Isolierung von Stämmen zahlreicher,
Oxy tetnacyclin produzierenden Strahlenpilzen, berichtet auch Silvestri: (R. C. Ist. Sup. Sanitä, Roma, 1955, <B>18 1227).</B> Beide Autoren, insbesondere Silvestni, machen auf die Ähnlichkeit aufmerksam,
die zwi- schen dem Stamm Streptomym rimosuis und der weit der Jahre 1914 bekannten -Strahlenpfzart Strepto- myces igriseofavus besteht.
Bei der Suche nach antagonistischen RTI ID="0001.0255" WI="14" HE="4" LX="1764" LY="2460"> Stralden- plzen 3n Polen wurde eine Strahlenpilzart isoliert, die sich durch ihre morphologischen und physielo,
gnschen Merkmale von den bisher in der Literatur beschriebenen Stämmen ausdrücklich unterscheidet.
EMI0002.0001
Dieser <SEP> -Stamm <SEP> wurde <SEP> sehr <SEP> genauem <SEP> taxomomischcn
<tb> Untersuchungen <SEP> unterworfen, <SEP> wobei <SEP> alle <SEP> modernen
<tb> Tests <SEP> zur <SEP> Identifizierung <SEP> der <SEP> Gattung <SEP> (genes) <SEP> und
<tb> Art <SEP> (species) <SEP> durchgeführt <SEP> wurden..
<SEP> Die <SEP> Differen-
EMI0002.0002
zierung <SEP> wurde <SEP> mit <SEP> den <SEP> in <SEP> der <SEP> Tabelle <SEP> 1 <SEP> .nachstehend
<tb> aufgeführten, <SEP> Oxytetracyclin <SEP> produzierenden <SEP> Strahlen pilzarten <SEP> durchgeführt.
EMI0002.0003
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Amen <SEP> von <SEP> Oxytetracyclin <SEP> herstellenden <SEP> Strahlenpilzen
<tb> L. <SEP> Nr. <SEP> Art <SEP> Literatur
<tb> 1. <SEP> Streptomyce#s <SEP> .griseofl.avus <SEP> KraalIusky <SEP> A., <SEP> Zbl. <SEP> f. <SEP> Bakt. <SEP> (11), <SEP> 1914, <SEP> 41, <SEP> 639.
<tb> (Kmainsky) <SEP> Waksman, <SEP> Waksman, <SEP> Henrici <SEP> (Bergeys <SEP> Manual <SEP> of
<tb> Henrici <SEP> Determinative <SEP> B,acteriology),
<tb> Wilhiams, <SEP> Wilkins, <SEP> Baltimore, <SEP> 1948.
<tb> 2. <SEP> Streptomyces <SEP> rimo:
sus <SEP> Sobin <SEP> B. <SEP> A., <SEP> Finlay <SEP> A. <SEP> C., <SEP> Kane <SEP> J. <SEP> H.:
<tb> USA-Patent <SEP> Nr. <SEP> 2 <SEP> 516 <SEP> 080 <SEP> (1950).
<tb> 3. <SEP> Stneptomyces <SEP> armilila@tus <SEP> Mancy-Courtillet <SEP> D., <SEP> Pinuert#Sindico <SEP> S.:
<tb> Aug. <SEP> Inst. <SEP> Pasteur, <SEP> 1954, <SEP> 87, <SEP> 580.
<tb> 4. <SEP> Stmmeptomyces <SEP> platensis <SEP> Mc <SEP> ,Cuir,e <SEP> J. <SEP> M.: <SEP> Brit. <SEP> Pat. <SEP> Nr. <SEP> 713795 <SEP> (1954)
<tb> 5.- <SEP> Streptomyces. <SEP> vendargenlsis. <SEP> Stheeman: <SEP> A., <SEP> Struyk <SEP> A. <SEP> P.:
<tb> Schweiz. <SEP> Pat. <SEP> Nr. <SEP> 331988 <SEP> (1958).
EMI0002.0004
Die <SEP> nachstehende <SEP> Tabelle <SEP> 2 <SEP> gibt <SEP> die <SEP> Züchtumgs Chärakteristika <SEP> und <SEP> einige
<tb> Merkmale
<tb> des <SEP> Stammes <SEP> Acdnomyces- <SEP> varsoviensis <SEP> sp. <SEP> nov. <SEP> sowie
<tb> des <SEP> Stammes <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> 2234 <SEP> an. <SEP> Bei
<tb> den <SEP> taxonamischen <SEP> Untersuchungen <SEP> des <SEP> Stammes
<tb> Actinomyces- <SEP> värsaviensis <SEP> sp. <SEP> nov. <SEP> wurden <SEP> nicht <SEP> nur
<tb> natürliche <SEP> Nährböden, <SEP> wie <SEP> z. <SEP> B. <SEP> Kartoffeln, <SEP> Kartoffel
<tb> agar <SEP> usw., <SEP> sondern <SEP> auch <SEP> gut <SEP> definierte <SEP> synthetische
EMI0002.0005
Substrate <SEP> angewandt. <SEP> Actinomyccs <SEP> varsoviensis <SEP> sp.
<tb> nov.
<SEP> unterscheidet <SEP> sich <SEP> ausdrücklich <SEP> von <SEP> der <SEP> Art
<tb> Streptorayces <SEP> rimo@sus, <SEP> von <SEP> welcher <SEP> Stämme <SEP> von
<tb> mehreren <SEP> ausländischen <SEP> Sammlungen <SEP> (American <SEP> Type
<tb> Cultuxe <SEP> Cöllection <SEP> und <SEP> National <SEP> Collection <SEP> of <SEP> In dustrial <SEP> Bacteria, <SEP> Teddington, <SEP> England, <SEP> sowie <SEP> Nor them <SEP> Regional <SEP> Research <SEP> Laboratory, <SEP> Peozia <SEP> all.)
<tb> erlangt <SEP> worden <SEP> sind.
EMI0003.0001
<I>Tabelle <SEP> 2</I>
<tb> Actihomyces <SEP> varsovienss <SEP> sp. <SEP> nov. <SEP> .
<tb> Nährboden <SEP> Wachstum <SEP> Luftmycel <SEP> Grundmycel <SEP> Lösliches <SEP> Pigment
<tb> Asparagin <SEP> Altar <SEP> mit <SEP> Glwcose <SEP> .++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> (PlaÜen) <SEP> 120
<tb> Altar <SEP> Sabouraud <SEP> mit <SEP> Malzzucker <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> schwefielfamben
<tb> 120 <SEP> (12 <SEP> I-4)
<tb> Altar <SEP> Czapek-Doxa <SEP> mit <SEP> Saecharose <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> farblos.
<SEP> fehlt <SEP> '
<tb> 120
<tb> Altar <SEP> mit <SEP> Dextrin <SEP> ++/+++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> 48-72
<tb> Kartoffel <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> lcinfanben <SEP> fehlt
<tb> 72 <SEP> (12 <SEP> B-2)
<tb> Kantoffel-Agar <SEP> seit <SEP> Glucose <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> 72
<tb> Agax <SEP> mit <SEP> Hafenflocken. <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> 72
<tb> Festes <SEP> Trigtonsubstrat <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> farblos. <SEP> fehlt
<tb> ' <SEP> 48
<tb> Citratsu#bstrat <SEP> <B>+++</B> <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> 72
<tb> Lindenbein.substrat <SEP> <B>+++</B> <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> 72
<tb> Flüssiges <SEP> Triptonsubstrat <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> :
fehlt
<tb> 48 <SEP> scheidet <SEP> Schwefelwasserstoff <SEP> aus
<tb> Flüssiges <SEP> Ememsonsubstrat <SEP> ++/+++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> 48-72
<tb> Synthetischer <SEP> Altar <SEP> mit <SEP> Pepton <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> farblos
<tb> 72 <SEP> (121-5)
<tb> Fleischbouillon <SEP> 24-4.8 <SEP> weiss <SEP> cremfarbig <SEP> fehlt
<tb> Altar <SEP> mit <SEP> Stärke <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> 120
<tb> Milch <SEP> :
mit <SEP> Lackmus <SEP> 72 <SEP> alkalisiert, <SEP> koaguliert
<tb> Gelatine <SEP> 72 <SEP> liquidiert <SEP> nicht <SEP> (nach <SEP> längerer <SEP> Zeit <SEP> liquidiert <SEP> teilweise)
<tb> Altar <SEP> mit <SEP> Blut <SEP> 72 <SEP> ruft <SEP> keine <SEP> Sämolyse <SEP> der <SEP> Blutkörper- <SEP> hervor
<tb> Altar <SEP> mit <SEP> Nitraten <SEP> ++/+++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> pyritfarben <SEP> (Y)
<tb> <B>48-72-</B> <SEP> reduziert <SEP> nicht <SEP> Nitrate <SEP> <B>(121-3)</B>
<tb> ++ <SEP> bedeutet <SEP> mittleres <SEP> Wachstum <SEP> ++-f- <SEP> bedeutet <SEP> üppiges <SEP> Wachstum
<tb> Die <SEP> Zahlen <SEP> geben <SEP> die <SEP> Züchtungsstunden <SEP> an,
<SEP> in <SEP> denen <SEP> das <SEP> angegebene <SEP> Wachstum <SEP> festgestellt <SEP> worden <SEP> ist.
<tb> Die <SEP> Farben <SEP> sind <SEP> gemäss <SEP> dem <SEP> Dictionary <SEP> of <SEP> color <SEP> Maerz <SEP> und <SEP> Paul <SEP> Me <SEP> Graw-Hill, <SEP> New <SEP> York, <SEP> 1950, <SEP> angegeben.
EMI0004.0001
<I>Tabelle <SEP> 2</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> StrePtomyceis <SEP> nmosus <SEP> N. <SEP> R. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> 2234
<tb> Nährboden <SEP> Wachstum <SEP> Luftmycel <SEP> Grundmycel <SEP> Lösliches <SEP> Pigment
<tb> A <SEP> paragin-Agar <SEP> mit <SEP> Glucose <SEP> + <SEP> + <SEP> fehlt <SEP> gelblich <SEP> Zitronen <SEP> Pwgmeut
<tb> 48-72 <SEP> (10 <SEP> J-2)
<tb> Agar <SEP> Sabouraud <SEP> mit <SEP> Malzzucker <SEP> +++ <SEP> fehlt <SEP> fasanenfambig <SEP> Sienna-Pigment
<tb> 120 <SEP> (13L-12) <SEP> (13 <SEP> I-10)
<tb> Agar <SEP> Czapek <SEP> Doxa <SEP> mit <SEP> Saccharose <SEP> +++ <SEP> fehlt <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> 120
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Dextrin <SEP> ++ <SEP> fehlt <SEP> hellbraun <SEP> Peruwianisch-Braun
<tb> 72-96 <SEP> (13D-4) <SEP> (13 <SEP> I-10)
<tb> Kartoffel <SEP> <B>+++</B> <SEP> weiss <SEP> Haselruss <SEP> fasanenfambig
<tb> 72 <SEP> (13 <SEP> J-9) <SEP> (13 <SEP> L-12)
<tb> Kartoffel <SEP> Agar <SEP> mit <SEP> Glucose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> fehlt <SEP> farblos <SEP> Haselruss
<tb> 72 <SEP> (13 <SEP> J-9)
<tb> Agax <SEP> mit <SEP> Haferflocken <SEP> +++ <SEP> fehlt <SEP> .
<SEP> grüngelb <SEP> Isabella
<tb> 120 <SEP> (12D-2) <SEP> (13 <SEP> K-7)
<tb> Festes <SEP> Triptonsubstrat <SEP> +++ <SEP> fehlt <SEP> gelbgrün <SEP> olivenfarbig
<tb> 120 <SEP> (12 <SEP> F-2) <SEP> (12 <SEP> L-2)
<tb> Citratsubstrat <SEP> ++ <SEP> fehlt <SEP> <B>hellgelb</B> <SEP> fehlt
<tb> 120 <SEP> (12 <SEP> E-5)
<tb> Lindeübeinsuibstrat <SEP> +++ <SEP> fehlt <SEP> Haselruss <SEP> antikes <SEP> Gold
<tb> 120 <SEP> (13 <SEP> J-9) <SEP> (12 <SEP> L-2)
<tb> Flüssiges <SEP> 'I7riptomubstrat <SEP> <B>+++</B> <SEP> scheidet <SEP> nicht <SEP> Schwefelwasserstoff <SEP> .aus
<tb> 48
<tb> Flüssiges <SEP> Emersonsubstrat <SEP> ++/+++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlet
<tb> 48-72
<tb> Synthetischer <SEP> Agar <SEP> mit <SEP> Pepton <SEP> ++/+++ <SEP> fehlt <SEP> farblos <SEP> Isabella,
<tb> 24-4.8 <SEP> (13 <SEP> K-7)
<tb> Fleischbouillon <SEP> 24-48 <SEP> fehlt <SEP> famblos <SEP> fehlt
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Stärke <SEP> ++ <SEP> fehlt <SEP> weidenfarbig <SEP> Tenis
<tb> 196 <SEP> (12 <SEP> L-6) <SEP> (12 <SEP> L-6)
<tb> Milch <SEP> mit <SEP> Lackmus <SEP> 24-72 <SEP> säuert <SEP> an, <SEP> peptonisiert
<tb> Gelatine <SEP> 48 <SEP> liquidiert <SEP> vollständig
<tb> Agar <SEP> ,mit <SEP> Blut <SEP> , <SEP> . <SEP> 48 <SEP> ruft <SEP> die <SEP> Hämolyse <SEP> der <SEP> Blutkörperchen <SEP> hervor
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Nitraten <SEP> + <SEP> + <SEP> .
<SEP> weiss <SEP> hell' <SEP> lbrann <SEP> Temis
<tb> 48 <SEP> (13D-3) <SEP> (12 <SEP> I-6)
<tb> reduziert <SEP> Nitrate <SEP> zu <SEP> Nitriten
<tb> ++ <SEP> bedeutet <SEP> mittleres <SEP> Wachstum <SEP> +++ <SEP> bedeutet <SEP> üppiges <SEP> Wachstum
<tb> Die <SEP> Zahlen <SEP> geben <SEP> die <SEP> Züchtungsstunden <SEP> an, <SEP> in <SEP> denen <SEP> das <SEP> angegebene <SEP> Wachstum <SEP> festgestellt <SEP> worden <SEP> ist.
<tb> Die <SEP> Farben <SEP> sind <SEP> gemäss <SEP> dem <SEP> Dictionary <SEP> of <SEP> colorb <SEP> Maerz <SEP> und <SEP> Paul, <SEP> Me <SEP> Graw-Hill, <SEP> New <SEP> York, <SEP> 1950, <SEP> angegeben.
Nachstehend ist die Vergleichstabefie der Mnkroorganisanan Actinomyces vansoviensis, Streptomyces rimosus und Streptomyces albus angegeben,. .
EMI0005.0013
<I>Tabelle <SEP> 3</I>
<tb> Actinomyces <SEP> varsoviensis <SEP> Streptomyces <SEP> albus
<tb> ATTC <SEP> 1463 <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> (Rosse <SEP> Doria <SEP> einend. <SEP> Krainsky) <SEP> Waksman, <SEP> Henrici
<tb> Luftmycel <SEP> schwach <SEP> Luftmycel <SEP> schwach- <SEP> Luftmycdl <SEP> reich
<tb> Luftmycel <SEP> weiss <SEP> Lufmyoel <SEP> nicht <SEP> ganz <SEP> weiss <SEP> Luftmycel <SEP> weiss
<tb> Glattes <SEP> Aussehen <SEP> der <SEP> Kolonie <SEP> Charakteristisches <SEP> Aussehen <SEP> der <SEP> Nicht <SEP> charakteristisches <SEP> Aussehen
<tb> und <SEP> der <SEP> Zucht <SEP> Kolonie <SEP> und <SEP> der <SEP> Zucht <SEP> der <SEP> Kolonie
<tb> Kartoffel: <SEP> Gnundmycel <SEP> leinenfarbig <SEP> Kartoffel: <SEP> Groundmycel <SEP> gelb <SEP> Kartoffel: <SEP> Kolonien <SEP> weiss
<tb> Milch:
<SEP> Koagulierung, <SEP> Peptonisierupg <SEP> Milch: <SEP> Hydrolyse, <SEP> Peptonisierung <SEP> Müch: <SEP> Koagulnerung,
<tb> Peptonisierung
<tb> Gelatine: <SEP> liquidiert <SEP> nicht <SEP> oder <SEP> liquidiert <SEP> Gelatine: <SEP> .nicht <SEP> völlige <SEP> Liquidierung <SEP> Gelatine: <SEP> intensive <SEP> Liquidierung <SEP> teilweise <SEP> nach <SEP> längwur <SEP> Zeit <SEP> (Verflüssigung)
<tb> Nitrate: <SEP> reduziert <SEP> nicht <SEP> zu <SEP> Nitriten <SEP> Nitrate: <SEP> Reduktion <SEP> zu <SEP> Nitriten <SEP> Nitrate: <SEP> Reduktion. <SEP> zu. <SEP> Nitriten
<tb> Stärke: <SEP> Hydrolyse <SEP> fehlt <SEP> Stärke: <SEP> leichte <SEP> Hydrolyse <SEP> Stärke: <SEP> Hydrolyse <SEP> oder
<tb> Hydrolyse <SEP> fehlt
<tb> H.S <SEP> im <SEP> Triptonsubstnat: <SEP> H2S <SEP> im <SEP> Triptonmycel:
<SEP> - <SEP> scheidet <SEP> nicht <SEP> :aus <SEP> scheidet <SEP> nicht <SEP> laus
<tb> Rote <SEP> Blutkörperchen: <SEP> hämolysiert <SEP> nicht <SEP> Rote <SEP> Blutkörperchen: <SEP> hämolysiarti <SEP> Erzeugt <SEP> Oxytetracyc <SEP> hn <SEP> Erzeugt <SEP> Oxytetracyclin <SEP> Erzeugt <SEP> Aktinomycim,
<tb> Endoniycih, <SEP> Thiolutih
<tb> Mit <SEP> der <SEP> Ziffer <SEP> x <SEP> sind <SEP> die <SEP> Angaben <SEP> für <SEP> den <SEP> Stamm <SEP> Strepto <SEP> myces <SEP> rimosus <SEP> N. <SEP> R. <SEP> R. <SEP> L. <SEP> 2234 <SEP> vermerkt.
Die übrigen, S. albus und S. rimosusbetreffenden .Angaben, stammen aus der deutschen Patentschrift Nr. 862647 und aus Bergeys Manual of Determina- tive Bacteni:olo@gy, Willams Wllti@ns, Baltimore, 1948.
Die in der Tabelle 4 enthaltenen Angaben be- ziehen sich auf einen: Starau von Streptomyces armillatus sowie auf die Angaben von Mancy-Cour- tifiet D. und Pinnert-Sindico S.:
Ure .nouvelle espeoe @de S;treptomyces: Streptomyces ammiäatus ; Anal. In-st. Pasteur (1954), 87 580.
EMI0005.0054
<I>Tabelle <SEP> 4</I>
<tb> Actinomyces <SEP> varsoviensis <SEP> sp. <SEP> nov.
<tb> Nährboden <SEP> Wachstum <SEP> Luftmycel <SEP> Grundmycel <SEP> Lösliches <SEP> Pigment
<tb> Asparagin-Agar <SEP> mit <SEP> Glucose <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> Agar <SEP> Czapek <SEP> Doxa <SEP> mit <SEP> Saecharose <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> Nährboden <SEP> Glucose <SEP> und <SEP> Pepton <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> weiss <SEP> fUtblos <SEP> dunkel <SEP> gelb
<tb> (P1 <SEP> 12,-1-5)
<tb> Emerson <SEP> Nährboden <SEP> ++/+++ <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> Kartoffel <SEP> +++ <SEP> weiss <SEP> leivnenfarben <SEP> fehlt
<tb> (P1 <SEP> 12, <SEP> B-2)
<tb> Nährboden <SEP> mit <SEP> Stärke <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> Nälntboden <SEP> mit <SEP> Nietraten <SEP> + <SEP> + <SEP> /+ <SEP> + <SEP> + <SEP> reduziert <SEP> nicht <SEP> Nitrate <SEP> zu. <SEP> Nitriten
<tb> Gelatine <SEP> +++ <SEP> liquidiert <SEP> nicht <SEP> Gelatine, <SEP> nach <SEP> längerer <SEP> Zeit <SEP> liquidiert
<tb> @teilweise
<tb> Milch <SEP> bei <SEP> 26 <SEP> <B>+++</B> <SEP> koaguliert, <SEP> peptonisiemt,: <SEP> säuert <SEP> an.
Bei der Kultivierung von Actinomyces vanso- viensis sp. nov. kommen z. B. folgende in Frage:
Fructose, Glucose; Galactose, Mannose, Trähalose, Glycerin, Mannit, Natrium- succinat. Schwach ausgenutzt sind: Raffinose, Saccharose, Lactose, Inosit :sowie Natriumacetat.
von Actinomyceis varsoviensis werden in der Regel nicht assimiliert: Rhamnose, Maltose, Dulcit und Stärke.
EMI0006.0036
Streptomyees <SEP> armillatus
<tb> Nährboden <SEP> Wachstum <SEP> Luftmycel <SEP> Grundmycel <SEP> Lösliches <SEP> Pigment
<tb> Asparagin-Agar <SEP> mit <SEP> Glucose <SEP> +++ <SEP> entwickelt <SEP> schwach <SEP> grauigelblich <SEP> (fehlt
<tb> weiss
<tb> Agar <SEP> Czapek-Doxa <SEP> mit <SEP> Saccharose <SEP> <SEP> fehlt <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> Nährboden <SEP> Glucose <SEP> und <SEP> Popton <SEP> -I-++ <SEP> entwickelt <SEP> schwach <SEP> graugelblich, <SEP> fehlt
<tb> weiss <SEP> glatt
<tb> Emerson <SEP> Nährhode <SEP> +++ <SEP> entwickelt <SEP> gelbgrau, <SEP> glatt <SEP> blassrosain.'blass braun <SEP> übergehend
<tb> Kartoffel <SEP> +-f- <SEP> entwickelt <SEP> schwach <SEP> graugelblich, <SEP> fehlt
<tb> glatt
<tb> Nährboden <SEP> -mit <SEP> Stärke <SEP> <SEP> hydrolysiert <SEP> nicht <SEP> Stärkemehl
<tb> Nährboden:
- <SEP> mit <SEP> Nifaten <SEP> + <SEP> reduziert <SEP> nicht <SEP> Nitrate <SEP> zu <SEP> Nitriten
<tb> Gelatine <SEP> ++ <SEP> teilweise <SEP> Liqumdieruug <SEP> nach <SEP> 40 <SEP> Talgen
<tb> Milch <SEP> bei <SEP> 26 <SEP> ++ <SEP> koaguliert, <SEP> poptonisiert, <SEP> säuert <SEP> an
<tb> Aufklärung: <SEP> Wachstum <SEP> <SEP> sehr <SEP> schwach, <SEP> + <SEP> schwach, <SEP> -h+ <SEP> mittel, <SEP> +++ <SEP> gut <SEP> bis <SEP> sehr <SEP> gut <SEP> (üppig).
Aus synthetischem Nährboden nutzt Strepto- myees annAatus -folgende Kohlenquellen -aus:
Glu cose, Galactose, Mannose, Glycerin, Eritri t. Schwä- cher ausgenutzt worden:
ATabinose, Raffinose, Man- nit; NatrIumacetat, Natriumcitrat und Stärke. Strepto- myces armilllatas nutzt folgende Kohlenquellen nicht aus:
Xylose,- Rhamnose, Lävulose, SacchaTose, Mal tose, Lactose, Sogbit, Dulcit, Inosit und Natrium- tartr at.
Die physiologischen Eigenschaften von Actino- myces vars@oviensis, die sich .auf .dessen Assiani!1ie- rumgakapazität .der Kohlenquellen aus synthetischen Nährböden (Methode Priedham-Gottlieb) beziehen,
sind in der Tabelle 5 angegeben.
EMI0006.0091
<I>Tabelle <SEP> 5</I>
<tb> Ausnutzung <SEP> der <SEP> Kohlenstoffquellen <SEP> aus <SEP> synthetischem <SEP> Agar <SEP> durch
<tb> A. <SEP> varsoviensis, <SEP> S. <SEP> armillatus <SEP> i <SEP> S. <SEP> rimosus
<tb> Actinomyces <SEP> Streptomyces <SEP> Streptomyces
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> varsoviensis <SEP> armillatus <SEP> rimosus
<tb> sp. <SEP> nov.
<SEP> 2234
<tb> Glucose <SEP> _ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++l Galactase <SEP> - <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Mannose <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> ++
<tb> Fructose <SEP> +++ <SEP> _ <SEP> + <SEP> +++
<tb> Lackase <SEP> + <SEP> -@ <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Maltore <SEP> - <SEP> - <SEP> +
<tb> Sacchamose <SEP> <SEP> - <SEP>
<tb> Raffinose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Rhämmose <SEP> - <SEP> Trehalose <SEP> + <SEP> . <SEP> + <SEP> X <SEP> + <SEP> +
EMI0007.0001
<I>Tabelle <SEP> 5</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Actinomyces <SEP> Streptomyces <SEP> Streptomyces
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> varsoviensis <SEP> armillatus <SEP> rimosus
<tb> s<U>p</U>. <SEP> nov.
<SEP> 2234
<tb> Stärkemehl <SEP> - <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> Glycerin <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> +++
<tb> Mannit <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> ++
<tb> Dulcit <SEP> - <SEP> - <SEP> Inosit <SEP> X <SEP> - <SEP> X
<tb> Natriumsuccinat <SEP> <B>+++</B> <SEP> X <SEP> + <SEP> +
<tb> Natrsurnacetat <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> -+- <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Die <SEP> Zeichen <SEP> <B>+</B>, <SEP> +, <SEP> ++, <SEP> +++ <SEP> bezeichnen <SEP> den <SEP> Grad <SEP> der <SEP> Ausnutzung <SEP> der <SEP> Kohlen quelle, <SEP> den <SEP> bestimmten <SEP> Grad <SEP> des <SEP> Wachstumsdes <SEP> untersuchten <SEP> Stammes,
<tb> - <SEP> bezeichnet <SEP> Wachstummangel. <SEP> X <SEP> Ausnutzungsgrad <SEP> nicht <SEP> ermittelt <SEP> worden.
Die Angaben betr. S. armnllatus, S. rimosus und S. griseoflavu,s stammen aus dem Werk Mancy-Cour- tillet D. und Pinnet-Sindico S. (Ann. Inst. Pastenr, 1954, 87 580).
Die Angabe betr. Actnomyces varso- viensis .sp. nov. deuten daraufhin, dass dieser Stamm sich mit gewissen Merkanalen dem Stamm. Strepto- myces armillatus nähert (das Fehlen. der Reduktion vom,
Nitraten zu Nitriten, das Fehlen hydrolytischer Eigenschaften für Stärke). Von diesem Stammle unter- scheidet er sich idurch ,sein Verhalten auf Gelatine und durch den Wachsturncharakter auf ,gewissen Nähr böden,
wie dies aus den in der Tabelle 6 enthaltenen Angaben hervorgeht.
Auf Grund der genannten Angaben unterscheidet sich der Stamm Actinomyces varsoviensis sp. nov. be deutend von den Stämmen Streptomyces rdmosus und Streptornyces griseoflavus.
EMI0007.0065
<I>Tabelle <SEP> 6</I>
<tb> Nährboden <SEP> Actinomyces <SEP> varsoviensis <SEP> Streptomyces <SEP> armillatus <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> Streptomyces <SEP> griseoflavus
<tb> Synthetischer <SEP> schwaches <SEP> Wachstum, <SEP> schwaches, <SEP> Wachstum,
<SEP> wächst <SEP> nicht <SEP> Grundmycell
<tb> Nährboden <SEP> fehlt <SEP> Pigment <SEP> fehlt <SEP> Pigment <SEP> orange <SEP> oder <SEP> braunrosa,
<tb> Pigment <SEP> Massgelb
<tb> Kartoffel <SEP> ' <SEP> Grundmyeel <SEP> leinen- <SEP> Grundmycel <SEP> graugelb, <SEP> Grundmycel <SEP> Grundmycel <SEP> Flechten faTben, <SEP> leicht <SEP> gekräuselt, <SEP> glatt, <SEP> fehlt <SEP> Pigment <SEP> braungekräuselt, <SEP> typ, <SEP> crernfarben <SEP> oder
<tb> fehlt <SEP> Pigment <SEP> Pigment <SEP> Massgelb <SEP> braunrosa, <SEP> fehlt <SEP> Ngment
<tb> Gelatine <SEP> teilweise <SEP> Liqui!diexung <SEP> langsame <SEP> Liquidierung <SEP> teilweise <SEP> ,schwache <SEP> Liquidierung,
<tb> (Verflüssigung) <SEP> nach <SEP> Pigment <SEP> braunrosa <SEP> Liquidierung,
<SEP> Pigment <SEP> blassgelyblich
<tb> längerer <SEP> Zeit <SEP> fehlt <SEP> Pigment
<tb> Milch <SEP> bei <SEP> 26 <SEP> alkalisiert, <SEP> koaguliert, <SEP> Koaiguhezung, <SEP> Peptoni- <SEP> ändert <SEP> nicht <SEP> schnelle <SEP> Pepton!snerung
<tb> peptonisiert, <SEP> gäuemt <SEP> an <SEP> sierung, <SEP> Ansäuerumg <SEP> ohne <SEP> Koagulierung
<tb> Ernersom <SEP> Grundrnycel <SEP> farblos, <SEP> G@rundmycel <SEP> Cmundmyced <SEP> Grundmycel <SEP> Flechten
<tb> Nährboden <SEP> glatt, <SEP> Pigment, <SEP> fehlt <SEP> graugelblich, <SEP> glatt, <SEP> oravage, <SEP> rissig, <SEP> typ, <SEP> Gremfanben <SEP> oder
<tb> oder <SEP> Massgelb <SEP> Pigment <SEP> blassrosa <SEP> Pigment <SEP> gelbbraun <SEP> braun, <SEP> Pigment <SEP> gelblich
<tb> Nitrate <SEP> Fehlt <SEP> Reduktion <SEP> fehlt <SEP> Reduktion <SEP> zu <SEP> Reduktion <SEP> zu <SEP> Reduktion <SEP> zu.
<SEP> Nitriten
<tb> zu <SEP> Nitriten <SEP> Nitriten <SEP> Nitriten
<tb> Stärlm <SEP> Hydrolyse <SEP> fehlfit <SEP> Hydrolyse <SEP> fehlt <SEP> leichte <SEP> HydTolyse <SEP> begrenzte <SEP> Hydrolyse Die Angaben betr. Strep@tomyce)s vendargensis und Streptomyces rimosus sind aus der schweizerischen Patentschrift Nr.
331998 entnommen. Die Beschrei buneen der dort angegebenen ,Stämme sind unzurei- chend, da sie die Charakteristik der physnologischen Grundmerkmale nicht aufweisen. Die Differenzierung zwischen S. vendargensis und S.
romosus ist in dem genannten Patent hauptsächlich, darauf glestützt, da.ss S. vendargensis ausser Oxytetracyclin noch einanderes Antibiotikum, Vengicid, produziert, während S.
rimosus ausser Oxytetracychn ein zweites Antibiotikum, Rimo- cidin, produziert. Vengicid rund Rimocidin unterschei den ;sich voneinander durch physikochemnsche und biologische Eigenschaften.
Auf Grund. der angeführten Angaben betr. die Charakteristik der Züchtung der drei miteinander verglichenen Strahlenpilzstämme können grundsätz liche Verschiedenheiten zwischen Actinoanyoes varso- viensis und <RTI
ID="0008.0042"> den; ebenden übrigen Stämmen festgestellt wenden (siehe Tabellen 7 und 8). Aus dem ange- führfien Vergleich ist ersichtlich,
dass der Stamm Actinomyces varsoviensis sp. nov. im Vergleich mit den anderen. untersuchten Stämmen sich durch ein leichteres Luftmycel und ein farbloses oder leicht gelbes Gru.ndmycel unterscheidet;
ausserdem erzeugt er ein gelbes, in das Substrat diffundierendes Pigment. In Wirklichkeit sind die Unterschiede zwischen dien verglichenen Stämmen, insbes@ond@ere zwischen Actino- myces vamsoviensis und Streptomyces rimasus,
deut- licher undbetreffen physiologische Merkmale. Diese Unterschiede sind in der Tabelle 8 angegeben.
EMI0008.0093
<I>Tabelle <SEP> 7</I>
<tb> Aotinomyces <SEP> varsaviensis <SEP> sp.
<SEP> nov.
<tb> Nährboden <SEP> Luftmycel <SEP> Grundmycel <SEP> Lösliches <SEP> Pigment
<tb> A.gar <SEP> mit <SEP> Hafermehl <SEP> weiss <SEP> - <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> Fmerson-Agar <SEP> weiss <SEP> farblosfehlt
<tb> Sabouraud-Agar <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> schwefelfarben
<tb> (12 <SEP> L-4)
<tb> Kantoff <SEP> e1 <SEP> Agar <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> fehlt
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Natriumcitrat <SEP> weiss <SEP> f <SEP> Übles <SEP> fehlt
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Glucose <SEP> und <SEP> weiss <SEP> farblos <SEP> pyritfarben
<tb> Nitraten <SEP> (12 <SEP> L-3)
<tb> Kartoffel <SEP> weiss <SEP> leinenfarben <SEP> fehlt
<tb> - <SEP> (12 <SEP> B-2)
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Stänke <SEP> weiss <SEP> .
<SEP> farblos <SEP> fehlt
EMI0008.0094
Streptomyces <SEP> vendargensis
<tb> Nährboden <SEP> Luftmycel <SEP> Grundmycel <SEP> Lösliches <SEP> Pigment
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Hafennehl <SEP> fehlt <SEP> hellgelb <SEP> fehlt
<tb> (11 <SEP> F-4)
<tb> Emerson <SEP> Agar <SEP> weiss <SEP> hellbraun, <SEP> fehlt
<tb> (13 <SEP> 1D-5)
<tb> Sabouxaud-Agar <SEP> weiss <SEP> gelblich <SEP> fehlt
<tb> (12 <SEP> F-3)
<tb> Kartoffel-Agar <SEP> fehlt <SEP> braun <SEP> fehlt
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Natriumcitrat <SEP> fehlt <SEP> weiss <SEP> fehlt
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Glucose <SEP> und <SEP> fehlt <SEP> hellgelb <SEP> fehlt
<tb> Nitraten <SEP> (10 <SEP> B-1)
<tb> Kartoffel <SEP> weiss <SEP> gelb <SEP> oder <SEP> braun <SEP> fehlt
<tb> (12 <SEP> D-5, <SEP> 13 <SEP> L-7)
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Stärke <SEP> weiss <SEP> hell,
<SEP> farblos <SEP> fehlt Die Beschmibung des Stammes ätreptoanyces vendaxgensis sp. nov. stammt aus der schweizerischen Patentschrift Nr. 3319$8.
EMI0009.0001
<I>Tabelle <SEP> 8</I>
<tb> Actinomyces <SEP> Streptomyces:
<SEP> Streptoriyces
<tb> Nährboden <SEP> varsoviensis <SEP> vendargensis <SEP> rimosus
<tb> Agaer <SEP> mit <SEP> Hafermehl <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> fehlt <SEP> A <SEP> weiss
<tb> B <SEP> farblos <SEP> B <SEP> hellgelb <SEP> B <SEP> dunkelbraun
<tb> (11 <SEP> F-4) <SEP> (8 <SEP> C-12)
<tb> P <SEP> fehlt <SEP> P <SEP> fehlt <SEP> - <SEP> P <SEP> dunkel
<tb> Emerson-Agar <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> weiss
<tb> B <SEP> hellbraun <SEP> B <SEP> hellbraun <SEP> B <SEP> dunkelbraun
<tb> (13 <SEP> D-5) <SEP> (13 <SEP> D-5) <SEP> (15 <SEP> A-12)
<tb> P <SEP> fehlt <SEP> P <SEP> fehlt <SEP> P <SEP> dunkel
<tb> Sabo#umaud <SEP> Agar <SEP> A <SEP> wdss <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> gelbweiss
<tb> B <SEP> farblos <SEP> B <SEP> gelb <SEP> (12 <SEP> E-3)
<SEP> B <SEP> schwarzbraun
<tb> P <SEP> schwefeltarben <SEP> P <SEP> fehlt <SEP> P <SEP> dunkel
<tb> (12 <SEP> L-4)
<tb> Kartoffel-Agar <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> fehlt <SEP> A <SEP> weiss
<tb> B <SEP> farblos. <SEP> B <SEP> braun <SEP> B <SEP> braun <SEP> bis <SEP> violett- <SEP> ,
<tb> P <SEP> fehlt <SEP> P <SEP> fehlt <SEP> P <SEP> fehlt
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Natriumcitrat <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> fehlt <SEP> A <SEP> fehlt
<tb> B <SEP> farblos <SEP> B <SEP> weiss <SEP> (2 <SEP> A-1) <SEP> B <SEP> grawgrün
<tb> P <SEP> fehlt <SEP> P <SEP> fehlt <SEP> (3 <SEP> A-1, <SEP> 13 <SEP> 7-5)
<tb> P <SEP> fehlt
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Glucose <SEP> und <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> fehlt
<tb> Nitraten <SEP> B <SEP> farblos.
<SEP> B <SEP> hellgelb <SEP> B <SEP> bräun <SEP> (13 <SEP> K-9)
<tb> P <SEP> pyritfanben <SEP> (10 <SEP> B-1) <SEP> P <SEP> gelb
<tb> (12 <SEP> L-3) <SEP> P <SEP> fehlt
<tb> Kartoffel <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> weiss
<tb> B <SEP> leinenfärben <SEP> B <SEP> gelb <SEP> oder <SEP> braun <SEP> B <SEP> <B>gelb</B> <SEP> (12 <SEP> E-5)
<tb> (12 <SEP> B-2) <SEP> (12 <SEP> D5,13 <SEP> L-7)
<tb> Agar <SEP> mit <SEP> Stärke <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> weiss <SEP> A <SEP> weiss
<tb> B <SEP> farblos <SEP> - <SEP> B <SEP> hell,
<SEP> farblos <SEP> B <SEP> braun
<tb> P <SEP> fehlt <SEP> P <SEP> fehlt <SEP> P <SEP> heubraun
<tb> A <SEP> = <SEP> Luftmycel <SEP> B <SEP> = <SEP> Grundmycel <SEP> P <SEP> <B>=</B>im <SEP> Nährboden <SEP> lösliches <SEP> Pigment Zur Herstellung von Oxytetracyclineignen sieh ausser ,Actinomyces. varsoviensis sp. nov. auch einige seiner natürlichen Mutanten oder künstlichen Mutan ten, ,die durch bekannte;
stark wirksame Mutagene, wie z. B. Ultraviolettstrahlen, Stick- stoff-Lost und andere, induziert worden sind. Diese Mutanten: unterscheiden ,sich zuweilen bedeutend von denn ursrpünglichen Stamm.
Die wesentlichen Unter schiede betreffen die Färbung des Giv;ndmyoels, .des firn Substrat löslichen Pigments, die Art und Weise des Ausnutzens der Kohlenstoffqueällen und des Stick stoff s ,au;s,den synthetischen Nährböden und vor :allem betreffen die Unterschiede die antibiotische Aktivität.
Zur Selektion natürlicher und künstlicher Mutar- ten wurde zum ersten Mal unter den Strahlenpilzen ein Verfahren zur Bestimmung der Stammescharak teristik, welches Populationsmuester benannt wor den ist,
angewandt. Es gestattet riecht nur- genaue- Beschreibung der Population der gegebenen Mutar- ten, sondern auch Proben zum Auffinden des.
Zu <U>sammenhanges</U> zwischen den morphologischen Merk- malen der Population und ihrer antibiotischen Akti- vität. Diese Verfahrensweise erleichtert 3n:
hohem. Masse die Selektion in antibiotischer Hinsicht hoch ausgiebiger Stämme von Actinmnyces varsovensis sn. nov. Es wurde auch eine einfache, billige und schnelle Methode ausgearbeitet;
die es erlaubt, innerhalb von 18 Stunden aus einer solchen Population Mutanten von höherer antibiotischer Leistungsfähigkeit auszu sondern. Eine :
eingehende Beschreibung beider Selek- tiansmethoden ist im Biulctyn Informacyjny Ins & tyüutu Antiotykow; Warazawa, 1959, 2, Heft 6, angegeben.
Auf Grund der erwähnten Vergleichsangaben betr. die Stämme der Strahlenpilze: Streptoanyces albus; .S. griseoflavus, S. rimosus, S. armillatus,, S. pla- tensis und S. vendargens:
is russ festgestellt werden, das A. varsoviensis sp. nov. mit keiner der genannten Gattungen identisch: ist.
Actinomyees varsoviensis p. nov. .ist, wie gesagt, eine neue, bisher nicht beschriebene, Oxytetracyclin herstellende Strahlenpilzart.
Zwecks Erzeugung von Oxytetracychn züchtet man den Stamm Actinomyces varsoviensis p. nov., wie gesagt, suubmers und aerob in flüssmgemm Nähr- medium,
zweckmässig auf dem Schüttelapparat und in geschlossenem Gefässen, die vor Verunreinigung durch andere Mikrooagan ;
smen schützen, gleich- zeitig wird belüftet, zweckmässig durch Zufuhr von steriuler Luft oder sterilem Sauerstoff.
Im allgemeinen wenden besondere Bedingungen eingehalten, unter denen die für die Biosynthese des Oxytetracyclins günstige Züchtung des Stammes Aeinoanyces varsoviensis ;
sp. nov. erfolgt und die dem. Zyklus der Biosynthese, die Substrate, die Züchtungs- teempematur, die eigentliche Fermentation und die Zeit- dauer derselben, die Belüftung usw. betreffen.
Der Stamm; Actmomyoes varsoviemsis - sp. nov. wird zweckmässig auf einen entsprechenden Sporula- tionsnährboden,oder in, Lyophilform aufbewahrt.
Bei der Aufbereitung wird am besten wie folgt vorgegangen: Die Stämme des Actii-nomyces sp. nov. auf S:poru- lationnährbodeu können ohne Veränderung etwa 6 Wochen im Gefrierapparat bei:
-201>C und in der Kühlvorrichtung bei + 4 C sowie etwa 3-.6- Monate bei Zimmertemperatur (etwa + 18o- C) aufbewahrt werden.
Bei der Aufbewahrung bei Zimmertempera- tur werden zwecks Verhütung eventueller ungünstiger Andarungen, -.die in der Züchtung vorkommen kör neu, .im:
die Probiergläser mit schrägem Agar einige cams flüssigen, -sterilen Paraffins; das die ganze Kultur oberfläche bedecken russ,. :gegossen.
Aetinomyces varsaviensis sp:: nov. kann man in einem entsprechenden Eiweiss und Kohlenhydrate enthaltendes Medium in Lösungen von Anunosäumen öder einigen organischen Saunen,
oft mit Zugabe .einer schützenden Substanz zwecks Verhütung von Verlusten der Vitalität bei der Resuspension des lyophiksierten Materials, lyophmliiseren. Es wurde festgestellt,
dass das beste Medium für die Sporen des Actinamyces vaatsoviensis ein Gemisch von 100/aiger Saccharoselösung und 1% iger Gelaiinelösung ist. Die Endfeuchtigkeit des lyophlisierten Materials russ hierbei 0,
2-1 /o betragen. Die Aaspullen oder Flaschen, in denen die lyophilisierten Sporte des Actnnomyces. varsoviensis sp.
nov. aufbewahrt wer den, müssen dabei unter vermindertem, 30-100 man Hg ausmachendem Druck dicht verschlossen (zuge- schmoIzen), oder mit Stickstoff gefüllt werden.
Die Sporen des Stammes Actinomym varso- viensis sp. nov. kann man auch in einem Gemisch von Erde und Sand bei Zimmertemperatur (etwa 18 C)
oder bei Kühlhaustemperatur (etwa + 4 Q aufbewahren. Die mit Sand vermischte Erde, in die die Sporensuspension eingeführt worden ist,
kau langsam bei Zimmertemperatur getrocknet werden öder sie kann aus denn Gefrierzustand im hohen Va kuum getrocknet werden.
Eine andere Aufbewahrungsmethode von Sporen der Stämme Actinomyoes varsoviensis sp. nov. ist die Aufbewahrung derselben auf vorher sterilisierten und getrockneten. Pflanzenprodukten, z. B. auf verschie- denen Grützen (Hirse).
Nach vorheriger mehrtägiger Ausbrütung bei entsprechender Temperatur (24 bis 26 C) verteilen sich die Sporen über die ganze kugelförmige Oberfläche der Pflanzenkörner und kön nen danach in Wasser suspendiert werden und zum Impfen des. flüssigen Saatnährbodens dienen.
Die erwähnten Arbeitsweisen zum Aufbewahren des Stammes Actinomyces vor so:vsensis. sp. nov. sichern diesen Stamm vor Änderungen seiner physio logischen Merkmale und antibi ötischen Eigenschaften.
Der Sponulationsnähmböden für den Stamm Actino- myces varso:viensis sp. nov. kann ausser natürlichen Stickstoffquellen, wie z.
B. Kartoffelextrakt, Weizen- kleieextrakt und .andere pflanzhcheoder tierische Extrakte, auch Amnosäuren, Ammoniumsulfat oder Natriuannitrat enthalten. Geeignete Kohlenstoff- quellen;
sind einfache Zucker oder Polysaccharide, höhere Alkohole, Melasse, Malzextrakt und .andere. Ausserdem kann das SporulatioLnsnährmedium einen Zusatz, an Mineralsalzen und einen. Zusatz an Mikro elementen, z.
B. Kobaltsalz in einer Menge von: 0,1 bis 1 mg "!o enthalten .sowie schliesslich 1,5-3 % Agar.
Als zum Impfen des Saatnährbodens dienendes Inoculum kann die 6-14 tägige Kultivierung von Aetinomyces vaTsoviensis sp. nov. bei optimal <B>26 </B> C dienen, aus der eine Sporensuspension hergestellt wird.
Zusammensetzung geeigneter Sporulationsn;ähz- medien für Actinornyces varsoviensis sp. nov.:
EMI0010.0418
<I>Nährmedium <SEP> 1</I>
<tb> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> g
<tb> C0C12, <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,0005 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 25 <SEP> g
<tb> wässriger <SEP> Kartoffelextrakt <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> (erhalten <SEP> durch <SEP> Extraktion
<tb> binnen <SEP> 2-3 <SEP> Stunden <SEP> in
<tb> fhessendem <SEP> Dampf)
<tb> pH <SEP> 6,6-6,8
EMI0011.0001
<I>Nährmedium <SEP> 2</I>
<tb> Malsweiehextrakt <SEP> (50 <SEP> %a) <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Kartoffelstärke <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 15 <SEP> g
<tb> (NH4SO4 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> g
<tb> KH2P04 <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> g
<tb> CaCO3 <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 15 <SEP> .g
<tb> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> pH <SEP> 6,6-6,8 In der Biosynthese des Oxytetracyclins durch den Stamm Actinomyces varsoviensis in grosstechnIschem Massstab wird vorteilhaft ein aus drei Etappen be stehender Züchtungszyklus verwendet:
A. Vonibereitung des vegetativen Saatmateäals auf dem Schüttelapparat, B. Vorbereitung eines grösseren Volumens an vege- tativem Saatinoculum äm Fermentationstank und C. die eigentliche Fermentation, - während welcher :das Antibiotikum Oxytetracyclin gebildet wird.
In allen drei Etappen der im grosstechnischen Massstab geführten Biosynthese wind die Submers- kudtivierung sowohl sauf dem Schüttelapparat als,
auch in Feimentationstanks verschiedenen Vollumens ange- wandt. Diese Tanks müssen hierbei mit Vonichtuni ,gen versehen sein, die ,eine kontinuierliche Belüftung mittels ,steriler Luft, das Mischen des Nährbodens,
dii Aufrechterhaltung !einer konstanten Temperatur gestatten, sowie mit Vorrichtungen ausgerüstet sein, die es erlauben,
den Verlauf der Ferrnentation zu kontrollieren und zu registrieren. Diese Vorrichtungen gestatten die Bestimmung und die Aufrechterhaltung eines optimalen pH-Wertes des Nährbodens, die Er gänzung der während der Fermentation erschöpften Bestandteile des Nähirbodens, z.
B. der Köhlenstoff- queillen, die Einführung vorn die Erzeugung von: Oxy- tetracyclin anregenden Verbindungen ,sowie Mittel zur Verhinderung des Schäumens der Nährlösung und dergleichen.
Die einzelnen Etappen bei der genannten Arbeits weise unterscheiden sich voneinander durch eine verschiedene Zusammensetzung und durch einen verschiedenen pH-Wert der Nährlösung,
verschiedene Temperatur und Zeiitdauer der Züchtung sowie durch deren verschiedene Lüftungsbedingungen.
Die Nährlösung enthält, wie gesagt, eine Stick- stoffquelle, z. B. eine organische oder anosgamsche Stickstoffquelle oder ein Gemisch beider; sowie einte Kohlenstoffquellle, eine Mineralsalzquelle und eine Quelle für Spurenelemente;
die Nährlösung kann ausserdem Calciumcarbonat enthalten.
Als Quellen für Mineralsalze und Spurenelemente kommen im allgemeinen die natürlichen Bestand- teile des Nährmediums, die pflanzlicher oder-anima- lischer Herkunft .sind, in Betracht. Die Häuptstick- stoffquelle .im Nährstoff,
bilden z. B. Maiseich extrakt, Fleischextrakt und dergleichen.
Von den am meisten angewandten Stickstoff- quellen ist zu erwähnen: Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Hefe, Hefeextrakt, Hefehydrolysat, Casein; :
saures Caseinhydrolysat, mit Bauchspeicheldrüsen- ferment geätztes Casein, Maisweichextrakt, Sojamehl, Extrakte und Hydrolysate aus diesem Mehl, Erdnuss- mehl, gean ahlene Erdnüsse, Extrakte und Hydnollysate aus Erdnüssen, Mehl aus Baumwollsamen,
Mehl .aus Sonnenblumensamen und aridere natürliche Stick- stoffquellen pflanzlicher und- animalischer Herkunft sowie aus diesen hergestellte Extrakte, gequollene Er- zeugnIsse und Hydrolysate;
anstelle der oder neben den erwähnten können ausserdem Ammoniumsullfat oder Nitrate verwendet werden. Der Zusatz :einigeir der erwähnten Stickstoffquellen, z.
B. Maisweichextrakt, zum Nährstoff, in dem -die Hauptstickstoffquelle :gemahlene Erdnüsse sind, haben eineu stimulierenden Einfluss auf die Erzeu- gung des Oxytetracyclins..
Als Kohlemstoffquelien kann man lösliche oder unlösliche Kohlenhydrate verwenden,- z.
B. Siaccha rosen, Maltosen, Glucosen und andere einfache Zucker oder deren Gemische, Stärke, Kartofffehnehl, Maismehl, Malzextrakt oder Gennische mit den vor her erwähnten einfachen zuckern. Man:
kann, auch höhere Alkohole verwenden; z. B.RTI ID="0011.0249" WI="14" HE="4" LX="1611" LY="1097"> Glycerin, Mammt und andere. Für einige natürliche und künstliche Mutanten des Actinomyces varsoviensis ,sp. nov. ;haben sich pflanzliche Öle, z.
B. Ärachisöl; Sojäöl, Sonnenblumenöl und andere, _ als geeignete Kohlen stoff quellen erwiesen. Der Prozentgehalt der einzel- nen Bestandteil,
-des Substrates russ in der Regel für jeden Mutanten gesondert festgelegt werden. Für einfache Zucker beträgt er 0,5 bis 5 /o, für Öle 0,5 bis 3 19/m.
<I>Beispiel</I> l Die Kultivierung eines Stammes. von Actino- myces var;soviensis sp. nov. wird in: drei Etappen :durchgeführt.
Die 1. Etappe dies Ferrnentationszyklus dauert 24-48 Stunden:, abhängig von :der Meinige der für die Inokulatie:n angewandten Sporen des Mikroorganis mus, der Zusammensetzung des Nährmediums., der Züchtungstemperatur; der Intensität der Belüftung;
!die wiederum vom Typ des Schüttelapparates, der, Zahl der Schüttelumgen bzw. Umdrehungen- sowie von Hub,
.schliesslich von der Gestalt des Gefässes und des Verhältnisses des Volumens des Gefässes zum Volumendes in ihm befindlichen Nährmediums abhängig ist: Für Actinomyees varsoviensis Sp. nolv. erwiesen ,sich in der 1.
Etappe als optimale Bedingungen die fdligenden: 2-5,1/o Suspension der Sporen eines Schrägägars von vorher angegebener Zusammen ;
Setzung, ein einem Maisweichextraktenthaltendes Sub strat, ErdnussmeM, Ammoniumsulfat, Stärke, Na triumehlorid und Calcumearbonat in entsprechenden Verhältnis: 80 ml .dieses Nährbodens in 500 ml Erlenmeyerkoliben;
das Nährmedium wind nach der Impfung mit Sporen auf einen. Schüttelapparat mit 180 Umdrehungen pro Minute;
mit feinem <B>Hub</B> von 3-5 cm, gebracht und bei einer Temperatur von 20 C, meistens 24 Stunden lang ausgebrütet. Oft werden in dieser Etappe zwei Sieburigen von dem ärnneren Nährmedium auf Idas eine reichere Kohlen.- stoffquell.e <RTI
ID="0012.0014"> enthaltende Nährmedium. angewandt.
EMI0012.0017
<I>Nährmedium <SEP> 3</I>
<tb> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Kdbaltchlorid <SEP> : <SEP> - <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,0005 <SEP> g
<tb> Caciumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> g.
<tb> Wässriger <SEP> Kartoffelextrakt <SEP> . <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> Sojaöl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> ml
<tb> pH-Wert <SEP> 6,6 <SEP> bis <SEP> 6,8
EMI0012.0018
<I>Nährmedium <SEP> 4</I>
<tb> Maisweichextirakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> - <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Gemahlene <SEP> Arachidschnitzel <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> <B>g</B>
<tb> Kartoffelmehl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> 25 <SEP> kg
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Natriumchlörid <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1000 <SEP> m1
<tb> pH <SEP> 5;7 <SEP> bis <SEP> 5,8
EMI0012.0019
<I>Nährmedium <SEP> 5</I>
<tb> Maisweichextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> :
<SEP> 7 <SEP> g
<tb> Arachidschnfzel <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Kartoffelmehl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 45 <SEP> -g
<tb> Ammonumsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> , <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Calcumcarbonät <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Kabaltsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,02 <SEP> g
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> pH <SEP> 6,0 <SEP> bis <SEP> 6,2 Die 2.
Etappe des Züchtungszyklns danert eben- falls 24-48 Stunden, abhängig von den Fcrunenta- tionsbedingungen. In eineue das Kulturmedium ent- haltenden 1000-1-,Fermentationstank beträgt, bei 28 C,
die Züchtungszeit etwa 30 Stunden. Das Nähr- Medium, enthält ein Gemisch entsprechender Mengen Maisweidchlextrakt, Ammoniumsulfat, Kamtoffeltnehl, Natriumchlorid, Calciumcarbonat und Arachisöl (als Antischäumungsmiütel für die Nährlösung)
. Das Vo- lumen. des aus der 1. Etappe der -Züchtung auf denn Schüttelapparat stammenden vegetativen Inoaulums beträgt mehr als<B>0,0501o</B> (0,1-10/0) des gesamten Volumens der Nährlösung des 1000-1-Tanks. Die Belüftung der Kultur erfolgt mit 0,2-0,
6 des Luft volumens auf 1 Volumen des Nährbodens pro Mi- nute. Die Drehzahl des Rührers ,beträgt 220 bis 360 Umdrehungen pro Minute.
EMI0012.0079
<I>Nährmedium <SEP> 6</I>
<tb> Erdnussmehl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>20</B> <SEP> g
<tb> Maisweichextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Malzextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Ammontumsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> ig
<tb> Natriumchlbrd <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> - <SEP> . <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Calciumearbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> .- <SEP> . <SEP> . <SEP> 10:g
<tb> Sojaöl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> ml
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> pH <SEP> 6,6 <SEP> bis <SEP> 6;
8 Die 3. Etappe des Züchtungszyklus des Stammes Actinomyces varsoviensis sp. nov., in der die elgent hche Fermentation stattfindet, während welcher das Oxytetracycliln erzeugt wird, dauert, :
abhängig von den Züchtungsbedingungen, 140 bis 150 Stunden. Im Fenmentationstank mit einem Volumen von 15 000 1, der 10 000 1 Nährlösung, welche Arachid- mehl, Maisweichextrakt, Ammoniumsulfat, Kartoffel- mehl, Käba;
ltsalz, Calaiumcarbonatund Arachisöl als Äntischäumungsmittel für die Nährlösung lenthält, dauert die Fermentation 144 Stunden, bei einer Tem- paratur von 28 C und bei einer Züchtungsbelüftung, die 0,6 bis 0,8 des Luftvolumens auf 1 Nähnboden- volumen pro Minute beträgt.
In dieser Zeit wird die maximale Ansammlung des Oxytetracyclins inn Nähr medium. festgestellt.
EMI0012.0135
<I>Nährmedium <SEP> 7</I>
<tb> Maisw <SEP> echextrakt <SEP> <B><I>(5001e)</I></B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Kartoffelmehl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 37,5 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6 <SEP> g
<tb> Natr@umchlorid <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 1000 <SEP> <I>ml</I>
<tb> Sojaöd <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> g
<tb> pH <SEP> 6,0 <SEP> bis <SEP> 6,2 Die Ausbeute nach 168 Stunden Fermentation im Kolben auf dem Schüttelapparat beträgt 282 mcg .pro ml; pH = 7,1.
EMI0012.0145
<I>Nährmedium <SEP> 8</I>
<tb> Erdnussmehl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Maiswechextrakt <SEP> (5011/o) <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Natriumsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Malzextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Natriumchlolrid <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Caleiumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Sojaöl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> pH-Wert <SEP> 6,6 <SEP> bis <SEP> 6,8
EMI0012.0146
<I>Nährmedium <SEP> 9</I>
<tb> Gemahlene <SEP> Arachidsehnitzel <SEP> . <SEP> 22,5 <SEP> g
<tb> Malswaichextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,3 <SEP> g
<tb> Kartoffelmehl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 40,0 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 3,6 <SEP> g
<tb> Kobaltsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,018 <SEP> g
<tb> Arachisöl <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,8 <SEP> g
<tb> Calcumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 6,3 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb> pH-Wert <SEP> 6,3 <SEP> bis <SEP> 6,5 In der 48. und 60.
Fermentationsstunde isst je 2,5 g Sojaöl zuzugeben. Im B. Nährmedium bildet das Sojaöl, ähnlich wieder Malzextrakt,eine Kohlen stoff quelle.
Die Ausbaute nach 120 F.ermentationsstunden im Kolben auf dem Schüttelapparat beträgt: 320 E in 1 m;1; pH = 6,8 für das B. Nährmedium und 356 E in 1 ml, pH = 6,9 für das 9. Nährmedium.
Während die 3. Etappe zur Biosynthese des Oxy- tetracyclins führt, dienern die zwei ersten Etappen zu Heustellung des Inooulunts zum. Beimpfen des Nähr- mediums der Etappe 3,
das heisst zum Beimpfendes eigentlichen Fermentationsnährbodens.
In allen Züchtungsetappen wird :das Inooulum mittels cytochernischen Methoden kontrolliert (in nach der Grammethode gefärbten Präparaten russ das Saatinoculum zu 90 % gram-positiv sein)
. Eine wichtige Rolle spielt auch die Kontrolle :und die Auf rechterhaltung des- entsprechenden, pH-Wertes des Mediums in den -einzelnen Etappen, insbesondem der p11-Wert des Saatinoeulums und des pH-Wertes der Nährlösung während der eigentlichen Fermentation. <B>In</B> der 3.
Etappe russ der pH-Wert der Nährlösung in den folgenden Grenzen aufrechterhalten werden: vor der Impfung mittels des aus denn. 1000-l@Tank stammenden Saatinoculums russ der pH-Wert des N"ah;rnnediums .in den Grenzen von 6,2-6;
9 liegen., während der Fernnentation kann er auf 6,8-8;8 an steigen und am Schluss der Fermentation russ er in den Grenzern. der Ausgangswerte 6,2-6;9 hegen.
Mittels der Papierchromatographie in Systemen, die wassergesättigtes Äthylacetat sowie Butylketon- metihylsobutyl-nHbutaaolacetat im Verhältnis von 5:15:
2 entwickeln, wurde im Fentmentationsnähr- medium die Anwesenheit nur einer antibaktenellen Substanz bei der biologischen Entwicklung des Chromautogramms mittels des Bacifilus su 'f i s. 6633 festgestellt. Die Lage dieser Substanz -auf <RTI
ID="0013.0112"> dein Löschpapierstreifen entsprach der Lage er durch das Oxyitetracychn hervorgerufenen Hemmungszone.
Nach Beendigung der Fermentation des Nähr- mediums kann man das gebildete Oxytetracyclün durch verschiedene bekannte Verfahren aus der Fer- mentationsflüssigkeit isolieren.
Zwecks Abtrennung des Mycels wird. die Fermen- tationsflüssigkeit auf pH 1-,5 bis 2,0, vorzugsweise pH 1,8, mit Oxalsäure bei stetigem Rühren ange säuert.
In diesen: p13 Grenzen erfolgt die Zersetzung der während der Fermentation entstandenen .Oxy- tetracyclinkomplexsalze mit Calcium und Magnesium sowie der vollkommene Übergang des Antibiotikums in die Lösung. Bei xliesen Bedingungen <RTI
ID="0013.0166"> erfolgt auch die teilweise Niederschlagung von Eiweiss- und anderer in der Mischung :enthaltenen Verunreiniguni gen,
was das Filtrieren -erleichtert und den Erhalt eines durchsichtigen Filtrates gestattet. Nach denn Ansäuern wird etwa 6 %, Kieselgur als Filtrierhilfs- mtted zugageiben,
das -Ganze wird 30 Minuten lang energisch gerührt, wonach das Mycel zusammen mit dem niedergeschlagenen Calciumoxalat :albfiltriert wird.
Aus dem durchsichtigen Filtrat kann man das Antibiotikum mittels eines -allgemem ?bekannten Ver- fahrens zum Isolieren und Reinigen der Antibiotika ausscheiden. Das Oxytetracycliu weist als .amphotere Verbin dung sowohl saure als auch <RTI
ID="0013.0222"> basische -Gruppen mit den Dissoziationskonstanten pK 3,5, 7,6:9,2 auf, welche die Adsorptonsfähigkeit des Antibiotikums auf Iornenaustauschern bestintmen.
Zur chemischen Aufarbeitung des Antibiotikums werden folgende ionenaustauscher angewandt:
Kat- ionenaustauschez CBC-3 (ein sulfoniertes .Polymerisa tiornsprodukt von Styrol und B@utadien)., Anionaus- tauscher <B>AN -2</B> (ein Polymerisationsprodukt von Mel- amin und Formaldehyd),
.Anionaustauscher EDE-le RTI ID="0013.0259" WI="6" HE="4" LX="1079" LY="653"> (ein Polymerisationsprodukt von Abhylendsamin und Formaldehyd), ank welchen ,eine Säule -bis 20 cm Höhe gefüllt wird. Das Verhältnis des Durchmessers der Säule zu ihrer Höhe beträgt 1:
10. Die Durch- flussgeschwindigkeit des NährmediunÜilatrats durch die Ionenaustauschersäuse beträgt 200 ml@/cm2/Std. Die Ausbeute -der Adsopption des Autibiotkums,ad dem Ionenaustauscher hängt in hohem. Masse von der Konzentration :
des Oxytetracyclins in den Ferments tiongmedien ab und schwankt in Aden Grenzen von 200-1000 mg pro Gramm -des Austauschers.
Nach Beendigung der Absorption -wird diie Ionen- austausseherkolonne mit dem ads,orbierten Antibioti- kum abwechselnd ,mit destilliertem Wasser rund Methanol gewaschen,
wonach .das adsorbierte Oxy- tetracyclin mittels mit HCl .gesättigtem Methanol eluieet wird. Die Durchflussgeschwhldigkeeit des sauren Methanols beträgt 30 ml/cm2/Std.
Die Ausbeute des Eluierungsprozesses hängt von der Konzentration -des adsorbierten Antibiotikums:au@f den Ionenaugtausähern ab und beträgt 50-97 0/a.
Die Kontrolle des Adsomptions- und Eluierungs- prozesses wird durch Entnahme von Proben laus den einzelnen Fraktionen,
und durch Bestimmung des in innenenthaltenen Antibiotikums mittels a4emein bekannter chemischer und biologischer - Methoden durchgeführt.
Das das adsombierte .Antibiotikum .enthaltende saure Metthanoleduat kann durch eine:
NaOH-Lösung neutralisiert werden, jedoch bewirkt dieses Vorgehen zusätzliches Einführern. von anorganischen Salzei. in die Lösung, was die Reinigung des Antibiotikums, erschwert.
Besser ist es, zum Neutralisieren des sauren Eluabs einen Anionenaustauscher von basischem Cha rakter .anzuwenden. Die Neutralisiemng mit einem Anionenaustauscher erfolgt <U>zusammen</U>. mit der Ad- sorbierung von Chlorionen aus der iC;
ösung und mit der Ausscheidung von Wasser: Die Neutrafsierung wird so durchgeführt, dass die Methanollösung des Antibiotikums einten p11-Wert von 3;0=3,5 erlangt.
Während .der Neutralisierung reichen die Anti- bmatikumverlu!ste bis zu 7 %. Das Eluat wird, im Vakuumverdampfer bei 35-45 bis zu einem kleinen Volumen eingedickt,
wonach das Hydro- chlorid =des Oxytetracychnsmittels konzentrierter Salzsäure ,gefällt wird. Der :
gefällte Niederschlag wird nach dem Eiltreren und Waschen albwechselnd. mit Methanol und Aceton bei einer Temperatur von 400 getrocknet. Die Endausbeute des Prozesses beträgt etwa 36-%. Die Aktivität des erhaltenen
Hydro- chlorids des Oxytetracyclins beträgt ungefähr 670 mcg/mg.
Zweck Erlangung eines Produktes mit höherer Aktivität kann- man das erhaltene Oxytetracychm mittels allgemein. bekanntem Methoden umkristalli sieren (siehe Beispiel 5).
<I>Beispiel 2</I> 10 1 einer gemäss Beispiel 1 erhaltenen Gärbrühe werden mit Oxasle,äune bis zu einem pH-Wert von 2;
0 unter ständigem Rühren angesäuert. Danach werden 500 g Kieselgur zugegeben und das Ganze 30 Minu- ten lang gerührt, worauf der Nährboden auf der Zen- trifuge albgesondert wird. Wenn das Filtrat .trübe ist, russ ,
das Filtrieren wiederholt werden bis zur Erlan gung eines durchsichtigen Filtrats.
Das klare Filtrat mit einem pH-Wert von 2,0 bis 2,5 wird durch eine mit dem Kationenaustauscher gefüllte Kolonne mit einer Geschwindigkeit von 200 m1/em2/Std. durchgelassen. Nach dem Durch lassen wird die Kolonne mit 500 ml destillierten Wassers und danach
mit 250 ml gewaschen-. Das auf dem Kationenaustauscher adsorbierte Anti biotikum wird mit 1500 ml .einer 0,5n HCl-Lösung in Methanol mit :einer Durchflussgesahwimdigkeit von 30 ml/am/Std. eluiert.
Das gewonnene Oxytetracyckneluat senthält 2,19 .g Oxytetracyclim, d. i. 49 % der ursprünglichem Menge. Das saure Eluat wird mittels eines Amionenaus- tausahers bis zu einem pH-Wert von 3,
0-3;5 neutra- lisiertund danach im Vakumverdampfer,'bei 35 bis 40 , bis zu einem Volumen von 50 ml eingedickt.
Das OxytetTacyclimmethanolkomzentrat wird mit konzentrierter Salzsäure versetzt und .im Laufe des Zugebers erfolgt das Aussähen des Hydrochlorids des Oxytetracycl'vns. Der abfiltrserte Niederschlag wird abwechselnd mit
Methanol und Äther gewaschen und dann bei 400 getrocknet.
Es wurde 1,6 .g Oxytetracycfi@n mit einer Potenz von 670 mcg/mg @gewonnen.
Eine aridere Arbeitsweise zur Isolierung von Oxytetracychn aus dem Fermentatiönsmedümberuht auf der Extraktion des Antibiotikums aus der Was- serphase mit einem organischen Lösungsmittel; das bei dem angewandten pH-Wert wasserummischbar ist.
Als Lösungsmittel können Butyl- und Amyl- - alkohol und deren Ester sowie Gemischre von Alko holen und deren Estern mit niedrigen organischen Säuren .angewandt werden.
Das klare Fermenrtations- medium wird bei ständigem Rühren mit einem Ge- misch von Butanal und Buiylacetat versetzt, wonach eine 20 ,
oi' ö iige NaOH Lösung zwecks Herbeiführung eines pH-Wertes von 9,5 zugegeben wird. Bei, diesen Bedingungen sgeht das Oxytetracycbn: aus der Wasser phase in die organische Phase über.
Nach der Tren nung der Phasen wird die extrahierte Antibiotikum enthaltende organische Phase mit einer Schwefel.- säurelösung versetzt, wobei der pH-Wert bis 2,0 ge bracht wird.
Das Antibiotikum ,geht in die Wasser phase über, aus der nach Abscheidumg der orga nischen Phase dass Hydrochlorid des Oxytetracyclins mit Kochsalz bei einema pH-Wert von 5,5 ausgesalzen wind. Der gefällte Hydrochlomidniederschlag des.
Oxy- tetracyclns wird nach dem Filtrieren reit Methanbl und danach mit Äther gewaschen.
<I>Beispiel -3</I> 10 1 .einer gemäss Beispiel 1 erhaltenen Fermen- tatIonsbrühe werden mittels Oxals@äure zu einem pH- Wert von 1,8 bei ständigem Rühren angesäuert. <BR> Danach werden 500g Kieselfigur zugegeben und das Ganze eine halbe Stunde lang gerührt,
wonach das Mycel und .das gussgefällte Calciumoxalat abfiltriert werden. Bei Erhalt eines trüben oder opalisierenden Filtrates ist der Füstrierprozess zu wiederholen.
Das durchsichtige Filtrat mit einem pH-Wert von 1,8 wird mit 1000 ml eines Gemisches, von Butanol und Bu tylacetat irr Verhältnis von 93:
7 versetzt und bei kontinuierlichem Rühren wird eine 20a/aige NaOH -Lösung zugegeben und der pH-Wert auf 9,5 gebracht. Nach der Festsetzung des p11-Wertes wird dass Ganze :eine Stunde lang gerührt und danach zum Trennen der Phasen in Ruhe :gelassen,.
Die Ausbeute aus dem Nährboden bis zur orga nischen Phase beträgt 85 0/0.
Die von der Wasserphase getrennte organische Phase wird mit 0,1n H2S04 bei ständigem Rühren extraliiert und der pH-Wert auf<B>1,8</B> gebracht. Nach Festsetzung des pH-Wertes wird das Ganze eine Stunde lang gerührt und dann zur Phasentrennung in Ruhe gelassen.
Die Wasserphase wird mit kristal- lrisahem Na.Cl vemeitzt, der pH-Wert auf 5,5 gebracht und zwecks Auskristallislerung .des 1-lydoochlords des Oxytetracyclins abgestellt. Der Niederschlag wird ab- fil'tri:ert; mit Alkohol und danach mit Äther gewaschen und bei 400 C getrocknet.
Die Potenz des gewonnenen Hydrochlorids des Oxytetracyclins beträgt 640 mcg in 1 mg. Die Aus beute beträgt 46 o/o:
Eine andere Verfahrensweisse zurr. Ausscheiden des Oxytetracyclins aus der Nährlösung !beruht auf dem Aussahen des Antibiotikums mittels Kochsalz aus dem alkalischen Medium.
Ein geringer Butanol- zusatz zum Filtrat bewirkt eine Vemgröss.eruug der Reinheit des niedergeschlagenen Oxytetracychms.
Der abfiltrierrte Niederschlag wird nach dem Waschen. und Trocknen in einer Methanollösung des Calciumchl'orids aufgelöst, aus dem der Niederschlag des Oxytetracyclimhydrochlorid s :mit konzentrierter Salzsäure gefällt wird.
Der abfiltrierte Niederschlag wird abwechselnd mit Methanol und Äther gewaschen und danach bei 400 C getrocknet.
<I>Beispiel 4</I> 10 l einer gemäss Beispiel 1 erhaltenen Fermen- 2ationsbrühe werden mit Oxalsäure bis zu einem pH-Wert von 1,8 angesäuert. Dann werden 500 g Kieselgur zugegeben und das (.ranze wird 30 Minuten lang gerührt,
wonach der Nährboden auf Zentrifuge filtriert wird. Bei trübem Filtrat wird der Fütrier- prozess bis zur Erlangeng eines durchsichtigen Fil trats wiederholt.
Dem filtrierten Nährmediums wind !bei ständigem Rühren 2,5 kg Kochsalz und 500 ml Butanal zuge geben, wonach mit einer NaOH-Lösung bis zu einem- pH-Wert von 9,0-9,5 alikalisiext wird.
Das Ganze wird eine Stunde ;lang gerührt und zwecks Phasenabscheidung stehengelassen. Zn:
der Zwischenphase auf der Grenze der Wasserphase und ,cler,organischen Phase ist der Niedexschla!g idez Kom- plexsalzd des OxyteüacyclinLs,
suspend ert. Nachdem Abscheiden der Wasserphase wird die organische Phase zusammen mit der ZwIschenphase mit Kiesel- gur versetzt und nach dem Rühren wird der Nieder schlagder Komplexsalze des Oxytetracyclins und des Kieselguss aibfiltriert.
Nach dem Waschen und Trocknen bei 40 C wurden. 27<B>g</B> KomplexsaIzniederschlag des Antibio@t kums mit einer Potenz von 115 mcg in, 1 mg .erhalten, was 7211/9 der ursprünglichen Menge des Antibioti- kums darstellt. Des gewonnene Niederschlag wund .
fünfmal in 80 ml-einer Methanollbsun!g des. Cakiuän- chlorids extrahiert, wobei zu der ersten Extrakiion 30 ml und zu den folgenden, zur zweiten und dritten je 15 ml, zur viezten und fünften: je 10 ml angewen det wurden.
Zu denn in einer Menge vom. 58 ml erhaltenen Methanolfiltrat worden 6 m!1 konizentriener Salzsäure bei ständigem Rühren ,eingetropft. Bei,
diesem. Bedin gungen scheiden Hydrochlord@kristalle des Oxytetra= cyclins aus, die nach dem Filtrieren und Waschen mit 99 o/oeem Methanol bei 40 C :getrocknet werden.
Es wurden 1,78g Hydrochlorid des Oxyte@tra- cychns mit einer Stärke von 860 mrg in 1 mg ge- wonnen.
<I>Beispiel 5</I> Zur Rekristailljsiea.ung von gemäss Aden Beispielen 1 bis 4 erhaltenem Oxytetracychühydrochlozzti!d wer- ,den 3;
5 g Oxytetracyclmhydroehlord mit leinex Potenz von 670 E .in 1 mg nüt 1,2 g Triiäthylaminund 30 ml Methanollösung ödes Calciumchlionds versetzt. Nach voldkoamnener Auflösung des Oxytetnacypltiinhydro- ch!lornds werden 4,
5 ml konzentrierter Salzsäure zuge- ge!ben. Es -wird der gebildete Niederschlag dies Oxy- betracyclinhydrochloxids nach dem Filtrieren abwech- selind mit Methanol und. Äther igewuschen und- da nach bei einer Temperatur
von 40 C getrocknet.
Es, wurden 2,6 g Oxytetracyclmhydroohloxid reit einer Potenz von 920 mcg in 1 mg erhalt. Die Kontrolle wurde mittels iaägemevn bekannten chemischen und biologischen Methoden durchgeführt.