Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver fahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, das gegen Bakterien, insbesondere gegen grampositive Bakterien wirksam ist.
Es wurde gefunden, dass man durch Kultivierung einer bisher nicht beschriebenen Art von Mikroorga nismen, die aus einer in Utah entnommenen Boden probe stammt, nämlich von Streptomyces caelestis, ein neues Antibiotikum, im folgenden als Antibiotikum D-52 bezeichnet, erhalten kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung dieses neuen Antibiotikums ist dadurch gekennzeich net, mass man einen Stamm von Streptomyces caelestis unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthält, kultiviert.
Der vorgeschlagene Name für den neuen Mikro organismus, Streptomyces caelestis, charakterisiert die himmelblaue Farbe (nach Ridgway, Color Standards and Nomenclature ) seiner Conidien. Eine Kultur des lebenden Mikroorganismus wurde bei der Fermen tation Division of the Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, deponiert und wurde der permanenten Sammlung unter der Bezeichnung NRRL 2418 einverleibt.
Eine sorgfältige Untersuchung der Morphologie und Physiologie von S. caelestis, zeigt, dass diese Art deutlich verschieden ist von irgendwelchen früher in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 6. Auflage, Seiten 929-977 und in Waksman und Lechevalier's Actinomycetes and their Anbibiotics beschriebenen Streptomycesarten. Die Beschreibung erfolgt nachstehend in Form einer Tabelle.
Alle Be- impfungen erfolgten mit einer Sporensuspension. Die Reagenzgläser enthielten verschiedene Kulturmedien, und die Bebrütung erfolgte bei 24-28 C. Die Be stimmungen erfolgten am 4., 7. und 14. Tag.
EMI0001.0041
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> <I>Kultureigenschaften <SEP> von <SEP> S. <SEP> caelestis</I>
<tb> Farbe <SEP> des <SEP> der <SEP> Luft
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> ausgesetzten <SEP> Mycels <SEP> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> Bemerkungen
<tb> und <SEP> der <SEP> Sporen
<tb> Reine <SEP> Gelatine <SEP> gut <SEP> blaugrau <SEP> braun <SEP> Verflüssigung <SEP> bis <SEP> zur
<tb> Tiefe <SEP> des <SEP> Pigment
<tb> 0,5% <SEP> Trypton <SEP> schwach <SEP> blauweiss <SEP> braun
<tb> <B>-0,3%</B> <SEP> Hefe extraktbrühe
<tb> Tryptonbrühe <SEP> schwach <SEP> grauweiss <SEP> braun
<tb> Czapek's <SEP> gut <SEP> blau-grau-weiss <SEP> gelb
<tb> Sucrose-Agar
EMI0002.0001
<I>Tabelle <SEP> 1</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> <I>Kultureigenschaften <SEP> von <SEP> S.
<SEP> caelestis</I>
<tb> Farbe <SEP> des <SEP> der <SEP> Luft
<tb> Medium <SEP> Wachstum <SEP> ausgesetzten <SEP> Mycels <SEP> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> Bemerkungen
<tb> und <SEP> der <SEP> Sporen
<tb> Waksman's <SEP> keines <SEP> keine <SEP> keine
<tb> Stärke-Agar
<tb> d-Glucose-Agar <SEP> gut <SEP> blau-grau-weiss <SEP> gelbbraun
<tb> Nähr-Agar <SEP> ziemlich <SEP> schwach <SEP> braun-gelb-braun
<tb> gut <SEP> rosaweiss
<tb> d-Glucose- <SEP> gut <SEP> keine <SEP> gelbbraun
<tb> Nährbrühe
<tb> Lackmusmilch <SEP> ziemlich <SEP> schwach <SEP> keine <SEP> keine <SEP> Peptonisation
<tb> gut <SEP> oder <SEP> Reduktion
<tb> Kartoffel- <SEP> gut <SEP> gräulich <SEP> bis <SEP> braun <SEP> Scheibe <SEP> wird <SEP> dunkel
<tb> Schrägboden <SEP> blauweiss
<tb> Rüben- <SEP> gut <SEP> schwach,
<SEP> weiss <SEP> keine
<tb> Schrägboden <SEP> mit <SEP> Blaustich
<tb> Nitratnährbrühe <SEP> gut <SEP> schwach, <SEP> tiefes <SEP> keine <SEP> Reduktion <SEP> im
<tb> 0,1 <SEP> % <SEP> KN03 <SEP> blauweiss <SEP> gelbbraun <SEP> verwendeten <SEP> Medium
<tb> Waksman's <SEP> gut <SEP> keine <SEP> keine
<tb> Tyrosin-Agar
<tb> wässriges <SEP> gut <SEP> keine <SEP> keine
<tb> 1-Tyrosin <SEP> (1 <SEP> %)
<tb> Nährbouillon <SEP> gut <SEP> schwach, <SEP> weiss <SEP> tiefes <SEP> gelbbraun
<tb> Pepton- <SEP> gut <SEP> keine <SEP> schwarzbraun <SEP> H2S <SEP> dunkelwerden
<tb> Eisen-Agar
<tb> Dorsett's <SEP> Eier- <SEP> gut <SEP> schwach, <SEP> braun
<tb> Schrägboden <SEP> lavendelweiss
<tb> Loeffler's <SEP> Serum- <SEP> gut <SEP> schwach,
<SEP> rosa- <SEP> braun
<tb> Schrägboden <SEP> _ <SEP> lavendel-weiss
<tb> Bennett's <SEP> Agar <SEP> gut <SEP> blauweiss <SEP> gelbbraun
<tb> bis <SEP> braun Die Assimilierung von Kohlenstoffverbindungen durch S. caelestis in einem synthetischen Medium wird in Tabelle II gezeigt. Man arbeitete nach der Arbeits weise von Pridham und Gottlieb, J. Bact. 56, 107 bis 114 (1948) mit folgenden Abänderungen: 1. Schüttelkolben wurden mit Sporen von S. cae- lestis beimpft und bei 28 C auf einem Schüttelappa rat bebrütet.
2. Nach 48 Stunden wurde das Überstehende ab- gegossen, die Kultur mit<B>100</B> cm3 sterilem destillier tem Wasser gewaschen und das Überstehende wie derum abdekantiert. Dann setzte man 100 cm3 steriles destilliertes Wasser zu und bebrütete bei 28 C auf einem Schüttelapparat.
3. Nach 48 Stunden wurde das Überstehende ab dekantiert, wie oben gewaschen und in einem Wa- ring-Mischer 1 Minute mit 100 cm3 sterilem destillier tem Wasser vermischt.
EMI0003.0001
<I>Tabelle <SEP> 11</I>
<tb> <I>Assimilation <SEP> von <SEP> Kohlenstof <SEP> f <SEP> verbindungen <SEP> durch <SEP> S.</I>
<tb> <I>caelestis <SEP> im <SEP> synthetischen <SEP> Medium <SEP> von <SEP> Pridham</I>
<tb> <I><U>u</U>nd <SEP> Gott<U>l</U>ieb</I>
<tb> Medium <SEP> Ergebnis <SEP> Medium <SEP> Ergebnis
<tb> Blindversuch <SEP> - <SEP> lösliche <SEP> Stärke <SEP> (+)
<tb> d-Xylose <SEP> + <SEP> Glycerin <SEP> +
<tb> 1-Arabinose <SEP> + <SEP> Dulcit <SEP> (-)
<tb> Rhamnose <SEP> + <SEP> d-Mannit <SEP> d-Fructose <SEP> + <SEP> d-Sorbit <SEP> (-)
<tb> d-Galactose <SEP> + <SEP> d,l-Inosit <SEP> +
<tb> d-Glucose <SEP> + <SEP> Na-Formiat <SEP> d-Mannose <SEP> + <SEP> Na-Oxalat <SEP> Maltose <SEP> + <SEP> Na-Tartrat <SEP> Sucrose <SEP> + <SEP> Na-Salicylat <SEP> Lactose <SEP> + <SEP> Na-Acetat <SEP> +
<tb> Cellobiose <SEP> + <SEP> Na-Nitrat <SEP> (+)
<tb> Raffinose <SEP> + <SEP> Na-Succinat <SEP> (+)
<tb> Dextrin <SEP> +
<tb> Inulin <SEP> (-)
EMI0003.0002
+ <SEP> = <SEP> positive <SEP> Assimilierung
<tb> - <SEP> = <SEP> negative <SEP> Assimilierung
<tb> (+) <SEP> = <SEP> positive <SEP> Assimilierung, <SEP> nur <SEP> schwaches
<tb> Wachstum
<tb> (-) <SEP> = <SEP> schwaches <SEP> Wachstum, <SEP> keine <SEP> Assimi lierung In allen Fällen positiver Assimilierung war das Mycelium des S.
caelestis durch eine staubige, blau graue Farbe mit Spuren von Weiss gekennzeichnet.
Die Kultur des S. caelestis bildet ein langes faden- förmiges Mycel, das sich üppig verzweigt. Die Coni- dien haben eine kugelige bis ovale Form und werden von lockeren, spiralförmigen Sporophoren getragen, die sich aus dem Mycelium erheben. Kultiviert man S. caelestis auf Bennett's Agar, so hat das Mycelium eine blasse meergrüne Farbe. Ferner wird im Medium ein gelbbraunes Pigment entwickelt.
Die Kolonien auf Bennett's Agar sind in der Mitte leicht erhoben mit glatten Rändern, die eine weisse Färbung auf weisen. Die günstigste Temperatur zur Sporenbildung von S. caelestis liegt zwischen 28 und 30 C.
Obschon S. caelestis in gewissen Beziehungen dem S. Glaucus (Waksman und Lechevalier's Actino- mycetes and Their Antibiotics , S. 91) und dem S. chartreusis (J. A. C.
S. 75, 4011 [1953]) ähnlich ist, lassen sich diese Mikroorganismen leicht unter scheiden, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:
EMI0003.0033
<I>Tabelle <SEP> I11</I>
<tb> <I>Eigenschaften <SEP> von <SEP> S. <SEP> caelestis, <SEP> S. <SEP> chartreusis <SEP> K-180 <SEP> und <SEP> S. <SEP> Glaucus</I>
<tb> Reaktion
<tb> Medium <SEP> S. <SEP> caelestis <SEP> S. <SEP> chartreusis <SEP> K-180 <SEP> S. <SEP> glaucus
<tb> Kartoffel <SEP> Wachstum <SEP> gut; <SEP> gräulich <SEP> Wachstum <SEP> ordentlich;
<SEP> Wachstum <SEP> sehr <SEP> stark;
<tb> bis <SEP> blauweiss <SEP> mit <SEP> Dun- <SEP> Mitte <SEP> der <SEP> Kolonien <SEP> blau- <SEP> bedeckt <SEP> mit <SEP> samtartigem
<tb> kelwerden <SEP> der <SEP> Scheibe <SEP> grau <SEP> mit <SEP> weissen <SEP> Kanten <SEP> grünem <SEP> Luftmycel
<tb> Milch <SEP> keine <SEP> Peptonisierung <SEP> langsame <SEP> Peptonisie- <SEP> Peptonisierung <SEP> langsam,
<tb> rung <SEP> mit <SEP> vorheriger <SEP> Koagula tion <SEP> bei <SEP> einigen <SEP> Stäm men
<tb> Stärke <SEP> keine <SEP> Hydrolyse <SEP> gute <SEP> Hydrolyse <SEP> rasche <SEP> Hydrolyse
<tb> Nitrat <SEP> keine <SEP> Reduktion <SEP> auf <SEP> Reduktion <SEP> Reduktion
<tb> dem <SEP> verwendeten <SEP> Me dium Wie oben erwähnt, kann S.
caelestis, NRRL 2418, in einem Kulturmedium unter Bildung eines wirk samen Antibiotikums gezüchtet werden. Aus Grün den der Wirtschaftlichkeit der Produktion, der maxi malen Ausbeute und der leichten Isolierung des Anti biotikums D-52 werden gewisse Kulturmedien bevor zugt. So sind z. B. die zur Zeit bevorzugten Kohlen stoffquellen im Kulturmedium brauner Zucker, Lac- tose und Dextrin. Andere Quellen sind Stärke, Suc- rose, Melassen und dergleichen.
Die bevorzugten Stickstoffquellen sind Maisquellwasser, Brauereihefe, lösliche Schlempebestandteile; doch kommen auch andere Quellen, wie Sojabohnenmehl, Casein, Amino- säuregemische, Peptone (Fleisch und Soja) und der gleichen, in Frage.
Als anorganische Nährsalze eignen sich z. B. Ka lium-, Natrium-, Calziumsalze, Phosphate, Chloride, Sulfate und dergleichen. Anorganische Stickstoff quellen sind Nitrate oder Ammoniumsalze.
Im Kulturmedium für S. caelestis sollten auch wesentliche Spurenelemente enthalten sein. Solche Spurenelemente sind gewöhnlich in den andern Zu sätzen als Verunreinigungen enthalten.
Für das optimale Wachstum und die Entwick lung von S. caelestis NRRL 2418 sollte das Kultur medium vor der Beimpfung mit dem Organismus auf ein PH zwischen etwa 6,5 und 7,5 eingestellt werden, wobei das pH 7,0 bevorzugt wird. Es wurde beob achtet, dass während der Wachstumsperiode des Or ganismus und der Produktion des Antibiotikums das Medium allmählich alkalisch wird und eine Alkali- nität vom PH etwa 8-8,5 oder höher erreicht.
Der End-PH hängt mindestens zum Teil vom Anfangs-PH des Mediums, den vorhandenen Puffern und der Zeit dauer, während welcher der Organismus wachsen gelassen wurde, ab.
Bei der Züchtung in grossen Tanks empfiehlt es sich, die vegetative Form des Organismus zur Be- impfung zu verwenden, um eine Verzögerung in der Herstellung des Antibiotikums und die damit ver bundene ungenügende Ausnutzung der Anlage zu vermeiden. Dementsprechend ist es erwünscht, zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus herzustellen, indem man eine verhältnismässig kleine Menge des Kulturmediums mit Sporen des Organismus beimpft, und nach Ausbildung des jungen aktiven, vegetativen Inokulums dieses aseptisch in die grossen Tanks zu geben.
Das Medium, in welchem das vegetative Inokulum hergestellt wird, kann das gleiche sein wie das, in welchem das Antibiotikum erzeugt wird, oder ein von diesem verschiedenes.
S. caelestis NRRL 2418 lässt sich bei Tempera turen zwischen etwa 20 und etwa 32 C gut kulti vieren. Die besten Ausbeuten werden erhalten, wenn das Kulturmedium zwischen etwa 24 und 28 C gehalten wird.
Die Bildungsgeschwindigkeit des Antibiotikums D-52 bzw. die Zunahme der antibiotischen Aktivität im Kulturmedium kann während der Wachstums periode des Mikroorganismus leicht verfolgt werden, indem man Proben des Kulturmediums mittels Orga nismen prüft, von denen man weiss, dass sie vom Antibiotikum gehemmt werden, wie z. B.
B. subtilis. Für diese Bestimmungen empfiehlt sich die Anwen dung eines Tests, bei welchem serienweise Verdün nungen der Kulturproben hergestellt, dem geschmol zenen Nähragar zugesetzt werden, wonach man den Agar in einer Petrischale erstarren lässt, mit einer jungen Kultur von B. subtilis beimpft und die grösste Verdünnung ermittelt, die das Wachstum des Organis mus auf dem Nähragar noch vollständig verhindert.
Die Bildung des Antibiotikums D-52 kann auch durch turbidimetrische Verfahren, wie sie bei der Herstellung anderer Antibiotika üblich sind, ver folgt werden.
Im allgemeinen findet die grösste Produktion des Antibiotikums zwischen etwa 2 und 6 Tagen nach der Beimpfung statt, wenn die Fermentation submers aerob erfolgt.
Das Antibiotikum kann aus dem Kulturmedium durch Extraktion oder Adsorption gewonnen werden. Für die technische Produktion wird die Extraktion bevorzugt, da sie weniger zeitraubend und kostspielig ist. Zur Extraktion eignen sich vorzugsweise wasser unlösliche polare organische Lösungsmittel, wie chlo rierte Kohlenwasserstoffe, z.
B. Methylenchlorid, Äthylendichlorid, Chloroform und dergleichen; Alko hole mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Butanol, Amylalkohol und dergleichen; Alkylester von Fett säuren, wie Äthylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Amylacetat und dergleichen, wenig wasserlösliche Ke- tone, wie Methylisobutylketon, Methylamylketon und dergleichen.
Der erhaltene Extrakt wird vorzugs weise im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man das Antibiotikum in roher Form erhält.
Anderseits kann man das Antibiotikum D-52 aus dem Kulturmedium gewinnen, indem man die fil trierte Lösung mit einem Adsorptionsmittel zusam menbringt. Hierzu eignen sich aktivierte Tonerde, Silikagel, <U>Mag</U> nesiumaluminiumsilikat und derglei chen. Diese eignen sich auch zur Reinigung des Produktes auf chromatographischem Wege.
Des gleichen kann man Aktivkohle verwenden, da diese das Antibiotikum kräftig adsorbiert. Es empfiehlt sich jedoch, die Kohle mit einem Mittel, wie Essig säure, vorzubehandeln, um die starke Bindungsaffini tät des Kohlenstoffes für das Antibiotikum herab zusetzen und dessen nachherige Elution zu erleichtern. Die Elution erfolgt leicht mit einem polaren organi schen Lösungsmittel, in welchem das Antibiotikum löslich ist.
Verwendet man zur Isolierung des Antibiotikums D-52 ein Extraktionsverfahren, so kann man das Lösungsmittel auf ein relativ kleines Volumen ein engen und das Antibiotikum daraus durch Zusatz eines Fällungsmittels ausfällen. Man kann so das Antibiotikum in Form der freien Base in roher, aber fester Form erhalten.
Eine z. Zt. bevorzugte Art zur Isolierung des Antibiotikums D-52 in Form seiner Base besteht darin, das PH des filtrierten Mediums auf etwa 7-10 einzustellen, vorzugsweise auf etwa 7,5-8, und dann mit einem in Wasser unlöslichen organischen Lö sungsmittel, wie Amylacetat, Butanol, Äthylacetat, Methylenchlorid oder dergleichen, zu extrahieren. Der Extrakt wird dann zur Trockne verdampft und der Rückstand zu einem flüssigen, gesättigten Kohlen wasserstoff mit 5-8, vorzugsweise 6 Kohlenstoff atomen, wie Hexan, gegeben, um einen amorphen Niederschlag zu erzeugen.
Der Niederschlag wird filtriert und getrocknet, wobei man das Antibiotikum als freie Base erhält.
Die Salze des Antibiotikums D-52 mit Säuren kann man erhalten, indem man eine Lösung des selben in einem organischen Lösungsmittel, wie Me thanol, Äthylacetat, Methylenchlorid oder derglei chen, mit einer äquivalenten Menge Säure, wie z. B. gasförmigem Chlorwasserstoff, Oxalsäure, Salicyl- säure, Citronensäure oder dergleichen, versetzt und die Lösung zur Trockne verdampft.
Ferner kann man eine Lösung des Antibiotikums D-52 in einem organischen Lösungsmittel mit einer Säure oder einer Lösung derselben behandeln und das Salz des Anti biotikums D-52 direkt aus der Lösung ausfällen.
Beispiele für Salze, die hergestellt wurden, sind das Hydrochlorid, Oxalat und Salicylat. Andere Salze wie das Citrat, Benzoat, Sulfat und dergleichen kön nen nach der oben erwähnten Arbeitsweise leicht er halten werden. Für therapeutische Zwecke eignen sich natürlich nur untoxische Salze.
Für das erfindungsgemässe Verfahren können auch das Antibiotikum D-52 erzeugende Abarten von S. caelestis verwendet werden, die leicht durch rou tinemässige Isolierungs- und Modifikationsverfahren, wie Auswahl des kultivierten Organismus und Be handlung desselben mit modifizierenden Mitteln, wie Röntgenstrahlen, ultraviolettem Licht und chemischen Mitteln, wie z. B. Senfgas, erhältlich sind.
Das Antibiotikum D-52 und seine Salze mit Säu ren haben eine grosse antibakterielle Wirkungsbreite, insbesondere gegen grampositive Bakterien. Die Wirk samkeit des Antibiotikums D-52 im Vergleich zu Streptomycin gegen verschiedene Organismen ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt:
EMI0005.0018
<I>Tabelle <SEP> IV</I>
<tb> <I>Antibakterielles <SEP> Spektrum</I>
<tb> <I>Kleinste <SEP> wachstumshindernde <SEP> Konzentration</I>
<tb> (mcg1cm3)
<tb> Organismus <SEP> AntD <SEP> 52 <SEP> um <SEP> Streptomycin
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> 0,39 <SEP> 25
<tb> S. <SEP> viridans <SEP> 25-11 <SEP> 3,1 <SEP> 50
<tb> S. <SEP> viridans <SEP> L-17 <SEP> 6,2 <SEP> >100
<tb> S. <SEP> hemolyticus <SEP> C <SEP> 203 <SEP> 0,19 <SEP> 0,19
<tb> S. <SEP> hemolyticus <SEP> L-2 <SEP> 0,78 <SEP> 3,1
<tb> S. <SEP> agalactiae <SEP> 7077 <SEP> 1,5 <SEP> 100
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> L-40 <SEP> 0,39 <SEP> 5100
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> M-1 <SEP> 1,5 <SEP> 3,1
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 284 <SEP> 0,78 <SEP> 1,5
<tb> S. <SEP> albus <SEP> 2,5 <SEP> 0,05
<tb> S.
<SEP> fecalis <SEP> 2,5 <SEP> 1
<tb> B. <SEP> anthracis <SEP> 2,5 <SEP> 0,05 Die antibiotische Wirksamkeit wurde durch Ab- strichverdünnungs- oder Nährbouillonverdünnungs- proben ermittelt. Im ersten Fall wurden die zu prü fenden Organismen auf eine Reihe von Agarplatten, die verschiedene Konzentrationen des Antibiotikums enthielten, abgestrichen, um die kleinste Menge Anti biotikum D-52 in mcg!em3 Substrat zu bestimmen, welche das Wachstum 40 Stunden verhinderte. Bei der zweiten Prüfung werden die zu prüfenden Or ganismen in einer Nährbouillon, die verschiedene Mengen des Antibiotikums D-52 enthält, gezüchtet.
Das Antibiotikum D-52 ist wirksam gegen No- cardia asteroides, den Organismus der bei Tieren und Menschen Actinomycose hervorruft und ist eben falls wirksam gegen Xanthomonas pruni, Phytomonas fasciculata und Phytomonas stewartii, welche Bak terien in Pflanzen von wirtschaftlicher Bedeutung Krankheiten verursachen.
Da Giftigkeitsprüfungen ergaben, dass bei Konzentrationen von 1000 Teilen pro Million das Antibiotikum D-52 Apfel- und Bir nenlaub nicht schädigt, ist das Antibiotikum auch wertvoll zur Bekämpfung des Meltaus von Apfel- und Birnbäumen.
Das Antibiotikum D-52 kann entweder für sich allein oder zusammen mit andern Antibiotika, wie Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Penicillin, Strepto- mycin, Actidion und dergleichen zur Behandlung von Pflanzenkrankheiten, wie bakterielle Flecken auf To maten und Pfefferpflanzen, Nussbaummeltau, Bohnen meltau, verschiedene Rasenkrankheiten, Pfefferminz brand, Kirschblattflecken und dergleichen, verwen det werden.
Ausserdem kann man das Antibiotikum D-52 wegen der geringen Giftigkeit und dessen Aktivität in vivo sowohl gegen Streptokokken als auch gegen Sta- phylokokken, ferner zur Behandlung von Scharlach fieber, Streptokokken-Brustinfektionen, Oberflächen infektionen und dergleichen einsetzen.
Demzufolge ist das Antibiotikum D-52 von therapeutischer Be deutung in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Antibiotika, wie Streptomycin, Di- hydrostreptomycin, Oxytetracyclin, Tetracyclin, Chlor- tetracyclin, Bacitracin, Circulin, Penicillinen, wie Penicillin 0, Procainpenicillin, Chlorprocainpenicillin und dergleichen, Chloramphenicol, Tyrothricin,
Poly- mixin B, Endomycin, Amicetin, Fumagillin, Erythro- mycin und dergleichen, Sulfaverbindungen, wie Sulfa- diazin, Sulfamerazin, Sulfämethazin und dergleichen, Steroidhormonen, wie Cortison, Hydrocortison und Estern desselben, Halogen-Cortisonen, wie 9-a-Chlor- cortison,
9-a-Fluor-cortison und dergleichen, und deren Estern, Halogenhydrocortison, wie 9-a-Chlor- hydrocortison, 9-a-Fluor-hydrocortison und deren Estern, oestrogenen Stoffen und dergleichen, Anal- getica, wie Salicylate und dergleichen, Antihistamine wie Pyrrollidinäthyl-phenothiazin-Chlorhydrat, Pyri- benzamin (eingetragene Marke),
CN'-pyridyl-N'-ben- zyl-N-dimethyläthylendiamin-monochlorhydrat) und dergleichen. Das Antibiotikum D-52 kann auch als Nahrungsmittelergänzung zur Förderung des Wachstums von Tieren und Geflügel allein oder in i Verbindung mit einem oder mehreren der vorgenann ten antibiotischen Stoffe verwendet werden. Es kann auch mit fungiciden Stoffen, wie Caprylsäure, Un- decylensäure, p-Oxybenzoesäure und dergleichen, An wendungen finden.
<I>Beispiel 1</I> Bildung des Antibiotikums D-52: In eine Anzahl von 500 em3 Erlenmeyerkolben gibt man je 100 cm3 des folgenden Mediums: Bactopepton (Difco) 7,5 g Hefeextrakt (Difco) 2,5 g Glucose 5,
0 g Destilliertes Wasser auf 1000 em3 Die Kolben werden 20 Minuten im Autoklaven bei 1210 C sterilisiert. Nach dem Abkühlen werden s die Kolben mit einer wässrigen Sporensuspension be- impft, die auf üblichem Casein-Stärke-Agar erhalten worden war, worauf man etwa 48 Stunden bei einer Temperatur zwischen 24 und 28 C auf einer Schüt telmaschine bebrütete.
5 cm3 dieses vegetativen o Impfmediums wurden verwendet, um eine Reihe von 500 cm3 Erlenmeyerkolben, die je 100 cm3 des fol genden Mediums enthielten, zu beimpfen.
EMI0006.0045
Rohzucker <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glycerin <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Lactose <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Dextrin <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Brauereihefe <SEP> 2 <SEP> g
<tb> S. <SEP> V. <SEP> P. <SEP> " <SEP> 5 <SEP> g
<tb> NH4N03 <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Maisquellwasser <SEP> 2 <SEP> g
<tb> CaCO3 <SEP> 4 <SEP> g
<tb> NaCl <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> 1000 <SEP> em3 [* S. V.
P. = Lösliches pflanzliches Proteingemisch der Glen- more Distilleries, Inc.] Vor der Beimpfung wurden die Kolben im Auto klaven 20 Minuten bei 121 C sterilisiert und abge kühlt. Die Kolben wurden bei 24-28 C auf einem Schütteltisch bebrütet.
Nach 120 Stunden enthielt eine Probe des fermentierten Kulturmediums 87 M.- avium-Einheiten pro cms und 180 B.subtilis-Einhei- ten pro cm3.
Die Gehaltsbestimmung erfolgte nach dem Ver fahren von Loo und Mitarb. [J. Bact. 50, 701-709 (1945)] und wird in M.avium-Einheiten bezogen auf den Streptomycinsulfat-Standard ausgedrückt und in B.subtilis-Einheiten, bezogen auf den Neomycinsulfat- Standard. Jede M.avium-Einheit entspricht einem Mikrogramm Streptomycinbase auf Grundlage der Plattenaktivität und jede B.subtilis-Einheit einem Mikrogramm Neomycinbase auf Grundlage der Plat tenaktivität.
<I>Beispiel 2</I> Bildung des Antibiotikums D-52 100-cm3-Portionen des folgenden Mediums:
EMI0006.0073
Cerelose <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Sojamehl <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Brauereihefe <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> (NH4)2S04 <SEP> 5 <SEP> g
<tb> KCl <SEP> 3 <SEP> g
<tb> CaC03 <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> 1000 <SEP> cm3 werden in 500-cm3-Kolben gefüllt, die dann 20 Mi nuten bei 121 C im Autoklaven sterilisiert wurden. a Die abgekühlten Kolben wurden mit je 5 cms einer 48 Stunden alten Kultur, wie im Beispiel 1 beschrie ben, beimpft und dann bei 24-28 C auf dem Schüt teltisch bebrütet.
Nach 120 Stunden enthielt eine Probe des fermentierten Kulturmediums 21 M.avium- a Einheiten pro em3 und mehr als 80 B.subtilis-Einhei- ten pro cm3.
<I>Beispiel 3</I> Bildung und Gewinnung des Antibiotikums D-52: Ein Tank aus rostfreiem Stahl von 378,5 1 Inhalt E wurde mit 240 1 des folgenden Nährmediums be schickt.
EMI0006.0085
g/1
<tb> Rohzucker <SEP> 10
<tb> Glycerin <SEP> 5
<tb> Lactose <SEP> 5
<tb> Dextrin <SEP> 5
<tb> Brauereihefe <SEP> 2
<tb> S. <SEP> V. <SEP> P. <SEP> 5
<tb> NH2N03 <SEP> 2
<tb> Maisquellwasser <SEP> 2
<tb> <B>CaCO3</B> <SEP> 4
<tb> NaCl <SEP> 5 Dann wurde 30 Minuten bei 121 C sterilisiert und abgekühlt. Hierauf wurde mit 121 einer wie folgt hergestellten Kultur beimpft.
Man verwendete Sporen von S.caelestis, die von einer Casein-Stärke-Agar-Schrägkultur erhalten wor- den waren zur Beimpfung eines der 100 cm3 des folgenden Mediums enthielt:
EMI0006.0095
Gramm/Liter
<tb> Cerelose <SEP> 20
<tb> Sojamehl <SEP> 10
<tb> Brauereihefe <SEP> 2,5
<tb> (NH4)2S04 <SEP> 5
<tb> KCl <SEP> 3
<tb> CaCO3 <SEP> 4 Dieser Kolben wurde auf einem Schütteltisch 48 Stunden bei 28 C bebrütet. 25 cm?, dieser Kultur wur den zur Beimpfung eines etwa 191 fassenden Fermen- tiertanks aus rostfreiem Stahl, der 12 1 des oben ge nannten Mediums enthielt, benutzt. Er wurde vor gängig 11/2 Stunden bei 12l C sterilisiert und dann abgekühlt. Dann wurde bei 28 C zwei Tage fermen tiert. Während dieser Zeit wurde mit einem Rührer gerührt und mit 6 1 pro Minute belüftet.
Der 378,5-1-Tank wurde mittels eines verklei deten Propellers mit Saugrohrschikane in Bewegung gehalten. Die Drehzahl des Propellers betrug 280 Touren pro Minute. Luft wurde in einer Menge von 0,0849 m3 pro Minute zugeführt. Der Kultur setzte man 100 cm3 eines Antischaummittels, bestehend aus Lardöl (Swift, prime burning lard oil) und l Octadecanol zu.
Nach 67 Stunden wurden 1500 cms der Kultur filtriert und zweimal mit je 500 cm3 Methylenchlorid extrahiert. Das p. der Probe war 7,8. Der Extrakt wurde im Vakuum auf 2 cm3 eingeengt und dann zu 10 cm3 Skellysolve B gegeben, ein Lösungsmittel, das grösstenteils ein Gemisch von Hexankohlenwas- serstoffen enthält. Man erhielt einen flockigen Nie derschlag.
Nach dem Waschen mit Skellysolve B und Trocknen erhielt man 3 8 mg (43% Ausbeute) an Antibiotikum D-52 mit 2700 B.subtilis-Einheiten pro cm:' und 720 M.avium-Einheiten pro cm3.
Das Antibiotikum D-52 besitzt im pH-Bereich zwi schen 2 und 7 eine gute Stabilität (3 Stunden bei 80 C). Die Stabilität scheint geringer beim p. 10, wenn man 3 Stunden bei 25 C hält.
Das Antibiotikum D-52 ist in Wasser löslich im pfi-Bereich von 1-7, unlöslich zwischen 7,5 und 9,0 und löslich im Bereich zwischen 10 und 13. Die ses Löslichkeitsverhalten zeigt, dass das Antibiotikum amphoter ist. Es ist unlöslich in 6n-NaOH. Seine Salze mit Säuren sind wasserlöslich. Es ist löslich in Methanol, Chloroform, Athylacetat und Methylen- chlorid, aber unlöslich in Äther und Ligroin.
Die Analyse des Antibiotikums D-52 führt zur versuchsweisen Formel C23H30-400ON2s Bestimmt man das Ultraviolett-Absorptionsspek- trum des Antibiotikums D-52 in wässriger Lösung unter Verwendung eines Beckman-Quarz-Spectro- photometers Modell DU oder eines Cary-Registrier- Spectrophotometers, so werden Maxima von Ei m = 182 bei 239 Millimikron und Ei m = 74 bei 307 Millimikron beobachtet. Das Antibiotikum D-52 be sitzt eine optische Drehung [a] = + 121,5 (0;5% D in Chloroform).
Eine Suspension des Antibiotikums D-52 in flüs sigem Petroleum zeigt folgende charakteristische Ab sorptionsbanden im Infrarot, ausgedrückt in cm-': 3340, 3210, 1900, 1672, 1655, 1615, 1570, 1545, 1488, 1090 und 758. Dies ist in Fig. 1 dargestellt. Die Banden bei 3340 und 3210 sind charakteristisch für OH- und(oder NH-Gruppen. Die Bande bei<B>1900</B> ist charakteristisch für ein Salz und zeigt an, dass das Antibiotikum wahrscheinlich als Zwitterion vor liegt.
Die Banden bei 1672, 1655, 1570 und 1545 sind charakteristisch für die Carbonylgruppe. Die Banden bei 1615, 1488 und 758 sind charakteristisch für die Phenylgruppe. Die Bande bei 1090 ist charak teristisch für die CH-Gruppe oder die CO-Gruppe.
<I>Beispiel 4</I> <I>Herstellung des Chlorhydrats von Antibiotikum D-52</I> Eine Lösung von 750 mg Antibiotikum D-52 (hergestellt gemäss Beispiel 3) wurde mit trockenem Chlorwasserstoff behandelt. Beim Eindampfen erhielt man einen harzigen Rückstand. Nach Verreiben desselben mit wasserfreiem Äther erhielt man 435 mg eines weissen, halbkristallinen Pulvers, das als Hydro chlorid des Antibiotikums D-52 identifiziert wurde. Dieses Produkt enthielt 1650 M.avium-Einheiten pro mg und 2200 B.subtilis-Einheiten pro mg.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer Probe des Chlorhydrats des Antibiotikums D-52 zeigt Ma xima von E i = 188 bei 240 Millimikron und E i m = 67 bei 305 Millimikron.
Eine Suspension des Chlorhydrats in flüssigem Petrolatum zeigt folgende charakteristische Absorp tionsbänder im Infrarot ausgedrückt in cm-': 3290, 3065, 1671, 1613, 1583, 1566, 1485, 1088 und 755. Das Einzelband bei 3290 ist charakteristisch für die OH- und/oder NH-Gruppe. Die Bänder bei 1671, 1583 und 1566 sind charakteristisch für die C=O- Gruppe. Die Bänder bei<B>1613,</B> 1485 und 755 sind charakteristisch für die Phenylgruppe. Das Band bei 1088 ist charakteristisch für die CO-Gruppe.
Das Band bei 3065 ist charakteristisch für die =CH- Gruppe.
Das Hydrochlorid des Antibiotikums D-52 besass eine optische Drehung von [a]24 = +96,711 <B>(0,5%</B> in Wasser).
<I>Beispiel 5</I> Oxalat <I>des Antibiotikums D-52</I> Zu 120 cms wasserfreiem Äther gibt man eine Lösung von 40 mg Oxalsäuredihydrat in 20 cm3 Me thanol sowie 200 mg Antibiotikum D-52 (hergestellt gemäss Beispiel 3). Nach Umkristallisieren des er haltenen Niederschlages aus Methanol erhielt man 70 mg Oxalat des Antibiotikums D-52 als weisse, zwischen 149 und 154 C schmelzende Nadeln. Das Produkt enthielt 900 M.avium-Einheiten pro mg und 4000 B.subtilis-Einheiten pro mg.
Die Analyse ergibt versuchsweise die empirische Formel von C25H30-40013N2s. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum des Oxalats in wässriger Lösung ist durch folgende Maxima cha rakterisiert: Ei m = 155,9 bei 240 Millimikron und Ei % = 61,8 bei 305 Millimikron.
Eine Suspension des Oxalats in flüssigem Pe- trolatum zeigt folgende charakteristische Absorptions bänder im Infrarot, ausgedrückt in cm-1: 3600, 3460, 3265, 2540, 2206, 1935, 1720, 1689, 1674,<B>1</B>625, 1589, 1545, 1486, 1085 und 756. Dies ist in Fig. 2 dargestellt. Die Einzelbänder bei 3600, 3460, 3265, 2540 und 2206 sind charakteristisch für die OH- undloder NH-Gruppe. Das Band bei 1935 ist charakteristisch für das Salz. Die Bänder bei 1720, 1689, 1674, 1625 und 1545 sind charakteristisch für die GO-Gruppe.
Die Bänder bei 1589, 1486 und 756 sind charakteri stisch für die Phenylgruppe. Das Band bei 1085 ist charakteristisch für die GO-Gruppe.
Das Oxalat des Antibiotikums D-52 besitzt eine optische Drehung von [u]= D + 106,4 (0,5% in Wasser).
Die Untersuchung zur Aufklärung der Struktur des Oxalats des Antibiotikums D-52 zeitigte folgende Ergebnisse:
EMI0008.0018
Nitroprussid <SEP> negativ
<tb> Ferrichlorid <SEP> negativ <SEP> (braun)
<tb> Millon's <SEP> Reagens <SEP> weisser <SEP> Niederschlag
<tb> Bariumchlorid <SEP> weisser <SEP> Niederschlag, <SEP> säure löslich <SEP> (kein <SEP> Sulfat)
<tb> Jodoform <SEP> negativ
<tb> Benzolsulfonyl chlorid <SEP> unbestimmt
<tb> Brz <SEP> in <SEP> CCl4 <SEP> negativ
<tb> Brr <SEP> H20 <SEP> weisser <SEP> Niederschlag <SEP> (Aryl amin <SEP> oder <SEP> Phenolgruppe)
<tb> NaN.- <SEP> I, <SEP> Entwicklung <SEP> von <SEP> N"-Gas
<tb> (C-SH <SEP> oder <SEP> C <SEP> = <SEP> S)
<tb> H.,-Pt0z <SEP> Kataly sator <SEP> keine <SEP> Reduktion;
<SEP> behält <SEP> das
<tb> U. <SEP> V.-Spektrum 1,15g des Oxalats des Antibiotikums D-52 wur den zu 10 cm3 6n-NaOH gegeben. Nach Stehen über Nacht bei Zimmertemperatur ging das Antibiotikum in Lösung, und man erhielt einen Niederschlag, der als Natriumoxalat identifiziert werden konnte. Die überstehende Schicht wurde mit Methylenchlorid ge waschen und angesäuert, wobei man einen neuen Nie derschlag erhielt.
Das feste Produkt wurde dann aus heissem Wasser umkristallisiert. Man erhielt 80 mg eines weissen kristallinen Produktes, das bei 100 C sublimierte und zwischen 154 und 158 C schmolz. Bei der Infrarotanalyse erwies sich dieses Produkt als Salicylsäure.
Die intraperitonealen Toxizitäten des Antibioti kums D-52, dessen Oxalats, des Chlortetracyclins und Tetracyclins sind in der folgenden Tabelle zusammen gestellt.
EMI0008.0035
<I>Tabelle <SEP> V</I>
<tb> <I>Akute <SEP> Toxizität</I>
<tb> (mgjkg <SEP> bei <SEP> Mäusen)
<tb> Antibiotikum <SEP> LDbo <SEP> (mg/kg)
<tb> D-52 <SEP> freie <SEP> Base <SEP> 167
<tb> D-52-Oxalat <SEP> 233
<tb> Chlortetracyclin <SEP> 192 <SEP> (im <SEP> Mittel)
<tb> Tetracyclin <SEP> 190 <SEP> (im <SEP> Mittel) <I>Beispiel 6</I> <I>Gewinnung des Antibiotikums D-52 als freie Base</I> <I>aus dessen Salzen</I> 2 g Oxalat des Antibiotikums D-52 (hergestellt gemäss Beispiel 5) wurden in 20 em3 Wasser gelöst.
Das PH der Lösung wurde durch Zusatz von 6n- NaOH auf 8,5 eingestellt, wobei sich ein öliger Nie derschlag bildete, der mit 20 cm3 Methylenchlorid extrahiert wurde. Der Extrakt wurde über Natrium sulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt 750 mg eines amorphen, praktisch farblosen Produktes, das als Antibiotikum D-52 in Form der freien Base identifi ziert wurde. Sie enthielt 900 M.avium-Einheiten pro Milligramm und 2700 B.subtilis-Einheiten pro Milli gramm.
<I>Beispiel 7</I> Salicylat <I>des Antibiotikums D-52</I> Nach Zusatz von 60 cm wasserfreiem Äther zu einer Lösung von 1 g Antibiotikum D-52 (hergestellt gemäss Beispiel 3) und 0,27 g Salicylsäure in 10 cm3 Methanol schied sich ein harzartiger Niederschlag aus. Nach Umkristallisieren aus heissem Athylacetat er hielt man das Salicylat des Antibiotikums D-52 vom Smp. 136-l38 C, das 720 M.avium-Einheiten pro mg und 3800 S.subtilis-Einheiten pro mg enthielt.
Das U. V.-Spektrum des Salicylats ist gekenn zeichnet durch Maxima von Ei% - 227 bis 236,5 Millimikron und El l% = 106,7 bei 301,5 Milli- mikron. Seine optische Drehung [a]24 D = + 90,2 (0,5% in Wasser).
Elektrometrische Titrationsstudien am Salicylat bei Verwendung einer Mischung von Wasser und 95 /a Äthanol als Lösungsmittel zeigen eine basische Funktion mit einem pKa 7,80 und eine saure Gruppe mit dem pKa 9,90. Das Äquivalentgewicht dieses Salzes ist 680 20 g.
Eine Suspension des Salicylats in flüssigem Pe- trolatum zeigt folgende charakteristische Absorptions bänder im Infrarotgebiet, in cm-' ausgedrückt: 3540, 3260, 3070, 1950, 1677, 1625, 1614, 1584, 1546, 1488, 1096, 1089, 766 und 764, was in Fig. 3 dar gestellt ist.
Die Einzelbänder bei 3540, 3260 und 3070 sind charakteristisch für die OH- und,'oder NH- Gruppe. Das Band bei 1950 ist charakteristisch für das Salz. Die Bänder bei 1677, 1625. 1614, 1548 und 1546 sind charakteristisch für die G=O-Gruppe, und die Bänder bei 1488, 776 und 764 sind charak teristisch für die Phenylgruppe. Die Bänder bei 1096 und 1089 sind charakteristisch für die GO-Gruppe.