Verfahren zur Herstellung von 6a, 16a-Dimethyl-4-pregnen-17a, 21-diol-3,11,20-trion Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion, ausgehend von 16-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion. Dieses neue 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion besitzt eine ausserordentlich starke entzündungs hindernde Wirkung und eignet sich besonders für die Behandlung von Arthritis und verwandten Krank heiten, indem es mit cortisonartiger Wirkung in äusserst geringen Mengen verabreicht werden kann,
wobei unerwünschte Nebenwirkungen auf ein Mini mum beschränkt werden.
Das erfindungsgemässe hergestellte 6a,16rz-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion lässt sich durch folgende Formel veranschaulichen:
EMI0001.0011
<B>35</B> und wird erfindungsgemäss so hergestellt, dass man 16-Methyl-4-pregnen-17(,i,21-diol-3,11,20-trion vorzugsweise unter sauren Bedingungen mit Form aldehyd umsetzt zur Bildung von 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- 4-pregnen-3,11-dion, welches in Gegenwart eines sauren Katalysators mit Athylenglykol behandelt wird zur Bildung von 3-Äthylendioxy-17a,20,20,
21-bismethylendioxy- 16a-methyl-5-pregnen-11-on. Die letztere Verbindung wird mit einer organischen Persäure, z. B. Perbenzoesäure, Perphthalsäure oder dergleichen, umgesetzt, wobei 3-Athylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 5,6-epoxy-16a-methyl-pregnan-11-on gebildet wird, welches dann mit Ameisensäure um gesetzt wird zur Bildung eines Gemisches von 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- 6-formyloxy-pregnan-5-ol-3,11-dion und 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- 5-formyloxy-pregnan-6-ol-3,11-dion,
welches Gemisch durch Behandeln mit einer wässeri gen Alkalihydroxydlösung in 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- allopregnan-3,6,11-trion übergeht. Die letztgenannte Verbindung wird durch Behandeln mit Butanondioxolan in 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 16a-methyl-allopregnan-6,11-dion übergeführt, welches mit einem Methyl-Grignard- Reagens umgesetzt wird und 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6a,
16a-dimethyl-allopregnan-6ss-ol-11-on bildet. Dieses 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6a,16a-dimethyl-allopregnan-6ss-o1-11-on wird mit einem Wasserabspaltungsmittel, wie Thionyl- chlorid in Pyridin, behandelt zur Gewinnung des ent sprechenden 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6,16a-dimethyl-5-pregnen-11-ons, welches durch Behandeln mit p-Toluolsulfonsäure- monohydrat in Aceton in 17a,20,20,21 Bismethylendioxy-6a,
16a- dimethyl-4-pregnen-3,11-dion übergeführt wird; die letztere Verbindung wird mit einer als Hydrolysierungsmittel wirkenden wässerig organischen Säure behandelt, wobei 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion entsteht. Diese Verbindung kann durch Behandeln mit einem Acylierungsmittel in das entsprechende 21-Acylat umgewandelt werden.
Die Reaktion zwischen der 16-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20- trion-Verbindung und Formaldehyd zur Herstellung des entsprechen den Bismethylendioxy-Derivates erfolgt zweckmässig durch inniges Vermischen einer Lösung des Steroids in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie Chloro form, mit einer Lösung von Formaldehyd in einer wässerigen Mineralsäure, z.
B. wässeriger Salzsäure. Die Reaktion wird gewöhnlich im wesentlichen bei Zimmertemperatur durchgeführt, unter welchen Bedin gungen die Bildung des Bismethylendioxy-Derivates innert etwa 2-3 Tagen beendet ist.
Die nichtwässe rige Schicht wird gewonnen, mit einer wässerig alkalischen Lösung neutralgewaschen, getrocknet und eingedampft zur Isolierung des 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- 4-pregnen-3,11-dions. Die Umsetzung dieses Bismethylendioxy-Derivates mit Äthylenglykol erfolgt zweckmässig durch Er hitzen der beiden Reaktionsteilnehmer in einer Lö sung in einem Kohlenwasserstofflösungsmittel, wie Benzol, in Gegenwart eines sauren Katalysators,
wie p-Toluolsulfonsäure. Bei Verwendung von Benzol als Lösungsmittel wird die Reaktion zweckmässig so durchgeführt, dass man die Reaktionslösung während etwa 15 Stunden auf Rückfluss erhitzt, worauf man die gekühlte Reaktionslösung mit einer wässerigen alkalischen Lösung wäscht, trocknet und eindampft zur Isolierung von 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 16a-methyl-5-pregnen-11-on. Dieses 3-Äthylendioxy-Derivat kann gewünschten falls durch Chromatographieren auf mit Säure ge waschener Tonerde gereinigt werden.
Das 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylen- dioxy-16a-methyl-5-pregnen-11-on wird vorzugsweise in Gegenwart eines flüssigen Me diums, beispielsweise eines Kohlenwasserstofflösungs mittels wie Benzol, mit der Persäure, z. B. Perbenzoe- säure oder Perphthalsäure, behandelt. Die Reaktion erfolgt zweckmässig bei Zimmertemperatur, unter welchen Bedingungen sie gewöhnlich nach etwa 2 Tagen im wesentlichen beendet ist.
Die Reaktions lösung wird von einem Teil des Epoxydproduktes dekantiert, und das verbleibende Epoxyd wird durch Eindampfen der neutralisierten und getrockneten Re aktionslösung gewonnen. Das Epoxydprodukt, das heisst das 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 5,6-epoxy-16a-methyl-pregnan-11-on, wird in im wesentlichen wasserfreier Ameisensäure gelöst, und die erhaltene Lösung wird während etwa 2-3 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Hierauf giesst man die Reaktionslösung in Wasser und extrahiert das wässerige Gemisch mit einem halogenierten Kohlenwasserstofflösungsmittel, wie Chloroform.
Der chloroformische Auszug wird neu tralisiert, getrocknet und eingedampft und liefert ein Gemisch von 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- 6-formyloxy-pregnan-5-ol-3,11-dion und 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- 5-formyloxy-pregnan-6-ol-3,11-dion. Die Umsetzung des Gemisches der Formyloxy- Derivate mit der Alkalihydroxydlösung erfolgt zweck mässig durch Auflösen der Formyloxy-Verbindungen in einem niedrigen A.lkanol,
Zugabe einer wässerigen Lösung eines Alkalihydroxyds, wie Kaliumhydroxyd, zu dieser Lösung und Erhitzen der erhaltenen wässe- rig-alkoholischen alkalischen Lösung während etwa 1/-, Stunde in Anwesenheit einer Stickstoffatmosphäre unter Rückflussbedingungen. Die Reaktionslösung wird dann gekühlt, mit einer organischen Säure, wie Essigsäure, neutralisiert und auf ein kleines Volumen eingedampft. Man verdünnt das wässerige Konzentrat mit Wasser und extrahiert das wässerige Gemisch mit einem halogenierten Kohlenwasserstofflösungs mittel, wie Chloroform.
Der nichtwässerige Auszug wird neutralisiert, getrocknet und eingedampft, wobei man 17ce,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- allopregnan-3,6,11-trion erhält, welches gewünschtenfalls durch Kristallisieren aus einem niedrigen Alkanol, wie Methanol, gerei nigt werden kann.
Die Reaktion zwischen dem 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16:i-methyl- allopregnan-3,6,11-trion und Butanon-dioxolan wird zweckmässig durchge führt, indem man die Reaktionsteilnehmer miteinan der in Gegenwart eines sauren Katalysators, wie p-Toluolsulfonsäure, auf Rückfluss erhitzt, unter wel chen Bedingungen die Reaktion gewöhnlich in etwa 10 Minuten beendet ist.
Das Reaktionsgemisch wird gekühlt, mit Chloroform verdünnt, und die erhaltene chloroformische Lösung wird mit Bicarbonat gewa schen, getrocknet und eingedampft, wobei man 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 16a-methyl-allopregnan-6,11-dion erhält, welches gewünschtenfalls durch Kristallisieren aus Äthylacetat gereinigt werden kann.
Man gibt dann eine Lösung dieses 3-Athylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 16a-methyl-allopregnan-6,11-dions in Benzol unter Rühren innert 10 Minuten zu einer Lösung von Methylmagnesiumjodid in Diäthyläther. Das erhaltene Gemisch wird eine weitere halbe Stunde gerührt, worauf man Wasser und anschlie ssend zusätzliches Benzol zugibt, um dann die orga nische Schicht abzutrennen, zu trocknen und einzu dampfen zur Bildung des entsprechenden 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6ce,16a-dimethyl-allopregnan-61>-ol-11-ons. Die Reaktion zwischen dem 3-Äthylendioxy-17a,20,20,
21-bismethylendioxy- 6a,16a-dimethyl-allopregnan-6/1-ol-11-on und Thionylchlorid - insofern letzteres als Wasser abspaltungsmittel verwendet wird - wird zweckmässig durchgeführt, indem man eine Lösung von Thionyl- chlorid in wasserfreiem Pyridin tropfenweise zu einer wasserfreien pyridinischen Lösung des Steroids zu setzt, derweil die Temperatur der Lösung auf unge fähr 40" C gehalten wird.
Die erhaltene Lösung wird während einer weiteren halben Stunde gerührt, dann gekühlt und in Eiswasser gegossen, und das wässerige Gemisch wird mit einem halogenierten Kohlenwasser stofflösungsmittel, wie Chloroform, extrahiert. Die chloroformische Schicht wird neutralisiert, getrock net und zu einem Rohprodukt eingedampft, welches durch Chromatographieren über Tonerde gereinigt wird, wobei man 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6,16a-dimethyl-5-pregnen-11-on erhält.
Man löst das 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6,16cc-dimethyl-5-pregnen-11-on in wasserfreiem Aceton, welches p-Toluolsulfonsäure- monohydrat enthält, und lässt die erhaltene Lösung während etwa 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Hierauf giesst man das Produkt in Wasser und extrahiert das wässerige Gemisch mit einem halo- genierten Kohlenwasserstofflösungsmittel, wie Chloro form.
Die chloroformische Lösung wird neutralisiert, getrocknet und eingedampft, wobei man 17cc,20,20,21-Bismethylendioxy-6a,16a-dimethyl- 4-pregnen-3,11-dion erhält. Die Reaktion zwischen dem 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-6a,16a-dimethyl- 4-pregnen-3,11-dion und dem aus einer wässerigen organischen Säure be stehenden Hydrolysierungsmittel, insbesondere einer wässerigen Essigsäurelösung, wird durchgeführt, indem man die Reaktionsteilnehmer miteinander unter Stick stoffatmosphäre während etwa 8 Stunden auf etwa 701, C erhitzt.
Die Hydrolyselösung wird zu 6cc,16a-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion eingedampft, welches dann mit einem Acylierungs- mittel, z.
B. Acetanhydrid und Pyridin, behandelt werden kann zur Bildung des entsprechenden 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion-21-acylats. Das in dieser Weise erzeugte 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion wird zur Herstellung der entsprechenden 1,4-Pregna- dien-Verbindung verwendet, indem man das genannte 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,
20-trion der wasserstoffabspaltenden Wirkung von Schizomy- cetes-Mikroorganismen aussetzt oder aber mit Selen dioxyd behandelt, wobei das 6a,16a-Dimethyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol- 3,11,20-trion erhalten wird.
<I>Beispiel 1</I> Man löst 10 g 16a-Methyl-4-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion in 400 cm3 Chloroform. Zu dieser Lösung gibt man ein Gemisch von 100 cm3 konzentrierter wässeriger Salzsäure und 100 cm3 37 laiger wässeriger Form aldehydlösung. Das, entstehende Gemisch wird wäh rend ungefähr 3 Tagen bei Zimmertemperatur gerührt.
Die chloroformische Schicht wird abgetrennt, mit Na- triumbicarbonatlösung bis zur Neutralität und dann mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne einge dampft. Das zurückbleibende rohe Material wird ge reinigt durch Kristallisieren aus einem Gemisch von Methylenchlorid und Methanol, wobei man 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- 4-pregnen-3,11-dion erhält.
Man löst 10 g 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- 4-pregnen-3,11-dion in 500 cm3 Benzol, versetzt die Lösung mit 25 cm3 Äthylenglykol und 1 g p-Toluolsulfonsäure und er hitzt das erhaltene Gemisch ungefähr 15 Stunden lang auf Rückfluss. Die Reaktionslösung wird ge kühlt, mit wässeriger Natriumbicarbonatlösung ge waschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Das zu rückbleibende rohe Material absorbiert man aus benzolischer Lösung auf 250 g mit Säure gewa schener Tonerde, und das gebildete Adsorbat wird unter Verwendung von Gemischen aus Äther und Petroläther eluiert, wobei man 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 16a-methyl-5-pregnen-11-on erhält.
Ein Gemisch aus 10 g 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 17a-methyl-5-pregnen-11-on, 4,3 g Perbenzoesäure und 230 cm- Benzol wird etwa 2 Tage lang bei Zimmertemperatur stehengelassen. Ein Teil des Epoxydproduktes, welches ausfällt, wird durch Dekantieren von der Reaktionslösung abge trennt, und die dekantierte Lösung wird mit gesättig ter wässeriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrock net.
Die getrocknete Lösung wird dann im Vakuum eingedampft, und das als Rückstand anfallende Epoxydprodukt wird mit dem ursprünglich aus dem Reaktionsgemisch abgetrennten Epoxydprodukt ver einigt.
Das Epoxydgemisch wird in 200 cm3 wasserfreier Ameisensäure gelöst; die erhaltene Lösung wird bei Zimmertemperatur während etwa 21/2 Stunden stehengelassen. Man giesst die Reaktionslösung in Wasser und extrahiert das wässerige Gemisch mit Chloroform.
Die chloroformische Lösung wird mit gesättigter wässeriger Natriumbicarbonatlösung ge waschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft, wobei man ein Gemisch aus 17a,20,20,21 Bismethylendioxy-16a-methyl- 6-formyloxy-pregnan-5-ol-3,11-dion und 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- 5-formyloxy-pregnan-6-ol-3,11-dion erhält.
Dieses Gemisch der 5-Formyloxy- und 6-Formyl- oxy-Derivate wird in etwa 850 em3 Methanol gelöst. Zu dieser Lösung gibt man eine Lösung, welche etwa 17g Kaliumhydroxyd in 80 cm3 Wasser enthält, und erhitzt das erhaltene Gemisch unter Stickstoffatmo sphäre während ungefähr 1/2 Stunde auf Rückfluss. Die Reaktionslösung wird gekühlt, mit etwa 23 cm3 Essigsäure neutralisiert und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft.
Man giesst die kon zentrierte Lösung in Wasser und extrahiert die wässe rige Mischung mit Chloroform. Der chloroformische Auszug wird mit wässeriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrock net und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das zurückbleibende Material wird aus Methanol kristal lisiert, wobei man 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- allopregnan-3,6,11-trion erhält.
Eine Lösung, welche etwa 5 g 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-16a-methyl- allopregnen-3,6,11-trion und 0,1 g p-Toluolsulfonsäure in 120 cm3 Butanon- dioxolan enthält, wird während etwa 10 Minuten auf Rückfluss erhitzt. Die Reaktionslösung wird auf etwa 0 bis 5 C abgekühlt und mit Chloroform verdünnt, und die erhaltene Lösung wird mit wässeriger Na- triumbicarbonatlösung gewaschen und über wasser freiem Natriumsulfat getrocknet.
Die erhaltene trockene Lösung wird im Vakuum zur Trockne ein gedampft, und der Rückstand wird mit Äther auf gerührt, worauf man filtriert und trocknet zur Ge winnung von 3-Athylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 16a-methyl-allopregnan 6,11-dion.
Eine Lösung, welche etwa 5 g 3-Athylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 16a-methyl-allopregnan-6,11-dion in 70 cm- Benzol enthält, wird unter Rühren innert etwa 10 Minuten einer ätherischen Lösung zugesetzt, welche, gelöst in 50 cm3 Äther, das aus 5 cm3 Me- thyljodid und 0,5g Magnesiumspänen erhaltene Me- thylmagnesiumjodid enthält. Man rührt das erhaltene Gemisch während einer weiteren halben Stunde und versetzt die gebildete Lösung mit 70 cm3 Wasser.
Zum wässerigen Gemisch gibt man etwa 170 cm3 Benzol und trennt die Schichten. Die wässerige Schicht wird zweimal mit je 100 cm3 Chloroform extrahiert, und die organischen Schichten werden ver einigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6a,16a-dimethyl-allopregnan-6ss-ol-11-on erhält.
Man gibt eine Lösung, welche 5,5 cm3 frisch destilliertes Thionylchlorid in 26 cm3 kaltem wasser freiem Pyridin enthält, tropfenweise unter Rühren zu einer Lösung von 5,0 g 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6a,16a-dimethyl-allopregnan-6/3-o1-11-on in 32 cm3 wasserfreiem Pyridin, wobei man die Temperatur des Reaktionsgemisches bei ungefähr 40 C hält.
Nach dem Zusatz des Thionylehlorid- Reagens rührt man die Reaktionslösung während weiteren 30 Minuten, kühlt dann das Reaktions gemisch auf etwa 0 bis 5 C und giesst in 180 cm3 Eiswasser. Das wässerige Gemisch wird mit Chloro form extrahiert, und der chloroformische Auszug wird neutral gemacht, über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne ein gedampft.
Das verbleibende Material wird in Benzol gelöst und über 150 g mit Säure gewaschener Ton erde chromatographiert; durch Eluieren des Adsor- bates mit einem Petroläther-Äther-Gemisch erhält man 3-Äthylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6,16a-dimethyl-5-pregnen-11-on. Eine Lösung, welche etwa 5 g 3 Athylendioxy-17a,20,20,21-bismethylendioxy- 6,16a-dimethyl-5-pregnen-11-on, 500 cm3 wasserfreies Aceton und etwa 0,
5 g p-To- luolsulfonsäure-monohydrat enthält, wird während etwa 15 Stunden stehengelassen. Die Reaktionslösung wird in Wasser gegossen, und das wässerige Gemisch wird mit Chloroform extrahiert. Die chloroformische Lösung wird mit wässeriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat ge trocknet, und die chloroformische Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Benzol kristallisiert, wobei man 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-6a,16rz-dimethyl- 4-pregnen-3,11-dion erhält.
Man suspendiert etwa 0,1 g 17a,20,20,21-Bismethylendioxy-6a,16a-dimethyl- 4-pregnen-3,11-dion in 18 cm3 50 /oiger wässeriger Essigsäure und reinigt die Suspension sorgfältig mit Stickstoff, worauf man die Suspension auf dem Dampfbad unter Stickstoff atmosphäre während etwa 8 Stunden erhitzt und dann während weiteren 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehenlässt. Die Reaktionslösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei man 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion erhält.
Das Material wird in 20 cm3 Chloroform gelöst, und die chloroformische Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Zum Rückstand fügt man 1 cm' Pyridin und 1 cm3 Acetanhydrid und erhitzt dann das Gemisch auf einem Dampfbad während etwa 15 Minuten. Darauf wird die Reaktionslösung auf etwa 0 bis 5 C gekühlt und in Eiswasser gegos sen. Die wässerige Suspension wird mit Chloroform extrahiert, und der chloroformische Auszug wird mit wässeriger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Va kuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in 30 cm?, Benzol gelöst und auf 5 g mit Säure ge waschener Tonerde adsorbiert; das Adsorbat wird mit 50 cms Äther gewaschen. Hierauf wird es mit 250 cm3 eines Äther-Chloroform-Gemisches 5:5 und dann mit 50 cm3 eines Äther-Chloroform- Gemisches 3 :
7 eluiert. Die Eluate werden im Va kuum eingedampft, und der Rückstand wird aus Me thanol kristallisiert, wobei man 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion21-acetat erhält.
<I>Beispiel 2</I> Es werden 50 cm3 eines. Nährmediums von fol gender Zusammensetzung hergestellt: Cerelose 1 g Edamin 1 g Getreideweiche 0,25 cm3 destilliertes Wasser auf 50 cm3 Dieses Medium wird mit KOH auf pH 6,5 ge stellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 em3 einer Kultur von Bacillus sphaericus (ATCC-245)-Mikro- organismen geimpft.
Die geimpfte Kultur wird dann unter Rühren während etwa 24 Stunden bei<B>28 </B> C bebrütet. Zur erhaltenen Kultur gibt man eine Lö sung von 10 mg 6a,16a Dimethyl-4-pregnen-17a,21-diol- 3,11,20-trion in 0,2 cm3 Dimethylformamid. Die die Steroid-Ver- bindung enthaltende Kultur wird unter Rühren "wäh rend weiteren 24 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Fermentierungsbrühe wird viermal mit je 50 cm-- Äthylacetat extrahiert, und die Äthylacetat- Auszüge werden vereinigt und im Vakuum auf etwa 5 em3 eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird auf Papierchromatogramme aufgetragen, welche unter Verwendung von Formamid als stationäre Phase und von Benzol-Chloroform <B><I>50:</I></B> 50 als bewegliche Phase entwickelt werden.
Nach 8stündiger Entwicklung in einem absteigenden System schneidet man die obern Bänder jedes Chromatogramms, welche dem dl-De- hydro-Derivat entsprechen, ab, extrahiert mit Me thanol und unterwirft das mit Methanol extrahierte Material erneut der Papierstreifenchromatographie. Das obere Band wird wiederum abgeschnitten, gut getrocknet und mit Methanol extrahiert, und der me- thanolische Auszug wird im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird umkristallisiert zur Gewinnung von 6a,16a-Dimethyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol 3,11,20-trion.
Das 6a,16a.-Dimethyl-1,4-pregnadien-17a,21- diol-3,11,20-trion wird mit Acetanhydrid und Pyridin behandelt zur Bildung des 21 Acetyl-Derivates, welches durch Um kristallisieren gereinigt wird zur Gewinnung von reinem 6a,16a-Dimethyl-1,4-pregnadien-17a,21-diol- 3,11,20-dion-21-acetat.