CH385871A

CH385871A - Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12-Derivaten

Info

Publication number: CH385871A
Application number: CH7643559A
Authority: CH
Inventors: Bernhauer Konrad Dr Prof
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1959-07-31
Filing date: 1959-07-31
Publication date: 1964-12-31
Also published as: BE593141A

Description

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Verfahren zur Herstellung von Vitamin Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B12 Derivaten der Formel
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worin A- bzw. A-- Anionen, z. B. zwei Cyanidionen und Ri Wasserstoff, eine Alkyl- oder Carbalkoxygruppe, R2, R3 und R4 Wasserstoff oder Alkylgruppen darstellen und R,, eine gegebenenfalls veresterte oder verätherte Hydroxygruppe bedeutet, wobei die Alkylgruppen 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten.

Die den Säureamiden der Formel I zugrundeliegende Säure wird im folgenden als Cobyrinsäure und die gegebenenfalls funktionell ausgestalteten Carboxylgruppen dieser Säure durch die im Formelbild angegebenen Kleinbuchstaben a bis g bezeichnet.

Es wurde gefunden, dass man die Verbindungen der Formel I dadurch erhalten kann, dass man Cobyrin- säure abcdeg-hexamid mit durch Anionen kompensierten Ladungen des Ions, welches auch als Faktor V1, bezeichnet wird, oder ein in der (f)-Carboxyl- gruppe abgewandeltes reaktionsfähiges Derivat eines solchen Salzes mit einem Amin der Formel

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kondensiert. Das als Ausgangsverbindung verwendete Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid konnte bisher nicht durch Abbau von Vitamin B12 erhalten werden, doch kann es bei der Aufarbeitung von Faulschlamm geeigneter Herkunft isoliert werden, wie es im folgenden beschrieben ist.

16 Kubikmeter Faulschlamm einer Abwasserreinigungsanlage in Darmstadt-Eberstadt werden in der in der deutschen Patentschrift Nr. 922126 beschriebenen Weise zu einem Kieselgurkonzentrat verarbeitet. Bei der chromatographischen Trennung dieses Konzentrates mittels einer Zellulosesäule unter Verwendung von n-Butanol, welches mit Wasser und Kaliumperchlorat gesättigt ist und 0,3 ml -10 1/oige Blausäurelösung pro Liter enthält, wird zwischen den Fraktionen des Vitamins B12 und des Faktors III eine Zwischenfraktion gewonnen, welche das Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid-dicyamid enthält. Durch Einengen dieser Fraktion im Vakuum erhält man ein wässriges Konzentrat, das durch Extraktion mit Phenol und Fällung mit p-Chlorphenol an Kieselgur gereinigt wird.

Das so erhaltene Kieselgurprodukt unterwirft man einer Chromatographie an Zellulosepulver unter Verwendung von n-Butanol mit 15 % Wasser und 0,5 ml 10 11/oiger Blausäure pro Liter als Eluiermittel. Unter diesen Bedingungen eluiert man die vorhandenen Bi.-Faktoren in folgender Reihenfolge: Faktor Ib, Vitamin B12, 5-Methyl-benzimidazolcobalamin, Benzimidazol-cobalamin, 2-Methylmercapto-adenin-cobalamin und Faktor III. Schliesslich erhält man eine nur langsam wandernde Fraktion, die Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid-dicyanid enthält. Diese Fraktion wird im Vakuum eingeengt und bei pH 2,7 in 0,5n Essigsäure mit einem Zusatz von 0,005 /o Blausäure der Elektrophorese unterworfen. Dabei wandert das Hexamid zur Kathode, während der Rest der vorstehend genannten B12 Faktoren nicht wandert und so abgetrennt werden kann.

Man eluiert mit Wasser, reinigt die wässrige Lösung durch Extraktion mit Phenol und verdampft sodann im Vakuum. Der Trockenrückstand wird mit Aceton verrieben und der nach Verdampfung des Acetons verbleibende Rückstand im Vakuum getrocknet. Man erhält so ein violettrotes amorphes, nicht hygroskopisches Pulver, in dem das Cobyrinsäure-abcdeghexamid-dicyanid in einem Reinheitsgrad von über 70 /o vorliegt.

Das erhaltene Produkt kann einer weiteren Reinigungsbehandlung unterworfen werden, indem man eine ziemlich konzentrierte wässrige Lösung der Substanz durch eine Säule von phosphorylierter Zellulose laufenlässt. Dabei wird das Hexamid festgehalten, saure proteinartige Verunreinigungen jedoch aus-
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gewaschen. Anschliessend entwickelt man mit Wasser, das 0,005 bis 0,1 1/o Blausäure enthält. Dadurch wird das Hexamid in die Cyanoform umgewandelt und kann ohne weiteres aus der Säule ausgewaschen werden, wähend basische proteinartige Verunreinigungen am Austauscher verbleiben. Aus der wässrigen Lösung erhält man nach dem Filtrieren über Kieselgur, Eindampfen des Filtrates im Vakuum und Behandeln des Rückstandes mit Aceton ein violettrotes Pulver, in dem das Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid-dicyanid in einem Reinheitsgrad von über 90 %vorliegt.

Die so erhaltene Substanz besitzt bei pH 6,5 in Gegenwart von Cyanidionen dasselbe Absorptionsspektrum, wie das daraus durch Kondensation mit 1-Amino-propanol-(2) erhaltene Cobyrinsäure-abcdeghexamid-f-isopropanolamid-dicyanid (im folgenden als Cobinamid-dicyanid bezeichnet) mit dem typischen Maximum bei 367 ,u. Die RF-Werte im Vergleich zu denjenigen von Vitamin B12 bzw.

Cobinamid-dicyanid sind aus der folgenden Tabelle zu entnehmen.
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A B C Entwickler 0,68 0,54 1,0 a 0,63 0,63 1,0 b 1,16 0,98 1,0 c 0,43 0,36 1,0 d A = Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid-dicyanid B = Cobinamid-dicyanid C = Vitamin Bit a = wassergesättigtes sekundäres Butanol b = a mit einem Zusatz von Ammoniak c = a mit einem Zusatz von Essigsäure d = a mit 0,5 11o Natriumtetraphenylborat
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Dabei wurde während 24 Stunden bei Raumtemperatur aufsteigend auf Schleicher & Schüll Papier 2043A entwickelt, wobei der Entwickler stets Cyanidionen enthielt.

Das papierelektrophoretische Verhalten in Gegenwart von Cyanidionen war bei pH 2,7 basisch (wie Cobinamid-dicyanid) (orange) und bei pH 6,5 einfach sauer (violett).

Als Amine der Formel 1I können solche mit freier Hydroxylgruppe, wie z. B. Aminoäthanol, 1-Amino-propanol-(2), 2-Amino-propanol-(1), 3-Amino-butanol-(2), Amino-tert. butanol, verwendet werden. Anstelle der Aminoalkohole können, wie gesagt, auch Derivate derselben, in denen die Hydroxylgruppe durch Äther- oder Esterbildung verschlossen ist, verwendet werden. Hierzu eignen sich z. B. die Alkyl-, Aralkyl- oder Tetrahydropyranyl- äther. Man kann auch die mit organischen Säuren veresterten Aminoalkohole, wie z. B. die Acetate oder Benzoate, verwenden. Ebenso können Verbindungen der Aminoalkohole, in denen die Hydroxylgruppe mit anderen Säuren verestert ist, wie z.

B. mit Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Dialkylphosphorsäure, Diarylphosphorsäure,

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Diaralkylphosphorsäure, Schwefelsäure, Methylschwefelsäure, Arylsulfonsäuren, eingesetzt werden. Beispiele derartiger Verbindungen sind Aminoäthylchlorid, 1-Amino-propylbromid-(2), 1-Amino-propyljodid-(2), Aminoäthanol-O-phosphat, 1-Amino-propanol-(2)-O-phosphat, 1-Amino-propanol-(2)-O-diphenylphosphat, 1-Amino-äthanol-O-methylphosphat, 1-Amino-propanol-(2)-O-tosylat.

Wenn ein Endprodukt der vorstehenden allgemeinen Formel I gewünscht wird, in welcher R1 eine Carbalkoxygruppe bedeutet, so verwendet man als Amin der Formel II einen entsprechenden Aminosäureester, wie z. B. die Ester des Serins oder Threonins und Derivate derselben. Nach Umsetzung dieser Aminosäureester mit dem Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid kann die Carbalkoxygruppe durch Hydrolyse und Decarboxylierung abgespalten werden. Es können, wie im Fall der Aminoalkohole, auch Aminosäureester mit einer veresterten oder verätherten Hydroxylgruppe verwendet werden. Als Beispiele seien folgende Verbindungen genannt: Serinmethylester-O-methyläther, Serinmethylester-O-dibenzylphosphat, Serinäthylester-O-phosphat, Threoninmethylester-O-benzyläther, Threoninäthylester-O-benzoat.

Alle diese Aminoalkohole und deren Derivate können sowohl in optisch aktiver Form als auch in Form der Racemate als Ausgangsstoffe verwendet werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform des. erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man die Säure in ein reaktionsfähiges Derivat überführt und letzteres mit der Aminkomponente kondensiert. Als reaktionsfähige Derivate eignen sich z. B. die Ester, wie Methyl- oder Äthylester, oder auch sogenannte aktivierte Ester, wie Cyanmethylester oder Thiolester. Besonders geeignet sind auch Anhydride, z. B. die gemischten Anhydride, welche durch Umsetzen der Säure mit Chlorkohlensäureester in Gegenwart einer tertiären Base erhalten werden.

Eine besonders zweckmässige Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man in Gegenwart eines Carbodiimides kondensiert. Man kann sowohl aromatische als auch aliphatische oder cycloaliphatische Vertreter dieser Körperklasse verwenden, z. B. p-Ditolylcarbodümid, Di-tert: butylcarbodümid oder Dicyclohexylcarbodiimid. Bei Verwendung eines Carbodiimides ist die Herstellung eines reaktionsfähigen Derivates der Säure nicht notwendig und ausserdem kann die Umsetzung auch in Wasser oder wasserhaltigen Lösungsmitteln durchgeführt werden, in denen die als Ausgangsmaterial verwendete Säure löslich ist.

Die Reaktion wird zweckmässig in Gegenwart eines Lösungsmittels durchgeführt. Als Lösungsmittel kommen ausser Wasser besonders die mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Aceton, Dioxan,
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Tetrahydrofuran, Formamid, Dimethylformamid, und niedere Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol, Isöpropanol, in Betracht. Ausserdem eignen sich dafür besonders chlorierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid und Chloroform, sowie aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol und Toluol. Andere geeignete Lösungsmittel sind z. B. Pyridin und dessen Homologe, wie Lutidin, die sowohl in Mischung mit Wasser als auch mit den anderen vorstehend erwähnten Lösungsmitteln verwendet werden können.

Infolge der Empfindlichkeit der Ausgangs- und Endstoffe ist es vorteilhaft, hohe Temperaturen bei der Durchführung der Kondensation zu vermeiden. Man arbeitet deshalb zweckmässig bei Raumtemperatur oder unter Kühlung, gegebenenfalls bei leicht erhöhter Temperatur. Bei der Umsetzung eines Esters mit einem Amin kann auch das Kochen in- einem Lösungsmittel vorteilhaft sein.

Weiter kann es zweckmässig sein, die Kondensation unter Verwendung von sauren oder basischen Katalysatoren durchzuführen. Als solche eignen sich z. B. Alkoholate, wie Natriummethylat, Mineralsäuren, wie Salzsäure, oder organische Säuren, wie p-Toluolsulfosäure. Auch ist es zweckmässig; die Reaktion in Gegenwart von Stoffen durchzuführen, welche das bei der Reaktion gebildete Wasser binden, wie z. B. Essigsäureanhydrid, Calciumehlorid, Natriumsulfat.

Die Isolierung und Reinigung der Verfahrensendprodukte kann durch chromatographische Methoden oder durch Elektrophorese erfolgen, wobei die Trennung von nicht umgesetztem Material besonders einfach durchzuführen ist. Die Reinigung kann auch durch fraktionierte Fällung mit Hilfe geeigneter Lösungsmittelgemische, wie z. B. Wasser/Aceton, erfolgen.

Die Verfahrensendprodukte sind zum Teil als Wuchsstoffe für Mikroorganismen, wie z. B. gewissen Colibakterien, wirksam. Sie können auch Antivitamin-B12-Wirkung entfalten. Einzelne Vertreter eignen sich zur Synthese kompletter Vitamine der B12 Gruppe. Besondere Bedeutung hat das Verfahrensendprodukt, in welchem die Carboxygruppe in f-Stellung mit Aminoisopropanol amidartig verknüpft ist, da das Aminoisopropanol in den kompletten Vitaminen der B12 Gruppe das Bindeglied zwischen dem makrocyclischen Kobaltkomplex und dem Nucleotid darstellt.

Beispiel 1 Zu einer Lösung von 5,42 mg (5,5 X 10-s Mol) Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid-dicyanid (getrocknet bei 110 und 0,1 Torr über P205) in 2,0 ml abs. Dimethylformamid werden 0,011 ml (1,1 X 10-s Mol) einer 1 molaren TriäthylaminLösung in Dimethylformamid zugefügt. Nach Kühlung auf -10 werden 0,005 ml (5,0 X 10-s Mol) einer 1 molaren Lösung von Chlorameisensäureäthylester in Dimethylformamid eingetragen, das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei -10 belassen- und

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anschliessend in der Kälte mit 7,5 mg (1 X 10-4 Mol) D,L-1-Amino-propanol-(2) versetzt. Unter mehrmaligem Umschütteln wird nun innerhalb 30 Minuten die Reaktionslösung auf Raumtemperatur gebracht und sodann noch 1 Stunde im Wasserbad auf 40 erwärmt.

Die Lösung wird mit 4 ml Aceton und 8 ml Düsopropyläther versetzt, der rote Niederschlag zweimal mit je 5 ml Aceton ausgewaschen, in 5 ml Wasser gelöst und mittels eines Austauschers von phosphorylierter Zellulose gereinigt. Die cyanidhaltige Fraktion wird hierauf im Vakuum auf ein Volumen von 1 ml eingeengt.

0,05 ml der so erhaltenen Lösung werden auf Schleicher & Schüll -Papier 2043bG1 aufgetragen und im Phosphat-Puffer in Gegenwart von Cyanidionen bei pH 6,5 während 15 Stunden und 150 Volt der Elektrophorese unterworfen. Weitaus der grösste Teil verbleibt in der neutralen Zone und nur ein kleiner Anteil wandert als einbasische Säure. Die neutrale Zone wird ausgeschnitten, mit Wasser eluiert und mit einem Austauscher von phosphorylierter Zellulose entsalzt. Man erhält nach dieser Methode in 92%iger Ausbeute das Racemat von Cobinamiddicyanid.

Beispiel 2 5,0 mg (5,1 X 10-s Mol) Cobyrinsäure-abcdeghexamid-dicyanid wird in 0,1 ml Wasser und 0,9 ml Pyridin gelöst, mit 7,5 mg (1 X 10-4 Mol) D,L-1Amino-propanol-(2) versetzt und zu dieser Mischung bei Raumtemperatur eine Lösung von 3,84 mg (2 X 10-5 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Pyridin eingetragen. Nach 18 Stunden Stehen bei Raumtemperatur werden zur klaren Reaktionslösung 2 ml Wasser gegeben, vom ausgeschiedenen N,N'-Dicyclohexyl-harnstoff abfiltriert, das Filtrat 5mal mit je 1 ml Äther extrahiert und die wässrige Phase mit 1n Essigsäure auf pH 4,5 gebracht. Der neu entstandene Niederschlag wird abzentrifugiert und die wässrige Phase im Vakuum auf ein Volumen von 1 ml eingeengt. Die Reinigung erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben. Man erhält das Racemat von Cobinamid-dicyanid in einer Ausbeute von 22,5,1/o.

Die vorstehend beschriebene Umsetzung kann in gleicher Weise auch mit D-1-Amino-propanol-(2) oder mit L-1-Amino-propanol-(2) anstelle von D,L- 1-Amino-propanol-(2) durchgeführt werden.

Beispiel 3 Zu einer Lösung von 9,85 mg (1 X 10-5 Mol) Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid-dicyanid in 4,0 ml abs. Dimethylformamid und 0,02 ml (2 X 10-5 Mol) einer 1 molaren Triäthylamin-Lösung in Dimethylformamid werden unter Kühlung bei -10 0,011 ml (1,1 X 10-5 Mol) Chlorameisensäureäthylester (1 molare Lösung in Dimethylformamid) eingetragen. Nach 20 Minuten Stehenlassen bei -10 wird die Reaktionsmischung mit 12,2 mg (2 X 10-4 Mol) 1-Amino- äthanol-(2) versetzt, innerhalb 30 Minuten unter mehrmaligem Umschütteln auf Raumtemperatur gebracht und anschliessend noch 1 Stunde im Wasser-
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bad auf 40 erwärmt. Das Reaktionsprodukt wird mit einem Gemisch von 6 ml Aceton und 14 ml Düsopropyläther gefällt, zentrifugiert und der Rückstand zweimal mit je 8 ml Aceton gewaschen, in 1 ml Wasser gelöst und auf 15g Kieselgar mittels Aceton-Äther niedergeschlagen.

Das Kieselgur-Produkt wird über Magnesiumperchlorat im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.

In einer Zellulose-Säule (Linterspulver Nr. 124 der Firma Schleicher & Schüll; Säule 3 X 20 cm) wird das Kieselgur-Produkt mit wassergesättigtem sekundärem Butanol als Entwickler chromatographiert. Es bilden sich 3 scharfe Zonen aus, wobei die ersten beiden Zonen verhältnismässig rasch eluiert werden. Die letzte Zone wird aus der Säule genommen und mit Wasser eluiert. Die so erhaltenen 3 Fraktionen werden im Vakuum auf ein Endvolumen von 1 ml eingeengt. Die Fraktion 1 enthält 86 /o, die Fraktion 2 6 % und die Fraktion 3 4 % an Reaktionsprodukt bezogen auf eingesetztes Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid-dicyanid.

Die folgende Tabelle zeigt das papierchromatographische Verhalten der einzelnen Fraktionen in verschiedenen Entwicklersystemen, wobei aufsteigend mit einer Entwicklungsdauer von 20 Stunden an Schleicher & Schüll -Papier 2043 a entwickelt wurde:
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Entwickler Fraktion 1 Fraktion 2 Fraktion 3 11,-Werte (Cobinamid-dicyanid = 1) a 0,96 1,03 0,54 b 0,95 0,86 0,63 c 0,97 1,04 0,95 d 0,95 1,03 0,35 a = wassergesättigtes sekundäres Butanol b = a mit einem Zusatz von Ammoniak c - a mit einem Zusatz von Essigsäure d = a mit 0,5% Natriumtetraphenylborat
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Die folgende Tabelle zeigt das elektrophoretische Verhalten der einzelnen Fraktionen in Gegenwart von Cyanidionen:

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<tb> pH <SEP> 2,7 <SEP> pH <SEP> 6,5
<tb> Fraktion <SEP> 1 <SEP> basisch <SEP> neutral
<tb> Fraktion <SEP> 2 <SEP> basisch <SEP> neutral
<tb> Fraktion <SEP> 3 <SEP> basisch <SEP> sauer

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Die Fraktion 1 enthält Cobyrinsäure-abcdeghexamid-f-äthanolamid-dicyanid, die Fraktion 2 den entsprechenden Monoäthylkohlensäureester und die Fraktion 3 Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid-dicyanid. Beispiel 4 1,97 mg (2 X 10-s Mol) Cobyrinsäure-abcdeghexamid-dicyanid, gelöst in 0,2 ml Wasser und 0,3 ml.

Methanol, werden bei Raumtemperatur mit 1 ml (6 X 10-4 Mol) Diazomethan gelöst in Äther versetzt.

Die ätherische Diazomethan-Lösung wird in Anteilen zu je 0,1 ml eingetragen, und zwar jeweils nachdem die Ätherschicht der Reaktionslösung farblos geworden ist. Nach 1 Stunde ist die Grient j wicklung beendet. Der Ansatz bleibt über Nacht stehen; anschliessend wird 3mal mit je 2 ml Äther extrahiert und die wässrige Phase über einem Aus- tauscher von phosphorylierter Zellulose gereinigt.

Die Cyanidionen enthaltende Fraktion wird auf 0,5 ml eingeengt und bei pH 6,5 in Gegenwart von Cyanid- ionen bei 200 Volt elektrophoretisch getrennt. Es bilden sich 2 Zonen aus. Fraktion 1 wandert als einbasische Säure und ist identisch mit dem Ausgangs- produkt, wovon 52'% zurückerhalten werden. Die Fraktion 2 verhält sich neutral (analog Cobinamid- dicyanid) und wird in einer Ausbeute von 2819/o erhalten.

Die Substanz verhält sich nach dem Entsalzen am Ionenaustauscher in allen Entwicklersystemen einheitlich und hat folgendes papierchroma- tographisches Verhalten:
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Entwickler Rf R, (Cobinamid-dicyanid = 1) a 0,43 1,07 b 0,36 0,88 c 0,44 1,09 d 0,46 1,05 a = wassergesättigtes sekundäres Butanol b = a mit einem Zusatz von Ammoniak c = a mit einem Zusatz von Essigsäure d = a mit 0,5010 Natriumtetraphenylborat
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Das elektrophoretische Verhalten von Fraktion 2 in Gegenwart von Cyanidionen ist bei pH 2,7 basisch und bei pH 6,5 und pH 11 neutral.

0,4 mg (2 X 10-7 Mol) der das Cobyrinsäureabcdeb hexamid-methylester-dicyanid enthaltenden Fraktion 2 werden bei 50 und 0,1 Torr über Phosphorpentoxyd getrocknet, in 1 ml abs. Dimethylformamid gelöst und mit 1,5 mg (2X 10-5 Mol) D,L-1-Amino-propanol-(2) versetzt. Der Ansatz wird 4 Tage bei 25 gehalten, mit Aceton/Düsopropyläther gefällt, 3mal mit Aceton gewaschen, in Wasser gelöst und an einem Austauscher von phosphorylierter Zellulose gereinigt. Das Cyanidionen enthaltende wässrige Eluat wird auf 0,2 ml eingeengt und durch mit Wasser gesättigtem sekundärem Butanol mit einem Zusatz von Ammoniak als Entwickler auf Schleicher & Schüll -Papier 2043 a getrennt. Man erhält in 9 %iger Ausbeute das Cobinamid-dicyanid.
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Beispiel 5 Zu einer Lösung von 5,42 mg (5,5 X 10-6 Mol) Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid-dicyanid in 2,0 ml abs.

Dimethylformamid werden 0,011 ml (1,1 X 10-5 Mol) einer 1 molaren Triäthylamin-Lösung in Dimethylformamid eingetragen. Nach Kühlung auf -100 werden 0,005 ml (5,0 X 10-6 Mol) einer 1 molaren Lösung von Chlorameisensäureäthylester in Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 20 Minuten bei -10 stehengelassen und anschlie- ssend in der Kälte mit 31,0 mg (2 X 10-4 Mol) D,L-1-Amino-propanol-(2)-O-phosphat, gelöst in 0,4 ml 1n Natronlauge (4 X 10-4 Mol) versetzt. Unter kräftigem Umschütteln wird nun innerhalb 30 Minuten das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gebracht und sodann noch 3 Stunden im Wasserbad auf 300 erwärmt. Die Lösung wird mit Aceton/ Düsopropyläther versetzt, der entstandene Niederschlag zweimal mit Aceton gewaschen, in 5 ml Wasser gelöst und mit 1n Essigsäure auf pH 6 eingestellt.

Die so erhaltene wässrige Lösung wird mittels eines Austauschers von phosphorylierter Zellulose (Säule 2 X 20 cm) getrennt. Man bildet 2 Fraktionen. Die Fraktion 1 wird erhalten durch Eluieren mit 250 ml Wasser und Einengen auf 2 ml Endvolumen im Vakuum bei 200. Die Fraktion 2 wird erhalten durch Eluieren mit 300 ml 0,1fl/oiger Blausäure und Einengen auf 2 ml.

Fraktion 1 wird bei pH 2,7 in Gegenwart von Cyanidionen bei 300 Volt innerhalb 4 Stunden elektrophoretisch gereinigt. Der grösste Anteil verbleibt dabei an der Startlinie (neutral) und nur ein geringer Anteil wandert praktisch gleich wie Cobyrinsäureabcdeg-hexamid-dicyanid zur Kathode. Die neutrale Zone wird mit Wasser eluiert und analysiert. Man erhält Cobinamid-phosphat-dicyanid mit einer Ausbeute von 470/e.

Beispiel 6 5,42 mg (5,5 X 10-s Mol) Cobyrinsäure-abcdeghexamid-dicyanid werden in analoger Weise wie in Beispiel 3 beschrieben, in das gemischte Säureanhydrid umgewandelt und anschliessend mit 28,2 mg (2 X 10-4 Mol) 1-Amino-äthanol-(2)-O-phosphat, gelöst in 0,8 ml Pyridin und 0,2 ml Wasser, wie in Beispiel 3 beschrieben, zur Reaktion gebracht und aufgearbeitet. Man erhält Cobyrinsäure-abcdeghexamid-f- [äthanolamid - O - phosphat] - dicyanid in. 62 % iger Ausbeute.

Claims

EMI5.41 PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Vitamin-B12 Derivaten der Formel <Desc/Clms Page number 6> EMI6.1 EMI6.2 worin Ri Wasserstoff, eine Alkyl- oder Carbalkoxygruppe, R2, R3 und R4 Wasserstoff oder Alkylgruppen und R5 eine gegebenenfalls veresterte oder ver- ätherte Hydroxygruppe bedeuten, wobei die Alkylreste 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten und A- bzw. A-- Anionen sind, dadurch gekennzeichnet, dass man Cobyrinsäure-abcdeg-hexamid mit durch Anionen kompensierten Ladungen des Ions oder ein in der (f)-Carboxylgruppe abgewandeltes reaktionsfähiges Derivat eines solchen Salzes mit einem Amin der Formel EMI6.3 EMI6.4 kondensiert. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Amin der Formel II ein D-, L- oder D,L-Aminoisopropanol verwendet. EMI6.5 2.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man als Amin der Formel II ein D-, L- oder D,L-Aminoisopropanol-O-phosphat verwendet. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass R1, R2, R3 und R4 zusammen mindestens zwei Kohlenstoffätome aufweisen. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man ein gemischtes Anhydrid des Cobyrinsäure-abcdeg-hexamids verwendet. 5. Verfahren nach Unteranspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als gemischtes Anhydrid Cobyrinsäure-abcdeg-hexamidschwefelsäure-anhydrid verwendet. 6. Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kondensation in Gegenwart eines Carbodiimides durchführt.