CH392780A - Verfahren zur Herstellung von intravenös anwendbaren Antikörperpräparaten humanen Ursprungs - Google Patents

Description

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 Verfahren zur Herstellung von    intravenös   anwendbaren    Antikörperpräparaten   humanen Ursprungs Die intravenöse Verabreichung von    Gamma-Glo-      bulin-   bzw. Antikörperpräparaten, ist der intramuskulären Anwendung aus verschiedenen Gründen vorzuziehen: - Das    Gamma-Globulin   kommt rascher zur Wirkung. - Es findet kein    Verlust   durch    Proteolyse   am Injektionsort statt. 



  - Die grössere Wirksamkeit einer Dosis gestattet, den gewünschten Effekt mit geringeren Mengen zu erzielen, wodurch die Behandlung wesentlich    billiger   wird. 



  - Die bei der intramuskulären Applikation grösserer    Gamma-Globulinmengen   unvermeidlichen Schmerzen an der Einstichstelle fallen weg. 



  Bis heute war es nicht möglich, auch noch so sorgfältig hergestellte    Gamma-Globulinpräparate   regelmässig intravenös zu applizieren. Ein gewisser Prozentsatz von Empfängern reagierte auf intravenöse    Gamma-Globulingaben   regelmässig mit mehr oder weniger ausgeprägten, vielfach aber sogar bedrohlichen,    anaphylaktoiden   Reaktionen. 



  Die Reaktionen sind einerseits bedingt durch die Tatsache, dass es sich bei    Gamma-Globuhnpräparaten   notwendigerweise um Präparate handelt, die aus einem einer sehr grossen    Anzahl   von Individuen entstammenden Ausgangsmaterial gewonnen. werden. Anderseits sind die Reaktionen empfängerseitig bedingt. 



  Es ist möglich, durch Zusätze zu den    Gamma-      Globulinlösungen   oder durch gleichzeitige, vorausgehende oder nachfolgende Verabreichung anderer Medikamente (z. B.    Antihistaminika   u. a.) die Reaktionen zu unterdrücken oder mindestens stark abzuschwächen. 



  Durch langsame    Infusion   sehr verdünnter    Gamma-      Globulinlösungen   lässt sich eine    allfällig   auftretende Reaktion sehr genau    unter   Kontrolle    halten.   Ein Patient, der auf eine    Gamma-Globulininfusion   reagiert hat, tritt nach    Abklingen   der Reaktion regelmässig in eine    Refraktärperiode   von etwa 4 Tagen Dauer ein. Während dieser Periode werden vom Patienten beliebig grosse    Gamma-Globulinmengen   intravenös reaktionslos ertragen. 



  Weiter    wurde      gefunden,   dass - einerseits die unerwünschten    Reaktionen:      parallel   gehen der antikomplementären Aktivität des    Gamma-Globulins   und - anderseits die antikomplementäre Aktivität des    Gamma-Globulins   vorwiegend an    höhermolekulare      Aggregate   mit    Sed'imentationskonstanten   S20>7    Svedberg-Einheiten   gebunden ist. Jedoch ist auch natives    Gamma-Globulin,   in dem sich in der    Ultra-      zeritrifuge   keine Teilchen mit    S2,>7   mehr nachweisen lassen,    immer   noch antikomplementär. 



  - Ein durch    Ultrazentrifugation   von    allen.   Anteilen    mit      S2o   > 7 befreites    Gamma-Globulin   wird    intra-      venös   meist gut vertragen. 



  Es ist bekannt, dass sich    Gamma-Globulinpräpa-      rate   zu kleineren Teilchen partiell abbauen lassen, ohne dass dabei ihre spezifische    Antikörper-Wirksam-      keit   Schaden erleidet. Wir haben    gefunden,   dass diese Präparate intravenös durchwegs reaktionslos vertragen werden. Sie stellen somit gegenüber den bisher zur Verfügung stehenden    einen,   erheblichen Fortschritt dar. 



  Der chemische    Angriff   auf die    Gamma-Globulin-      moleküle   zum Zwecke des Abbaus zu kleineren Einheiten kann sich gegen verschiedenartige Bindungen im Molekül richten, wie z. B.    Säureamidbindungen      (Peptidbindungen)   oder    -S-S-Brücken   oder mehrere    Arten   von Bindungen gleichzeitig. 

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 Zur reduktiven Aufspaltung von    -S-S-Brücken   können in erster Linie    Sulfide   oder Substanzen dienen, die selber Träger von    -SH-Gruppen   sind.

   Praktisch lässt sich dieser Abbau sehr leicht bewerkstelligen mit    Cystein,      Cysteamin   oder    Glutathion.   Diese Substanzen haben den Vorteil, ungiftig zu sein. Der Nachteil ist jedoch, dass Substanzen dieses Typs in Lösung leicht oxydieren und dabei unwirksam werden. Auch schon zu    -SHHS-   gespaltene    Brückenverbindungen   werden leicht rückoxydiert zu    Disulfidbrücken.   Man kommt auf diesem Wege nur zu beständigen Lösungen, sofern man für eine endgültige Blockierung der    freigesetzten      -SH-Gruppen   sorgt, was    möglich   ist durch Anwendung von    Jodacetamid,      Sulfit   usw. 



  Zur    oxydativen   Aufspaltung von    Disulfidbrücken   kommen als Reagenzien    Perameisensäure,      Peressig-      säure,   Wasserstoffperoxyd usw. in Frage.    Eine      oxy-      dative   Aufspaltung der    Disulfidbrücken   ist weitgehend irreversibel. 



  Eine    Spaltung      intramolekularer   Bindungen kann allein durch    pH-Verschiebung   erreicht werden. Die komplementäre Wirkung des    Gamma-Globulins   kann    schon   durch blosses    Inkubieren   der Lösung bei    pH-      Werten   unter 5, während eines Tages, bei 37 , weitgehend abgeschwächt werden. 



  Rascher verläuft die Reaktion, wenn sie mit einem Katalysator    (Ferment,      proteolytisch   wirksame    Fer-      mentbruchstücke   oder andere Substanzen) durchgeführt wird. Da nur ein beschränkter Abbau erwünscht ist, kann es    vorteilhaft   sein, das Ferment nicht bei den für seine Aktivität optimalen Bedingungen einwirken zu lassen. 



  Man arbeitet beispielsweise bei Temperaturen zwischen 0 und 20  und bei    pH-Werten,   die um 1 bis 4 Einheiten vom    pH-Optimum   entfernt    liegen.   



  Der Abbruch der    Fermentwirkung   lässt sich nur    dann   allein durch    pH-Verschiebung   genügend vollständig erzielen, wenn das    pH-Optirnum   in extrem saurem oder alkalischem Gebiet liegt. In    denn   andern Fällen wäre eine    Hemmung   des Ferments    unerläss-      lich,   sofern sich dieses nicht quantitativ aus dem Reaktionsgemisch    entfernen   lässt. Da eine quantitative    Entfernung   eines Fermentes meist nur mit grossen Schwierigkeiten möglich ist, ist es von    Anfang   an vorzuziehen, mit an    unlösliche   Träger gebundenen Fermenten zu arbeiten.

   Dies bringt den weiteren Vorteil mit sich, dass, im Fälle das verwendete Ferment    Anti-      gencharakter   aufweist, kein Antigen zurückbleibt. 



  Die Veränderung der    Gamma-Globulinmoleküle   sollte so weit gehen, dass sich nachher keine Partikeln mehr nachweisen lassen, die eine    Sedimentationskon-      stante      S2,   > 7    Svedberg-Einheiten   aufweisen (gemessene Werte für die    Sedimentationskonstanten,   umgerechnet auf die Standardbedingungen:    20 ,   Lösungsmittel Wasser,    Proteinkonzentration   extrapoliert auf 0), und vor allem, dass das Präparat nicht mehr antikomplementär ist. Die abgebauten Präparate können nach Einstellen der gewünschten Konzentration eventuell direkt    konfektioniert   werden.

   Es ist aber auch möglich, durch Fällen    (Aussalzen,      Azetonfällung   usw.) und    Wiederauflösen   zu den endgültigen Präparaten zu kommen. 



  Beispiel 1 Eine Lösung von 8 g    Gamma-Globulin   in etwa 50 ml 2,25 %    iger   (0,3 m)    Glycinlösung   wird mit 40 mg kristallisiertem Pepsin versetzt. Das    pH   wird mit 0,1n    Salzsäure   auf 4,0    eingestellt.   Die Lösung wird nun mit 0,9 %    iger   (0,15 m)    NaCI-Lösung   auf 100 ml Volumen gebracht. Diese Lösung wird während 3 Std. bei 37     inkubiert.   Danach wird das    pH   mit    0,1n      NaOH   vorsichtig auf 7,30 eingestellt. 



  Die    antikomplementäre   Wirkung von nativem Gamma Globulin wirkt sich im    Hämolysetest   mit    Schaferythrocyten   bis zu einer Verdünnung von 1 : 2048, das heisst bis zu einer    Gamma-Globulinkon-      zentration   von 4 mg % aus. Das abgebaute    Gamma-      Globulin   weist im gleichen System keine antikomplementäre Wirkung mehr auf. 



  Im abgebauten    Gamma-Globulin   lassen sich in der Ultrazentrifuge keine Teilchen mit einer    Sedimen-      tationskonstanten      S2      o   > 7    Svedberg-Einheiten   mehr nachweisen. 



  Beispiel 2 Ein dem    Pepsinabbau   analoger Effekt lässt sich durch blosses Einstellen des    pH-Wertes   auf 4,0 und    17stündige   Inkubation bei 37  erreichen. Nach Rückneutralisation auf    pH   7,3 ist auch hier die    antikom-      plementäre   Wirkung verschwunden. 



     Immunoelektrophoretisch   erleiden die    Gamma-      Globulinpräparate   bei obigen Versuchsbedingungen keine nennenswerte Änderungen. Bei höheren Pepsinkonzentrationen    (Verhältnis   Pepsin:    Gamma-Globu-      lin   = 1 : 20) kommt es zu    einem   so weitgehenden Abbau, dass er sich    immunoelektrophoretisch   in einer Aufspaltung der    Gamma-Globulinfraktion   in eine rascher und eine    langsamer      wandernde   Komponente mit einer gemeinsamen    Antigendeterminanten   äussert.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung intravenös applizier- barer Antikörperpräparate, dadurch gekennzeichnet, dass man ein humanes Gamma-Globulin, das Antikörper verschiedener Spezifität enthält, auf chemischem Wege so weit abbaut, dass es nicht mehr antikomplementär wirkt. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einem proteolytisch wirksamen Katalysator, z.

   B. einem proteolytischen Ferment, abbaut. 2. Verfahren nach Patentanspruch und Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den, proteolytischen Katalysator nicht bei den Bedingungen seiner optimalen Wirksamkeit anwendet. 3. Verfahren nach Patentanspruch und Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass der proteolytisch wirksame Katalysator an einen unlöslichen Träger gebunden ist. <Desc/Clms Page number 3> 4.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einer reduzierenden Substanz abbaut. 5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einer oxydierenden Substanz abbaut. 6. Verfahren nach Patentanspruch oder einem der Unteransprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einem proteolytisch wirksamen Katalysator und einer reduzierenden oder oxydierenden Substanz gleichzeitig oder nacheinander abbaut. 7. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man mit sauren oder alkalischen Mitteln abbaut.