CH640140A5

CH640140A5 - Verfahren zur herstellung von intravenoes injizierbarem gamma-globulin.

Info

Publication number: CH640140A5
Application number: CH1470677A
Authority: CH
Inventors: Myer Louis Dr Coval
Original assignee: Coval M L
Priority date: 1976-12-03
Filing date: 1977-12-01
Publication date: 1983-12-30
Also published as: ES464681A1; AR215037A1; IE46104B1; AU3119677A; DE2751717A1; IT1092178B; DK529377A; IE46104L; DE2751717C2; FI60022C; FI60022B; AT361119B; FR2372841A1; JPS5372816A; HK50581A; NL7713362A; FI773477A7; FR2372841B1; YU41084B; ZA777185B

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren für die Herstellung eines für intravenöse Verabreichung geeigneten Gamma-Globulins aus der einfach zugänglichen Plasma-

Protein-Paste von Cohn-Fraktionen II + III oder aus einer Cohn-Fraktion-II-Paste oder einem Cohn-Fraktion-II-Pulver oder aus einem die entsprechenden Fraktionen enthaltenden Placenta-Extrakt. Die Fraktion II oder II + III-Masse oder die entsprechenden Fraktionen aus Placenta-Ex-trakt werden mit Wasser bei einem pH von 4,9 bis 6,0 extrahiert, Verunreinigungen werden fraktioniert durch Zusetzen von Polyäthylenglykol bis zu einer Konzentration von 4% (Gewicht/Volumen) und in einer zweiten Stufe von 4 bis 12%, vorzugsweise von 6% (Gewicht/Volumen), Äthanol gefallt. Das gewünchte Gamma-Globulin wird dann bei einem pH-Wert von 6,8 bis 8,2, vorzugsweise von 8,0, durch Zugabe von Polyäthylenglykol bis zu einer Konzentration von 12% (Gewicht/Volumen) oder von Äthanol bis zu einer Konzentration von 25% (Volumen/Volumen) gefallt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gamma-Globulinen, die sich für die intravenöse Verabreichung eignen.

Die Immuno-Globulin-G-Fraktion aus gesammeltem menschlichem Plasma enthält Antikörper gegen viele Viren und Bakterien. Immunoglobuline sind wirksam bei der klinischen Behandlung einer breiten Palette von Krankheitszu-ständen, beispielsweise bei

1. der Prophylaxe und Therapie von Infektionen bei Personen mit genetischen und nososomischen Antikörper-Man-gelzuständen, speziell bei Staphylokokken-, Pneumokokken-, Streptokokken- und H. influenzae-Infektionen

2. der Prophylaxe bei Patienten mit normalem Immuno-Globulin-Spiegel gegen Virus-Infektionen, z.B. gegen Hepatitis-, Polio-, Masern-, Röteln-, Tollwut-, Herpes- und Paro-titis-Infektionen oder bei der Prophylaxe gegen Tetanus und bei vorliegender Rh-Unverträglichkeit, des weiteren

3. der Therapie von schweren bakteriellen Infektionen: Staphylokokken, Coli, Pseudomonas, Pyocyanaeus septice-mia und auch bei der Therapie einiger Virusinfektionen, wie z. B. Herpes Zoster.

Sämtliche klinischen Möglichkeiten für die Anwendung des Immunoglobulins sind aus den folgenden Gründen noch nicht realisiert worden: Millionen von Immunoglobulin-Do-sen sind bereits intramuskulär mit den weiter unten beschriebenen Folgen verabreicht worden; die intravenös verabreichten Präparate werden aber sehr schnell abgebaut, hinzu kommt, dass zu niedere Dosen angewendet wurden. Die meisten antibakteriellen Antikörper des Human-Gam-ma-Globulins sind gegen Mikroorganismen, die den oberen Respirationstrakt, die Haut und den Gastrointestinaltrakt bewohnen, gerichtet. Die Menge Gammaglobulin, die benötigt wird, um eine experimentelle in vivo-Infektion zu bewältigen, ist proportional der Anzahl infektiöser Organismen in dem Inokulat. Diese Tatsache wurde im Falle von Pseudomonas aeruginosa, E. Coli, Proteus und Staphylokokkus aureus bewiesen. Die benötigte Menge Gamma-Glo-bulin ist aber auch proportional dem jeweils vorliegenden spezifischen Antikörper-Spiegel. Mit Chloramphenicol ergibt sich eine synergistische Wirkung, aber mit anderen Antikörpern ergibt sich nur ein additiver Effekt.

Human-Immuno-Globuline wurden zuerst in grossem Massstab im Zeitraum von 1945 bis 1950 in Harvard im Labor von F. J. Cohn isoliert. Sehr bald wurde beobachtet, dass eine intravenöse Injektion dieser Präparate Schockreaktionen bei manchen Patienten hervorrief, und später wurde festgestellt, dass die antikomplementäre Aktivität von Ig G-Präparaten für diese Schockreaktionen verantwortlich ist. Diese antikomplementäre Aktivität geht auf Ig G-Aggregate zurück, die sich während der Fraktionierung gebildet haben.

Mit Rücksicht auf diese mit der intravenösen Verabreichung von Immuno-Globulin verbundenen Schockreaktionen wurden diese therapeutisch wertvollen Stoffe stattdes5

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sen intramuskulär verabreicht. Jedoch hat die intramuskuläre Verabreichung von Immuno-Globulinen viele Schranken:

a) sie ist schmerzhaft,

b) die Menge, die verabreicht werden kann, ist begrenzt,

c) die Proteolyse am Ort der Injektion vermindert das verfügbare Ig G und d) maximale Blutspiegel werden erst nach drei bis vier Tagen erzielt, was ein ernsthafter Nachteil in jenen Fällen darstellt, die hohe Blutspiegel gleich nach der Injektion erfordern.

Darüber hinaus gibt die intravenöse Verabreichung von Immunoglobulinen breitere klinische Anwendungsmöglichkeiten, da die volle Dosis an Ig G sogleich in den Blutstrom gelangt, ohne dass ein Abbau an der Injektionsstelle eintritt und dann bedeutend höhere Blutspiegel erreicht werden können. Diese Überlegungen haben die Suche nach Methoden zur Herstellung von Ig G mit niederer antikomplementärer Aktivität, welches für intravenöse Anwendung geeignet ist, beschleunigt. Die entwickelten Methoden basieren auf einer proteolytischen oder chemischen Behandlung zur Beseitigung der antikomplementären Eigenschaften der Aggregate.

Es sind folgende Herstellungsverfahren bekannt:

1. Pepsinbehandlung von Immuno-Globulinen. Das Protein wird weitgehend zu Antikörper-Fragmenten (5 S, F (ab')2) abgebaut. Seine Brauchbarkeit zur Bekämpfung bakterieller Infektionen ist dadurch begrenzt, dass es eine nur kurze Halbwertszeit (etwa 30 Stunden im Vergleich zu 20 bis 30 Tagen für negatives Ig G) besitzt. Nach der Kombination mit Antigenen fixierten die 5 S-Fragmente kein Kompliment. Es findet in der Prophylaxe keine Anwendung.

2. Mit Plasmin behandeltes Immuno-Globulin. Mehr als 60% dieses Präparates werden zu Fragmenten (F ab und F c) abgebaut. Das verbleibende 7S-Globulin hat eine normale Halbwertzeit (drei bis vier Wochen), aber das Antikörper-Spektrum ist beschränkt.

3. Bei einem pH-Wert von 4 behandeltes Immuno-Glo-bulin. Dieses Präparat hat die Tendenz, bei der Lagerung antikomplementär zu werden. Seine Verträglichkeit ist daher begrenzt und hohe Dosen können nicht verabreicht werden. Die Halbwertzeit ist ein wenig geringer (12 bis 14 Tage) und die antibakterielle Aktivität auf einen nicht vorhersehbaren Grad reduziert.

4. Mit ß-Propiolacton behandeltes Immuno-Globulin. Die Moleküle sind stark abgewandelt, wodurch sie wahrscheinlich neue Antigen-Determinanten bilden. Die Halbwertzeit ist etwa 10 Tage. Die bakteriolytische Aktivität ist herabgesetzt.

Die vier Ig G-Unterklassen haben eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegen Proteolyse. Die Pepsin-, Plasmin-und pH-4-(Pepsin)-Präparate unterscheiden sich demgemäss beträchtlich von unbehandeltem Ig G in ihrer Unterklassen-Verteilung.

Wie bereits erwähnt, ist die unerwünschte, antikomplementäre Aktivität, welche die Ursache für die Schockreaktion bei der intravenösen Verabreichung von Ig G bildet, durch die Anwesenheit von Aggregaten bedingt, welche während der Fraktionierung durch die angewandten Frak-tionierungs-Methoden entstehen. Bei den oben beschriebenen Präparaten werden diese Aggregate nach ihrer Bildung zerstört, in den meisten Fällen entweder durch chemischen oder enzymatischen Abbau. Dieser Abbau führt aber auch zu einer gewissen Degradation des Ig G und demzufolge zu einem Verlust an Aktivität; so sind solche Präparate nicht so aktiv wie gewünscht. Wenig Arbeit ist in die Entwicklung von Methoden gesteckt worden, die die Bildung von Aggregaten verhindern und Ig G-Präparate bereitstellen, die im wesentlichen keine antikomplementäre Aktivität aufweisen.

Kürzlich ist in der DT-OS 2 357 800, veröffentlicht am 6. Juni 1974, eine Methode zur Herstellung von für die intravenöse Verabreichung geeignetem Gamma-Globulin veröffentlicht worden. Dieses Verfahren erfordert, ebenso wie andere veröffentlichte Verfahren zur Herstellung von Gamma-Globulin, als Ausgangsmaterial eine relativ reine Gamma-Glo-bulin-Fraktion. Jedoch bedeutsamer ist, dass das nach dieser Methode erhaltene Gamma-Globulin immer noch eine aus-sergewöhnlich hohe antikomplementäre Aktivität bei intravenöser Anwendung besitzt.

Es wurde auch vorgeschlagen (vgl. US-Patent 3 763 135), ein für intravenöse Injektionen geeignetes Material aus Fraktion III herzustellen, jedoch ergibt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine wesentlich höhere Ausbeute, und das Produkt hat einen wesentlich geringeren Gehalt an antikomplementärem Material.

Es gibt «Food and Drug-Administration» (FDA)-Stan-dards für intramuskuläres Gamma-Globulin, aber nicht für intravenöses Gamma-Globulin. Solche Standards sind jedoch erforderlich, um zwischen Gamma-Globulin, das schockähnliche Reaktionen bei der Anwendung auf intravenösem Wege bei empfindlichen Personen verursacht, und Gamma-Globulin, das solche Reaktionen nicht hervorruft, unterscheiden zu können.

Während der letzten fünfzehn Jahre ist nachgewiesen worden, dass - sogar bei hochempfindlichen Empfängern -keine klinischen Symptome beobachtet werden, wenn die Höhe der antikomplementären Aktivität nur genügend niedrig ist. Bezieht man sich auf die Einheiten des Standard-Tests von Mayer (Expérimental Immunochemistry, E. A. Kabat und M.M. Mayer, zweite Auflage, S. 133, Thomas, Springfield, Illinois, 1961), so liegt die sichere Konzentration bei 0,04 bis 0,02 Einheiten oder weniger an antikomplementärem Material pro Milligramm Immuno-Globulin G, sie kann auch etwas höher als 0,04 sein; aber Reaktionen werden in der Regel erst beobachtet, wenn die Höhe bei 0,4 Einheiten pro Milligramm liegt. Die Verwendbarkeit von Gam-ma-Globulin-Präparaten für eine intravenöse Anwendung, die die Abwesenheit von Nebenreaktionen erfordert, setzt , ein besonders niedriges Niveau an antikomplementärer Aktivität voraus. Es ist notwendig, die physiologische Antikör-per-Aktivität und Spezifizität zu erhalten, um ein klinisch sicheres und wirksames Präparat bereitzustellen.

Gemäss der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Gamma-Globulins vorgeschlagen, bei welchem die Eigenschaften des aktiven Gamma-Globulin-Moleküls erhalten bleibt und das im wesentlichen keine Aggregate mit antikomplementärer Aktivität aufweist, wodurch das Produkt sicher und wirksam für die intravenöse Anwendung wird.

Es ist demnach ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Gamma-Globulins zu schaffen, das für die intravenöse Injektion geeignet ist.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Gamma-Globulins zu schaffen, welches in vitro im wesentlichen keine antikomplementäre Aktivität mehr aufweist.

Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Gamma-Globulins zu schaffen, welches im allgemeinen eine biologische Halbwertzeit von 3 bis 4 Wochen hat.

Es ist wieder ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Gamma-Globulins zu schaffen, welches die Fähigkeit hat, Komplemente zu fixieren, wenn es mit dem korrespondierenden Antigen kombiniert wird, und wel5

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ches ein im wesentlichen unverändertes Antikörper-Spektrum beibehält, immer im Vergleich zu den Plasmaarten und Mengen an Gamma-Globulin-Antikörpern, die im Ausgangs-Plasma-Pool und in dem Standard-Gamma-Globulin, das nach Cohn's klassischer Äthanol-Fraktionierung von Plasma erhalten wurde, enthalten sind.

Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Gamma-Globulins, ausgehend von leicht verfügbaren Blutprotein-Fraktionen, zu schaffen.

Es ist ferner ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Methode für die Herstellung eines für die intravenöse Injektion geeigneten Gamma-Globulins zu schaffen, wobei es zu keiner Bildung von Aggregaten kommt.

Aus der DE-OS 2 606 118 ist ein Verfahren bekannt, das zu einem für die intravenöse Injektion geeigneten Produkt mit weniger als 0,020 Einheiten an antikomplementärem Material führt. Dieses wurde nach der Methode von Kabat und Mayer, Expérimental Immunochemistry, 2. Aufl. Seite 224 (1961 Thomas-Verl. Springfield Illinois) bestimmt. Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird jedoch durch geänderte Fraktionierungsbedingungen ein Produkt erhalten, dessen pH innerhalb des physiologischen Bereichs liegt und dessen antikomplementäre Aktivität selbst während der Lyophilisierung nicht steigt. Letzteres war ein Nachteil aller bekannten Produkte.

Die antikomplementäre Aktivität des vorliegenden Verfahrensproduktes ist so niedrig, dass sie mittels der obengenannten Methode nicht mehr bestimmt werden kann. In einer neuen Bestimmungsmethode müssen die Bedingungen der obigen bekannten Methode in der Weise geändert werden, dass die Zahl der Erythrocyten auf ein Zehntel verringert wird. Das Komplement wurde entsprechend herabgesetzt und die Methode dadurch 10-1 lmal so empfindlich gemacht. Auf diese Weise kann man das antikomplementäre Material des neuen Produkts bestimmen: es sind 0,0005 bis 0,0025 Einheiten pro mg, während das Produkt der obenbezeichneten DT-OS 0,010 bis 0,020 Einheiten pro mg an antikomplementärem Material enthält. Man kann daher ein gefriergetrocknetes Präparat herstellen, das eine lange Lebensdauer hat und leicht in eine gebrauchsfertige Form gebracht werden kann.

In Übereinstimmung mit einem Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird das Gamma-Globulin aus der leicht zugänglichen Plasma-Protein-Fraktion II + III von Cohn et al. (Vgl. J. Am. Chem. Soc. 68,459-475 /(1946/) erhalten. Diese Fraktion, die nahezu alle Immuno-Globuline neben anderen Proteinen enthält, wird neuen Fraktionie-rungs-Techniken unterworfen, welche die Bildung von Aggregaten, die bei Anwendung der bekannten Fraktionie-rungsmassnahmen entstehen, verhindern und die zu einem aktiven Gamma-Globulin führen, welches praktisch völlig bar jeder antikomplementären Aktivität (0,0005 bis 0,0025 Einheiten) und damit für die intravenöse Verabreichung geeignet ist.

Eine andere wertvolle Rohmaterial-Quelle ist das Material der Fraktion II, das leicht als Immun-Serumglobulin zu-gänglich ist. Dieses Material ist billig, es ist als gefriergetrocknetes Pulver oder gefrorene Paste stabil und ist frei von Hepatitis-Viren. Es kann in der gleichen Weise wie das Material der Fraktion II 4- III behandelt werden.

Noch ein weiteres wertvolles Ausgangsmaterial ist ein Placenta-Extrakt, der entsprechende Fraktionen enthält.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren wird eine Paste, bestehend aus den Plasma-Proteinen der Fraktionen II + III, oder eine Paste oder ein Pulver, bestehend aus den Plasma-Proteinen der Fraktion II, mit Wasser bei einem pH von 4,9 bis 6,0, vorzugsweise 5,1, extrahiert. Man verwendet py-

rogenfreies Wasser, im allgemeinen in einem Volumen von 25 bis 45 Liter, vorzugsweise 30 Liter pro kg der Paste oder des Pulvers, das bevorzugt einen Proteingehalt von 25 bis 30% aufweist. Die Ionenstärke ist so eingestellt, dass die Lösung eine Leitfähigkeit von etwa 300 x 10-"6 cm_1Q_1 aufweist. Jede nicht-toxische, pharmazeutisch akzeptable organische oder anorganische Säure, wie Essig-, Milch-, Zitronen*, Salz- oder Schwefelsäure oder ähnliche Säuren,

kann verwendet werden, um den pH einzustellen. Das wasserunlösliche Material wird abgetrennt und das Filtrat dann fraktionierten Fällungen unterworfen. Zunächst mit Polyäthylenglykol bei einer Konzentration von 4% (Gewicht/ Volumen), dann mit Äthanol bei Konzentrationen von 4 bis 12% (Gewicht/Volumen), vorzugsweise von 6% und zuletzt durch Erhöhen der Polyätyhlenglykolkonzentration auf bis zu 12% (Gewicht/Volumen) oder durch Erhöhung der Äthanolkonzentration auf bis zu 25% (Volumen/Volumen), das letztere bei einem pH von 6,8 bis 8,2, vorzugsweise von 8,0. Die ersten zwei fraktionierten Fällungen beseitigen Verunreinigungen und die letzte Fällung ergibt das gewünschte Gamma-Globulin. Bevorzugt wird ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4000 bis 12000. Jede nichttoxische, pharmazeutisch akzeptable anorganische Base kann benützt werden, um den pH auf 6,8 bis 8,2, vorzugsweise auf 8,0, einzustellen. Das Verfahren wird bei einer Temperatur von-10 bis +20 °C ausgeführt.

Es wird angenommen, dass in der im Patentanspruch 1 angegebenen Stufe a) das Gamma-Globulin im sauren Medium protoniert wird und die nicht protonierten Begleitproteine mit antikomplementärer Aktivität abgetrennt werden. In der Verfahrensstufe d) im Patentanspruch 1 wird durch Einstellen des pH-Wertes von 6,8 bis 8,2 das Gamma-Globulin in die ursprüngliche Verbindung übergeführt.

Das Verfahren ist im einzelnen in den Beispielen beschrieben.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren nach Anspruch 1. Die Ausführungsformen gemäss den übrigen Ansprüchen sind bevorzugt.

Beispiel 1

Paste der Cohn-Fraktionen II + III wird bei 0-5 °C in pyrogenfreiem destilliertem Wasser - Konzentration 30 Liter pro kg - Paste - suspendiert. (Ein Bereich von 20 bis 50 Liter kann benützt werden.) Der pH der Suspension wird dann auf 5,1 (Bereich 4,9 bis 6,0) mit verdünnter Essigsäure eingestellt (andere Säuren als die erwähnte können eingesetzt werden). Die Suspension wird daraufhin bei 0-5 °C filtriert oder zentrifugiert und der Rückstand verworfen. Das Filtrat wird auf eine Konzentration von 4% Polyäthylenglykol 4000 (PEG 4000) gebracht (PEG 6000 und 12000 können, in anderen Konzentrationsbereichen, ebenfalls verwendet werden). Der Niederschlag, der sich während einer Stunde bildet, wird wie bei der vorhergehenden Stufe verworfen.__Das Filtrat wird dann auf eine 6%ige (Bereich 4 bis 12%) Äthanol-Konzentration gebracht, wobei der Zusatz vorsichtig bei -2 °C (Bereich 20 bis -10 °C) erfolgt. Der Niederschlag wird ebenfalls nach 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise nach 2 Stunden, entfernt.

Die Lösung wird sodann 0,01 molar an Kochsalz gemacht und der pH mit l%iger Natronlauge auf 8,0 (Bereich 6,8 bis 8,2) eingestellt. Der Niederschlag, der sich durch Zusatz von Äthanol bis zu einer Konzentration von 25%, oder von Polyäthylenglykol 4000 bis zu 10-12%, vorzugsweise 12%, bildet, wird durch kontinuierliches Durchfluss-Zen-trifugieren bei hoher Geschwindigkeit entfernt. Die so erhaltene Paste hat eine Reinheit von mindestens 97% mit der einzigen auffindbaren Verunreinigung Albumin. Die antikomplementäre Aktivität liegt unter 0,01 Einheiten pro mg

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Gamma-Globulin (im Bereich 0,0005 bis 0,0025 Einheiten). Die Einheiten werden nach dem «Zwei Einheiten-Test» von Mayer, vgl. oben, gemessen.

Beispiel 2

In pyrogenfreiem destilliertem Wasser, das 1 bis 4% vorzugsweise 2% Polyäthylenglykol 4000 und 0,1 bis 1% vorzugsweise 0,2% Humanalbumin enthält, wird Cohn-Frak-tion-II-Paste oder Pulver bei 0-5 C gelöst, so dass eine Lösung mit einem Proteingehalt von 1-5%, vorzugsweise 2%, entsteht. Der pH wird auf 5,1 (Bereich 4,9 bis 6,0, vorzugsweise 5,0 bis 5,8) eingestellt und der resultierende Niederschlag, der nach einer Stunde gebildet wird, wird durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt. Die Polyäthylengly-kol-(PEG)-Konzentration des Filtrats wird mittels einer 50%igen PEG-4000-Lösung oder mit trockenem PEG-4000-Pulver auf 4% erhöht. Der innerhalb einer Stunde gebildete Niederschlag wird entfernt. Dann wird Äthanol bis zu einer Konzentration von 6% langsam zugesetzt, so dass die Temperatur nicht über 2 °C steigt. Der gebildete Niederschlag wird nach 1-12 Stunden, vorzugsweise 12 Stunden, entfernt. Der pH wird dann auf 8,0 (Bereich 6,8 - 8,2) erhöht. Der resultierende Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, nachdem man den Äthanol-Gehalt auf 25% erhöht hat, und unter den gleichen Bedingungen wie im ersten Beispiel wieder aufgelöst. Das Produkt enthält über 99% Gam-ma-Globulin, gemessen vor dem Zusatz von Albumin zu der zum Wiederauflösen benutzten Lösung. Es ergibt sich keine wahrnehmbare Hemmung der Hämolyse, wenn 50 mg des Gamma-Globulins pro ml (eine 5% ige Lösung) im Standard-Test von Mayer getestet werden; d.h. die antikomplementäre Aktivität liegt unter 0,01 Einheiten pro mg Ig G. Die zum Schluss erhaltene Lösung enthält nur das zugesetzte Albumin, das zuvor in bekannter Weise erhitzt worden ist, um jegliche Hepatitis-B-Viren zu entfernen. Keine anderen Proteine können mit konventionellen Techniken, wie z.B. Celluloseacetat-Elektrophorese, Immun-Elektrophorese oder Immunodiffusion, festgestellt werden.

Beispiel 3

Piacentares Gamma-Globulin, das durch bekannte Massnahmen isoliert worden ist, kann wie im Beispiel 2 aufgearbeitet werden. Weil placentares Gamma-Globulin, das in bekannter Weise isoliert worden ist, einige wenige Prozent Verunreinigungen enthält, die Plasma-Proteine sind, wird zusätzliche Sorgfalt darauf verwendet, alles unlösliche Material in jeder Stufe zu entfernen, insbesondere unlösliches Material abzuschwemmen, bevor der pH in der ersten und allen weiteren Stufen eingestellt wird. Das Filtrat der 6%igen Ät-hanol-Lösung wird wie im ersten Beispiel 0,01 molar an Kochsalz gemacht. Die anderen Schritte sind alle wie in Beispiel 2 angegeben. Die Reinheit des Produkts ist mindestens 98% an Gamma-Globulin, gemessen (vor dem Zusatz der zum Auflösen verwendeten Lösung, die 5-10 mg/ml Albumin enthält) mit denselben Techniken wie in Beispiel 2.

Beispiel 4

Immuno-Globulin-G-Paste oder Fraktion II, oder getrocknetes Fraktion Ii-Pulver plazentaren Ursprungs kann benützt werden, um ein zur intravenösen Anwendung geeignetes hoch gereinigtes Produkt herzustellen. Folgende Massnahmen werden durchgeführt:

1. Die Paste oder das Pulver wird bis zu einer Konzentration von 1% (Bereich 0,3-5%) in Wasser suspendiert, welchem 2% Polyäthylenglykol 4000 (PEG 2000, 6000,8000 und 12000 - durchschnittliches Molekulargewicht - können ebenfalls benützt werden) und 0,2% erhitztes Human-Al-

bumin bei 1 °C (Bereich 20 bis-10°C) zugesetzt sind. Das unlösliche aufschwimmende Material wird durch Abschöpfen entfernt.

2. der pH wird dann auf 5,1 (Bereich 4,9-6,0) mit Essigoder Salzsäure oder Zitronensäure oder anderen Säuren eingestellt. Der Niederschlag wird bei 1 °C nach einer Stunde entfernt, und zwar durch Filtrieren oder Zentrifugieren.

3. Die Polyäthylenglykol 4000-Konzentration wird dann auf 4% erhöht. Das aufschwimmende Material wird wiederum entfernt. Später wird der sich bildende Niederschlag durch Filtrieren oder Zentrifugieren ebenfalls entfernt.

4. Äthanol wird bis zu einer Konzentration von 6% (Bereich 4-12%) langsam bei -6 °C (Bereich +20 bis -10 °C) zugesetzt.

5. Der Niederschlag und das aufgeschwommene Material werden wie bei den vorhergehenden Stufen entfernt.

6. Kochsalz wird bis zu einer Konzentration von 0,01 N (Bereich 0,0025 - 0,15 N) zugesetzt.

7. Der pH wird dann auf 8,0 (Bereich 6,8 - 8,2) angehoben.

8. Äthanol wird langsam bei -6 °C bis zu einer Endkonzentration von 25% zugesetzt.

9. Der Niederschlag wird mittels Zentrifugieren gesammelt.

10. Der resultierende Niederschlag enthält keine bekannten Verunreinigungen und hat weniger als 0,003 Einheiten an antikomplementärer Aktivität in dem «Zwei-Einheiten-Komplement-Test» von Mayer.

11. Wenn der Niederschlag von Stufe 9 analysiert wird, enthält er mehr als 98% Gamma-Globulin.

Das Gamma-Globulin kann leicht in die Form von pharmazeutischen Präparaten, die sich zur intravenösen Verabreichung eignen, gebracht werden. Bei der Formulierung solcher Präparate wird das Gamma-Globulin in einer auf etwa pH 5,4 - 6,7 gepufferten und Glycin, Ablumin und ein nichtionisches Tensid enthaltenden wässrigen Lösung aufgelöst. Der pH des Präparates wird dann, wie gewünscht, auf einen Wert zwischen 5,4 und 6,7 gebracht und die Konzentration an Gamma-Globulin in dem Präparat auf 5% eingestellt. Geeignete Puffer schliessen Phosphat- und Natriumacetat/ Essigsäure-Systeme ein.

Um jegliche Denaturierung des gelösten Produktes an einer Flüssigkeit/Gas- oder Flüssigkeit/FeststofT-Grenzfläche zu verhindern oder zu reduzieren, ist es vorteilhaft, dem pharmazeutischen Präparat ein Tensid zuzusetzen. Geeignete Tenside sind nichtionische Tenside, wie die Block-Co-polymeren von Propylen- und Äthylenoxiden, wie z.B. Plu-ronic 68 (Poloxamer 188), und Partialester von Sorbit und Polyoxyäthylenoxid mit langkettigen Fettsäuren, wie die Tweens R 20,40, 60, 80 und 95 (Polysorbate 20,40,60, 80 und 95), wasserlösliche Substanzen, die in der 1973er Ausgabe des CFTA Cosmetic Ingredient Dictionary's der Cos-metic, Toiletry und Fragrance Association Inc. beschrieben sind, und Fluoro-Tenside, wie z.B. Zonyl FSA, FSB, FSC und FSN. Diese nichtionischen Tenside stabilisieren Proteine gegen Oberflächen-Denaturierung und enthalten als Struktur keinerlei chemische Gruppen, welche auf andere Weise mit Proteinen in Wechselwirkung treten oder sie denaturieren könnten. Das Gamma-Globulin hat, wenn es als pharmazeutisches Präparat aufbewahrt wird, eine längere Halbwertzeit als die anderen jetzt auf dem Markt befindlichen Gamma-Globulin-Präparate. Das Gamma-Globulin hat sich als wertvoll bei der intravenösen Verabreichung bei allen Gelegenheiten und unter allen Bedingungen erwiesen, bei denen eine intravenöse Verabreichung gefordert war ohne dass hierbei die üblichen unerwünschten Effekte, die sonst mit der intravenösen Verabreichung von Gamma-Glo-bulin einhergehen, auftraten.

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1. Verfahren zur Herstellung eines für die intravenöse Verabreichung geeigneten Gamma-Globulins mit einer antikomplementären Aktivität von 0,0005 bis 0,0025 Einheiten, dessen Antikörperspektrum und Unterklassenverteilung gegenüber dem als Ausgangsmaterial verwendeten Plasma unverändert ist, aus einer Paste von Cohn-Fraktionen II + III oder aus einer Cohn-Fraktion-II-Paste oder einem Cohn-Fraktion-II-Pulver oder aus einem diese Fraktionen enthaltenden Placenta-Extrakt, dadurch gekennzeichnet, dass man bei Temperaturen von -10 °C bis +20 °C

a) diese proteinhaltigen Ausgangsstoffe mit pyrogenfrei-em Wasser mit einem pH-Wert von 4,9 bis 6, dessen Ionenstärke so eingestellt ist, dass die Lösung eine Leitfähigkeit von etwa 300 x 10~6cm-1ß_1 aufweist, extrahiert;

b) aus dem filtrierten Extrakt Verunreinigungen durch Zugabe von Polyäthylenglykol bis zu einer Konzentration von 4% (Gewicht/Volumen) ausfällt;

c) weitere Verunreinigungen durch Zugabe von Äthanol bis zu einer Konzentration von 4 bis 12% (Gewicht/Volumen) ausfallt; und d) nach Abfiltrieren der Verunreinigungen aus dem Filtrat bei einem pH-Wert von 6,8 bis 8,2 das Gamma-Globulin durch Erhöhung der Äthanolkonzentration auf bis zu 25% (Volumen/Volumen) oder durch Erhöhung der Poly-äthylenglykolkonzentrationaufbiszu 12% (Gewicht/Volumen) ausfällt und isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion und die Entfernung der Verunreinigungen mittels Polyäthylenglykol und anschliessend Äthanol bei den Verfahrensstufen a) bis c) bei einem pH-Wert von 5,1 erfolgt.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Verunreinigungen in der Verfahrensstufe c) durch Zugabe von Äthanol bis zu einer Konzentration von 6% (Gewicht/Volumen), vorzugsweise bei einer Temperatur von -2 °C, ausfällt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Verfahrensstufe d) einen pH-Wert von 8,0 einstellt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das Gamma-Globulin in der Verfahrensstufe d) bei einer Temperatur zwischen -6 und 0 °C ausfallt und isoliert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Polyäthylenglykol ein Molekulargewicht von 4000 bis 6000 besitzt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Entfernung der Verunreinigungen das Polyäthylenglykol in einer Konzentration von 4%, das Äthanol in einer Konzentration von 6% bei einer Temperatur von -2 °C zur Anwendung kommen und nach Einstellung eines pH-Wertes von 8,0 die Lösung 0,01 molar an Kochsalz gemacht und, bei -6 °C, mit Polyäthylenglykol 4000 bis zu einer Konzentration von 12% (Gewicht/Volumen) oder mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 25% (Volumen/Volumen) zur Fällung des Gamma-Globulins versetzt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Ausgangsstoffe mittels Wasser extrahiert, welches etwa 2% Polyäthylenglykol und etwa 0,2% Albumin enthält.