CH393790A - Kolorimetrische Bestimmung der Milchsäuredehydrogenase - Google Patents

Description

Kolorimetrische Bestimmung der Milchsâturedehydrogenase Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung der Milchsâuredehydrogenase in Serum oder anderen Flüssigkeiten.

Zahlreiche Forscher haben bereits darauf hinge- wiesen, da13 der Spiegel der Milchsâuredehydrogenase, im folgenden kurz als LD bezeichnet, im Blut ein wichtiges Hilfsmittel bei der Diagnose von Infarkten, insbesondere Infarkten der Herzmuskeln darstellt. Hii_1 und Levi (Cancer Rsch., Vol. 14, Nr.7, 513) wiesen weiter auf einen müglichen Zusammenhang zwischen dem Spiegel der Milchsâuredehydrogenase ira Blut und Leukâmie hin.

Die bicher bekannten Methoden zur Bestimmung der LD besitzen jedoch den Nachteil, da13 zur Durch- führung der Bestimmungen ein Ultraviolett-Spektro- photometer benütigt wird, zu dessen Bedienung um- fangreiche technische Kenntnisse erforderlich sind. Dadurch wurden die die Bedeutung der LD-Konzen- tration betreffenden Untersuchungen gehemmt.

Die Bestimmungsmethoden von White (New Eng. T. Med. Nov. 22, 1956) und Wroblewski und LaDue (Proc. Soc. Exptl. Biol. & Med. 90 : 210) bedienen sich zur Bestimmung der Milchsüuredehydrogenase der Anderung der optischen Dichte von Dihydro- diphospho - pyridin - nucleotid (DPNH; reduzierte Cozymase) bei der durch die Milchsâuredehydro- genase katalysierten Umsetzung desselben mit durch Alkali auf einen bestimmten pH-Wert eingestellter Brenztraubensâure. DPNH besitzt ein Absorptions- maximum bei 340 mit. Zu beiden Seiten des bei 340 mp, liegenden Absorptionsmaximums nimmt die Lichtabsorption des DPNH rasch ab, weshalb eben ein Ultraviolett-Spektrophotometer erforderlich ist.

Im Rahmen der Bestimmungsmethode von White werden bei einem pH-Wert von 7,8 0,0033 Mol Brenztraubensâure und 0,000085 Mol DPNH ver- wendet. Die optische Dichte wird hierbei anfünglich bestimmt, die Reaktionsmischung wird 30 Minuten auf 38 C gchalten und die Abnahme der optischen Dichte wird als Mag für die Konzentration der Milchsâuredehydrogenase genommen. Im Rahmen der bicher am meisten durchgeführ- ten Bestirnmungsmethode nach Wroblewski und LaDue werden bei einem pH-Wert von 7,4 und bei 25 C 0.00077 Mol Brenztraubensüure und 0,0001 Mol DPNH umgesetzt. Abgesehen davon, daB auch bei dieser Bestimmungsmethode ein Ultraviolett- Spektrophotometer verwendet werden mu13, tritt bei der Bestimmungsmethode nach Wroblewski und LaDue noch die Schwierigkeit auf, daB die optische Dichte zwecks Bestimmung der Abnahmegeschwin- digkeit der optischen Dichte in regelmâfgen Zeit- abstânden, ira allgemeinen alle halben Minuten, be- stimmt werden muB. Diese Bestimmung der opti- schen Dichte selbst ist nicht allzu schwierig, jedoch liegt in dem RTI ID="0001.0264" WI="15" HE="4" LX="1272" LY="1879"> Umstand, daI3 die Temperatur der Reak- tionsteilnehmer konstant gehalten werden mu13, eine betrüchtliche praktische Schwierigkeit, da die vom Spektrophotometer abgestrahlte Wârme die Tempera- tur der Reaktionsmischung zu erhdhen und damit den Reaktionsablauf zu beschleunigen trachtet.

Es ist nun Gegenstand der Erfindung, ein Ver- fahren zu schaffen, durch welches die Milchsâure- dehydrogenase unter Anwendung einfacher Arbeits- methoden und unter Verwendung einfacher und bil- liger Einrichtungen genau bestimmt werden kann. Es ist weiters Gegenstand der Erfindung, ein solches Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Milchsüuredehydrogenase zu schaffen, daI3 fin Rah- men eines solchen Verfahrens ein weiter Wellen- lângenbereich verwendet werden kann und auch die Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer innerhalb weiter Grenzen schwanken kdnnen. Weitere Vorteile der Erfindung werden im fol- genden noch nüher erlüutert.

Gemü13 der Erfindung wird nun ein Verfahren zur Bestimmung der Milchsâuredehydrogenase ge- schaffen, im Rahmen desselben von dem Umstand Gebrauch gemacht wird, da13 Milchsâuredehydro- genase Reaktionen der Brenztraubensâure bzw. des Derivates derselben katalysiert, wobei die Menge der umgesetzten Brenztraubensüure bzw. des Derivates derselben abhüngig ist von der anwesenden Menge der Milchsüuredehydrogenase.

Im Rahmen des erfindungsgemül3en Verfahrens wird Bine bestimmte bekannte Menge Brenztrauben- sâure bzw. ein Derivat derselben verwendet und nach Ablauf Biner bestimmten Zeit wird die verbleibende Menge der Brenztraubensâure bzw. des Derivates derselben kolorimetrisch bestimmt. Die Menge der verbrauchten Brenztraubensüure bzw. des Derivates derselben ist Bine Funktion der anwesenden Menge der Milchsüuredehydrogenase, se dat3 die Menge der vorhandenen Milchsâuredehydrogenase unmittelbar bestimmt werden kann.

Soweit im Rahmen der Beschreibung der Aus- druck Brenztraubensüure bzw. das Derivat dersel- ben verwendet wird, ist darunter Bine Quelle von Ionen der Brenztraubensüure zu verstehen. Als Bine solche Quelle kann Brenztraubensüure selbst oder Bines ihrer Salze verstanden werden, wobei in beiden der Fülle der pH-Wert in geeigneter Weise einge- stellt wird. In den spüter noch gegebenen Ausfüh- rungsbeispielen wird der pH-Wert auf etwa 7,5 ein- gestellt. Im folgenden wird stets kurz Brenztrauben- sâure statt Brenztraubensâure bzw. ein Derivat der- selben gesagt.

Im Rahrnen des erfindungsgemüf3en Verfahrens werden insbesondere bekannte Mengen Brenztrau- bensure und Dihydro-diphosphor-pyridin-nucleotid in Gegenwart Bines bekannten Volumens Biner in un- bekannter Konzentration Milchsüuredehydrogenase enthaltenden LBsung vermischt. Nach Ablauf Biner genau bestimmten Zeit wird die Reaktion unterbro- chen und die verbleibende Brenztraubensüure wird mit einem geeigneten Hydrazin, wie beispielsweise 2,4-Dinitrophenyl-hydrazin, zu einem intensiv gefürb- ten Hydrazon umgesetzt. Anschliel3end wird die opti- sche Dichte oder die Lichtdurchlüssigkeit des Hydra- zons bestimmt und die Konzentration der Milchsüure- dehydrogenase kann anschliel3end aus einem Dia- gramm entnommen werden.

Zur Herstellung Bines solchen Diagramms, wel ches einfach Bine Eichkurve für ein bestimmtes Ko- lorimeter und Bine bestimmte Wellenlünge des Lich- tes darstellt, wird die optische Dichte der aus inner- halb des zu erwartenden Bereiches liegenden Brenz- traubensâurekonzentrationen erhaltenen Hydrazons aufgetragen. Die unter den Bedingungen der nach- folgend beschriebenen Bestimmungsmethode üquiva- lenten Milchsüuredehydrogenaseeinheiten pro mlRTIID="0002.0270" WI="6" HE="4" LX="1885" LY="1312"> sind für verschiedene Konzentrationen der Brenztrauben- süure in der folgenden Tabelle angegeben.

ml 0,00080 m Aquiv. der Berger-Broida Brenztraubensâure ml Wasser Milchsâuredehydrogenase bei pH 7,5 einheiten/ml 1,0 0,1 0 0,8 0,3 280 0,6 0,5 640 0,4 0,7 1040 0,2 0,9 1530 0,1 1,0 2000 Die Berger-Broida-Einheiten sied willkürliche MaBe für die Wirksamkeit der Milchsüuredehydro- genase, jedoch sind die unter den spüter beschrie- benen Bedingungen erhaltenen Einheiten vergleich- bar mit den nach Wroblewski erhaltenen Einheiten. Es ki?nnen auch andere willkürliche Einheiten an- stelle der Berger-Broida-Einheiten verwendet wer- den.

Beispielsweise kann Bine Eichkurve se hergestellt werden, da13 sechs Proben von brenztraubensaurem Natrium der in der Tabelle angegebenen Art verwen- det werden. Zu jeder dieser Proben wird 1 ml standar- disiertes 2,4-Dinitrophenylhydrazin zugegeben. Die Proben werden, nachdem das 2,4-Dinitrophenylhy- drazin zugegeben wurde, 20 Minuten bei Raumtem- peratur, 25 5 C stehengelassen. Sofort nach Ab- lauf von 20 Minuten werden 10 ml 0,4 n-Natrium- hydroxyd zu jeder der Proben zugegeben und gut mit den Proben vermischt. 5 Minuten nachdem das Natriumhydroxyd zugegeben worden war, wird die optische Dichte oder Lichtdurchlüssigkeit jeder Probe gegen Wasser als Vergleichsflüssigkeit bestimmt. Die verwendete Lichtwellenlünge wird vorzugsweise se gewühlt, da13 Bine optische Dichte von etwa 0,9 (12ô Lichtdurchldssigkeit) für die erste Probe, das ist die 1,0 ml benztraubensaures Natrium und 0,1 ml Wasser enthaltende Probe, erhalten wird. Dies ist jedoch nicht unbedingt. erforderlich und die Wellen- lünge kann grMer oder kleiner gewühlt werden, se da13 Bine geeignete Einstellung erhalten wird. Es ist jedoch wünschenswert, Bine solche Einstellung zu wühlen, daB für den grZil3ten müglichen Wert ein Wert für die optische Dichte von solcher Grüf3e er- halten wird, der innerhalb des Anzeigebereiches des MeOinstrumentes noch ablesbar ist.

Es ist ersichtlich, dag bei der praktischen Durch- führung der Bestimmung der Wirksamkeit der Milch- sâuredehydrogenase die schliefich erhaltene optische Dichte der 1,üsung Bine inverse Funktion der Wirk- samkeit der Milchsüuredehydrogenase ist, da je grü- f3er die Wirksamkeit der Milchsüuredehydrogenase ist, um so weniger Brenztraubensüure verbleibt. Des- halb kann es, wenn Bine hohe Milchsâuredehydro- genasewirksamkeit gemessen werden soli und wenn das verwendete Spectrophotometer oder Colorimeter bei sehr hohen und bei sehr niedrigen optischen Dichten weniger genau arbeitet als ira mittleren Be- reich, wünschenswert sein, Bine Wellenlünge zu wâh- len, welche für das erste Eichmuster einen grül3eren Wert für die optische Dichte gibt, als er normalerweise verwendet würde, das heil3t, Bine optische Dichte, welche zu grof3 ist, um mit gro13er Genauigkeit ge- messen werden zu künnen, so da13 die Versuchsergeb- nisse nüher innerhalb des mittleren Bereiches liegen. Umgekehrt kann, wenn sehr niedere Wirksamkeiten der Milchsâuredehydrogenase zu erwarten sind, die Wellenl,inge so gewühlt werden, daB anfânglich ein niedrigerer Wert für die optische Dichte erhalten wird, als er unter normalen Bedingungen verwendet werden würde, so da13 der erhaltene Wert für die optische Dichte ira mittleren, das heil3t leicht ables- baren Bereich liegt. Brauchbare Wellenlüngen liegen innerhalb Bines Bereiches von etwa 400 mg bis 550 mu. Wenn jedoch einmal Bine bestimmte Wellen- lünge des Lichtes für die Mel3zwecke gewâhlt wurde, mu13 für die gesamte Eichung und auch für hin- künftige Bestimmungen der Milchsâuredehydro- genase, welchen die bei Verwendung Biner bestimm- ten Lichtquellenlünge erhaltene Eichkurve zugrunde liegt, Licht genau derselben Wellenlünge verwendet werden. Die optische Dichte (oder % Lichtdurchlâs- sigkeit) wird auf gewühnlichem Koordinatenpapier gegen die entsprechenden Einheiten der Milchsâure- dehydrogenase aufgetragen. In Fig. 1 ist Bine typische Eichkurve gezeigt und die in der Fig. 1 aufschei- nenden optischen Dichten wurden mit Licht von Biner Wellenlünge von 525 my in einem Colaman Jr. Colorimeter in 19-mm-Rdhren bestimmt. Es konnte Bine praktisch identische Kurve erhalten werden, wenn die optischen Dichten in einem Beckmann DU-Spektrophotometer in 10-mm-Küvetten und unter Verwendung von Licht Biner Wellenlünge von 464 my bestimmt wurden.

Ira Rahmen Biner beispielsweisen Ausführung der erfindungsgemül3en Bestimmungsmethode werden 1,0 mg Dihydro-diphospho-pyridin-nucleotid inRTI ID="0003.0274" WI="8" HE="4" LX="963" LY="2355"> trok- kener Form in Bine Phiole eingebracht. 1,0 cm3 Biner 0,00080-m-Ldsung von brenztraubensaurem Natrium wird in die Phiole einpipettiert und die Phiole hierauf zwecks Aufwürmung der Reaktionspartner einige Minuten in ein auf 37 C erwürmtes Wasserbad ge- bracht. Es kônnen auch andere Temperaturen ver- wendet werden, sofern der graphisch festgehaltenen Lichtdurchlüssigkeitskurve Bine geeignete Tempera- turkorrekturskala beigegeben ist. Hdhere Tempera turen führen zur Ablesung niedrigerer Werte, da die Wirksamkeit der Milchsâuredehydrogenase zunimmt, und umgekehrt.

Nun werden 0,10 Bras verdünntes Serum (1 Teil Serum auf 5 Teile Wasser) in die Phiole gegeben, der Inhalt leicht umgesehüttelt, die Uhr eingestellt und hierauf wird die Phiole in ein Wasserbad ein- gebracht.

Nach Ablauf von genau 30 Minuten nach der Zugabe des Serums werden 1,0 cm3 Biner standar- disierten Lüsung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin (1 mMo1/1 in ln-HCl) zugegeben. Die Ldsung wird durch Schiitteln gut durchmischt, die Phiole aus dem Wasserbad entfernt und bei Raumtemaeratur so- dann stehengelassen. 20 Minuten nach Zugabe des 2,4-Dinitrophenylhydrazins werden 10 cm3 0,4n- NaOH-Ldsung zugegeben und die erhaltene Lüsung durch mehrmaliges Umkehren der Phiole geschüttelt, worauf die LBsung in Bine Küvette übergeführt wird. Nach Ablauf von weiteren 5 Minuten wird die optische Dichte bzw. die Lichtdurchlüssigkeit der Lüsung abgelesen, wobei Licht jener Wellenlânge verwendet wird, mit welchem die Eichkurve zu die- sem Instrument gewonnen wurde.

Die Wirksamkeit der Milchsâuredehydrogenase wird direkt aus dem Diagramm entnommen.

Sofern ein grBBerer Wert, als er 2000 Einhei- ten/cms entspricht. erhalten wird, ist es zu empfeh- len, den Versuch unter Verwendung weiter propor- tional verdünnten Senims zu wiederholen. Der nun nach der Messung aus der Eichkurve erhaltene nette Wert ist, mit dem entsprechenden Verdünnungs- faktor multipliziert, der richtige Wert für die Ein- heiten pro cm3. Wenn niedrige Werte für die Nfilch- sâuredehydrogenase zu erwarten sind, kann unver- dünntes Serum verwendet werden, wobei dann aller dings die in der dritten Kolonne der Tabelle ange gebenen Einheiten entsprechend richtiggestellt werden müssen.

Es ist leicht einzusehen, daf3 es unbedingt erfor- derlich ist, daB die verschiedenen Reagentien standar- disiert werden müssen, wenn gleichbleibende Er- gebnisse erhalten werden sollen. Wenn die Rea- gentien in geeigneter Weise standardisiert wurden, kann die sich aus der enzymatischen Reaktion er- gebende optische Dichte ohne hüufige Nacheichung des Kolorimeters oder Spektrophotometers mit aus- reichender Genauigkeit und Konstanz gemessen wer- den. Wenn ein geeigneter Blindversuch durchgeführt wird, kdnnen weniger genau gestellte LBsungen ver wendet werden, jedoch müssen die dabei auftreten- den Abweichungen korrigiert werden.

Ira gegebenen Ausführungsbeispiel, welches die bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemâl3en Bestimmungsverfahrens darstellt, war die Konzen- tration des brenztraubensauren Salzes 0,0008-molar, wührend die anfüngliche Konzentration des Dihydro- diphospho - pyridin - nucleotids 0,00116-molar war. Wenn auch angenommen wird, daB die Reaktion in dem Sinne ablüuft, dal3 das Brenztraubensâuremole- kül zur Milchsâure und das Dihydro-diphospho-pyri- din-nucleotid zum Diphospho-pyridin-nucleotid, um- gewandelt wird, und damit ein Molverhâltnis des Brenztraubensüuremoleküls zum Dihydro-diphospho- pyridin-nucleotid von 1 : 1 für erforderlich zu halten ist, se wirkt dock der Vberschul3 an Dihydro- diphospho-pyridin-nucleotid im Sinne eines vollstân- digen Reaktionsablaufes.

Auch dann, wenn die Konzentration der Brenz- traubensâure auf 0,0002-molar und die Konzentra- tion des Dihydro-diphospho-pyridin-nucleotids auf 0,0003-molar herabgesenkt wird, ist dennoch das er- findungsgemül3e Bestimmungsverfahren noch durch- führbar. Dadurch wird jedoch der verfügbare B.e- reich der Milchsâuredehydrogenasewirksamkeiten ver- ringert, wenn nicht das Enzym weiter verdünnt wird. Bei solchen niedrigen Konzentrationen wird die opti- sche Dichte mit Licht solcher Wellenlânge bestimmt, das einen relativ hohen Wert für die optische Dichte liefert. Das Reaktionsprodukt aus Brenztraubensâure und 2,4-Dinitrophenylhydrazin besitzt die maximale optische Dichte bei 440 mu. Die Konzentration der Brenztraubensâure kann auch hôher als 0,0008- molar, welche Konzentration ira Ausführungsbeispiel angegeben wurde, bis hinauf zu jenem Punkt er- hôht werden, bei welchem die entstehende Fürbung den Mel3bereich des verwendeten Spektrophotometers überschreitet. Jede Abünderung der Konzentration der Brenztraubensâure oder der Verdünnung des Serums erfordert eine entsprechende Anderung der Eichkurve.

Die optische Dichte kann dadurch erhôht werden, da13 ein geringeres Volumen Natriumhydroxyd zuge- geben werden. Se k5nnen beispielsweise 5 cm3 0,8-n NaOH statt 10 cm3 0,4n-NaOH zugegeben werden. Auch dadurch wird selbstverstândlich die Verwen- dung einer anderen Eichkurve erforderlich, da die im Zusammenhang mit der vorzugsweise verwende- ten Bestimmungsmethode verwendete Eichkurve auf einem bestimmten Volumen der Lüsung beruht. Die- ser Notbehelf kann erforderlich sein, wenn die zu bestimmenden Mengen der Milchsâuredehydrogenase auf3ergewôhnlich hoch liegen. Die Konzentration des Atznatrons kann bei jeder verwendeten Volummenge in gewissen Grenzen schwanken.

Die Konzentration des 2,4-Dinitrophenylhydra- zins ist se lange nicht kritisch, als sic konstant und ausreichend ist, um alle verbleibende Brenztrauben- sâure umzusetzen und Solange das Gesamtvolumen bei der Eichung Berücksichtigung findet. Es kônnen auch andere Hydrazine in. geeigneter Weise verwen- det werden, wie beispielsweise 3-Chinolylhydrazin, es müssen jedoch für jedes der verschiedenen Hydrazine verschiedene Eichkurven hergestellt werden.

Wie bereits oben angegeben wurde, kann, wenn niedrige NElchsâuredehydrogenasewirksamkeiten ge- messen werden sollen, das Serum unverdünnt oder weniger als auf das 1- bis 6fache verdünnt verwen- det werden. Für noch geringere Milchsüuredehy- drogenaseaktivitâten kann die Reifezeit, die Tempera- tur oder auch beide Faktoren erh6ht werden, um einen hâheren Verbrauch an Brenztraubensâure zu erzielen. Eine Anderung der Temperatur bedingt je- doch ebenfalls die Verwendung einer korrigierten Eichkurve. Wenn zusammen mit einer lüngeren Reife- zeit bei Standardtemperatur gearbeitet wurde, se wurde gefunden, da13 die Reaktionsgeschwindigkeit ziemlich konstant bleibt, se da13 z. B. ein unverdünn- tes und zwei Stunden lang ausgereiftes Serum etwa i/2,1 der auf der Standardeichkurve (1- bis 6fache Verdünnung, 30 Minuten) angezeigten Aktivitüt bc- sitzt, und zwar für den erhaltenen Wert der optischen Dichte. In der Praxis mu13 mit der zu verwendenden Einrichtung ein sorgfâltiger Blindversuch durchge- fiihrt werden, und es darf keinesfalls angenommen werden, daf3 alle die Reaktionsgeschwindigkeit be- einflussenden Faktoren einen linearen Gang auf- weisen. In âhnlicher Weise kônnen dann, wenn h8 here Milchsâuredehydrogenasewirksamkeiten bestimmt werden sollen, kürzere Reaktionszeiten verwendet werden. In dem Ma13e, in dem die Reaktionszeiten verkürzt werden, werden aber auch die prozentuel- len Fehler grül3er, da die Ungenauigkeit der Zeit- messung von grül3erem Einfluf3 ist. Die im bevorzugten Ausführungsbeispiel des er- findungsgemüBen Bestimmungsverfahrens angegebe- nen Zeitintervalle sind nicht im entferntesten sa kri- tisch als jene Zeitspanne, welche zwischen der Zu- gabe des Serums und der Zugabe des Farbentwick- lers liegt. Diese Zeitspanne ist wichtig. Der nach- folgende Schritt, nümlich die Zugabe des Natrium- hydroxyds, nachdem 2,4-Dinitrophenylhydrazin zuge- geben worden war; darf mindestens erst 10 Minuten nachher erfolgen, jedoch kann eine Verzügerung von mehr als einer Stunde in Kauf genommen werden, das heit, daf3 unter den im Beispiel angegebenen Bedingungen eine minimale Zeitspanne von 10 bis 15 Minuten eingehalten werden mu13 und daf3 die im Ausführungsbeispiel angegebene Zeitspanne von 20 Minuten Wartezeit einfach aus Sicherheitsgrün- den se gewâhlt wurde. Nachdem das Natriumhy- droxyd zugegeben worden war und die Lüsung ge- schüttelt wurde, entwickelt sich die Farbe in etwa 5 Minuten vollstândig. Diese Farbe bleibt minde- stens 1 Stunde lang RTI ID="0004.0541" WI="9" HE="4" LX="1458" LY="2227"> stabil.

Die in den Beispielen erwâhnte Milchsâuredehy- drogenase stammte aus dem Blutserum. Das Bestim- mungsverfahren kann aber auch unter Verwendung von Extrakten der Rückenmarksflüssigkeit, von Hefe, von Bakterien, von Pflanzen, von Geweben oder von anderen Milchsâuredehydrogenase enthaltenden Flüs- sigkeiten durchgeführt werden.

Der pH-Wert der Lüsung kann von an der Be- stimmung der Milchsâuredehydrogenaseaktivitât in- teressierten auf einen von 7,5 verschiedenen pH-Wert eingestellt werden. Es wurde jedoch gefunden, daB die Milchsâuredehydrogenaseaktivitât mit verschie- denen pH-Werten merklich schwanken kann und da13 Bine Ànderung der Konzentration der Brenztrauben- sâure bei verschiedenen pH-Werten die Wirksamkeit der Milchsâuredehydrogenase derart verândern kann, da13 in dem MaBe, als die Konzentration der Brenz- traubensâure im Laufe der Reaktion abnimmt, die Reaktionsgeschwindigkeit sich derart verândert, dada sic' ein entschieden nichtlineares Zeitverhalten zeigt.

In dem oben angegebenen Ausführungsbeispiel ist dieses Problem jedoch nicht behandelt. Unter verschiedenen Bedingungen ist es, wie bereits oben erwâhnt wurde, erforderlich, die Eichkurve in Biner gegebenen optischen Dichte entsprechenden Einhei- ten neu zu eichen.

Wenn auch durch das erfindungsgemâBe Be- stimmungsverfahren die Zusammengehtirigkeit der Milchsâuredehydrogenaseeinheiten mit der entspre- chenden Krankheit keinen Gegenstand der vorliegen- den Erfindung bildet, so ist doch die Feststellung interessant, da13, wie die Anmelderin gefunden hat, ira normalen Fall etwa 165 bis 332 Berger-Broida- Einheiten/cm3 Blutserum, und zwar bestimmt nach dem erfindungsgemâl3en Verfahren, erwartet werden kônnen, wâhrend in Fâllen von Herzinfarkt die Maxi- malwerte zwischen 340 und 4000 Einheiten/cms liegen. Hôhere, zwischen etwa 350 bis 1000 Ein- heiten/cm3 liegende Werte sind für heptocellu- lare Nekrosis, metastatische Karzinome, diabetische Ketosis, infektiôse Mononucleosis und cerebrale In- farkte angegeben worden.

Claims (3)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung der Milchsâuredehydrogenasekonzentration, dadurch ge- kennzeichnet, da13 Brenztraubensâure bzw. ein Deri- vat derselben mit Dihydro-diphospho-pyridin-nucleotid in Gegenwart Biner unbekannten Menge von Milch- sâuredehydrogenase, bei Biner bestimmten Tempera- tur, wâhrend Biner bestimmten Zeit, in einem be- stimmten Lôsungsmittelvolumen umgesetzt wird, wo- bei die Anfangsmenge der Brenztraubensâure bzw. des Derivates derselben bekannt ist, und nach abge- schlossener Umsetzung die nichtumgesetzte Brenz- traubensâure bzw. das Derivat derselben kolorime- trisch bestimmt wird. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, da13 die Brenztraubensâure bzw. das Derivat derselben und das Dihydro-diphospho-pyri- din-nucleotid bei geregelter Temperatur wâhrend Bines genau bestimmten Zeitabschnittes miteinander umgesetzt werden, worauf ein bekanntes Volumen mit der Brenztraubensâure bzw. des Dexivates der- selben ein gefârbtes Hydrazon bildendes Hydrazin zugegeben, die Farbe entwickelt und anschlieBend die optische Dichte der Lôsung mit Licht Biner be- stimmten Wellenlânge bestimmt wird.
2. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dal3 die Brenztraubensâure bzw. das Derivat derselben und das Dihydro-diphospho-pyri- din-nucleotid bei Biner geregelten Temperatur wâh- rend Bines genau bestimmten Zeitabschnittes umge- setzt wird, worauf Bine zur Umsetzung mit der ge- samten Brenztraubensâure bzw. des Derivates der- selben ausreichende Menge 2,4-Dinitrophenylhydrazin in Form Bines bestimmten Volumens Biner Lésung und nach Biner zum Abschlug der Umsetzung der Brenztraubensâure bzw. des Derivates derselben rait dem 2,4-Dinitrophenylhydrazin ausreichenden Zeit- spanne Alkali zugegeben und nach Entwicklung der Farbe die optische Dichte der Lôsung mit Licht Biner bestimmten Wellenlânge bestimmt wird.
3. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge- kennzeichnet, dal3 Bine bestimmte Menge Dihydro- diphospho-pyridin-nucleotid in trockener stabilisier- ter Form mit einem bestimmten Volumen Biner Bine bestimmte Menge brenztraubensaures Natrium ent- haltenden Lôsung vermischt wird und da13 nach Ein- stellung der Temperaiur der Lôsung ein bestimmtes Volumen Biner Bine unbekannte Menge Milchsâure- dehydrogenase enthaltenden Lôsung zugefügt, die Brenztraubensâure und das Dihydro-diphospho-pyri- din-nucleotid bei geregelter Temperatur wâhrend Biner genau bestimmten Zeitspanne umgesetzt, hier- auf Bine zur Umsetzung mit der gesamten Brenz- traubensâure ausreichende Menge 2,4-Dinitrophenyl- hydrazin zugegeben und nach Ablauf Biner zum Ab- schluf3 der Umsetzung des 2,4-Dinitrophenylhydrazins mit der gesamten verbleibenden Brenztraubensâure ausreichenden Zeitspanne Alkali zugegeben wirdund da13 anschliel3end nach vollstândiger Entwicklung der Farbe die optische Dichte der L & sung mit Licht Biner bestimmten Wellenlânge bestimmt wird.