DE2149763B2 - Verfahren zur bestimmung des haemoglobingehalts im blut - Google Patents
Verfahren zur bestimmung des haemoglobingehalts im blutInfo
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Description
•25
Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut mit Hilfe des Drabkins-Reagens.
Das Reagens enthält Kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6), Kaliumcyanid (KCN) und Natriumbicarbonat
(NaHCO3). Wird das Hämoglobin zu diesem Reagens zugefügt, so wird das Kaliumferricyanid
reduziert zu Kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)n),
und das Hämoglobin wird oxydiert zu Methämoglobin, das mit dem Cyanid zu dem stabilen Cyanmethämoglobin
reagiert.
Diese Methode wurde zuerst beschrieben von Dr abk in und Austin in »Journal of Biological
Chemistry« 98, S. 719 (1932), und wurde von den gleichen Autoren in »Journal of Biological Chemistry«
112, S. 51 (1935), weiter diskutiert. Das Verfahren ist
auch bekannt als Cyanmethämoglobin-Verfahren. Da Cyanmethämoglobin stabil ist, findet das Verfahren
als Test für Hämoglobin weitgehend Anwendung. Das Verfahren stützt sich auf Drabkins-Reagens, das
anderweitig hergestellt und in speziell bezeichneten Behältern zum Gebrauch des Arztes an Ort und
Stelle oder durch die Techniker des Kliniklaboratoriums verschickt werden kann.
Fines der hierbei auftretenden Probleme besteht jedoch darin, daß das Drpbkins-Reagens bei niederer
Temperatur nicht stabil ist. Es zeigte sich, daß Drabkins-Reagens, wenn es Gefriertemperaturen ausgesetzt
wird, seine Farbe einbüßt, so daß damit keine genaue Hämoglobin-Bestimmung mehr durchgeführt
werden kann. Die beim Gefrieren eintretende Reaktion, für welche noch keine befriedigende Erklärung
gefunden wurde, scheint unter anderem die Reduktion des Kaliumferricyanids zu Kaliumferrocyanid zu
umfassen, wobei gleichzeitig Kaliumcyanid zu Ka-Iiumcyanat oxydiert wird.
Ein typisches Drabkins-Reagens enthält 61 · 10 "5MoI
Kaliumferricyanid, 77 · 10~5 Mol Kaliumcyanid und und 1190 · 10~5 Mol Natriumbicarbonat je Liter.
Dieses Reagens ist sehr stabil. In dem in der Zeitschrift Blood, 12, S. li:5 Ί957), publizierten Artikel
von Crosby und Houchin wird berichtet, daß das
in diesem Reagens gebildete Cyanmethämoglobin bei der Aufbewahrung in verschlossenen braunen Flaschen
in einem Zeitraum von 3 Jahren nur einen 4prozentigen Farbverlust aufwies.
Der Farbvedust dieses Reagens bei Gefriertemperaturen
ist selbstverständlich ein Hauptproblem, insbesondere dann, wenn das Reagens abgepackt wird
und für den Hämoglobintest außerhalb des Krankenhauses verfügbar sein soll. Der Erfindung liegt deshalb
die Aufgabe zugrunde, die Cyanmethämodobin-Methode so zu verbessern, daß auch beim Aufbewahren
des Reagens bei Gefriertemperaturen ein Farbverlust nicht auftreten kann.
Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 angegebene
Erfindung gelöst. Ein Reagenz zur Durchführung des Verfahrens ist im Anspruch 2, vorteilteilhafte
Weiterbildungen des Reagenz sind in den Ansprüchen 3 und 4 beschrieben.
Das Drabkins-Reagens enthält üblicherweise 200 mg Kaliumferricvanid, 50 mg KCN und 1 g Natriumcarbonat
je Liter. Die Hämoglobin-Bestimmung wird durchgeführt durch Beobachten der Höhe des
540-Millimikioiipeaks in einem typischen Spektrometerbild
der die Blutprobe enthaltenden Lösung. Die Konzentration errechnet sich aus der folgenden
Gleichung:
C - A ■ Cs
As
worin C1, die unbekannte Konzentration und Cs die
Standardkonzentration in g je 100 ml ist. A11 ist. die
Absorption der unbekannten Probe und As diejenige
des Standards.
Es wurde gefunden, daß bei Zusatz von Aceton zu dem Drabkins-Reagens in dem im Anspruch 1 angegebenen
Konzentrationsbereich, vorzugsweise in einem Anteil von 0,6%, der Gefrierpunkt der Drabkins-Lösung
nur leicht herabgesetzt wird. Jedoch bleibt die gelbe Farbe erhalten, selbst wenn das Reagens
gefroren ist. und die optische Dicht: des Reagens erleidet keine Veränderung. Hierdurch wird
offensichtlich das seit langem anstehende Problem gelöst, das durch den Farbverlust des Drabkins-Reagens
bei Gefriertemperaturen gestellt wurde.
Außerdem wurde gefunden, daß der Zusatz von Aceton zum Drabkins-Reagens ein unmittelbares Erreichen
der Spitzenabsorption von Cyanmethämoglobin bewirkte. Dies ist insbesondere deshalb wichtig,
da die charakteristische Spitze bei 540 ΐημ unmittelbar
und nicht über eine Zwischenspitze bei 570 τημ
(die Standardspitze für Oxyhämoglobin) erreicht wird. Die Genauigkeit des Tests ist insofern verbessert, als
daß das sofortige Auftreten der Cyanmethämoglobinspitze ohne Auftreten der Oxyhämoglobinspitze jede
Möglichkeit ausschließt, daß der Wert der Oxyhämoglobin-Ablesung übertragen wird, woraus sich der
Irrtum in der Berechnung des Prozentgehaltes an Hämoglobin in der Blutprobe ergeben würde.
Die Erfindung sei an Hand der Beispiele näher erläutert.
Zur Bereitung von Drabkins-Reagens wurden 200 mg Kaliumferricyanid, 50 mg Kaliumcyanid and
1 g Natriumbicarbonat in 1 1 Wasser gelöst. Nach gutem Durchmischen und völliger Auflösung wurde
einem Teil des Reagens eine Menge von 6 ml Aceton je Liter Lösung zugegeben. Dem anderen Teil wurde
kein Aceton zugefügt. Beide Lösungen wurden dann 96 Stunden einer Temperatur von — 30° C ausge-
setzt, worauf man sie sich wieder auf Raumtemperatur
erwärmen ließ.
Die Testlösungen wurden volumetrisch in 13 · 50-mm-Glasküvetten abgefüllt. Sämtliche Bestimmungen
wurden unter Verwendung dieser Behältnisse als erste Reaktionsküvette durchgeführt. In
allen Küvetten befand sich ein Volumen von 3,8 ml Drabkins-Lösung. Von den Blutproben wurden jeweils
13 Mikroliter einpipettiert. Die Küvetten wurden dann in ein Spektrophotometer mit einem 2-mm-Spalt
gebracht. Das Spektrophotometer wurde mit 10 mV volle Skala betrieben. Die Absorptionen des Reagens
wurden gemessen beim 540-n^-Peak. Bei Verwendung der acetonhaltigen Lösung war die Höhe des
Peaks im wesentlichen die gleiche wie bei der Verwendung von frischer Drabkms-Lösung. Im Gegensatz
dazu betrug die Höhe des Peaks, die man mit einer Drabkins-Lösung ohne Aceton-Zusatz nach
vorherigem Gefrieren und Wiederauftauen erhielt, nur 30% der Höhe des Peaks mit frischem Drabkins-Reagens.
Wie ersichtlich, verhindert der Aceton-Zusatz tatsächlich jeden Farbverlust bei Drabkins-Reagens und
ermöglicht die Herstellung eines Reagens, das ohne Gefahr eines Aktivitätsverlustes durch Gefrieren
transportiert werden kann.
Zur Auswertung des wie oben hergestellten, mit Aceton modifizierten Reagens wurde eine Spektralkurve
aufgestellt mit Hilfe eines selbstschreibenden Spektrophotometers mit 2-mm-Spalt, Das Spektrophotometer
wurde betrieben mit 10 mV, volle Skala. Es wurden zwei getrennte Tests durchgeführt. Zum
Vergleich wurden Blindversuche mit lediglich den
Reagenzien durchgeführt. Zum ersten Test vmrden nur 3,8 ml Drabkins-Reagens ohne Aceton verwendet.
Beim zweiten Test wurden 3,8 ml Drabkins-Reagens mit 6 ml Aceton je Liter verwendet. Beide
Tests wurden durchgeführt mit 13 Mikroliter Blut mit
ίο normalem Hämoglobingehalt mit raschem Abtasten
bei 10 Minuten, um sicherzustellen, daß keine Sekundärreaktionen aufgetreten waren.
Der mit dem Drabkins-Reagens ohne Aceton durchgeführte Test hatte zwei charakteristische
Peaks, von denen der eine bei 570, der andere bei 540 Millimikron auftrat. Der 570-MiUimikron-Peak
gehört selbstverständlich zu Oxyhämoglobin.
Wenn dagegen das mit Aceton modifizierte Drabkins-Reagens verwendet wurde, so wurde unmittelbar
so der 540-Millimikron-Peak erhalten, und es war kein
Anfangspaek bei 570 Millimikron zu beobachten. Das Reagens mit einem Gehalt an Aceton wurde
dann unter Verwendung einer 10-Minuten-Abtastung geprüft. Es war weder primäre noch sekundäre Inter-
ferenz zu beobachten.
Aus den Daten geht hervor, daß das Drabkins-Reagens mit einem Gehalt an Aceton eine sofortige
Cyanmethämoglobin-Ablesung ergibt und die Möglichkeit eines Irrtums durch Übertragung der Oxyhämoglobin-Ablesung
von dem Spektrometerblatt vor Auftreten des Cyanmethämoglobins ausschaltet.
Claims (4)
1. Verfahren zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut nach der Cyanmethämoglobin-Methode,
unter Verwendung einer Bestimmungslösung, welche Kaliumcyanid, Kaliumferricyanid
und Natriumbicarbonat als aktive Bestandteile enthält, dadurch gekennzeichnet, daß
der Lösung zur Verhinderung eines Farbverlustes bei Temperaturen unterhalb 0° etwa 0,2 bis
10 Gewichtsprozent Aceton zugefügt werden.
2. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend Kaliumcyanid, Kaliumferricyanid
und Natriumbicarbonat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an etwa 0,2 bis 10 Gewichtsprozent Aceton.
3. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch einen Gehalt von etwa 61 · 10~5 Mol Kaliumferricyanid,
77 · 10~5 Mol Kaliumcyanid und 1190 · IO-5 Mol Natriumbicarbonat.
4. Reagens nach Anspruch 2 oder 3. gekennzeichnet durch einen Gehalt an etwa 2,5 bis
126 cm3/! Aceton.
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