DE2149763B2 - Verfahren zur bestimmung des haemoglobingehalts im blut - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des haemoglobingehalts im blut

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Description

•25
Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut mit Hilfe des Drabkins-Reagens. Das Reagens enthält Kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6), Kaliumcyanid (KCN) und Natriumbicarbonat (NaHCO3). Wird das Hämoglobin zu diesem Reagens zugefügt, so wird das Kaliumferricyanid reduziert zu Kaliumferrocyanid (K4Fe(CN)n), und das Hämoglobin wird oxydiert zu Methämoglobin, das mit dem Cyanid zu dem stabilen Cyanmethämoglobin reagiert.
Diese Methode wurde zuerst beschrieben von Dr abk in und Austin in »Journal of Biological Chemistry« 98, S. 719 (1932), und wurde von den gleichen Autoren in »Journal of Biological Chemistry« 112, S. 51 (1935), weiter diskutiert. Das Verfahren ist auch bekannt als Cyanmethämoglobin-Verfahren. Da Cyanmethämoglobin stabil ist, findet das Verfahren als Test für Hämoglobin weitgehend Anwendung. Das Verfahren stützt sich auf Drabkins-Reagens, das anderweitig hergestellt und in speziell bezeichneten Behältern zum Gebrauch des Arztes an Ort und Stelle oder durch die Techniker des Kliniklaboratoriums verschickt werden kann.
Fines der hierbei auftretenden Probleme besteht jedoch darin, daß das Drpbkins-Reagens bei niederer Temperatur nicht stabil ist. Es zeigte sich, daß Drabkins-Reagens, wenn es Gefriertemperaturen ausgesetzt wird, seine Farbe einbüßt, so daß damit keine genaue Hämoglobin-Bestimmung mehr durchgeführt werden kann. Die beim Gefrieren eintretende Reaktion, für welche noch keine befriedigende Erklärung gefunden wurde, scheint unter anderem die Reduktion des Kaliumferricyanids zu Kaliumferrocyanid zu umfassen, wobei gleichzeitig Kaliumcyanid zu Ka-Iiumcyanat oxydiert wird.
Ein typisches Drabkins-Reagens enthält 61 · 10 "5MoI Kaliumferricyanid, 77 · 10~5 Mol Kaliumcyanid und und 1190 · 10~5 Mol Natriumbicarbonat je Liter. Dieses Reagens ist sehr stabil. In dem in der Zeitschrift Blood, 12, S. li:5 Ί957), publizierten Artikel von Crosby und Houchin wird berichtet, daß das in diesem Reagens gebildete Cyanmethämoglobin bei der Aufbewahrung in verschlossenen braunen Flaschen in einem Zeitraum von 3 Jahren nur einen 4prozentigen Farbverlust aufwies.
Der Farbvedust dieses Reagens bei Gefriertemperaturen ist selbstverständlich ein Hauptproblem, insbesondere dann, wenn das Reagens abgepackt wird und für den Hämoglobintest außerhalb des Krankenhauses verfügbar sein soll. Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die Cyanmethämodobin-Methode so zu verbessern, daß auch beim Aufbewahren des Reagens bei Gefriertemperaturen ein Farbverlust nicht auftreten kann.
Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 angegebene Erfindung gelöst. Ein Reagenz zur Durchführung des Verfahrens ist im Anspruch 2, vorteilteilhafte Weiterbildungen des Reagenz sind in den Ansprüchen 3 und 4 beschrieben.
Das Drabkins-Reagens enthält üblicherweise 200 mg Kaliumferricvanid, 50 mg KCN und 1 g Natriumcarbonat je Liter. Die Hämoglobin-Bestimmung wird durchgeführt durch Beobachten der Höhe des 540-Millimikioiipeaks in einem typischen Spektrometerbild der die Blutprobe enthaltenden Lösung. Die Konzentration errechnet sich aus der folgenden Gleichung:
C - A ■ Cs
As
worin C1, die unbekannte Konzentration und Cs die Standardkonzentration in g je 100 ml ist. A11 ist. die Absorption der unbekannten Probe und As diejenige des Standards.
Es wurde gefunden, daß bei Zusatz von Aceton zu dem Drabkins-Reagens in dem im Anspruch 1 angegebenen Konzentrationsbereich, vorzugsweise in einem Anteil von 0,6%, der Gefrierpunkt der Drabkins-Lösung nur leicht herabgesetzt wird. Jedoch bleibt die gelbe Farbe erhalten, selbst wenn das Reagens gefroren ist. und die optische Dicht: des Reagens erleidet keine Veränderung. Hierdurch wird offensichtlich das seit langem anstehende Problem gelöst, das durch den Farbverlust des Drabkins-Reagens bei Gefriertemperaturen gestellt wurde.
Außerdem wurde gefunden, daß der Zusatz von Aceton zum Drabkins-Reagens ein unmittelbares Erreichen der Spitzenabsorption von Cyanmethämoglobin bewirkte. Dies ist insbesondere deshalb wichtig, da die charakteristische Spitze bei 540 ΐημ unmittelbar und nicht über eine Zwischenspitze bei 570 τημ (die Standardspitze für Oxyhämoglobin) erreicht wird. Die Genauigkeit des Tests ist insofern verbessert, als daß das sofortige Auftreten der Cyanmethämoglobinspitze ohne Auftreten der Oxyhämoglobinspitze jede Möglichkeit ausschließt, daß der Wert der Oxyhämoglobin-Ablesung übertragen wird, woraus sich der Irrtum in der Berechnung des Prozentgehaltes an Hämoglobin in der Blutprobe ergeben würde.
Die Erfindung sei an Hand der Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Zur Bereitung von Drabkins-Reagens wurden 200 mg Kaliumferricyanid, 50 mg Kaliumcyanid and 1 g Natriumbicarbonat in 1 1 Wasser gelöst. Nach gutem Durchmischen und völliger Auflösung wurde einem Teil des Reagens eine Menge von 6 ml Aceton je Liter Lösung zugegeben. Dem anderen Teil wurde kein Aceton zugefügt. Beide Lösungen wurden dann 96 Stunden einer Temperatur von — 30° C ausge-
setzt, worauf man sie sich wieder auf Raumtemperatur erwärmen ließ.
Die Testlösungen wurden volumetrisch in 13 · 50-mm-Glasküvetten abgefüllt. Sämtliche Bestimmungen wurden unter Verwendung dieser Behältnisse als erste Reaktionsküvette durchgeführt. In allen Küvetten befand sich ein Volumen von 3,8 ml Drabkins-Lösung. Von den Blutproben wurden jeweils 13 Mikroliter einpipettiert. Die Küvetten wurden dann in ein Spektrophotometer mit einem 2-mm-Spalt gebracht. Das Spektrophotometer wurde mit 10 mV volle Skala betrieben. Die Absorptionen des Reagens wurden gemessen beim 540-n^-Peak. Bei Verwendung der acetonhaltigen Lösung war die Höhe des Peaks im wesentlichen die gleiche wie bei der Verwendung von frischer Drabkms-Lösung. Im Gegensatz dazu betrug die Höhe des Peaks, die man mit einer Drabkins-Lösung ohne Aceton-Zusatz nach vorherigem Gefrieren und Wiederauftauen erhielt, nur 30% der Höhe des Peaks mit frischem Drabkins-Reagens.
Wie ersichtlich, verhindert der Aceton-Zusatz tatsächlich jeden Farbverlust bei Drabkins-Reagens und ermöglicht die Herstellung eines Reagens, das ohne Gefahr eines Aktivitätsverlustes durch Gefrieren transportiert werden kann.
Beispiel 2
Zur Auswertung des wie oben hergestellten, mit Aceton modifizierten Reagens wurde eine Spektralkurve aufgestellt mit Hilfe eines selbstschreibenden Spektrophotometers mit 2-mm-Spalt, Das Spektrophotometer wurde betrieben mit 10 mV, volle Skala. Es wurden zwei getrennte Tests durchgeführt. Zum Vergleich wurden Blindversuche mit lediglich den
Reagenzien durchgeführt. Zum ersten Test vmrden nur 3,8 ml Drabkins-Reagens ohne Aceton verwendet. Beim zweiten Test wurden 3,8 ml Drabkins-Reagens mit 6 ml Aceton je Liter verwendet. Beide Tests wurden durchgeführt mit 13 Mikroliter Blut mit
ίο normalem Hämoglobingehalt mit raschem Abtasten bei 10 Minuten, um sicherzustellen, daß keine Sekundärreaktionen aufgetreten waren.
Der mit dem Drabkins-Reagens ohne Aceton durchgeführte Test hatte zwei charakteristische
Peaks, von denen der eine bei 570, der andere bei 540 Millimikron auftrat. Der 570-MiUimikron-Peak gehört selbstverständlich zu Oxyhämoglobin.
Wenn dagegen das mit Aceton modifizierte Drabkins-Reagens verwendet wurde, so wurde unmittelbar
so der 540-Millimikron-Peak erhalten, und es war kein Anfangspaek bei 570 Millimikron zu beobachten. Das Reagens mit einem Gehalt an Aceton wurde dann unter Verwendung einer 10-Minuten-Abtastung geprüft. Es war weder primäre noch sekundäre Inter-
ferenz zu beobachten.
Aus den Daten geht hervor, daß das Drabkins-Reagens mit einem Gehalt an Aceton eine sofortige Cyanmethämoglobin-Ablesung ergibt und die Möglichkeit eines Irrtums durch Übertragung der Oxyhämoglobin-Ablesung von dem Spektrometerblatt vor Auftreten des Cyanmethämoglobins ausschaltet.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut nach der Cyanmethämoglobin-Methode, unter Verwendung einer Bestimmungslösung, welche Kaliumcyanid, Kaliumferricyanid und Natriumbicarbonat als aktive Bestandteile enthält, dadurch gekennzeichnet, daß der Lösung zur Verhinderung eines Farbverlustes bei Temperaturen unterhalb 0° etwa 0,2 bis 10 Gewichtsprozent Aceton zugefügt werden.
2. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend Kaliumcyanid, Kaliumferricyanid und Natriumbicarbonat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an etwa 0,2 bis 10 Gewichtsprozent Aceton.
3. Reagens nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch einen Gehalt von etwa 61 · 10~5 Mol Kaliumferricyanid, 77 · 10~5 Mol Kaliumcyanid und 1190 · IO-5 Mol Natriumbicarbonat.
4. Reagens nach Anspruch 2 oder 3. gekennzeichnet durch einen Gehalt an etwa 2,5 bis 126 cm3/! Aceton.
DE2149763A 1970-10-05 1971-10-05 Verfahren zur Bestimmung des Hamoglobingehalts im Blut Expired DE2149763C3 (de)

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