Procédé de fabrication de cultures non virulentes de virus atténués et stabilisés du choléra du porc
La présente invention a pour objet un procédé de fabrication de cultures non virulentes de virus atténués et stabilisés du choléra du porc.
Les vaccins contre le choléra du porc ont été fabriqués jusqu'à présent à partir de cultures atténuées de virus du choléra du porc. En théorie, ces cultures atténuées sont fabriquées suivant un procédé dans lequel le virus pathogène du choléra du porc est modifié à partir d'un virus pouvant provoquer la maladie en un virus incapable de la provoquer.
Etant donné que le virus est viable et retient encore des antigènes, lorsqu'il est injecté à un porc susceptible de contracter la maladie, il confère à ce dernier une immunité efficace contre le choléra du porc.
En pratique cependant, les vaccins atténués contre le choléra du porc ne se sont pas montrés aussi satisfaisants que cela est désirable.
Tandis que l'administration de virus atténués du choléra à un porc non immunisé entraîne rarement la mort de cet animal, il y a fréquemment une réaction post-vaccinale assez sérieuse ressemblant à une forme bénigne du choléra du porc. Ceci est indiqué par une réaction fébrile, une perte de l'appétit, une diminution du gain de poids normal, etc. Ainsi, on peut remarquer que les virus atténués du choléra du porc utilisés actuellement dans les vaccins contre le choléra ne peuvent pas toujours être qualifiés de non virulents. I1 semble en fait que de nombreuses cultures de virus du choléra du porc qui sont considérées comme non virulentes peuvent tendre à revenir à un état de virulence marquée lorsqu'elles sont inoculées à un porc non immunisé.
L'invention est basée en partie sur la constatation que, lorsqu'on inocule à un jeune porc non immunisé un virus atténué du choléra, la virulence ne disparaît pas après la période d'hyperthermie, mais persiste au contraire pendant plusieurs semaines, le virus persistant ne provoquant qu'une réaction fébrile relativement modérée. Ceci est tout à fait inattendu étant donné qu'il était admis jusqu'à présent que la guérison du porc après l'inoculation de virus atténués du choléra du porc dépend de la formation d'anticorps en quantité suffisante pour détruire tous les virus au bout d'un temps ne dépassant pas 14 à 21 jours. De plus, on pensait que, si les anticorps produits ne détruisaient pas les virus du choléra du porc, l'infection par les virus ne serait pas réprimée et provoquerait la mort du porc.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on inocule à un porc non immunisé, âgé de moins de 3 mois un virus atténué du choléra du porc, on donne au porc une ration alimentaire normale, on mesure périodiquement sa température, on effectue les prélèvements de cultures non virulentes lorsque la température du porc est descendue à un niveau intermédiaire encore au-dessus de la normale, et lorsque le porc présente encore une température intermédiaire la 3e semaine après l'inoculation et un gain de poids normal.
Le procédé de l'invention peut être utilisé avec des virus atténués du choléra du porc obtenus à partir de divers procédés connus. Par exemple, un virus atténué convenable peut être obtenu en soumettant une culture de virus de choléra du porc adaptée à des lapins à plusieurs passages en série à travers des lapins, comme décrit dans l'article : Passages en série de virus du choléra du porc dans des lapins , compte rendu de la Société de médecine et biologie expérimentales 63, 183-187 (1946). 13 à 15 transferts dans des lapins sont usuellement nécessaires pour atténuer suffisamment la virulence du virus afin de permettre d'utiliser ce dernier dans la fabrication de vaccins contre le choléra du porc. Les virus pathogènes du choléra du porc peuvent être adaptés aux lapins en alternant les passages dans les lapins et dans les porcs.
Un procédé spécifique en vue d'obtenir ce résultat est décrit dans le brevet américain N" 2519978. Quelques cultures ne nécessitent pas cette adaptation et elles peuvent également être utilisées dans le procédé selon l'invention.
Dans la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, il importe d'utiliser des porcs non immunisés âgés de moins de 3 mois pour maintenir une infection persistante due aux virus lorsqu'on inocule à ces porcs des vIrus atténués. On peut supposer que la progéniture d'une truie non immunisée ne sera également pas immunisée et conviendra, en conséquence, à la réalisation du procédé selon l'invention.
On sait que le colostrum ou premier lait a une très forte teneur en gamma globuline et contient des anticorps du choléra du porc si la truie est immunisée, ce qui entraîne une immunisation partielle ou complète des porcs allaités.
On a constaté que, lorsque les porcs n'ont pas encore 3 mois, ils sont capables de s'adapter et d'entretenir une infection persistante due au virus du choléra lorsqu'on leur inocule des virus atténués du choléra du porc. Ce résultat peut être obtenu ordinairement lorsque le porc non immunisé est âgé de moins de trois mois, bien que l'on préfère utiliser des porcs d'environ 5 à 10 semaines au moment de l'inoculation.
La technique de l'inoculation n'est pas critique, bien que des résultats particulièrement favorables aient été obtenus par injection intramusculaire des virus atténués. Plus généralement, une injection parentérale des virus atténués convient.
Lorsqu'on a inoculé aux porcs non immunisés les virus atténués, le porc reçoit une ration convenable pour sa croissance normale. Cette nourriture convient habituellement mieux si on utilise des porcs sevrés, bien que le procédé puisse également être appliqué à des porcs allaités. Les porcs sont ordinairement sevrés à l'âge d'environ 5 à 6 semaines. Il suffit ensuite que les porcs sevrés reçoivent une nourriture en quantité suffisante consistant en une ration standard du commerce, qui comprend le plus souvent des succédanés du lait. On a aussi trouvé qu'il est avantageux d'incorporer dans la ration une faible quantité d'oxytétracycline.
En plus du fait que l'on doit donner au porc une ration alimentaire normale après l'inoculation, sa température doit être mesurée périodiquement pour déterminer le degré d'élévation de celle-ci au-dessus de la normale, car ceci indique le progrès de l'infection due aux virus. Comme cela est bien connu dans la pratique, au bout de 3 à 5 jours ou plus après l'inoculation, une réaction fébrile marquée est observée, la température de l'animal s'élevant ordinairement depuis sa valeur normale de 38,70 C jusqu'à un maximum d'environ 41,10 C. La température de l'animal reste à son niveau élevé pendant 3 à 5 jours ou plus, puis descend à un niveau intermédiaire auquel elle reste pendant quelques jours.
C'est pendant cette période que le porc peut être considéré comme présentant une infection virulente persistante qui diffère de l'infection virulente aiguë.
Puisqu'il y a quelques variations d'un animal à un autre, la chute de température jusqu'au niveau intermédiaire décrit ci-dessus doit ordinairement apparaître environ 8 à 10 jours après l'accès de fièvre et continuer pendant 6 semaines dans certains cas.
La durée exacte de la réaction fébrile intermédiaire peut naturellement être déterminée facilement en prenant la température de l'animal. Ordinairement, une température de 0,50 C à i C au-dessus de la normale est observée pendant la période intermédiaire de température. Il est surprenant que l'infection due aux virus puisse persister sans faire mourir l'animal, étant donné qu'on n'a encore enregistré aucun cas où un animal persistait à présenter une réaction fébrile à l'inoculation de virus atténués du choléra du porc au-delà de trois semaines et il a été reconnu que, si l'infection ne disparaît pas complètement au bout de 3 semaines, I'animal meurt.
Les virus viables du choléra du porc sont prélevés sur un porc pendant la période d'infection persistante, c'est-à-dire lorsque la température du porc est redescendue de son niveau maximum se trouvant au-dessus de la normale à un niveau inter mégi'aire se trouvant encore au-dessus de la normale. Le procédé particulier du prélèvement du virus n'est pas critique, bien que l'on préfère prélever le virus sans tuer l'animal. Cette opération peut être effectuée en prélevant par intervalles sur l'animal une quantité non nuisible de sang pendant la période d'infection virulente persistante. Ordinairement, les meilleurs échantillons de sang sont obtenus pendant la 4ème et la 5ème semaine après l'inoculation, bien que les échantillons prélevés pendant la 3ème et la 6ème semaine puissent également être valables.
Suivant une variante, les animaux peuvent être sacrifiés et le virus du choléra du porc peut être obtenu avec tout le sang ou à partir d'autres tissus contenant le virus, tels que la rate, etc.
Dans la pratique, le taux de gain de poids des porcs inoculés est observé en pesant les porcs à intervalles réguliers et en comparant les changements de poids à ceux que l'on doit normalement attendre chez des porcs de l'âge et de la race de ceux qui sont utilisés. Par exemple, les porcs âgés de 5 à 10 semaines peuvent ordinairement présenter un gain de poids de 1,8 à 2,3 kg par semaine lorsqu'ils sont nourris avec des rations appropriées à leur croissance normale. Si le porc n'atteint pas le taux normal de gain de poids, en particulier pendant la période d'infection virulente persistante, ceci indique que la culture du virus qui a été inoculée aux porcs a tendance à se modifier en une forme de plus grande virulence et, par conséquent, elle ne doit pas être utilisée à des fins de fabrication de vaccins contre le choléra du porc.
Par ailleurs, si le porc présente un taux nor mal de gain de poids, ceci indique directement que la culture du virus persistant dans le corps de l'animal n'a sensiblement aucune tendance à devenir virulente et c'est pourquoi on peut la considérer avec plus de certitude comme une culture non virulente de virus du choléra du porc. Par conséquent, les virus du choléra du porc ne sont pas prélevés à des fins de fabrication de vaccins contre le choléra du porc, à moins que le porc n'ait atteint un taux normal de gain de poids.
Si on le désire, le degré de virulence du virus du choléra du porc obtenu comme décrit ci-dessus peut être, de plus, expérimenté en injectant ce virus à un porc adulte non immunisé et en observant la gravité relative des symptômes du choléra du porc qui en résultent.
La nature stable non virulente du virus du choléra du porc obtenu comme décrit ci-dessus peut ensuite être exploitée pour fabriquer un vaccin suivant divers procédés connus, tels que la propagation dans des lapins ou dans des porcs. En particulier, la technique de propagation dans le porc décrite dans le brevet américain N 2594180 peut être utilisée.
Exemple
Un virus atténué du choléra du porc après 15 passages. en série fut préparé comme décrit dans l'article Passages en sére de virus du choléra du porc dans des lapins par James A. Baker, compte rendu de la Société de médecine et biologie expérimentales, 63, 183-187 (1946). Les diverses cultures de virus après 15 passages en série furent inoculées à des lapins.
La rate de chaque lapin recevant le virus du
15ème passage fut pesée, mise en suspension à 10 a/o et chaque porc reçut une inoculation intramusculaire de 1 ml dans la cuisse droite. Ensuite, les températures furent prises quotidiennement et les poids furent enregistrés chaque semaine. Avant l'inoculation et à des intervalles d'une semaine après l'inoculation, 5 ml de sang furent prélevés de la veine cave antérieure de chaque porc et défibrinés dans un flacon d'Erlenmeyer contenant des perles de verre. 1 ml de chaque échantillon défibriné fut distribué dans plusieurs fioles de verre qui furent stockées sous des conditions de réfrigération à la glace.
Les porcs utilisés pour l'expérience ci-dessus
étaient non immunisés du fait qu'ils étaient issus de truies non immunisées et étaient tous sevrés, leur
âge étant compris entre 6 et 8 semaines au moment
de l'inoculation. Les porcs reçurent une ration appropriée à leur croissance normale, contenant une faible
quantité de terramycine. Une étude de la température
et du poids montra que les porcs qui approchaient un
taux normal de gain de poids d'environ 1,8 à 2,3 kg
par semaine, pendant les quatre semaines suivant l'inoculation, avaient acquis une infection virulente
persistante mise en évidence par les températures de
niveau intermédiaire par rapport à la plus forte température atteinte après l'inoculation et à la température normale de l'animal.
Puisqu'il y avait quelques variations des températures enregistrées d'un animal à l'autre, deux séries de mesures de température sur des animaux différents peuvent être mentionnées à titre illustratif. Le premier porc atteignit une température élevée de 40,40 C neuf jours après l'inoculation. Des échantillons de sang furent prélevés sur ce porc au bout de 14, 21 et 28 jours, des températures de 38,9, 39,6 et 39,90 C ayant été respectivement relevées au bout de ces laps de temps. Un autre porc, après avoir atteint la température élevée de 41,70 C le 8ème jour après l'inoculation, présenta des températures de 40, 7O C le 14ème jour, 40,10 C le 21ème jour et 400 C le 28ème jour.
Le fait que de nombreux animaux pouvaient atteindre un taux normal de gain de poids malgré l'infection virulente persistante a montré que le virus n'était pas seulement atténué, mais, en plus, avait été stabilisé et n'avait aucune tendance à revenir à un état de plus grande virulence. Cette conclusion fut confirmée par un autre procédé d'expérimentation dans lequel les divers échantillons de sang furent comparés de la manière suivante:
Afin de confirmer la stabilité et l'atténuation du virus, un échantillon de sang de porc fut choisi, décongelé, mis en suspension à 10 O/o et 1 ml fut inoculé à un lapin par voie intraveineuse. Après une période de 5 jours, le lapin fut tué, se rate fut enlevée, pesée, mise en suspension à 10 o/o et inoculée à un porc susceptible de contracter le choléra, comme décrit ci-dessus.
De plus, des lapins reçurent une inoculation comme décrit ci-dessus afin de déterminer la viabilité du virus chez les lapins. La stabilité du virus entrant dans la composition des vaccins fut déterminée par réaction thermique du porc inoculé et par développement subséquent de l'immunité à l'inoculation de virus pathogènes qui tuèrent les porcs en observation.