Procédé de purification de l'hydroxocobalamine
La présente invention concerne un procédé permettant la séparation et la purification de l'hydroxo- cobalamine (aussi appelée vitamine B 12b) à partir de mélanges contenant cette substance.
On sait que la vitamine B 12b se distingue de la vitamine B 12 (ou cyanocobalamine) par le fait que dans la première le cobalt porte un groupe hy- droxy qui est remplacé dans la seconde par un groupe cyan.
Pour les usages pharmaceutiques, on tend au jour, d'hui à préférer l'hydroxocobalamine à la cyanocobalamine, car la première qui présente des pro piétés basiques entre plus facilement dans le méta bolismle des individus.
Pour fabriquer l'hydroxocobalamine, il est usuel de partir de la cyanocobalamine, à laquelle on fait subir divers traitements physiques ou chimiques.
Ainsi, une technique connue prévoit de réduire la cyanocobalamine par une hydrogénation catalytique qui la transforme en cobalamine. On oxyde ensuite la solution pour la transformer en hydroxocobalamine.
Selon un procédé connu on peut aussi effectuer l'hydrogénation sans catalyseur, en utilisant Ide l'lhydrogène naissant obtenu in situ par contact d'une solution acide de la cyanocobalamine avec du zinc granulé, après quoi l'oxydation est effectuée par barbotage d'air dans le liquide obtenu dilué d'eau.
Le produit obtenu par ces divers procédés doit subir des purifications primaires avant d'être utilisé.
Ainsi, dans le cas du dernier procédé visé, on traite la solution obtenue après l'oxydation par une base minérale telle que la soude, qui précipite les sels de zinc sous forme d'hydroxyde. On filtre pour éliminer ce dernier et on évapore sous vide le filtrat. Le résidu est repris par une petite quantité d'alcool mé plique. On filtre et on évapore le filtrat: on oient alors l'hydroxocobalamine brute.
Pour passer du produit brut, au produit techniquement pur, il est connu de, procéder, de la sorte: on redissout l'hydroxocobalamine brute dans l'eau, exempte de CO2, et on règle le pH à une valeur comprise entre 8,5 et 9,5. On ajoute ensuite un solvant organique soluble dans l'eau, appartenant au groupe formé par l'acétone, le dioxane et le tétrahydrofurane. Ces solvants sont désignés ci-après par solvants préférés . Ces corps sont utilisés à raison d'environ 80% de solvant pour 20l /o de solution aqueuse.
Puis on laisse reposer à température basse (5 à 100 C par exemple), et on obtient par cristallisation des cristaux d'hydroxocobalamine à 70 '0/o de pureté environ, qui constituent l'hydroxocobalamine technique.
Les 30 /o d'impuretés sont constitués par de l'humidité, par de la cyanocobalamine n'ayant pas réagi, et par des sels entraînés pendant la cristallination précédente.
Il est connu aussi qu'on peut améliorer la pureté du produit technique en soumettant celui-ci à une séparation c ! hromatographique, principalement sur une colonne d'alumine. On peut ainsi éliminer une partie importante de la cyanocobalamine qui n'a pas réagi.
En effectuant une élution, on recueille alors une hydroxocobalamine enrichie (à 80 % de pureté par exemple). On a ainsi séparé la cyanocobalamine et une ¯ grande partie des sels. I1 reste toutefois une petite quantité de sels, adsorbés en même temps que l'hydroxocobalamine par l'alumine.
Cependant ces impuretés peuvent compromettre la stabilité de lthydroxocobalamine qui peut se dégrader à la longue. L'instabilité Ide 11hydroxocobala- mine est d'ailleurs connue par la littérature, et on a proposé l'adjonction. dans les solutions dthydroxo- cobalamine de tampons ou de stabilisants pour y remédier, mais ces corps risquent de réduire son efficacité thérapeutique.
Le procédé qui fait l'objet de la présente invention remédie aux inconvénients des procédés antérieurs de purification, en. permettant d'arriver à un produit d'une très grande richesse (plus de 95 /o de pureté) et par suite d'une haute stabilité. Les solutions aqueuses d'hydroxocobalamine ainsi obtenues peuvent présenter un pH voisin de 8, et néanmoins demeurer stables, pendant plusieurs mois, lorsqu'elles sont stockées à température ambiante mais à l'abri de la lumière.
Suivant l'invention, après avoir fait subir, par exemple d'une façon en elle-même connue, un traite ment t chromatographique à l'lhydroxocobalamine de pureté teclnique, et après avoir effectué une élution de la colonne chromatographique au moyen d'un solvant organique soluble dans l'eau, on traite l'éluat ainsi obtenu par un acide fort pour former un sel acide d'hydroxocobalamine et on soumet ce sel à un passage successivement sur deux résines échangeuses d'ions, la première étant une résine neutre qui retient les impuretés salines en laissant passer l'hydroxocobalamine, et la seconde une résine basique, qui fixe l'acide en régénérant l'hydroxocobalamine.
La chromatographie est réalisée de préférence en envoyant sur une colonne d'alumine une dissolution d'hydroxocobalamine, de pureté technique dans une solution aqueuse d'un solvant préféré (acétone, dioxane, tétrahydroiFurane), la concentration du solvant étant comprise entre 75 oxo et 85 0/o, avantageusement 80 O/o.
L'élution est effectuée en utilisant une solution aqueuse du même solvant que pour la chromatographie, mais avec une teneur en eau plus forte, par exemple comprise entre 40 et 80 /0.
L'hydroxocobalamine obtenue après l'élution a un pH d'environ 7.
Elle est acidifiée par un acide fort tel que HCl ou H2SO4 de façon que le pH de la solution descende entre 1, 2 et 3. On forme ainsi un sel dthydroxo- cobalamine (chlorhydrate, sulfate par exemple). Ce sel est séparé par cristallisation et les cristaux ainsi obtenus sont réunis en solution aqueuse. On obtient ainsi une solution de chlorhydrate ou de sulfate d'hydroxocobalamine, dont le pH est de 3,5 à 4 environ.
Cette solution est ensuite envoyée sur les résines purificatrices.
La première résine échangeuse d'ions utilisée est du type neutre. Elle peut être obtenue en polyméri sant . un monomère anionique dans les pores d'une résine échangeuse anionique (ou basique) ou encore par polymérisation d'un monomère cationique dans une résine échangeuse cationique (ou acide).
Le polymère linéaire résultant est bloqué à l'intérieur de la résine échangeuse qui se trouve ainsi réticulée. On obtient un produit stable, physiquement et chirniquement, comportant des échangeurs anioniques et cationiques, mélangés à l'échelle moléculaire.
Des résines de ce genre sont généralement dési guées par l'expression résines à retardement d'ions , du fait que l'écoulement des ions dans la colonne de filtrage est retardé en raison des propriétés d'adsorption ioniques de la résine.
Dans le cas de l'invention cette résine fixe les sels neutres entraînés par lEhydroxocobalamine et elle peut être régénérée par simple lavage à l'eau purifiée.
La résine basique ou anionique comporte de préférence un groupe actif de base forte. Elle peut être préparée, par exemple, à partir d'amines aromatiques et de phénol. On peut également utiliser des résines du type polystyrène ammonium quaternaire. Ces résines peuvent être régénérées par passage à contrecourant d'une solution diluée fraîche de composés basiques (soude, ammoniac, etc.) et lavage ultérieur.
Le fait d'utiliser une résine basique forte après la résine neutre est contraire à la pratique Ide laboratoire connue consistant à utiliser la filtration sur la résine neutre à la fin des opérations.
Les résines sont de préférence introduites dans des colonnes superposées qui sont traversées successivement par la solution à purifier. Chacune de ces colonnes comporte un fond poreux pour retenir les grains de la résine.
L'exécution du procédé est contrôlée par le pH de la solution recueillie après la dernière colonne qui doit être au moins égal à 7. Pour éviter la rétention d'une trop grande quantité de produit dans les colonnes, on peut pousser la solution après son introduction, en envoyant à la suite de l'eau déminéralisée.
Le liquide obtenu à la sortie des colonnes peut être à nouveau cristallisé par addition d'un solvant préféré. Les cristaux formés sont recueillis par filtration, lavés par un solvant préféré ou à l'éther, puis séchés. On peut ainsi obtenir un produit de concentration au moins égale à 95 /o.
On va maintenant décrire Ide façon plus détaillée certaines modalités pratiques du procédé. On supposera, pour fixer les idées, que lthydroxocobalamine a été préparée en utilisant de l'hydrogène naissant obtenu par contact d'une solution acide de cyanocobalamine avec du zinc granulé.
La solution aqueuse d'hydroxocobalamine brute doit d'abord être débarrassée des sels solubles de zinc qu'elle contient. A cet effet, on transforme ces sels en hydroxyde de zinc insoluble par action d'une base minérale telle que NaOH, NH4OH, Ba(OH)2, en portant le pH de la solution à une valeur supérieure ou égale à 8,5. On filtre pour éliminer l'hydroxyde de zinc qui s'est précipité, et on évapore sous vide à sec le filtrat. Le résidu, repris par une petite quantité d'alcool méthylique, donne une solution rouge. On filtre, puis on évapore le filtrat pour obtenir l'hydroxocobalamine brute.
On dilue ensuite la solution aqueuse obtenue, en ajoutant l'un des solvants organiques suivants, solubles dans l'eau ; tétrahydrofurane, dioxane ou acétone.
La quantité de solvant ajoutée est telle que la solution obtenue contienne de 75 à 85' /o de solvant organique pour 25 à 15 /o ! d'eau. On utilise en général un mélange 80/20. Ce mélange dissout suffisamment la cyanocobalamine ou l'hydroxocobalamine pour permettre la préparation de la solution à utiliser.
Cette solution est alors soumise à une chromato- graphie sus une colonne d'alumine après avoir ajusté le pH de la solution et celui de la colonne à la meme valeur 7. L'alumine retient plus fortement l'hydroxocobalamine que la cyanocobalamine, l'enlève de la solution et la fixe à un niveau différent de la cyanocobalamine.
Pour éluer, c'est-à-dire pour retirer ensuite l'hydroxocobalamine qui a été fixée sur l'alumine, on utilise une solution comprenant le même solvant, mais dont la teneur en eau a été augmentée. On met ainsi à profit la solubilité plus grande Ide l'hydroxo- cobalamine, l'adsorption, du produit sur l'alumine n'étant plus suffisante pour retenir le produit fixé.
On utilise, en général, pour l'élution, des solutions contenant 50 /o de solvant et 50 o d'eau, mais on peut utiliser des solutions contenant de 20 à 60 % de solvant, et donc de 80 à 40 o/o d'eau.
Plus la teneur en eau est faible, plus l'extraction du produit de la colonne d'alumine est longue, mais en revanche les séparations entre les divers produits adsorbés sont plus nettes.
Conformément à l'invention, la fraction d'éluat contenant l'hydroxocobalamine à la sortie de la colonne d'alumine, est acidifiée par un excès d'acide fort convenablement choisi (HCl, H2SO4, etc.) de sorte que le pH de la solution est amené entre 1 2 et 3. Puis la solution est additionnée de 9 volumes du solvant utilisé pour l'opération précédente. En présence de l'acide, l'hydroxocobalamine qui pré- sente des propriétés basiques, forme un sel (dldor- hydrate ou sulfate) qu'on laisse cristalliser à une température comprise entre 5 et 100 C, et on obtient des cristaux rouges du sel d'hydroxocobalamine, qui sont isolés par filtration, puis lavés à l'acétone et à l'éther.
Ils sont ensuite redissous dans l'eau distillée, et cette nouvelle solution est alors passée sur une colonne de résine neutre capable de fixer les impuretés, tout en laissant passer le sel d'hydroxocobalamine.
Par exemple, cette résine peut être l'une de celles connues sous la marque de fabrique Retardion et vendues par la firme The Dow Chemical Company, Midland, Michigan.
Une telle résine est constituée par des grains très fins, qui peuvent être placés sur une couche de 10 à 50 cm de haut environ. La filtration est effectuée à température ambiante avec un débit d'environ 3 ml/minute.
La résine retient les sels entraînés avec l'hydroxocobalamine mais sans fixer complètement ceuxmoi, ce qui permet de régénérer la résine par lavage ultérieur à l'eau.
On vérifie l'absence de sels par des prélèvements du filtrat. Par exemple, si l'acidification a été effectuée par H2SO4, on contrôle l'absence de chlorures libres dans la solution.
La solution ayant subi cette première, purification par résine neutre passe ensuite sur une colonne contenant une résine basique échangeuse d'ions, qui par conséquent arrête les ions acides. Cette dernière colonne retient les ions chlore ou sulfate combinée à la cobalamine et régénère ainsi l'hydroxocobalamine qui reste en solution à la sortie de la colonne.
On peut utiliser une résine échangeuse d'anions fortement basique, constituée par exemple par des particules sphériques de 300 à 900 microns d'un copolymère de styrène et divinylbenzène possédant des radicaux ammonium quaternaires. Le débit horaire pour une telle résine est de préférence compris entre 0,5 et 1,5 m0 par m2 de résine.
Cette résine peut être régénérée par 50 à 80 g de soude caustique en solution à 5'0/o par litre de résine.
Des résines basiques fortes Ide ce genre sont des produits industriels usuels.
L'hydroxocobalamine, peut être identifiée par les tests classiques : chromatographie, coefficient de partage entre l'alcool benzylique et l'eau, courbes de titrage acidimétrique ou spectrographie.
Des méthodes particulières dont il sera question plus loin peuvent être utilisées pour contrôler la pureté de l'hydroxocobalamine obtenue après le traitement conforme à l'invention.
Exemple I - Exemple témoin:
On a préparé comme suit l'lhydroxocobalamine à purifier:
On dissout 0, 20 g de cyanocobalamine dans 50 cm3 d'une solution décinormale d'acide chlor- hydrique. Cette solution est passée sur une colonne de 40 g de zinc métallique granulé (500 à 1400 microns). Lorsque toute la solution a été introduite et passée sur la colonne, on lave cette Idernière deux fois de suite avec 10 orn3 d'eau distillée.
On recueille les liquides dans un flacon où barbote un courant d'air pendant toute l'opération.
L'oxydation par l'air est poursuivie pendant 10 minutes après réception de la dernière eau de lavage. La solution est alors rouge rubis.
Le pH de cette solution est ajusté à 8,5 par addition d'une solution décinormale de soude caustique pour précipiter Ie zinc. On filtre. On ramène le pH de la solution à 7. On a tainsi 70 cc de solution environ, auxquels on ajoute 280OC de tétrahydrofu- rane, et l'on passe sur une colonne d'alumine chromatographique de 30 mm de diamètre et 120 mm de haut. La durée de passage est de 1 heure. Cette alumine a été au préalïable tamponnée au pH 7. L'élution est effectuée au moyen d'un mélange à parties égales d'eau et de tétrahydrofurane.
On recueille la portion colorée, soit 50 cc, riche en hydroxocobalamine.
Cette fraction est additionnée de tétrahydrofurane de façon à n'avoir que 10 /o d'eau, puis on amorce la cristallisation avec quelques cristaux d'hydroxocobalamine, et on laisse cristalliser entre 5 et 100 pendant 24 heures.
Les cristaux sont recueillis par filtration, puis lavés à l'acétone et à l'éther, et séchés sous vide à la température ambiante. On obtient ainsi 0,15 g de cristaux représentant sensiblement 0,12 g d'hydroxo- cobalamine pure soit une pureté de 806/o.
Exemple Il:
On opère comme pour l'exemple I jusqu'à la sortie de la colonne d'alumine.
L'éluat riche est acidifié jusqu'à un pH de 1,2 au moyen d'un excès d'acide chlorhydrique, puis on y ajoute du tétrahydrofurane de façon à n'avoir au maximum que 10 e/o, d'eau dans la solution. On laisse cristalliser entre 5 et 100 C.
Les cristaux rouges de chlorocobalamine formés sont recueillis par filtration et lavés à l'acétone et à l'éther.
On dissout ces cristaux dans l'eau distillée à raison de 50 cm3 d'eau pour 0,20 g de cristaux.
La solution ainsi obtenue est passée sur deux
colonnes superposées. Tout d'abord, sur une première colonne à résine dénommée Retar, dion de la firme Dow CheminaI Company (Retardion ll A 8) de 25 mm de diamètre et de 100 mu de hauteur.
A la sortie de la première colonne, le liquide passe dans la seconde, de même taille, qui contient une résine basique forte, telle que celle dénommée
Dowex 2 de la Société Dow.
La vitesse de passage sur ces colonnes est réglée
à 2 cc/minute.
Lorsque le liquide commence à devenir rosé à la sortie de la 2e colonne, on recueille la solution.
Pendant toute la durée de l'opération, on envoie un
courant d'azote pur 'dans le flacon de réception pour
éviter l'action du gaz carbonique de l'air sur l'hy droxocobalamine.
On chasse ensuite la solutionemère retenue dans
la première colonne par un volume d'eau déminé
ralisée égal à celui retenu dans la colonne. Puis après
avoir démonté la première colonne, on chasse la solution retenue dans la seconde colonne par un volume égal (2 fois 10 cc d'eau déminéralisée).
Après addition de 9 volumes de tétrahydrofurane, au liquide recueilli, celuimci cristallise entre 5 et 100 C comme précédemment.
Les cristaux qui se sont formés sont recueillis par filtration, lavés à l'acétone et à l'éther et séchés sous vide.
On obtient ainsi 0, 12 g de cristaux, représentant sensiblement 0,115 g d'hydroxocobalamine pure, soit une pureté de 96/o.
Exemple ICI :
Une solution de 32 g d'hydroxooebalamine brute préparée par voie acide est ajustée à un pH de 7.
On a 9 litres de solution. On ajoute 36 litres d'acétone, et on passe sur une colonne d'alumine chromatographique de 120mm de diamètre et 300mm de haut, qui a été au préalable tamponnée au pH 7. Le passage est effectué en 8 heures. L'élution est effectuée au moyen d'un mélange à parties égales d'eau et d'acétone.
On recueille 4 litres de produit coloré riche en hydroxocobalamine.
L'éluat riche est acidifié jusqu'à un pH de 1,5 au moyen d'acide sulfurique, puis on ajoute de l'acétone de façon à avoir au maximum 10 % d'eau dans la solution.
On laisse cristalliser pendant 24 heures entre 5 et 100. Les cristaux rouges de sulfate d'hydroxocobalamine sont recueillis par filtration, et lavés à l'acétone et à l'éther. Ces cristaux sont dissous dans l'eau distillée à raison de 50 cm8 d'eau pour 0,2 g de cristaux, soit environ 7,5 litres au total.
La solution ainsi obtenue est passée en 3 heures environ sur deux colonnes, d'abord une colonne à résine dénommée Retardion 11 A 8 , puis une colonne à résine dénommée Amberlite IRA 400 de la firme RolDm & Haas, Plhiladelphie. Ces deux colonnes ont 600 mm de diamètre et 250 mm de haut.
A la sortie des colonnes, le liquide rosé est recueilli sous azote. On ajoute 9 volumes d'acétone,
et on cristallise pendant 24 heures entre 0 et 100.
Les cristaux formés sont recueillis par filtration, lavés
à l'acétone et à l'éther, puis séchés sous vide. On obtient 26 grammes d'hydroxocobalamine représentant
25 g de produit pur, soit une pureté de 96 %.
L'hydroxocobalamine purifiée par le procédé
conforme à l'invention se présente sous forme de cristaux rouge sombre, solubles dans l'eau et dans l'alcool, insolubles dans le chloroforme, l'éther et l'acétone.
Cette hydroxocobalamine est stable à pH 8 en solution aqueuse, sans addition de stabilisateurs ou de tampons, ce qui prouve sa grande pureté. Celle
ci est d'ailleurs démontrée aussi par la courbe de
pH, par les titrages biologiques (sur souches dans des milieux carencés en vitamine B 12 b), ou aussi par spectrographie optique.