Récipient pour la conservation d'une substance biologique à basse température
La présente invention a pour premier objet un récipient pour la conservation d'une substance biologique à basse température. Un tel récipient peut servir au refroidissement rapide, à l'emmagasinage et au chauffage rapide de substances biologiques telles que le sang, la moelle osseuse, des suspensions de cellules et des fluides biologiques.
On sait qu'un emmagasinage à long terme d'une substance biologique est possible à des températures suffisamment basses pour inhiber l'activité biologi- que et chimique de la substance. Toutefois, un emmagasinage à ces températures pose de nombreux problèmes parmi lesquels ceux relatifs aux caracté- ristiques de transfert de chaleur, à la facilité de stéri lisation et à la récupération d'un contenu qui ne doit pas avoir subi de dommage après l'emmagasinage. En outre, les matériaux de construction de tels récipients sont limités aux matériaux facilement stérilisables, capables de conserver leur stérilité et non toxiques pour les substances biologiques.
Le récipient faisant l'objet de la présente invention est caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux parois ondulées parallèles et jointes à leurs extrémités opposées par d'autres parois de manière à former un espace clos entre lesdites parois ondulées pour emmagasiner la substance biologique et des organes d'ouverture communiquant avec ledit espace clos pour permettre le passage stérile de la substance biologique, les parois étant construites avec un matériau présentant un rapport K/L supérieur à 0, 34 où
K est la conductibilité thermique en cal/s. cm C et L l'épaisseur du matériau en cm.
Le dessin annexé représente, à titre d'exemple, deux formes d'exécution du récipient objet de l'in- vention.
La fig. 1 est une vue, par-dessus partiellement en coupe, de la première forme d'exécution.
La fig. 2 est une vue frontale correspondant à la fig. 1.
La fig. 3 est une vue par-dessus, partiellement en coupe, de la seconde forme d'exécution.
La fig. 4 est une frontale correspondant à la fig. 3.
La fig. 5 est une coupe correspondant à celle de la fig. 1 à plus grande échelle montrant une substance biologique congelée dans ladite forme d'exécution.
Dans le cas de la conservation du sang, par exemple, les caractéristiques de transfert de chaleur doivent être telles que tout le sang contenu dans le récipient puisse être refroidi et réchauffé dans le domaine critique compris entre 00 C et-50 C dans un temps très court, ordinairement de l'ordre de dix secondes. En outre, le récipient doit être conçu de manière que les 70 11/o au moins des globules rouges du sang emmagasiné puissent être récupérés après l'emmagasinage en utilisant les additifs connus pour l'emmagasinage du sang, par exemple le lactose, la polyvinylpyrrolidone (PVP) ou un citrate-dextrose acide (ACD).
Des caractéristiques de transfert de chaleur très favorables pendant le refroidissement et la décongé- lation subséquente sont obtenues en congelant initialement le sang en coquille dans le récipient d'emma- gasinage. Une telle congélation assure l'utilisation maximum de la surface de transfert de chaleur disponible du récipient, quel que soit le degré de remplissage de ce dernier, puisque la coquille de sang congelé se forme sur toute la surface de la paroi inté rieure du récipient. On peut choisir différents degrés de remplissage du récipient avec la substance biologique, selon l'épaisseur désirée de la coquille et les con sidérations biologiques particulières propres à chaque application.
Une coquille congelée est obtenue le plus avan tageusement en secouant le récipient partiellement rempli pendant l'immersion dudit récipient dans le bain réfrigérant. L'épaisseur de la coquille formée est fonction de la surface disponible du récipient et du volume de sang ou autre substance biologique placée dans le récipient. L'épaisseur de coquille maximum permise pour une substance biologique congelée est fonction de ses caractéristiques de transfert de chaleur.
Pour obtenir une récupération des globules rouges de 85 à 90% après refroidissement de tout le sang mélangé avec des additifs tels que le lactose ou le glucose et avec un anticoagulant, il est nécessaire de maintenir une vitesse de refroidissement d'au moins 10 C/s après le changement de phase et dans le domaine de températures compris entre 00 C et -SOo C. Cela veut dire que l'épaisseur de la coquille de sang congelé dans le récipient ne doit pas dépas- ser 5 mm. De même, si la vitesse de refroidissement est connue pour toute autre substance biologique, l'épaisseur maximum permise de la coquille peut être déterminée.
Un avantage important de la congélation d'une substance biologique en coquille dans le récipient est de permettre des vitesses de refroidissement et de réchauffement pratiquement uniformes pour toute la masse de la substance biologique congelée. Plus la coquille congelée est mince, plus la variation de température à travers la coquille est petite pendant la congélation et la décongélation.
On a trouvé que pour améliorer encore les caractéristiques de transfert de chaleur pendant la congéla- tion et la décongélation d'une substance biologique, il est avantageux que le récipient présente : a) un rapport relativement élevé de la surface de
transfert de chaleur au volume de la substance
congelée, et b) des dimensions physiques telles qu'elles permet
tent la formation d'une coquille uniforme relati-
vement mince lors de la congélation et un trans
fert de chaleur efficace pendant la décongélation.
On a trouvé qu'un récipient ondulé satisfait aux exigences physiques exposées ci-dessus. Dans une forme d'exécution préférée, les ondulations de chaque paroi présentent un pas et une profondeur uniformes et sont disposées de manière que les sommets de l'ondulation d'une paroi soient alignés avec les creux de l'ondulation de la paroi opposée. Cet alignement assure un obstacle minimum à l'écoulement du liquide dans le récipient pendant que ce dernier est secoué, alors même que la direction d'écoulement est constamment modifiée. Quand le récipient est immergé dans un bain réfrigérant et secoué, les ondulations agissent comme des chicanes dirigeant la substance biologique contre toutes les surfaces de transfert de chaleur.
Cette action de chicane entraîne une distribution uniforme de la substance sur toutes les surfaces de congélation et par conséquent une utilisation plus efficace de ces surfaces. En outre, on a trouvé que la fréquence et l'amplitude des. secousses transmises au récipient sont moins critiques pendant la formation de la coquille si l'alignement des ondulations se fait en opposant les sommets et les creux comme indiqué ci-dessus.
On a trouvé que le pas et la profondeur des on dulations sont importants pour la. production d'une coquille congelée uniforme. Le pas des ondulations est défini comme étant la distance des sommets successifs dans la paroi ondulée. La profondeur est la distance entre un sommet et un creux de la paroi ondulée. Pour obtenir une coquille relativement uniforme, on utilise de préférence un pas d'au moins 15, 87 mm et une profondeur inférieure de 9, 52 mm.
Des pas inférieurs à 15, 87 mm et des profondeurs suprieures à 9, 52mm entrainent la formation d'une coquille congelée non uniforme qui est plus large autour des sommets et plus étroites autour des creux.
Les ondulations peuvent être du type en dents de scie ou de forme sinusoidale. On a remarqué que des ondulations sinusoïdales donnent l'épaisseur de coquille la plus uniforme.
L'épaisseur du récipient est limitée par la dimen- sion de l'appareil à secouer et par l'épaisseur désirée pour la coquille. Une épaisseur satisfaisante de la section droite du récipient peut être comprise entre 19, 05 et 50, 8 mm. L'épaisseur préférée pour cette section, soit la largeur du point de vue de la manutention et de l'emmagasinage, est de 25, 4 mm.
On a déterminé que pour obtenir une bonne agitation en secouant le récipient pendant la congélation et la décongélation, le volume de la substance biologique dans le récipient ne doit pas dépasser les 60 0/o du volume total du récipient. Comme indiqué plus haut, le rapport de la surface de transfert de chaleur au volume de la substance doit être aussi élevé que possible. Dans un récipient donné, une réduction du remplissage augmente ce rapport. Cependant, un plus petit volume ou un remplissage plus faible augmente l'espace vide dans le récipient congelé. Cette augmentation de l'espace vide entraîne une augmentation considérable de la production de mousse pendant l'agitation avant que la congélation et la formation de la coquille soient achevées.
L'entraînement d'air dans le mélange sanguin congelé produit une diminution du retrait de chaleur et détermine par consé- quent un niveau de remplissage minimum pour le récipient. Le niveau de remplissage préféré est compris entre 40 et 60 10/o du volume du récipient.
Les récipients représentés aux fig. 1 à 4 comprennent deux parois ondulées 10 dont les ondulations sont sinusoidales pour la première forme d'exé- cution (fig. 1 et 2) et en dents de scie pour la seconde forme d'exécution (fig. 3 à 5). Les deux parois 10 sont parallèles et sont jointes par des parois 12 de manière à définir un espace d'emmagasinage clos 14 pour la substance biologique. Les ondulations des parois sont disposées de manière que les sommets 22 de l'ondulation d'une paroi soient alignés avec les creux 24 de l'ondulation de l'autre paroi. Des organes d'ouverture 16 communiquent avec l'espace 14 pour permettre de remplir et de vider stérilement le récipient. La profondeur des ondulations est désignée par la lettre a aux fig. 1 et 3 et le pas des ondulations par la lettre b.
La fig. 5 montre le récipient représenté aux fig.
3 et 4 après qu'il a été partiellement rempli de sang total et d'additifs, et secoué après immersion dans un liquide réfrigérant, par exemple de l'azote liquide. Le sang a formé des coquilles 18 pratiquement uniformes dans l'espace d'emmagasinage 14 et contre les parois ondulées 10. Un vide central 20 se forme entre les coquilles 18.
On a trouvé que les matériaux appropriés à la construction des récipients décrits doivent présenter un rapport K/L supérieur à 0, 34, où K est la con ductibilité thermique en cal/s cm oC et L l'épaisseur du matériau en cm. Si le rapport K/L estinférieurà 0, 34, la chaleur ne peut être introduite ni retirée à travers les parois du récipient à une vitesse suffisamment rapide pour éviter la détérioration de la substance biologique. Ce point est d'une importance capitale pour la conservation à basse température du sang total.
Le matériau de construction doit non seulement présenter la valeur requise du rapport K/L, mais il doit être en outre non toxique pour la substance biologique emmagasinée. On utilise de préférence le magnésium, l'aluminium et l'acier inoxydable. Le ma gnésium et l'aluminium donnent pratiquement les mêmes résultats, tandis que l'acier inoxydable est légèrement inférieur. On a essayé le cuivre, mais ce dernier s'est révélé toxique. En outre, on peut utiliser des matériaux non métalliques comme les matières plastiques qui se sont montrées satisfaisantes en ce qui concerne la rigidité, la stérilité et les caractéristi- ques de transfert de chaleur. Pour des récipients mé- talliques, on peut utiliser une épaisseur de paroi comprise entre 0, 178 et 1, 25 mm.
Cependant, il est évi- dent que l'épaisseur minimum capable d'assurer une rigidité satisfaisante au récipient doit être préférée, par le fait qu'elle donne la plus haute valeur du rapport K/L.
Avec le récipient décrit, utilisé pour la conservation d'une masse d'une substance biologique, la chaleur doit être transférée à travers des parois pleines vers un réfrigérant en ébullition. Outre le choix du matériau de construction, la vitesse de transfert de chaleur peut être augmentée en modifiant la différence de température de manière à placer le récipient dans une région d'ébullition instable. On y parvient en disposant entre un solide et un liquide à son point d'ébullition une matière présentant une conductibilité thermique suffisamment faible pour régler la variation de température entre la surface en ébullition et le liquide à une valeur qui permet une plus grande vitesse de transfert de chaleur.
Le solide est de préférence en métal, et mieux un métal bon conducteur, de manière que la résistance au courant de chaleur à travers la masse d'une paroi soit minimisée.
La matière isolante peut être toute substance chimique chimiquement et thermiquement stable dans le domaine de température envisagé et présentant une conductibilité thermique inférieure à celle du matériau constituant le récipient d'emmagasinage. La con ductibilité thermique de la matière isolante est de préférence inférieure à 0, 0006 cal/s cm oC. La matière isolante doit être suffisamment épaisse pour régler la variation de température entre la surface d'ébullition et la température de saturation du réfri- gérant liquide à une valeur pour laquelle il se produit un transfert de chaleur plus efficace.
L'épaisseur d'un tel film isolant est fonction de sa conductibilité thermique, de l'épaisseur et de la conductibilité de la paroi du récipient et des caractéristiques d'ébullition du réfrigérant liquide.
Pour déterminer l'effet de minces revêtements isolants sur l'ébullition à partir d'un solide dans des conditions instables, on immerge brusquement dans de l'azote liquide bouillant à-1960 C, un cylindre d'aluminium d'un diamètre de 9, 525 mm et d'une longueur de 25, 4 mm, avec et sans revêtement isolant.
On place un thermocouple au centre du cylindre d'aluminium et on le relie à un enregistreur de température qui enregistre la température de l'axe en fonction du temps. On enregistre le temps nécessaire pour refroidir les cylindres d'aluminium de 25o C à -1960 C. Le cylindre nu demande 55 secondes, tandis que 14 secondes suffisent pour refroidir un cylindre identique isolé avec une vaseline de pétrole d'une épaisseur de 0, 10 mm.
D'autres revêtements pelliculaires isolants sont appliqués sur les cylindres d'aluminium et on enregistre le temps nécessaire pour le refroidissement de 25o C à-196 C dans de l'azote liquide. Les résultats sont donnés dans la table I.
Voir tableau I, page 4.
Table 1
Temps pour refroidir un cylindre d'aluminium de 9, 525 mm de diamètre et de 25, 4 mm de longueur de 25 C-à-196 C.
Temps de refroidissement
en secondes
1. cylindre nu. 55
2. cylindre canelé, sans revê-
tement 40
3. adhésif Poxalloy 0, 04 mm 40
4. adhésif Poxalloy ¯ 0,23 mm 28
5. adhésif Poxalloy o 0, 75 mm 25
6. vernis clair 0, 04 mm 29
7. vernis clair 0, 10 mm 20
8. caoutchouc vulcanisé 0, 04 mm 26
9. caoutchouc vulcanisé 0, 23 mm 15 10. paraffine ordinaire 0, 025 mm 36 11. paraffine ordinaire 0, 27 mm 23 12. paraffine ordinaire 0, 34 mm 26 13. paraffine de caoutchouc
0, 028 mm 38 14. parafine de caoutchouc
0, 28 mm 17 15. paraffine de caoutchouc
0, 39 mm 19 16. ruban de papier cache 0, 30 mm 19 17. ruban de papier cache 0, 60 mm 32 18.
ruban de papier cache 0, 90 mm 33 19. ruban de caoutchouc
d'électricien 0, 1, mm. 18 20. ruban de caoutchouc
d'électricien 0, 33 mm 26 21. ruban de caoutchouc
d'électricien 0, 50 mm 32 22. vaseline 0, 01 mm 36 23. vaseline 0, 025 mm. 24 24. vaseline 0, 05 mm 21 25. vaseline 0, 10 mm 14 26. vaseline 0, 15 mm 13, 5 27. vaseline 0, 20 mm 14 28. vaseline 0, 25 mm 16 29. vaseline 0, 37 mm 17 30. vaseline 0, 45 mm 20 31.'amiante 0, 25mm 42 32. amiante 0, 95 mm 64 33. silicate de sodium 0, 11 mm 33 34. silicate de sodium 0, 17 mm 30 35.
kaolin 0, 11 mm 38 36. plâtre de Paris 0, 19 mm 10
Le refroidissement rapide des substances biologi- ques est obtenu en immergeant les récipients dans un bain fluide cryogénique. Le fluide approprié à cet usage doit être suffisamment froid pour congeler la substance biologique et, évidemment, assurer une dif férence de température entre la substance biologique et les surfaces de transfert de chaleur compatible avec la rapidité de transfert de chaleur désirée. Dans le cas du sang, par exemple, il faut que le réfrigé- rant presentz une tamperatuxe de-120 C pau, r assu- rer une récupération satisfaisante des globules rouges du sang.
On préfère utiliser comme réfrigérant l'azote liquide car il présente l'avantage d'être relativement inerte, sans danger au cours de la manipulation et relativement bon marché. Il présente aussi un point d'ébullition extrêmement bas,-196 C à la pression atmosphérique. Cependant, on peut utiliser d'autres réfrigérants liquides, notamment l'air liquide, l'hélium liquide, le néon liquide, l'argon liquide, le kryp- ton liquide et une solution saturée de glace sèche dans de l'alcool méthylique.
L'azote liquide et les autres réfrigérants à bas point d'ébullition sont des fluides saturés à la pres sion atmosphérique et ils bouiZent violemment quand un objet chaud tel qu'un récipient contenant du sang y est plongé. Le transfert de chaleur dépend de la différence de température AT entre le fluide et l'objet chaud. Pour de très hautes valeurs de AT, un film de vapeur se forme autour du récipient chaud, entramant un très faible transfert de chaleur. Ce film de vapeur diminue et devient moins stable si AT di- minue et le transfert de chaleur est amélioré. Pour une différence AT de 30 C (pour l'azote liquide), le transfert de chaleur maximum est atteint et s'annule quand AT est réduit à zéro.
En tenant compte de ce schéma de transfert de chaleur en fonction de AT, il apparaît qu'une vitesse de transfert beaucoup trop basse serait atteinte si un récipient d'emmagasinage de sang à 25 C était plongé soudainement dans de l', azote liquide à-196 C. Cependant, l'application des revêtements indiqués plus haut sur les parois externes du. récipient permet de refroidir très rapidement la surface en contact avec l'azote liquide et assure une valeur de AT proche de 30 C.
Pour décongeler un récipient de sang congelé, il est nécessaire à nouveau de passer par la région de température critique à partir de-50 C pour obtenir la fusion la plus rapide possible. Malheureusement, il s'introduitunelimitationsupplémentaire en ce sens que le sang est rapidement et irréversiblement enr- dommagé à des températures supérieures à 500 C. Il s'ensuit que la température du fluide utilisé pour effectuer cette congélation ne doit pas dépasser nota blement cette température. On utilise de préférence l'eau comme milieu de décongélation, mais on peut utiliser aussi d'autres méthodes, par exemple une décongélation par énergie à haute fréquence.
Les résultats expérimentaux obtenus en congelant 293 cm3 de sang total sont donnés dans la table II. Le'récipient a une hauteur de 16 cm, une longueur de 18 cm et une épaisseur de section droite de 25 cm. Les deux parois opposées les plus grandes du récipient présentent des ondulations, en dents.
de scie et sont disposées asymétriquemont. Chaque paroi présente un pas d'ondulation de 16 mm et une profondeur de 6, 5 mm Le récipient est recouvert d'un mélange composé de 25 4/0 de'gtycérol, 25"/e de mé thanol et 50 ego de Santocel 54 (marque déposée) qui est un aérogel de silice léger, poreux, déshydra- tysé et fortement absorbant pour les huiles (Mon- santo Chem. Co).
Le récipient est rempli avec 293 coma de sang total et des additifs protecteurs, et immergé dans un bain d'azote liquide puis secoué à une ±réquence de 200cycles/mn avec une amplitude de 12, 7mm et pendant 45 secondes. Le récipient est décongelé en l'immergeant dans de 1'eau à 450 C et en le secouant à une fréquence de 200 cycles/mn avec une amplitude de 12, 7 cm et pendant 45 secondes. La table II montre le pourcentage de globules rouges récupérés.
Table 11 expérience /o de globules rouges récupérés
1 95, 0
2 94, 0
3 95, 3
4 94, 9
5 95, 2
Exemple 2
La table III donne les résultats obtenus en congelant 465 et 490 cm3 de sang total dans un récipient à ondulations sinusoidales. Le récipient utilisé pour congeler les 465 cm3 de sang total présente une hauteur de 22, 86 cm, une longueur de 20, 95 mm et une épaisseur unifomme en section droite de 1, 905 cm.
Les 490 cm3 de sang total sont congelés dans un récipient de même hauteur et de même longueur que le précédent, mais d'une épaisseur uniforme en section droite de 2, 38 cm. Les deux parois opposées les plus grandes des récipients présentent des ondulations si nusoidales et sont disposées asymétriquement. Chaque paroi présente un pas d'ondulation de 3, 17 cm et une profondeur de 0, 63 cm. Les deux récipients sont recouverts du mélange glycerol-méthanol-San- tocel 54 de l'exemple 1.
Le processus de congélation est similaire à celui utilisé dans l'exemple 1 et la récupération des glo- bules rouges est la suivante :
Récupération Volume Age du sang en 0/,
congelé cm3 jours des globules
rouges
1 465 0 89, 9
2 465 3 85, 9
3 465 13 84, 5
4 465 13 83, 3
5465090, 2
6 465 0 86, 2
7 465 0 89, 8
8 465 0 91, 2
9 490 0 88, 9 10 490 1 90, 1 11 490 1 84, 2 12 490 1 87, 0