Procédé de conservation de substances biologiques et appareil pour la mise en oeuvre de ce procédé La a présente invention concerne la technique de la conservation n à basse température de substances biologiques. Plus particulièrement, l'invention concerne les procédés et les appareils pour le refroidissement rapide, le stockage et le réchauffement rapide de substances biologiques telles que sang, moelle osseuse, autres sus, pensions de cellules et fluides biologiques.
La préservation des substances biologiques contre les altérations en cours de stockage a posé constamment un problème pour les savants. Le problème est particulièrement aigu dans le cas du sang. L'entretien de banques de sang et l'avantage du stockage de sang entier en énormes quantités en vue de son emploi lors de catastrophes crée le besoin impératif d'un procédé pour la conservation prolongée de sang stocké. Aucun procédé ou appareil employé précé- demment ne s'est montré entièrement satisfaisant pour la conservation et le stockage prolongé de lots de 1/2 1 de sang entier transfusable.
Dans le cas du sang, les constituants vivants principaux sont les érythrocytes ou globules rouges du sang. Le problème de la conservation du sang entier est donc fondamentalement lié à la conservation des globules rouges. Les globules rouges ont la forme de plaquettes rondes et contiennent un cytoplasme de type spécial enfermé dans une membrane semi-perméable. Cette membrane assure l'intégrité du contenu protéique et électrolytique du cytoplasme enfermé.
La membrane est duotile mais essentiellement non élastique, et il existe donc un volume critique du globule rouge au-delà duquel la membrane est endommagée. Cette altération de la membrane provoque la libération du constituant porteur d'oxygène des érythrocytes, c'est-à-dire l'hémoglobine, dans le plasma sanguin, où il ne peut pas exercer sa fonction de porteur d'oxygène et d'anhydride carbonique.
La quantité d'hémoglobine libérée par un nombre donné de globules est une mesure de l'efficacité des divers procédés de conservation du sang. Plus la quantité d'hémoglobine libérée est faible, plus le procédé et/ou l'appareil est efficace pour conserver les globules.
Normalement, c'est-à-dire dans le système circulatoire du corps, les globules rouges ont une durée de vie d'environ 100 à 120 jours. Ils se détériorent par contre beaucoup plus rapidement en dehors du corps. L'une des altérations affectant le sang en dehors du corps est le phénomène de la coagulation.
Pour le stockage du sang, il est essentiel d'éviter la coagulation. A cet effet, on ajoute des ions citrate, oxalate ou fluorure qui inhibent les changements chimiques, tels que l'interaction des ions calcium avec certains composants, qui aboutit ordinairement à la coagulation. La coagulation n'est cependant pas la seule difficulté intervenant dans la oonservation du sang.
Le globule rouge a son propre métabolisme d'entretien et ses processus métaboliques se poursuivent en dehors du corps jusqu'à ce que la réserve de sucre sanguin soit épuisée par transformation en acide lactique. A ce moment, les substances et processus qui sont essentiels à la conservation de la structure cellulaire sont épuisés. En outre, le pH du plasma diminue jusqu'à un niveau défavorable, par accumulation d'acide lactique. Dans le sang prélevé, l'équilibre osmotique entre la matière intracellulaire et la ma tière extracellulaire est t rapidement détruit et l'eau du plasma diffuse dans la cellule en provoquant un gonflement anormal et finalement la rupture de la membrane. Ces changements se produisent rapidement à la température ordinaire et aux concentrations courantes de citrate et de glucose.
Ordinairement, pour préserver le sang vis-à-vis des altérations mentionnées ci-dessus, on recueille le sang d'un donneur dans une solution acide de citrate et de dextrose, après quoi on refroidit entre 4 et 60 C. Ce procédé ne permet toutefois qu'environ trois semaines de conservation sûre du sang. A la fin de cette période, les processus de dégradation ont progressé jusqu'à un point auquel l'efficacité fonctionnelle des cellules sanguines a décliné en dessous d'un niveau acceptable. Comme chaque lot doit être remplacé toutes les trois semaines, il s'est avéré impossible de stocker le sang en grande quantité.
D'autres procédés ont été essayés, mais aucun de ceux-ci ne s'est montré apte au stockage en masse à l'échelle industrielle de sang humain entier en lots de 1/4 OU 1/2 1.
Pour stopper les processus de dégradation décrits ci-dessus, une méthode rationnelle consiste à abaisser la température du sang jusqu'à un point où le métabolisme est essentiellement arrêté. Cependant, il faut pour cela que le sang franchisse l'intervalle de température de la congélation. En l'absence d'additifs protecteurs pendant la congélation ou/et le dégel du sang, la membrane cellulaire est endommagée au point que les globules sont hémolysés.
Le sang a été congelé en masse ou en pellicule mince. Pour la congélation en masse, des produits chimiques protecteurs tels que le glycérol ont été employés en concentration atteignant 50 0/, pour protéger les globules rouges vis-à-vis des altérations dues à la cristallisation de la glace. Ces produits chimiques protecteurs doivent être éliminés du sang avant la transfusion, de sorte que ces produits de congélation en masse sont coûteux et prennent beaucoup de temps. En outre, les appareils et les opérations nécessaires pour séparer les produits chimiques protecteurs du sang sont compliqués et coûteux et ne se prêtent pas à la mise en oeuvre par les techniciens des hôpitaux. Us ne conviennent pas non plus au stockage en masse de sang transfusable.
Un autre procédé expérimental précédemment décrit utilise la polyvinylpyrrolidone comme agent protecteur pour la conservation du sang entier (Comptes Rendus des Sciences de la Soc. de Biologie, 149, 875, 1955). Ce procédé implique la congélation du sang avec 35 O/o de polyvinylpyrrolidone par immersion dans un bain de glace sèche. I1 n'a que peu d'intérêt en raison du grand volume de polyvinylpyrrolidone qui doit être employé, ce qui nécessite la séparation des globules rouges et leur remise en suspension dans du plasma neuf, avec risque de coagulation, de destruction physique, etc., des cellules.
On connaît d'autres procédés de congélation de produits alimentaires, de plasma sanguin et substances analogues sous forme de gouttelettes. En particulier, il existe un procédé de congélation de l'extrait de café, consistant à injecter le café dans un bain de trifluorotrichloroéthane et d'hexane normal à basse température (-500C). Dans ce procédé, le café est injecté à la base d'une colonne de bain congelant et monte par différence de densité jusqu'en un point de déchargement. Ce procédé ne convient pas pour la conservation du sang, car les hydrocarbures et les hydrocarbures halogénés provoquent l'hémolyse des globules rouges. En outre, l'injection du sang chaud directement dans un réfrigérant à basse température provoque la congélation du sang dans les buses d'injection et leur colmatage.
L'invention a donc pour but un procédé et un appareil pour le traitement et la conservation de substances biologiques, permettant notamment le stockage de sang entier en volume important pendant de longues durées sans altération sensible des globules rouges, ceux-ci récupérant rapidement leur état normal à la fin du stockage, sans qu'il soit nécessaire d'éliminer les additifs protecteurs après le dégel et avant la transfusion.
L'invention est basée sur la découverte que, lorsque des substances biologiques telles que le sang sont congelées et surrefroidies assez rapidement puis, après un stockage de durée quelconque, sont dégelées assez rapidement, l'intégrité biologique des substances peut être maintenue sans altération sensible.
Malheureusement, les vitesses de congélation et de dégel extrêmement élevées qui sont nécessaires pour éviter l'altération biologique ne peuvent pas être obtenues par les moyens connus, comme par exemple l'immersion d'un récipient de sang dans un bain d'azote liquide. Dans ce procédé connu, le taux de transmission de chaleur entre l'azote liquide et le récipient est de l'ordre de -1360 g.calories/(h)(cm de surface du récipient), jusqu'à ce que la température de la paroi interne du récipient soit abaissée jusqu'à environ-1750C, auquel point le taux de transmission de la chaleur augmente brusquement.
Cependant, le taux initial de transmission de la chaleur est trop faible pour une congélation rapide, par exemple sans réduction notable du pourcentage de récupération des globules rouges. On a trouvé que si le taux de transmission de chaleur est d'au moins 3800 g. oalories/(h) (cm2), et de préférence d'au moins 6520 g.calories/(h)(cm-'), pendant toute la phase de congélation, celle-ci peut être suffisamment rapide pour assurer des pourcentages élevés de récupération des globules rouges, de l'ordre d'au moins 85 O/o.
La présente invention a donc pour objet un procédé de conservation de substances biologiques, dans lequel on dispose ladite substance dans un récipient, on soustrait de la chaleur de la surface externe du récipient par mise en contact du récipient avec un réfrigérant pendant un temps suffisant pour congeler la substance biologique se trouvant dans le récipient, puis on stocke la substance congelée. Ce procédé est caractérisé en ce que l'on soutire la chaleur des parois du récipient à un taux d'au moins 3800 petites calories/(h)(cm2 de surface de récipient).
Cette soustraction de chaleur peut par exemple être effectuée au moyen d'un récipient revêtu d'une mince pellicule isolante, ayant un pouvoir isolant suffisant pour amener la différence de température entre la surface rejetant de la chaleur du solide revêtu et un milieu réfrigérant en ébullition à une valeur à laquelle une transmission de chaleur plus efficace apparaît. Le taux de transmission de chaleur peut être encore amélioré en appliquant une couche de matière pulvérulente sur la mince pellicule isolange mentionnée, qui sert alors de sous-couche.
On admet que la couche de matière pulvérulente augmente encore le taux de transmission de chaleur pour au moins deux raisons: premièrement, la discontinuité de la surface favorise la formation de bulles, et deuxièmement, les parties exposées des particules de la poudre se refroidissent rapidement, de sorte que l'ébullition en régime nucléé s'établit rapidement.
Par exemple, la glycérine convient tout particulière- ment comme matière pour former la mince pellicule isolante et la silice finement divisée s'est montrée particulièrement efficace pour former la couche de matière pulvérulente.
La glycérine est soluble dans l'eau; un procédé très efficace pour dégeler les substances biologiques congelées consiste en la mise en contact des parois du récipient avec de l'eau à une température de préférence inférieure à environ 55O C. La pellicule isolante et la couche pulvérulente sont de préférence enlevées par ce contact. Pour réaliser le dégel rapide qui est nécessaire, le récipient est de préférence construit en un matériau donnant une valeur K/L d'au moins 0,3375 (K = g.cal/(h)(cm)(0C) et L = épaisseur de la paroi en centimètres).
De préférence, on secoue le récipient pendant la congélation rapide et pendant le dégel pour faciliter un flux uniforme de la chaleur dans la substance biologique se trouvant dans le récipient.
Le contact réfrigérant est de préférence maintenu pendant un temps suffisant pour faire franchir à la substance biologique sa région critique de température, après quoi la matière congelée peut être stockée pendant toute la durée désirée. L'expression région critique de tempérakure telle qu'utilisée ici englobe aussi bien la zone de congélation que la zone de surrefroidissement, car l'altération des cellules peut se produire dans les deux zones. Par exemple, dans le cas du sang, la région critique de température est comprise entre le point où les mélanges sanguins sont pratiquement congelés et environ 500 C.
L'invention sera décrite plus particulièrement dans son application à la conservation du sang. I1 est cependant entendu qu'elle convient également à la conservation d'autres substances biologiques telles que la moelle osseuse, le sérum, c'est-à-dire le sang privé des cellules et du fibrinogène, les fractions de plasma sanguin et le liquide céphalo-rachidien. De même, des microorganismes tels que les bactéries
Azotobacter vinelandi, Escherichia coli et Micrococcus pyrogenes, la moisissure Aspergillus niger et la levure Saccharomyces sp. peuvent être ainsi conservés.
Dans le dessin annexé:
La fig. 1 représente une courbe de transmission de chaleur par ébullition, illustrant la relation entre le flux de chaleur et la différence de température entre la surface d'un solide chauffé et celle d'un liquide en ébullition.
La fig. 2 représente une courbe de vitesse de refroidissement pour l'azote liquide, dans laquelle la durée de refroidissement est portée (en ordonnées) en fonction de l'épaisseur de la pellicule isolante de revêtement (en abscisses).
La fig. 3 représente une série de courbes de taux de transmission de chaleur pour diverses épaisseurs d'un type de matière de revêtement.
La fig. 4 représente une série de courbes de taux de transmission de chaleur pour diverses matières isolantes de revêtement.
La fig. 5 représente une courbe illustrant l'amélioration de la transmission de chaleur dans le cas d'un échantillon pourvu d'un revêtement de sucreglycérine.
La fig. 6 représente une série de courbes de refroidissement pour des revêtements sucre-glycérine, montrant l'effet de plusieurs variables dans un intervalle de température de 250 C à -960 C.
La fig. 7 représente une série de courbes de refroidissement pour des revêtements sucre-glycériae, montrant l'effet de plusieurs variables sur un intervalle de température de O à -750 C.
La fig. 8 représente une série de courbes de taux de transmission de chaleur pour des revêtements sucre-glycérine, montrant l'effet des mêmes variables que dans la fig. 7 dans un intervalle de température des750 à0OC.
La fig. 9 est une vue en perspective de haut en bas d'un récipient rectangulaire pour le stockage de substances biologiques conformément à l'invention.
La fig. 10 est une vue en perspective de haut en bas d'un récipient cylindrique pour le stockage de substances biologiques conformément à l'invention.
La fig. 11 est une vue en perspective de haut en bas d'encore un autre récipient pour le stockage de substances biologiques, et
la fig. 12 est une coupe longitudinale du récipient représenté à la fig. 11, prise suivant la ligne 12-12 de la fig. 11.
Les facteurs influençant la conservation de grandes quantités de sang vont maintenant être étudiés en détail.
Milieu anticoagulant
Les milieux particulièrement appropriés sont les solutions standards de citrate-dextrose ou d'héparine.
Ces milieux sont couramment employés pour la con servation du sang humain entier par réfrigération à environ 4 à 60 C.
Additifs protecteurs
Le sang est recueilli dans un mélange d'arLti- coagulant et d'additif protecteur, dans le récipient de congélation, de stockage et de dégel. Le sang peut également être recueilli dans un anticoagulant approprié et l'additif protecteur mélangé ensuite. La congélation et le dégel des globules rouges humains provoquent d'habitude la libération de l'hémoglobine (hémolyse) et la perte de l'intégrité biologique d'une proportion considérable des cellules. Le degré de destruction dépend de la composition du sang utilisé et des conditions physiques du refroidissement et du réchauffement.
Ainsi, un refroidissement rapide jus qu'à des températures très basses et un réchauffement rapide jusqu'à l'état liquide en partant de l'état congelé favorisent un pourcentage élevé de récupération des globules rouges, comme mentionné précédemment. La présence de certains solutés désignés ici additifs protecteurs , en combinaison avec d'autres caractéristiques de l'invention, permet de congeler et de dégeler le sang avec un haut pourcentage de récupération des globules rouges.
La congélation et le dégel de globules rouges humains ont été réalisés avec succès conformément à la présente invention, en présence de divers additifs protecteurs, notamment des sucres et des polymères solubles.
Les additifs diffèrent notablement quant à la mesure dans laquelle ils pénètrent dans les globules ou sont captés par les globules. Certains composés ne pénètrent pas dans les globules, en raison de leur dimension ou de leur structure. Par exemple, les globules rouges sont perméables au glucose mais sont imperméables au lactose et au saccharose. Pour ceux qui pénètrent dans les globules, l'entrée peut se faire par simple diffusion ou par capture active . Cette dernière dépend de systèmes enzymatiques ou de substances porteuses se trouvant dans la membrane cellulaire. Le glycérol pénètre très rapidement alors que le glucose entre plus lentement. En raison de leur grosseur moléculaire et de l'absence de systèmes transporteurs voulus, les di- et tri-saccharides ne pénètrent pas.
Ces différences de perméabilité sont facilement mises en évidence en exposant les globules rouges à des solutions de diverses substances et en analysant directement les concentrations cellulaires ou en mesurant l'augmentation de la concentration intra-cellulaire totale par des méthodes osmotiques.
Dans l'ensemble, les additifs protecteurs peuvent être divisés en quatre classes
a) Sucre à cinq et à six atomes de carbone.
Ceux-ci sont connus comme ayant la faculté de traverser la membrane des globules rouges. Comme exemples de sucres de cette classe, on peut citer le xylose, l'arabinose, le ribose, le glucose, le fructose, la galactose et la mannite. Les concentrations efficaces pour cette classe sont de 0,3 à 0,75 mole/litre.
b) Di- et tri-saccharides. Ceux-ci ne pénètrent pas dans le globule rouge. A titre d'exemple, on peut citer le maltose, le saccharose, le lactose et le raffinose. Les concentrations efficaces sont de 0,075 à 0,3 mole/litre.
c) Polymères à haut poids moléculaire solubles dans l'eau. Comme les sucres de la classe b) ci-dessus, ceux-ci ne pénètrent pas dans les globules rouges.
A titre d'exemple, on peut mentionner le dextran et la polyvinylpyrrolidone. Les concentrations efficaces sont de 6 à 10 o/o en poids. Les concentrations s'expriment plus commodément en pourcentage en poids qu'en concentrations moléculaires en raison du haut poids moléculaire.
d) Mélange d'au moins un représentant des classes a) et b) ci-dessus. Comme exemple d'un tel mélange, on peut citer le mélange de lactose et de glucose. On admet que ces mélanges sont plus efficaces que l'un ou l'autre des additifs pris séparément à leurs concentrations minimum. Cette conclusion s'appuie sur les chiffres du tableau I.
Tableau I
Activité protectrice
de divers sucres
pour ta congélation et le dégel
0/o de récupération
des globules rouges
Concentration du sucre, Température
moles/litre du bain de congélation C -20 -40 -77 -120
Lactose 0,1 7 17 62 45
Lactose 0,2 9 43 72 69
Lactose 0,3 18 49 83 83
Glucose 0,1 2 11 35 45
Glucose 0,2 3 17 51 59
Glucose 0,3 9 29 61 71
Lactose 0,1-Glucose 0,2 13 30 65 69
Lactose 0,1-Glucose 0,4 25 47 76 82
Lactose 0,1-Glucose 0,6 38 42 84 82
Lactose 0,3-Glucose 0,1 44 66 87 85
Lactose 0,3-Glucose 0,2 47 64 86 86
Lactose 0,3-Glucose 0,3 44 73 88 84
La méthode expérimentale ayant conduit aux résultats du tableau I est la suivante:
mélanger des échantillons consistant en quatre volumes de sang
avec une solution de 0,9 /o NaCl et le sucre essayé de manière à obtenir les concentrations en sucre indiquées. Congeler ensuite des échantillons de S ml dans des tubes d'aluminium à parois minces de section transversale elliptique de 4 x 29 mm par immer
sion dans des bains appropriés de méthanol-glace sèche (-200, - 400, -770 C) ou d'isopentane refroidi par l'azote liquide (-1200 C). Le dégel s'effectue par
immersion dans l'eau à 400 C.
Le tableau I montre également que la récupération des globules rouges augmente lorsque les
échantillons sont congelés dans des bains de tempé
rature décroissante.
Revêtements favorisant la transmission de la chaleur
La transmission de chaleur s'effectue soit à l'état de régime d'équilibre, soit à l'état transitoire de nonéquilibre. Dans tous les cas de transmission de chaleur par conduction, convexion et ébullition, un gradient de température doit exister. Lorsque la température reste constante en fonction du temps et de la position, la transmission de chaleur se fait à l'état de régime. Ainsi, lorsqu'un tube chauffé à la vapeur d'eau est immergé dans un bain d'azote liquide en ébullition, la température du tube tombe pendant la période initiale d'immersion puis devient constante et le reste ainsi à l'état de régime, aussi longtemps qu'on laisse la vapeur circuler dans le tube immergé à un débit constant.
La transmission de chaleur à l'état transitoire existe lorsque la température d'un système varie avec le temps et la position. Ainsi, une opération de trempe implique un processus de transmission de chaleur à l'état transitoire. Les températures en différents points de l'échantillon tombent avec des vitesses variables pendant l'opération de trempe.
Comme les taux de transmission de chaleur sont affectés par les variations de température, ces taux varient également.
Lorsqu'un liquide en contact avec un solide chauffé bout à une pression donnée, le taux de transmission de chaleur dépend de la différence de température entre la surface du solide et celle du liquide en ébullition. Cette dépendance conduit à des régimes spécifiques d'ébullition pouvant être représentés graphiquement. La fig. 1 montre la forme générale d'une courbe de transmission de chaleur par ébullition, dans laquelle le flux de chaleur Q/A est porté en ordonnées en fonction de la différence de température AT entre la surface du solide chauffé et le liquide en ébullition, en abscisses. Les coordonnées sont logartthmiques. Lorsque la température de surface du solide en contact avec le liquide augmente au-dessus de la température de saturation du liquide, des bulles de vapeur se forment en des régions spécifiques de la surface (sites de nucléation).
Ces bulles croissent t jusqu'à une grosseur critique, se détachent de la surface et montent dans le liquide. Lorsque la différence de température AT augmente de A à B le long de la courbe, le nombre de sites de nucléation augmente, ainsi que la fréquence de formation des bulles sur chaque site. La turbulence oausée par ces bulles augmente la transmission de chaleur jusqu'à ce que le point B soit atteint. Au point B, appelé point de flux thermique critique, le nombre de points de nucléation est tellement grand que les bulles commencent à interférer les unes avec les autres et il se forme un film de vapeur sur la surface. Dans la région de AT comprise entre B et C, ce film de vapeur est instable et est constamment dissipé et reformé très rapidement.
La faible conductivité thermique du film de vapeur diminue le taux de transmission de chaleur dans cette région. Au point C, le film de vapeur devient stable et isole complète- ment le solide, formant ainsi une barrière relativement calme sur la surface chaude. Au-delà de C, le taux de transmission de chaleur augmente à nouveau, en partie en raison d'effets de radiation et en partie en raison de l'augmentation de la conduotibilité thermique de la vapeur en fonction de la température.
En résumé, les régions peuvent être définies comme suit :
Domaine de AT Régime d'ébullition
A B Nucléé, par points ou local
B C Film instable
C Film stable
Bien que les courbes d'ébullition aient essentiellement la même forme pour tous les liquides, les valeurs associées aux courbes varient fortement.
Pour l'eau à pression atmosphérique le point B correspond approximativement à un AT de 250 C et un flux de chaleur de 89500 g.cal/(h)(cm2), le point C apparaît à un AT d'environ 560 C et le flux de chaleur est d'environ 27200 g.cal/(h)(cm2). Pour l'azote liquide à pression atmosphérique, le point B correspond approximativement à un AT de 30 C et à un flux de chaleur de 7880 g.cal/(h)(cm2) et le point C correspond à un AT de -170 C et un flux de chaleur de 544 g.cal/(h)(cni2). Les différentes régions d'ébullition peuvent être illustrées en considérant une casserole pleine d'eau chauffée sur un fourneau.
L'eau qui se trouve immédiatement voisine de la source de chaleur atteint en premier lieu sa température de saturation, puis est légèrement surchauffée. De petites bulles commencent à se former en des points séparés sur le fond. Ces bulles montent et se condensent dans le liquide plus froid. Comme la chaleur continue à être fournie sur le fond de la casserole, des bulles se forment en des points toujours plus nombreux et la fréquence de formation en chaque point augmente. On se trouve dans la région d'ébullition nucléée. Finalement, on atteint un point où il se forme un tel nombre de bulles qu'elles interfèrent les unes avec les autres et il se forme un film de vapeur instable sur le fond de la casserole.
La croissance explosive et la destruction de ce film apparaît immédiatement à la surface du liquide car des volumes relativement importants de vapeur sont libérés, ce qui cause une forte turbulence, qui fait parfois montes le liquide. C'est là l'ébullition par film instable. Admettons maintenant que le liquide a été évaporé à sec et laissons tomber une petite quantité d'eau sur le fond. il se produit alors le phénomène dît de Leidenfrost > , c'est-à-dire que des globules d'eau dansent sur la surface chaude sans s'évaporer sensiblement. Ce phénomène est dû à la présence d'un film de vapeur surchauffée sous chaque globule d'eau, et ce film fonctionne comme isolant thermique entre la surface chauffante et l'eau. C'est là l'ébullition par film stable.
Dans la présente invention visant la conservation
de masses de sang, la chaleur doit être transmise
à un réfrigérant en ébullition à travers les parois du solide du récipient de stockage du mélange sanguin.
Le taux de transmission de chaleur est plusieurs fois
augmenté par un changement de la différence de température qui place le système dans les régions d'ébullition instable ou nucléée. On voit à la fig. 1
que le type d'ébullition, et par conséquent le taux de transmission de chaleur, peut être modifié par une variation de la différence de température AT entre le liquide en ébullition et la surface avec laquelle il est en contact. Ainsi, une diminution de AT de la valeur correspondant au point C jusqu'à une valeur quelconque comprise entre C et A' conduit à une augmentation du flux de chaleur passant du solide au liquide en ébullition.
Ceci est réalisé en interposant entre un solide et un liquide à son point d'ébullition une matière de conductibilité thermique assez faible pour amener la différence de température AT entre la surface d'ébullition et le liquide à une valeur permettant un taux de transmission de chaleur plus élevé. Le solide est avantageusement un métal et de préférence un métal à haute conductibilité, de manière à réduire la résistance au passage de la chaleur à travers la masse d'une paroi de séparation.
La matière isolante peut être n'importe quelle substance chimiquement et thermiquement stable dans l'intervalle de t
Tableau II (suite)
Durée du
refroidissement
(sec.) 15. Composition caoutchouteuse,
0,39 mm 19 16. Ruban de papier-cache, 0,30 mm 19 17. Ruban de papier-cache, 0,60 mm - 32 18. Ruban de papier-cache, 0,90 mm - 38 19. Toile isolante d'électricien, 0,16 mm 18 20. Toile isolante d'électricien, 0,33 mm 26 21. Toile isolante d'électricien, 0,50 mm 32 22. Vaseline, 0,01 mm - 36 23. Vaseline, 0,025 mm 24 24. Vaseline, 0,05 mm 21 25. Vaseline, 0, 10 mm 14 26.
Vaseline, 0,15 mm 13,5 27. Vaseline, 0,20 mm 14 28. Vaseline, 0,25 mm 16 29. Vaseline, 0,37 mm - 17 30. Vaseline, 0, 45 mm 20 31. Amiante, 0,25 mm 42 32. Amiante, 0,95 mm 64 33. Silicate de sodium, 0,11 mm 33 34. Silicate de sodium, 0,17 mm 30 35. Kaolin, O,llmm 38 36. Plâtre de Paris, 0,19 mm 10
Les expériences ont montré d'une manière concluante que l'emploi de revêtements isolants minces, tels que les films de vaseline auxquels il a été fait allusion, sur les récipients de stockage du sang abrège considérablement les temps de refroidissement et conduit à une meilleure récupération des globules rouges après le dégel du sang.
Par exemple, du sang humain contenant 0,3 mole-litre de lactose comme additif protecteur a été congelé dans les récipients d'aluminium décrits précédemment par immersion dans un bain d'azote liquide à -1960 C. Des épaisseurs croissantes de vaseline ont été déposées sur les récipients, et le pourcentage de récupération des globules rouges a été déterminé après dégel. Le tableau III indique les résultats obtenus.
Tableau III
Epaisseur du revêtement Pourcentage de récupération
de vaseline (mm) des globules rouges
0 65
0,001 69
0,023 73
0,16 78
0,24 82
0,26 82
On a constaté que le taux de transmission de chaleur entre le réfrigérant et les parois du récipient peut être encore augmenté en appliquant une couche de matière pulvérulente sur le mince film isolant La couche de poudre forme une surface discontinue favorisant la formation des bulles, et les parties exposées des particules de poudre se refroidissent rapidement. Ces propriétés augmentent la vitesse d'établissement du régime nucléé d'ébullition. Les propriétés de la poudre qui semblent importantes du point de vue de l'efficacité de la transmission de chaleur sont la grosseur des grains et la distribution des grosseurs de grains.
Lorsque les propriétés physiques des poudres employées sont semblables, et que l'on fait varier la grosseur des particules, l'épaisseur du film isolant doit être un peu plus forte lorsque la grosseur des particules de poudre diminue.
Une poudre d'aérogel de silice ayant une grosseur de particules de 0,04 micron a donné les meilleurs résultats avec une sous-couche de glycérine de 127 microns, alors que des zéolites de métaaluminosilicate cristallines pulvérulentes à propriétés de tamis moléculaire, ayant une grosseur de particules de 2 à 4 microns, ont donné un taux de transmission de chaleur optimum lorsqu'elles ont été appliquées sur un film de glycérine d'environ 102 microns d'épaisseur.
Lorsque la poudre est un conducteur thermique relativement médiocre, comme c'est le cas pour les substances non métalliques illustrées par l'aérogel de silice et les poudres de zéolites mentionnées ci-dessus, les propriétés isolantes contribuent à établir une corrélation de la température de la surface et de la température du liquide en ébullition qui est essentielle à l'ébullition en régime nucléé, et l'épaisseur de la sous-couche isolante doit être relativement plus faible que lorsqu'un bon conducteur thermique, par exemple une poudre de métal, est employé.
En raison de la corrélation entre la grosseur de particules de la poudre et l'épaisseur du film sousjacent, un certain degré d'uniformité des grosseurs de particules de la poudre est nécessaire. En général, les poudres les plus fines sont préférées, et elles sont généralement plus uniformes que les poudres plus grossières.
En dehors de la silice finement divisée telle que l'aérogel de silice ayant des grosseurs d'agglomérats de particules inférieures à environ 0,1 micron et les zéolites cristallines à propriétés de tamis moléculaire des variétés A et X, toutes deux en grosseur d'agglomérats de particules de 2-4 microns, des poudres de sucre ont été utilisées. L'aérogel de silice est préférable au sucre du fait qu'on peut l'obtenir plus facilement dans les grosseurs ultra-fines et l'unes formité qui sont désirées pour la meilleure reprodue- tibilité dans la pratique réelle, car le sucre doit être moulu jusqu'aux ouvertures de mailles correctes afin d'obtenir un revêtement optimum. La zéolite A est décrite dans le brevet des U. S. A. No 2882243 et la zéolite X est décrite dans le brevet des U. S. A.
No 2882244.
Il convient de relever que l'emploi d'une couche de poudre implique une condition supplémentaire à remplir par le film. En effet, la sous-couche doit être formée d'une matière qui accepte et retient la poudre. La glycérine et la polyvinylpyrrolidone ont été toutes deux employées avec succès. La glycérine a été utilisée seule et également diluée avec du méthanol. Parmi d'autres matières pour sous-couche, on peut mentionner les huiles un général et les fluides de silicone. Une sous-couche soluble dans l'eau est préférable pour la conservation du sang car elle s'élimine par lavage pendant le dégel. Chacune des matières mentionnées ci-dessus est soluble dans l'eau ou peut être obtenue sous forme soluble dans l'eau. Par exemple, on trouve de nombreuses huiles détergentes.
Le solvant ou diluant, illustré par le méthanol mentionné ci-dessus, peut également consister en une autre substance. Par exemple, l'éthanol, l'eau ou toute substance n'entravant pas le lavage du film par l'eau peuvent être utilisés. La fonction du diluant est d'ajuster les propriétés du film isolant (a) pour produire un bon film uniforme et adhérent, suivant si l'application est effectuée par pulvérisation, par trempe ou autrement, (b) pour maintenir le film à l'état fluide au moins jusqu'à ce que la poudre ait été ajoutée, et (c) dans certains cas, il agit comme plastifiant et aide à empêcher un séchage et un écaillage pendant le refroidissement.
Le mince film isolant et la couche pulvérulente peuvent être appliqués sur les parois externes du récipient de stockage du sang de toute manière appropriée, par exemple en immergeant le récipient dans une solution contenant la matière isolante. Dans ce cas, l'épaisseur du film isolant peut être réglée en agissant sur la concentration de la solution et sur le nombre de trempages.
Par exemple, le récipient est trempé dans une solution de glycérol et de méthanol contenant au moins 20 O/o de glycérol, retiré et laissé au repos à l'air pendant environ 30 sec. Cette dernière phase de vieillissement permet au film de se stabiliser avant l'application de la couche pulvérulente. Au moins une partie du solvant s'évapore et le film résultant devient plus uniforme, probablement en raison d'une augmentation de la viscosité. I1 est possible que certaines compositions de film souffrent d'un vieillissement trop prolongé, du fait qu'une trop grande perte de solvant pourrait avoir pour conséquence une mauvaise adhérence, avant ou pendant l'opération de congélation. Le vieillissement s'effectue de préférence avant l'adjonction de la poudre au film, bien qu'il puisse être effectué après cette adjonction.
Des expériences ont montré que le coefficient de transmission de chaleur optimum dans la zone de température critique est obtenu lorsqu'une solution glycérol-méthanol à 50 /o est employée, contrairement aux solutions ayant une concentration supérieure ou inférieure, la poudre étant un aérogel de silice e finement divisé. Dans le cas d'un revêtement de sucre, une solution à 22 o/o de glycérol dans le méthanol est préférée. La solution de 50 o/o de gly zéro1 donne une épaisseur de film d'environ 0,13 nun, alors que la solution à 22 oxo de glycérol donne une épaisseur de 0,038 mm.
Comme mentionné, la grosseur préférée des particules de silice est inférieure à 0,1 micron, alors que la grosseur préférée des partioules de sucre correspond à des tamis de 0,221 à 0,107 mm d'ouverture.
Au lieu d'appliquer le mince film isolant par trempe, on peut par exemple l'appliquer par aspersion à la main. La poudre est de préférence projetée à l'aide d'un gaz propulseur sur le film isolant vieilli.
Une série d'essais a été effectuée pour illustrer les avantages des sous-couches de glycérine avec des couches de silice et de sucre finement divisées pour augmenter le taux de transmission de chaleur. Dans ces essais, une sonde de cuivre massif de 4,13 cm de diamètre et 10,2 cm de longueur a été munie d'un thermocouple près de la surface et d'un thermos couple au centre. Un film de glycérine a été appli qué sur la sonde en trempant la sonde dans la solution n de glycérine spécifiée puis en retirant la sonde et en laissant le film se stabiliser pendant 30 60 sec., après quoi la poudre indiquée a été appliquée sur le film par projection.
La sonde ainsi préparée a été plongée dans l'azote liquide et l'allure du refroidissement a été suivie au moyen des deux thermocouples. La durée de refroidisselment est le temps compris entre le moment où le thermocouple externe passe par 00 C et le moment où le thermocouple interne atteint -46 < C. Cet intervalle comprend le domaine des températures critiques pour la congélation du sang. Les résultats suivants ont été obtenus.
(Voir tableau IV, page 9)
Les chiffres figurant dans le tableau IV montrent qu'une épaisseur de film de glycérine de l'ordre de 0,13 mm donne le taux maximum de transmission de chaleur lorsque la matière pulvérulente est la silice finement divisée. D'autre part, un taux de transmission de chaleur maximum a été obtenu avec un revêtement de sucre de grosseur de particules de 0,221-0,107 mm d'ouverture de maille de tamis.
On a conduit une autre série d'essais, qui illustrent clairement l'amélioration supplémentaire de la transmission de chaleur réalisable grâce à la présence d'une couche pulvérulente sur la sous-couche constituée par le film isolant. Pour ces essais, une mince couche de glycérine a été projetée sur un cylindre de cuivre de 4,13 cm de diamètre et 5,1 cm de longueur, puis un excès de sucre en poudre a été ajouté. Le taux de transmission de chaleur obtenu avec le revêtement de sucre a été en moyenne 16 fois supérieur à celui obtenu avec le récipient sans aucun revêtement. Il a fallu 350 sec. pour refroidir le cylindre non revêtu de 250 C à -196 < C dans l'azote liquide. Le même cylindre, pourvu des revêtements de glycérine et de sucre, s'est refroidi en 22 sec.
La fig. 4 montre les taux de transmission de chaleur réalisés avec un tel revêtement, en fonction de la température de l'échantillon. La fig. 5 montre l'amé- lioration de la transmission de chaleur pour diverses températures de l'échantillon. L'amélioration de la transmission de chaleur peut atteindre 35 fois à une température de l'échantillon de -100 < C.
A cette
Tableau IV
Temps de refroidissement Concentration du glycérol Epaisseur du film Poudre
de O à -40 C (sec.) dans le méthanol (mm)
10,5 20% 0,038 Poudre de silice de forme sphérique et
6,8 30 0, 051* de grosseur d'agglomérats de 0,1 micron
7,1 42 /o 0,076 <
5,4 60 % 0,127
6,9 80 O/o 0,203*
6,8 100% 0,431
12,1 22% 0,038 Sucre granulé (90% supérieur à 0,221
mm d'ouverture de maille)
8,1 22 % 0,038 Sucre granulé (moulu grossièrement dans
un mortier avec un pilon)
7,0 22 /o 0,038 > 0,221 mm d'ouverture de maille
5,7 22 /o 0,038 0,221-0,
107 mm d'ouverture de maille
6,2 22% 0,038 0,107-0,046 mm d'ouverture de maille
8,0 22 % 0,038 sucre en poudre (de confiseur) * Interpolé. température, le taux de transmission de chaleur de l'échantillon sans revêtement est très faible, soit envi ron 544 g.cal/(h)(cm2). Il ressort clairement des fig.
4 et 5 que des vitesses de congélation supérieures peuvent être obtenues avec des revêtements de gly cerine-sucre.
On a procédé à des expériences pour déterminer si les propriétés de transmission de chaleur des revê tements de glycérine-poudre de sucre sont reproductibles, et on a mis au point une combinaison optimum Je revêtement pour le présent procédé de congélation wn masse du sang. A cet effet, on a étudié les variables suivantes 1) L'épaisseur du revêtement de glycérine-sucre en
poudre.
2) Le poids du revêtement de glycérine-sucre en
poudre.
3) La grosseur de particules, exprimée en ouverture
de maille, de la poudre de sucre utilisée dans le
revêtement.
4) L'âge du revêtement de glycérine-poudre de
sucre.
La fig. 6 montre le temps nécessaire pour refroidir le cylindre de cuivre mentionné de 25 C C à -196 < C, en fonction des quatre variables mentionnées cidessus. Les quatre courbes présentent de larges paliers sur lesquels les durées de refroidissement sont constantes, ce qui tend à indiquer que les propriétés de transmission de chaleur des revêtements sont faciliement reproductibles dans les régions plates des courbes. Cependant, dans les opérations de congélation du sang, le taux de transmission de chaleur est plus important pendant la descente jusqu'à environ -500 C que le taux de transmission de chaleur global. La fig. 7 montre les taux de transmission de chaleur dans l'intervalle de 00 C à -75 < C en fonction des mêmes quatre variables mentionnées cidessus.
Là également, les courbes présentent des paliers relativement larges, ce qui indique que les taux de transmission de chaleur sont reproductibles dans des conditions de revêtement relativement variables.
Le taux de transmission de chaleur au-dessus de -500 C au cours du dégel du sang congelé est également important car, dans cet intervalle de température, les globules rouges peuvent être endommagés aussi bien pendant le dégel que pendant la congélation. La fig. 8 montre les taux de transmission de chaleur des cylindres avec revêtement pendant leur réchauffement dans un courant d'eau constant, en fonction des quatre variables. L'examen de la fig. 8 révèle que les taux de transmission de chsleur ne sont pas influencés par-ces variables dans l'intervalle de température de -75 C à 00 C, ce qui est très avantageux pour la reproductibilité de la phase de dégel du sang.
Les matières employées pour le revêtement sont non toxiques, bon marché et très répandues. Le revêtement ne gêne ni la collecte ni la transfusion du sang, si le récipient est pourvu de son revêtement après la collecte du sang. Le revêtement de glycé rine-sucre se dissout facilement dans l'eau pendant le dégel, et ne gêne donc pas l'administration du sang à un patient.
Réfrigérant
Pour convenir à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le réfrigérant doit bien entendu être assez froid pour congeler la substance biologi que. Dans le cas du sang, cela signifie que le réfrigérant doit avoir une température inférieure à environ -120 < C pour assurer un taux de récupération convenable des globules rouges.
L'azote liquide est le réfrigérant préféré en raison de ses avantages, qui sont une relative inertie, la sécurité d'emploi, et le coût relativement modeste.
Il a en outre un point d'ébullition extrêmement bas de -196 < C à pression atmosphérique. Comme il est bien connu, l'azote liquide peut être obtenu par distillation de l'air. Cependant, d'autres réfrigérants sont également utilisables, notamment l'air liquide (conte- nant la proportion normale d'azote), l'hélium liquide, le néon liquide, l'argon liquide et le krypton liquide.
L'azote liquide et les autres réfrigérants liquides à bas point d'ébullition sont des liquides saturés à pression atmosphérique, et entrent violemment en ébullition lorsqu'un objet chaud tel qu'un récipient de conservation du sang y est plongé. La transmis- sion de chaleur dépend de la différence de température AT entre le fluide et l'objet chaud, comme mentionné précédemment. Aux très hautes valeurs de AT, il se forme un film de vapeur autour du récipient chaud, qui a pour effet une très mauvaise transmission de chaleur. Ce film de vapeur devient de moins en moins stable lorsque la valeur de AT décroît et la transmission de chaleur s'améliore. La transmission de chaleur est maximum pour une valeur de AT d'environ 30 C (pour l'azote liquide), puis elle re tombe lorsque la valeur de AT tend vers zéro.
Tenant compte de cette relation entre la transmission de chaleur et AT, il semble qu'au taux de transmission de chaleur exagérément faible serait atteint lorsqu'un récipient contenant du sang à 250 C est brusquement plongé dans de l'azote liquide à -196 < C. Cependant, l'application des revêtements décrits ci-dessus sur les parois externes du récipient permet un refroidissement très rapide de la surface en contact avec l'azote liquide et conduit à une valeur de AT se rapprochant de 3O C.
Pour dégeler un récipient de sang congelé, il est nécessaire de franchir de nouveau aussi vite que possible la région des températures critiques allant de -50 < C à la fusion. Malheureusement, on se trouve en présence d'une limitation supplémentaire du fait que le sang est rapidement et irréversiblement altéré aux températures supérieures à 50 C. C. Par conséquent, la température du fluide utilisé pour exercer la fonction du dégel ne doit pas être sensiblement supérieure à cette valeur. L'eau est le milieu dégelant préféré, mais d'autres méthodes peuvent également être envisagées, telles que le dégel à l'aide d'énergie radioélectrique.
La cause réelle de l'altération des globules rouges dans la région critique des températures n'est pas connue, mais elle peut être due à (1) la croissance continue des cristaux de glace, et/ou (2) l'augmen- tation de la concentration d'électrolyte ou de sel lorsque l'eau sort de la solution par congélation.
Cela étant, il ne devrait pas être nécessaire de considérer le temps nécessaire pour soutirer la chaleur de fusion de la totalité du sang, mais seulement de sa dernière portion. On a procédé à des expériences pour étudier l'influence du temps pendant lequel le sang séjourne dans l'intervalle de température de -10 C à - 50 < C sur la récupération des globules rouges. A cet effet, on a introduit un thermocouple au centre de la masse de sang et on a secoué le récipient au cours de la congélation et au cours du dégel.
Les résultats indiquent qu'avec un additif protecteur consistant en 0,3 mole/litre (10,7 O/o) de lactose, il est nécessaire que le sang franchisse cette zone de température en moins de 15 sec., tant pendant la congélation que pendant le dégel, pour obtenir une récupération d'au moins 85 % des globules rouges.
Si ce temps est abaissé à 10 sec. ou moins, une récupération de 90 O/o est réalisable. Avec 5 % de glucose et 7¸% de lactose comme additifs protecteurs, un temps global de moins de 40 sec. devrait donner une récupération de 85 % et on devrait avoir une récupération de 9O0/o des globules rouges en 25 sec.
N'importe quelle méthode pratique de mise en contact des fluides d'échange de chaleur avec les parois du récipient de conservation du sang peut être employée, bien que dans les essais décrits plus haut, le contact ait été obtenu simplement en immergeant le récipient dans un bain du fluide. Dans une autre
Tableau V
Temps s'écoulant pendant que le thermocouple central franchit la zone de température de-IO0C à-500C
Température du bain Amplitude Pendant la congélation Pendant le dégel Temps total Oio de récupération
de dégel OC (cm) (sec.) (sec.) (sec.) des globules rouges
45 O 4 > 30 > 34 61
45 3,2 4 21 25 61
45 6,4 4 15,5 19,5 79
45 10,2 4 15,0 19,0 83
55 0 4 20,4 24,4 66
55 3,2 4 21,2 25,2 84
55 6,4 4 13,0 17,0 86,5
55 10,2 4 6,4 10,
4 90,5 méthode, par circulation de fluide, le réfrigérant et/ou le fluide dégelant peut être forcé au travers des parois du récipient, avec pour avantage possible un taux plus élevé de transmission de chaleur que celui obtenu par le système à immersion. Comme autre variante, les fluides échangeurs de chaleur peuvent être projetés contre les surfaces du récipient, et des expériences avec l'azote liquide ont montré des avantages considérables du point de vue de la transmission de chaleur par rapport à la simple immersion, ce qui est probablement dû à l'action de balayage du jet qui inhibe la formation d'un film continu de vapeur.
Récipients
On a trouvé que des améliorations substantielles des pourcentages de récupération des globules rouges sont réalisables dans certaines circonstances lorsque le récipient de conservation du sang est secoué pendant la congélation et pendant le dégel. Ceci provient probablement de ce que, grâce à la mise en circulation du sang en cours de fusion ou en cours de congélation, l'efficacité de la transmission de chaleur est améliorée par rapport à un récipient fixe dans lequel la chaleur doit être transmise du centre à la périphérie et de la périphérie au centre du sang stocké, à travers le sang environnant en contact avec les parois du récipient.
Les raisons de ce phénomène peuvent être comprises en examinant les mécanismes de la congélation et du dégel. Sitôt que le récipient froid est mis en contact avec de l'eau chaude, il se forme une couche de sang dégelé au voisinage de la paroi du récipient. Cette couche a une conductivité thermique égale à un tiers de celle de la glace et une conductivité bien inférieure à celle de la paroi du récipient, de sorte qu'elle ralentit immédiatement la transmission de la chaleur provenant du récipient. En agitant la couche de liquide, la transmission de chaleur entre celle-ci et la surface glacée du sang congelé qui reste est améliorée. Ainsi, si le récipient est secoué pendant le dégel, il se produit entre le liquide et la glace un mouvement relatif qui améliore la transmission de chaleur à travers le film liquide.
Des expériences ont montré que l'agitation du récipient pendant le dégel ne donne aucun avantage sensible si l'épaisseur de la masse de sang ne dépasse pas 6 mm. Par contre, si cette épaisseur est de l'ordre de 10 mm ou plus, l'agitation du récipient donne un net avantage pendant le dégel. Des expériences ont également montré que lorsque l'épaisseur de la masse de sang est de 17 mm ou plus, l'agitation du récipient pendant la congélation peut donner une amélioration de la récupération des globules rouges de 1 ou 2 %. Avec un récipient de 33 mm, cette amélioration peut être de l'ordre de 20 à 25 %.
On a procédé à une série d'essais qui illustrent clairement l'amélioration résultant d'une telle agitation pendant le dégel. Dans ces essais, un revêtement de glycérine-sucre a été appliqué sur un récipient et le sang, contenant 0,3 mole/litre de lactose comme Tableau VI
Conditions de refroidissement Conditions de réchauffement % de récupération des globules rouges
Amplitude Temps Amplitude Temps Epaisseur de la masse de sang (mm)
Forme du récipient Revêtement Méthode cm sec.
Méthode cm sec. 6 14 17 33
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Néant Immersion - - Immersion - - 83 47 -
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Polyvinyl- Immersion - - Immersion - - 89 70 - pyrrolidone méthanol
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Immersion - - Immersion - - 81,5 81,5 81
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Immersion - - Agitation 6,4 45 - 88* 93
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Immersion - - Agitation 10,2 45 - 92* 93 72,5
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Agitation 10,2 60 Agitation 10,2 45 - - - 89
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Agitation 10,2 45 Agitation 6,4 30 - 92 -
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Immersion - - Agitation 6,4 45 14 19 33 - 59
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Silice-glycérol Agitation 6,
4 30 Agitation 6,4 30 84 83
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Silice-glycérol Agitation 10,2 45 Agitation 6,4 45 - 89
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Silice-glycérol Agitation 10,2 45 Agitation 10,2 45 - 87,5
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Silice-glycérol Agitation 10,2 45 Agitation 10,2 60 - - 89 * Durée d'agitation : 30 secondes. additif protecteur, a été congelé dans le récipient de stockage par immersion dans un bain d'azote liquide.
Le sang a été ensuite dégelé par immersion dans un bain d'eau à la température indiquée. Le récipient a été secoué mécaniquement, et l'amplitude notée dans le tableau V ciessous correspond à la distance réelle entre l'élongation maximum d'oscillation dans une direction et l'élongation maximum d'oscillation dans l'autre direction. La fréquence de l'agitation a été maintenue constante à 188 cycles/min.
Le tableau V illustre l'amélioration de la récupération des globules rouges due à l'agitation du récipient pendant le dégel. De même, des récupérations supérieures des globules rouges sont réalisables en secouant pendant la congélation. Ceci ressort clairement d'une autre série d'essais dans lesquels des revêtements variés ont été appliqués sur des récipients de conservation du sang ayant des formes cylindriques et rectangulaires. Dans tous les cas, le réfrigérant était l'azote liquide, l'additif protecteur était 0,3 mole/litre de lactose, la température du bain de dégel était de 450 C et la fréquence d'agitation de 186 cycles/min. Les épaisseurs de la masse de sang ont été variées dans ces essais, dont les données sont rassemblées dans le tableau VI.
(Voir page 11)
On a effectué encore une série d'essais pour étudier l'effet du rapport du volume du sang au volume du récipient. Dans ces essais, un revêtement de glycérine-sucre a été appliqué sur des récipients de 35 cc et les échantillons de sang ont été introduits dans les récipients avec 0,15 mole/litre de lactose comme additif protecteur. Le milieu de congélation était l'azote liquide à -196 < C et le milieu de dégel était de l'eau à 45O C, I'amplitude d'agitation pendant le dégel étant de 10,2 cm pendant 30 sec. Les résultats de ces essais sont les suivants.
(Voir tableau
VII.)
Les chiffes du tableau ci-dessous montrent que si l'échantillon occupe une trop grande partie du volume disponible, le degré de turbulence interne est diminué pour n'importe quelle amplitude de secouage, ce qui abaisse les pourcentages de récupération des globules rouges. L'avantage d'un faible taux de remplissage est toutefois compensé par des considérations d'espace et de facilité de transport, et un volume de mélange sanguin occupant environ 60 /o de la ment avantageux, car il peut être stocké avec le coefficient d'emballage le plus élevé (le plus faible espace vide) parmi plusieurs configurations possibles, ce qui permet une économie dans l'installation de stockage. Cette configuration se prête également à une fabrication économique.
La possibilité d'utiliser le récipient de la fig. 9 est fonction de l'épaisseur de C. Un récipient de grandeur normale pour le présent procédé doit être capable de contenir environ 500 cc de sang en plus de l'additif protecteur.
Si l'on admet que l'additif protecteur occupe 10 % du volume du sang, et qu'on ménage 10 % d'espace libre pour tenir compte de la dilatation de la glace pendant la congélation, la capacité totale doit être de 600-650 cc. Bien entendu, il est désirable que le récipient soit aussi petit que possible, ce qui signifie que l'épaisseur C doit être aussi grande que possible, cependant dans une mesure compatible avec des pourcentages acceptables de récupération des globules rouges.
Si la congélation est effectuée par simple immersion dans l'azote liquide en utilisant les revêtements de glycérine-sucre, et si le dégel est effectué par immersion dans l'eau chaude, l'épaisseur C ne peut probablement pas dépasser environ 6 mm car avec les épaisseurs supérieures la résistance interne à la transmission de chaleur serait trop grande pour un refroidissement et un réchauffement suffisamment rapides. Une telle valeur de l'épaisseur C conduit à des dimensions d'environ 40 cm pour la largeur A et la hauteur B. Cependant, comme mentionné, il est préférable de secouer le récipient pendant la congélation et pendant le dégel.
Dans ces conditions, C est de préférence supérieur à 10 mm. I1 est également préférable que seulement 60 /o de la capa- cité du récipient soit occupé par le mélange conte- nant le sang. Ceci nécessite une capacité du récipient d'environ 900 cc.
I1 s'est avéré que des récupérations satisfaisantes des globules rouges peuvent être réalisées avec un récipient rectangulaire ayant une épaisseur C de 19 mm. I1 peut même être possible d'employer des récipients rectangulaires ayant des épaisseurs supé rieurs.
Un récipient cylindrique tel que représenté à la fig. 10 pourrait également convenir pour la conservation du sang conformément à l'invention. Là également, dans le cas de l'agitation du récipient pendant la congélation et le dégel, comme on le préfère, le diamètre D du récipient doit être supérieur à 10 mm et inférieur à 33 mm. Une capacité totale de 900 cc est désirable.
Une autre configuration pratique du récipient est représentée dans les fig. 11 et 12. Ce récipient, com prend une enveloppe semi-cylindrique 52 fermée aux deux extrémités par des plaques 53 et 54. Ces plaques présentent de multiples ouvertures 55 espacées uniformément, et chaque ouverture est sur le e même axe longitudinal qu'une ouverture correspondante dans la plaque opposée. Les ouvertures correspondantes cognuniquent l'une avec l'autre par un tube 56 scellé à chaque extrémité aux parois des ouvertures des plaques.
Les tubes 56 traversent longitu finalement l'enveloppe 52 et forment des passages pour la circulation des fluides de réfrigération et de réchauffement, comme montré dans la fig. 12. Le mélange sanguin est introduit et retiré par les conduits d'entrée et de sortie 50 et 51 traversant la plane que supérieure 53.
Le fluide échangeur de chaleur peut être continuellement forcé dans les tubes 56, ou le récipient peut être immergé dans un bain de réfrigérant de manière à tirer parti du phénomène de siphon thermique . Ce phénomène se produit lorsqu'un tube est introduit verticalement dans luln liquide en ébullition. Lorsque le liquide pénètre par la base du tube, il est partiellement vaporisé par les parois chaudes du tube. La vapeur se dilate dans le liquide et agit comme un piston sur le liquide en le chassant à grande vitesse vers le haut du tube.
L'ensemble des avantages du procédé selon l'invention ressort du tableau VIII, qui rassemble des résultats obtenus au cours d'une série d'essais comprenant les divers aspects de l'invention.