Verfahren zur Löslichmachung von unlöslichen Collagenfasern und Gewinnung des Collagens ohne Änderung der Molekularstruktur Die vorliegende Erfindung betrifft die Löslich- machung von Collagenfasern, die man bisher für unlöslich hielt. Das Collagen ist ein faseriges Pro tein, das den Hauptbestandteil des tierischen Binde gewebes darstellt.
Man war bisher der Auffassung, dass es unmöglich sei, dieses Collagen herauszulösen, ohne die Spiralstruktur nach Art fester Stäbchen, welche eine charakteristische Eigenschaft des Mole küls bildet, in eine fadenförmige Struktur umzuwan deln, deren Fäden sich falten können. Vorgänge die ser Art mit Änderung der Molekularstruktur treten bei Erhitzung auf eine Temperatur über 50 C ein, oder bei Verwendung eines Proteindenaturierungs- mittels, wie Kaliumthiocyanid, Calciumchlorid, Harnstoff, usw., oder bei überführung des Collagens in eine Gelatine.
Seit 1927 war es aber bekannt, dass ein kleiner Anteil einer gegebenen Menge von Colla gen mit verdünnter Säure oder verdünntem Alkali oder auch mit einer Lösung eines Neutralsalzes in Lösung gebracht werden kann, wobei die charakteri stische Molekularstruktur des Collagens, die Spiral- form mit ihrer Festigkeit, erhalten bleibt, und dass sich die Faser in ihrer ursprünglichen Form aus die ser Lösung wieder abscheiden lässt. Das in diesem Zustand befindliche Collagen wurde als lösliches Collagen von dem übrigen Collagen unterschieden.
Es machte aber nur einen ganz geringen Prozentsatz von der Gesamtmasse des Collagens aus und diese Menge wechselte leicht mit dem Alter, dem Körperteil und der Art des Tieres, von dem das Col lagen stammte. Der Hauptteil des Collagens ist aber bis heute als unlöslich angesehen worden.
Das vorliegende Verfahren schafft nun eine Möglichkeit, solches, bisher als unlöslich betrachtetes Collagen in guter Ausbeute in die lösliche Form überzuführen, ohne es zu denaturieren, d. h., bei Aufrechterhaltung der Spiralstruktur des Moleküls, und die Faser in ihrer ursprünglichen Molekularform wieder in guter Ausbeute abzuscheiden. Das Verfah ren erlaubt somit, lösliches Collagen in industriellem Masstab herzustellen.
Aus der gewonnenen Lösung können Collagenfilme, Collagenfäden, Collagengewe- be und Collagenschwämme erzeugt werden.
Wenn man solche löslich gemachte Collagenfasern in Was ser suspendiert und auf 65-75 C erhitzt, kann man eine homogene Gelatine von hoher Reinheit und einem höheren Erstarrungs- und Schmelzpunkt ge- genüber der bekannten Gelatine in 100 %iger Aus- beute und in weit kürzerer Zeit gewinnen.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird das sogenannte unlösliche Collagen in Lösung ge bracht, in der es ein einheitliches Molekulargewicht und die charakteristische Spiralstruktur aufweist, indem man auf das unlösliche Collagen bei niedriger Temperatur, nämlich bei einer Temperatur unterhalb von 60 C, ein hydrolitisches Enzym einwirken lässt und das Collagen mit einer verdünnten Säurelösung von pH 1-4 unterhalb der Denaturierungstempera- tur von 37 C behandelt.
Aus dieser Collagenlösung wird die Faser in ihrer ursprünglichen Form mit 100 o/oiger Ausbeute z. B. durch Neutralisation, durch Dialyse, mit Hilfe eines lonenaustauschharzes, oder durch ein organisches Lösungsmittel, z. B. Azeton oder Alkohol, wieder abgeschieden. Die Dialyse kann aus Wasser oder aus Na2HP04-Lösung erfolgen.
Die Abscheidung lässt sich auch durch Zusatz von Natri- umchlorid, Natriumcitrat, Natriumacetat, u. dgL, her beiführen. Die genannten Ausscheidungsmethoden sind aber nicht so vorteilhaft wie die Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels. Sie verlangen einen längeren Zeitaufwand für die Fällung und für die Un terdrückung der Schwellung der Faser beim nachfol- genden Waschprozess. Diese Nachteile fallen weg, wenn man ein oberflächenaktives Mittel benutzt, und die Faser wird gleichzeitig gereinigt.
<I>Beispiel 1</I> 3 kg Kuhhaut mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 70 0/0, von welcher das lösliche Protein mit Hilfe einer 5 obigen wässerigen Natriumchloridlösung und nachfolgendes Waschen mit Wasser entfernt worden ist, oder die durch Äscherung enthaart, mit Salzsäure neutralisiert und mit Wasser gewaschen wurde, wer den in 3 Liter einer Lösung eingetaucht, die 6 g Trypsin enthält, und darin bei einer Temperatur von 25 C und gelegentlichem Umrühren 90 Stunden ste hen gelassen.
Darauf wird die H Ionenkonzentration der Enzymlösung mit Ätznatron oder einer Borsäure- Pufferlösung auf pH 8 eingestellt. Man kann das gleiche Resultat auch bei Verwendung von Pancrea- tin an Stelle von Trypsin erzielen.
In diesem Fall sollte aber das Enzym in einer Menge von 0,5-2 % der Lösung, entsprechend seiner geringeren Aktivität, angewendet werden. Während der Behandlung mit dem Enzym löst sich das Collagen nicht auf und verändert auch nicht merklich sein Aussehen.
Nach dem das Trypsin durch gründliches Spülen in flies- sendem Wasser entfernt worden ist, wird die Kuhhaut in<B>100</B> Liter Wasser eingebracht. Das Wasser wird durch Zusatz von Salzsäure unter Rühren auf ein pH von 2-3 eingestellt. Für diesen Zweck sind etwa 35 cm3 konzentrierter 12 n-Salzsäure erforderlich. Unter Rühren bei einer Temperatur von 20-25 C während 24 Stunden löst sich die Kuhhaut vollstän dig in Form einer viskosen Flüssigkeit, wie Gluten, auf.
Das gleiche Ergebnis kann man durch Verwen dung von anderen Mineralsäuren, z. B. Schwefelsäu re, Phosphorsäure, usw., oder durch organische Säu ren, z. B. Essigsäure, Zitronensäure, u. dgl., an Stelle von Salzsäure erzielen.
Die viskose Lösung wird durch ein Pressfilter unter Benutzung von Stoff und entfetteter Baumwolle als Filtermaterial filtriert. Nach Neutralisation des Filtrats unter Zusatz von etwa 56 cm3 einer 30 o/oigen Natriumhydroxydlösung, Einstellung der H-Ionenkonzentration auf ein pH von 5-8, und Stehenlassen während einiger Stunden, scheidet sich ein faseriger, weisser Niederschlag aus. Der Niederschlag wird gründlich mit Wasser gewa schen, durch Filtration oder Zentrifugieren gesam melt und an der Luft getrocknet. Man erhält ungefähr 700 g von schneeweissem Collagen.
Da der Stick stoffgehalt der zurückgebliebenen Flüssigkeit prak tisch Null ist, folgt, dass die Ausfällung des Collagens quantitativ war. Man kann die Collagenfaser ausser durch die vorgenannte Neutralisation der Lösung auch durch Dialyse mit 0,02 m Na2HP04 oder .durch Zusatz von so viel Aceton oder Alkohol,
dass die Konzentration der Mischung etwa 30 % an der orga- nischen Flüssigkeit ausmacht, ausfällen. Die so erhal tene Collagenfaser hat dieselben physikochemischen Eigenschaften in Bezug auf Viskosität, Doppelbre chung, spezifische Rotation, Denaturierungs- und Schrumpftemperatur, Senkungsgeschwindigkeit, usw., wie das nach den bisherigen Versuchen gewonnene lösliche Collagen.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Collagenfasern besitzen eine Molekülstruktur des festen spiraligen Aufbaus, eine innere Viskosität von 15, gleichmässige Länge des Moleküls von 3000 Angström, gleichmässigen Durchmesser von 13,6 Angström, eine spezifische Rotation von -415 , eine konstante Senkgeschwin digkeit von 30 Svedberg-Einheiten, eine Denaturie- rungstemperatur von 37 C und eine Schrumpftempe ratur von 60 C.
Wenn man die ausgefällte Collagen- faser im Elektronenmikroskop beobachtet, kann man feststellen, dass sie ein quer gefurchtes Muster mit einer Periode von 700 Angström aufweist, ebenso wie es für die ungelöste, natürliche Collagenfaser charakteristisch ist.
<I>Beispiel 2</I> Ähnlich wie im Beispiel 1 werden 3 kg Kuhhaut mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 70 %, aus denen das lösliche Protein mit einer wässerigen Lösung von Natriumchlorid und nachfolgendem Wa schen entfernt wurde, oder die der Enthaarung durch Äscherung, der Neutralisation mit Salzsäure und Wa schen mit Wasser unterzogen worden war, in 3 Liter einer wässerigen Lösung eingebracht,
die 6 g Pepsin enthält und deren H-Ionenkonzentration auf ein pH von 2-2,5 eingestellt ist. Die Kuhhaut wird darin bei einer Temperatur von 25 C unter gelegentlichem Rühren 48 Stunden lang behandelt. In diesem Fall erfolgt neben der Einwirkung des Enzyms eine teil weise Auflösung des Collagens, da der optimale pH- Wert für Pepsin bei etwa 2 liegt, zum Unterschied gegenüber Beispiel 1, in dem Trypsin verwendet wird.
Es löst sich aber nicht die ganze Menge der Kuhhaut bei diesem Vorgang auf, da die Löslichkeit des Collagens in einer verdünnten Säurelösung unge- fähr bei 1 % liegt. Nach einer Behandlungsdauer von 48 Stunden mit dem Enzym wird das Volumen der Lösung durch Zusatz von 0,005 n Salzsäure auf<B>100</B> Liter erhöht (pH = 1-1,5). Im Verlauf von 24 Stun den bei einer Temperatur von 25 C und dauerndem Rühren löst sich alles Collagen auf.
Das gleiche Er gebnis erhält man, wenn man eine andere anorgani sche Säure oder eine organische Säure an Stelle von Salzsäure verwendet, wie bereits im Beispiel 1 er wähnt. Das Ausfällungsverfahren für das gelöste Col lagen ist dasselbe wie im Beispiel 1. Durch Neutrali sation der Lösung mit Ätznatron und Stehenlassen während mehrerer Stunden wird das Collagen nie dergeschlagen.
Nach dem Auswaschen und Trocknen des Niederschlags erhält man ungefähr 700 g Colla- genfasern. Die durch die Pepsinverdauung gewonne ne Collagenfaser unterscheidet sich ein wenig sowohl von dem nach den bekannten Methoden der Säureex traktion ohne Benutzung eines Enzyms erhaltenen Produkt als auch von dem Erzeugnis nach Beispiel 1 in ihren molekularen Eigenschaften.
Sie verhält sich ebenso wie die beiden vorgenannten Typen in bezug auf die Denaturierungstemperatur, die Schrumpftem- peratur, die spezifische Rotation, die Senkungskon stante, die Homogenität des Molekulargewichts, usw., und sie zeigt auch dieselbe feste Spiralstruktur wie die beiden anderen Arten. Die Viskosität beträgt aber nur 9,5, ist also etwas geringer als bei den beiden an deren Formen, und auch die Moleküllänge ist um un gefähr 200 Angström kleiner, in Übereinstimmung mit der Doppelbrechung.
Die gewonnene Collagenfa- ser ist sonach gegenüber der natürlichen Faser am Ende etwas gekürzt. Wenn man dieses Collagen in Wasser im Verhältnis von 1 Gewichtsteil Collagen zu 2 Gewichtsteilen Wasser suspendiert und es auf eine Temperatur von 60-70 C erhitzt, wird das Collagen denaturiert und löst sich in wenigen Minuten auf. Beim Abkühlen der Lösung entsteht ein Gel, das bei Trocknen Gelatine liefert. Wenn man diese Gelatine mit dem Produkt aus bekannten Verfahren ver gleicht, zeigt sich, dass das neue Verfahren dem be kannten in folgenden Punkten überlegen ist: 1. Im Vergleich mit dem bisher benutzten Äsche- rungsverfahren braucht das neue Verfahren nur ein Fünftel der Zeit zu seiner Durchführung.
2. Die Ausbeute beträgt praktisch 100 0/0.
3. Die physikalischen Eigenschaften wie Festig keit der Gallerte, Erstarrungspunkt, Schmelzpunkt, usw., sind besser als bei den besten Qualitätserzeug nissen nach dem bekannten Verfahren, wobei bei dem bekannten Produkt nur etwa 30 % des gewonne- nen Erzeugnisses von guter Qualität sind.
4. Es ist kein Konzenrationsverfahren erforder lich, und die Ausgaben für den Wärmebedarf betra gen nur die Hälfte, weil bei der früheren Methode nach der Extraktion ein Eindampfen folgen musste.
5. Die Reinheit des Erzeugnisses ist viel grösser als bei der Gelatine nach dem bekannten Verfahren, da bei dem neuen Verfahren die Collagenfaser zu nächst in molekularem Zustand in einer Lösung dis pergiert und dann ausgefällt wird. Der Herstellungs- prozess schliesst also eine Art von Umkristallisation ein. Eine solche Gelatine ist von besonders hohem Wert für photographische Zwecke.
Wenn man die Collagenlösung, die nach Beispiel 1 oder 2 gewonnen wurde, auf eine Kunststoffplatte aufbringt und bei Raumtemperatur trocknet, erhält man einen klaren Film. Ein solcher Film ist beson ders nützlich für medizinische Kapseln, zum Verpak- ken für Nahrungsmittel, u. dgl.
Wenn man die nach Beispiel 1 erhaltene Colla- genlösung filtriert und durch eine Düse in eine 2 m Natriumchloridlösung bei einer Temperatur von 25 C einspritzt, die Faser ausfällt, das Wasser mit Hilfe von Aceton entfernt, das erzeugte Produkt in einer Mischung von 10 % Formalin und 0,02 m Na2HP04 gerbt und an der Luft trocknet oder mit Aceton behandelt,
entsteht ein Collagengarn. Auch wenn man eine Collagenlösung, die einen Zusatz von nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren er haltener Gelatine beigefügt enthält, durch eine Düse in ein Gemisch aus 0,02 m Na2HP04, 10 0/0 Forma- lin und 2 m Natriumchlorid einspritzt, entsteht ein Garn, das eine geringere Elastizität aufweist. Bei der Herstellung von Fasern aus Protein, wie Albumin, Casein oder Seide, nach bekannten Verfahren wird stets im Laufe des Prozesses die Molekularstruktur verändert.
Im Gegensatz dazu ist die durch Anwen dung des erfindungsgemässen Verfahrens gewonnene Collagenfaser dadurch charakterisiert, dass sie diesel be Molekularstruktur wie das Ausgangsmaterial auf weist.
Method for Solubilizing Insoluble Collagen Fibers and Obtaining Collagen Without Changing the Molecular Structure The present invention relates to solubilizing collagen fibers which were previously thought to be insoluble. Collagen is a fibrous protein that is the main component of animal connective tissue.
Up until now, it was believed that it was impossible to detach this collagen without converting the spiral structure in the manner of solid rods, which is a characteristic property of the molecule, into a thread-like structure whose threads can fold. Processes of this kind with a change in the molecular structure occur when heated to a temperature above 50 C, or when using a protein denaturant such as potassium thiocyanide, calcium chloride, urea, etc., or when the collagen is converted into a gelatin.
However, since 1927 it was known that a small proportion of a given amount of collagen can be brought into solution with dilute acid or dilute alkali or with a solution of a neutral salt, whereby the characteristic molecular structure of collagen, the spiral shape with its Strength, is retained, and that the fiber can be separated again from this solution in its original form. The collagen in this state was distinguished from the rest of the collagen as soluble collagen.
However, it only made up a very small percentage of the total mass of collagen, and this amount varied slightly with age, body part and the type of animal from which the colagen came. The main part of the collagen has been regarded as insoluble until today.
The present process now creates a possibility of converting such collagen, which was previously considered insoluble, into the soluble form in good yield without denaturing it, ie. i.e., while maintaining the spiral structure of the molecule, and redepositing the fiber in its original molecular form in good yield. The process thus allows soluble collagen to be produced on an industrial scale.
Collagen films, collagen threads, collagen tissue and collagen sponges can be produced from the solution obtained.
If such solubilized collagen fibers are suspended in water and heated to 65-75 C, a homogeneous gelatine of high purity and a higher solidification and melting point compared to the known gelatine can be obtained in 100% yield and in a much shorter amount Gain time.
According to the process according to the invention, the so-called insoluble collagen is brought into solution, in which it has a uniform molecular weight and the characteristic spiral structure, by allowing a hydrolytic enzyme to act on the insoluble collagen at a low temperature, namely at a temperature below 60 ° C. and the collagen is treated with a dilute acid solution of pH 1-4 below the denaturation temperature of 37 ° C.
From this collagen solution the fiber is in its original form with 100% yield z. B. by neutralization, by dialysis, with the aid of an ion exchange resin, or by an organic solvent, e.g. B. acetone or alcohol, deposited again. Dialysis can be performed from water or from Na2HP04 solution.
The separation can also be achieved by adding sodium chloride, sodium citrate, sodium acetate and the like. dgL, bring about. However, the abovementioned elimination methods are not as advantageous as the use of a surface-active agent. They require a longer expenditure of time for the precipitation and for the suppression of the swelling of the fibers in the subsequent washing process. These disadvantages are eliminated when a surfactant is used and the fiber is cleaned at the same time.
<I> Example 1 </I> 3 kg cowhide with a moisture content of about 70%, from which the soluble protein has been removed with the aid of the above aqueous sodium chloride solution and subsequent washing with water, or which has been depilated by liming Hydrochloric acid was neutralized and washed with water, who dipped in 3 liters of a solution containing 6 g of trypsin, and left standing therein at a temperature of 25 C with occasional stirring for 90 hours.
The H ion concentration of the enzyme solution is then adjusted to pH 8 with caustic soda or a boric acid buffer solution. The same result can be achieved by using pancreatin instead of trypsin.
In this case, however, the enzyme should be used in an amount of 0.5-2% of the solution, depending on its lower activity. During the treatment with the enzyme, the collagen does not dissolve and does not noticeably change its appearance.
After the trypsin has been removed by thorough rinsing in running water, the cow skin is placed in <B> 100 </B> liters of water. The water is adjusted to a pH of 2-3 by adding hydrochloric acid while stirring. About 35 cm3 of concentrated 12N hydrochloric acid are required for this purpose. While stirring at a temperature of 20-25 C for 24 hours, the cow skin dissolves completely dig in the form of a viscous liquid, such as gluten.
The same result can be obtained by using other mineral acids, e.g. B. Schwefelsäu re, phosphoric acid, etc., or by organic acid ren, z. B. acetic acid, citric acid, u. Like., Achieve in place of hydrochloric acid.
The viscous solution is filtered through a press filter using cloth and degreased cotton as the filter material. After neutralizing the filtrate with the addition of about 56 cm3 of a 30% sodium hydroxide solution, adjusting the H-ion concentration to a pH of 5-8 and leaving it to stand for a few hours, a fibrous, white precipitate separates out. The precipitate is washed thoroughly with water, collected by filtration or centrifugation, and air-dried. About 700 g of snow-white collagen are obtained.
Since the nitrogen content of the remaining liquid is practically zero, it follows that the precipitation of the collagen was quantitative. In addition to the aforementioned neutralization of the solution, the collagen fiber can also be removed by dialysis with 0.02 m Na2HP04 or by adding as much acetone or alcohol
that the concentration of the mixture makes up about 30% of the organic liquid. The collagen fiber obtained in this way has the same physicochemical properties in terms of viscosity, double refraction, specific rotation, denaturation and shrinkage temperature, subsidence rate, etc., as the soluble collagen obtained according to previous experiments.
The collagen fibers produced by the process according to the invention have a molecular structure of solid spiral construction, an intrinsic viscosity of 15, a uniform length of the molecule of 3000 angstroms, a uniform diameter of 13.6 angstroms, a specific rotation of -415, a constant lowering speed of 30 Svedberg units, a denaturation temperature of 37 C and a shrinkage temperature of 60 C.
If one observes the precipitated collagen fiber under the electron microscope, one can see that it has a transversely furrowed pattern with a period of 700 angstroms, as is characteristic of the undissolved, natural collagen fiber.
<I> Example 2 </I> Similar to Example 1, 3 kg of cowhide with a moisture content of about 70%, from which the soluble protein has been removed with an aqueous solution of sodium chloride and subsequent washing, or that of depilation by liming which has been subjected to neutralization with hydrochloric acid and washing with water, is placed in 3 liters of an aqueous solution,
which contains 6 g of pepsin and whose H ion concentration is adjusted to a pH of 2-2.5. The cowhide is treated for 48 hours at a temperature of 25 C with occasional stirring. In this case, in addition to the action of the enzyme, a partial dissolution of the collagen takes place, since the optimal pH value for pepsin is around 2, in contrast to example 1, in which trypsin is used.
However, not all of the cow skin dissolves in this process, since the solubility of collagen in a dilute acid solution is around 1%. After a treatment time of 48 hours with the enzyme, the volume of the solution is increased to <B> 100 </B> liters by adding 0.005N hydrochloric acid (pH = 1-1.5). All collagen dissolves in the course of 24 hours at a temperature of 25 C and constant stirring.
The same result is obtained if another inorganic acid or an organic acid is used in place of hydrochloric acid, as already mentioned in Example 1. The precipitation process for the dissolved collagen is the same as in Example 1. The collagen is never beaten by neutralizing the solution with caustic soda and allowing it to stand for several hours.
After washing and drying the precipitate, approximately 700 g of collagen fibers are obtained. The collagen fiber obtained by the pepsin digestion differs slightly both from the product obtained by the known methods of acid extraction without the use of an enzyme and from the product according to Example 1 in terms of its molecular properties.
It behaves just like the two aforementioned types with regard to the denaturing temperature, the shrinkage temperature, the specific rotation, the subsidence constant, the homogeneity of the molecular weight, etc., and it also shows the same fixed spiral structure as the other two types. However, the viscosity is only 9.5, which is a little less than the two other forms, and the length of the molecule is also around 200 Angstroms shorter, in accordance with the birefringence.
The collagen fiber obtained is therefore somewhat shortened at the end compared to the natural fiber. If this collagen is suspended in water in the ratio of 1 part by weight of collagen to 2 parts by weight of water and heated to a temperature of 60-70 C, the collagen is denatured and dissolves in a few minutes. When the solution cools, a gel forms which, when dry, yields gelatin. If you compare this gelatine with the product from known processes, it turns out that the new process is superior to the known in the following points: 1. Compared with the previously used cremation process, the new process only takes a fifth of the time its implementation.
2. The yield is practically 100%.
3. The physical properties such as the strength of the gelatinous mixture, solidification point, melting point, etc., are better than those of the best quality products according to the known process, with the known product only about 30% of the product obtained being of good quality.
4. There is no need for a concentration process, and the expenditure for the heat requirement is only half because with the previous method, evaporation had to follow after the extraction.
5. The purity of the product is much greater than that of gelatine according to the known process, since in the new process the collagen fiber is first dispersed in a molecular state in a solution and then precipitated. The manufacturing process therefore includes a type of recrystallization. Such gelatin is of particularly high value for photographic purposes.
If the collagen solution obtained according to Example 1 or 2 is applied to a plastic plate and dried at room temperature, a clear film is obtained. Such a film is particularly useful for medical capsules, food packaging, and the like. like
If the collagen solution obtained according to Example 1 is filtered and injected through a nozzle into a 2 M sodium chloride solution at a temperature of 25 C, the fiber precipitates, the water is removed with the aid of acetone, the product produced in a mixture of 10% formalin and 0.02 m Na2HP04 tanned and air-dried or treated with acetone,
a collagen yarn is created. Even if a collagen solution, which contains an addition of gelatine obtained by the method described above, is injected through a nozzle into a mixture of 0.02 m Na 2 HPO 4, 10 0/0 formaline and 2 m sodium chloride, a yarn is produced which has a lower elasticity. When producing fibers from protein, such as albumin, casein or silk, using known processes, the molecular structure is always changed in the course of the process.
In contrast to this, the collagen fiber obtained by applying the method according to the invention is characterized in that it has the same molecular structure as the starting material.