CH403294A - Verfahren zur Löslichmachung von unlöslichen Collagenfasern und Gewinnung des Collagens ohne Änderung der Molekularstruktur - Google Patents

Description

  Verfahren     zur        Löslichmachung    von     unlöslichen        Collagenfasern     und     Gewinnung    des     Collagens    ohne     Änderung    der     Molekularstruktur       Die vorliegende Erfindung betrifft die     Löslich-          machung    von     Collagenfasern,    die man bisher für  unlöslich hielt. Das Collagen ist ein faseriges Pro  tein, das den Hauptbestandteil des tierischen Binde  gewebes darstellt.

   Man war bisher der Auffassung,  dass es unmöglich sei, dieses Collagen herauszulösen,  ohne die     Spiralstruktur    nach Art fester Stäbchen,  welche eine charakteristische Eigenschaft des Mole  küls bildet, in eine fadenförmige Struktur umzuwan  deln, deren Fäden sich falten können. Vorgänge die  ser Art mit Änderung der     Molekularstruktur    treten  bei Erhitzung auf eine Temperatur über 50  C ein,  oder bei Verwendung eines     Proteindenaturierungs-          mittels,    wie     Kaliumthiocyanid,        Calciumchlorid,     Harnstoff, usw., oder bei     überführung    des     Collagens     in eine Gelatine.

   Seit 1927 war es aber     bekannt,    dass  ein kleiner Anteil einer gegebenen Menge von Colla  gen mit verdünnter Säure oder verdünntem Alkali  oder auch mit einer Lösung eines     Neutralsalzes        in     Lösung gebracht werden kann, wobei die charakteri  stische     Molekularstruktur    des     Collagens,    die     Spiral-          form    mit ihrer Festigkeit, erhalten bleibt, und dass  sich die Faser in ihrer ursprünglichen Form aus die  ser Lösung wieder abscheiden lässt. Das in diesem  Zustand befindliche Collagen wurde als lösliches  Collagen von dem übrigen Collagen unterschieden.

    Es machte aber nur einen ganz geringen Prozentsatz  von der Gesamtmasse des     Collagens    aus und diese  Menge wechselte leicht mit dem Alter, dem  Körperteil und der Art des Tieres, von dem das Col  lagen stammte. Der Hauptteil des     Collagens    ist aber  bis heute als     unlöslich    angesehen worden.  



  Das vorliegende Verfahren     schafft    nun eine  Möglichkeit, solches, bisher als unlöslich betrachtetes  Collagen in guter Ausbeute in die lösliche Form  überzuführen, ohne es zu denaturieren, d. h., bei    Aufrechterhaltung der     Spiralstruktur    des Moleküls,  und die Faser in ihrer ursprünglichen     Molekularform     wieder in guter Ausbeute abzuscheiden. Das Verfah  ren erlaubt     somit,    lösliches Collagen     in    industriellem  Masstab herzustellen.

   Aus der gewonnenen Lösung  können     Collagenfilme,        Collagenfäden,        Collagengewe-          be    und     Collagenschwämme    erzeugt werden.

   Wenn  man solche löslich gemachte     Collagenfasern    in Was  ser suspendiert und auf 65-75 C     erhitzt,    kann man  eine homogene Gelatine von hoher     Reinheit    und  einem höheren     Erstarrungs-    und     Schmelzpunkt        ge-          genüber        der        bekannten        Gelatine        in        100        %iger        Aus-          beute    und in weit kürzerer Zeit gewinnen.  



  Nach dem     erfindungsgemässen    Verfahren wird  das     sogenannte    unlösliche Collagen in Lösung ge  bracht, in der es ein     einheitliches        Molekulargewicht     und die     charakteristische        Spiralstruktur    aufweist,  indem man auf das unlösliche Collagen bei niedriger  Temperatur, nämlich bei einer Temperatur unterhalb  von 60 C, ein     hydrolitisches    Enzym einwirken lässt  und das Collagen mit einer verdünnten Säurelösung  von     pH    1-4 unterhalb der     Denaturierungstempera-          tur    von 37 C behandelt.

   Aus dieser     Collagenlösung     wird die Faser in ihrer     ursprünglichen    Form     mit     100     o/oiger    Ausbeute z. B. durch Neutralisation, durch  Dialyse, mit Hilfe eines     lonenaustauschharzes,    oder  durch ein organisches Lösungsmittel, z. B. Azeton  oder Alkohol, wieder abgeschieden. Die Dialyse     kann     aus Wasser oder aus     Na2HP04-Lösung    erfolgen.

   Die       Abscheidung    lässt sich auch durch Zusatz von     Natri-          umchlorid,        Natriumcitrat,        Natriumacetat,    u.     dgL,    her  beiführen. Die genannten     Ausscheidungsmethoden     sind aber nicht so vorteilhaft wie die Verwendung  eines oberflächenaktiven Mittels. Sie verlangen     einen     längeren Zeitaufwand für die Fällung und für die Un  terdrückung der Schwellung der Faser beim nachfol-           genden    Waschprozess. Diese Nachteile fallen weg,  wenn man ein oberflächenaktives Mittel benutzt, und  die Faser wird gleichzeitig     gereinigt.     



  <I>Beispiel 1</I>  3 kg Kuhhaut mit einem Feuchtigkeitsgehalt von  etwa 70 0/0, von welcher das lösliche Protein mit Hilfe  einer 5 obigen wässerigen     Natriumchloridlösung    und  nachfolgendes Waschen mit Wasser entfernt worden  ist, oder die durch     Äscherung    enthaart, mit Salzsäure  neutralisiert und mit Wasser gewaschen wurde, wer  den in 3 Liter einer Lösung eingetaucht, die 6 g       Trypsin    enthält, und darin bei einer Temperatur von  25 C und gelegentlichem Umrühren 90 Stunden ste  hen gelassen.

   Darauf wird die H     Ionenkonzentration     der     Enzymlösung    mit     Ätznatron    oder einer     Borsäure-          Pufferlösung    auf     pH    8 eingestellt. Man     kann    das  gleiche Resultat auch bei Verwendung von     Pancrea-          tin    an Stelle von     Trypsin    erzielen.

   In diesem Fall       sollte        aber        das        Enzym        in        einer        Menge        von        0,5-2        %     der Lösung, entsprechend seiner geringeren Aktivität,  angewendet werden. Während der Behandlung mit  dem Enzym löst sich das Collagen nicht auf und       verändert    auch nicht     merklich    sein Aussehen.

   Nach  dem das     Trypsin    durch gründliches Spülen in     flies-          sendem    Wasser entfernt worden ist, wird die Kuhhaut  in<B>100</B> Liter Wasser eingebracht. Das Wasser wird  durch Zusatz von     Salzsäure    unter Rühren auf ein     pH     von 2-3 eingestellt. Für diesen Zweck sind etwa  35     cm3    konzentrierter 12     n-Salzsäure        erforderlich.     Unter Rühren bei einer Temperatur von 20-25 C  während 24     Stunden    löst sich die Kuhhaut vollstän  dig in Form einer viskosen     Flüssigkeit,    wie Gluten,  auf.

   Das     gleiche        Ergebnis    kann man durch Verwen  dung von anderen Mineralsäuren, z. B. Schwefelsäu  re, Phosphorsäure, usw., oder durch organische Säu  ren, z. B. Essigsäure, Zitronensäure, u. dgl., an Stelle  von Salzsäure erzielen.

   Die viskose Lösung wird  durch ein Pressfilter unter Benutzung von Stoff und  entfetteter Baumwolle als Filtermaterial     filtriert.     Nach Neutralisation des Filtrats unter Zusatz von  etwa 56     cm3        einer    30     o/oigen        Natriumhydroxydlösung,     Einstellung der     H-Ionenkonzentration    auf ein     pH     von 5-8, und Stehenlassen während einiger Stunden,  scheidet sich ein faseriger, weisser Niederschlag aus.  Der Niederschlag wird gründlich mit Wasser gewa  schen, durch Filtration oder Zentrifugieren gesam  melt und an der Luft getrocknet. Man erhält ungefähr  700 g von     schneeweissem    Collagen.

   Da der Stick  stoffgehalt der zurückgebliebenen Flüssigkeit prak  tisch Null ist,     folgt,    dass die Ausfällung des     Collagens     quantitativ war. Man kann die     Collagenfaser    ausser  durch die vorgenannte Neutralisation der Lösung  auch durch Dialyse mit 0,02 m     Na2HP04    oder .durch  Zusatz von so viel Aceton oder     Alkohol,

      dass die       Konzentration        der        Mischung        etwa        30        %        an        der        orga-          nischen    Flüssigkeit ausmacht, ausfällen. Die so erhal  tene     Collagenfaser    hat dieselben physikochemischen  Eigenschaften     in    Bezug auf Viskosität, Doppelbre  chung, spezifische Rotation,     Denaturierungs-    und    Schrumpftemperatur, Senkungsgeschwindigkeit, usw.,  wie das nach den bisherigen Versuchen gewonnene  lösliche Collagen.

   Die nach dem erfindungsgemässen  Verfahren hergestellten     Collagenfasern    besitzen eine  Molekülstruktur des festen spiraligen Aufbaus, eine  innere Viskosität von 15,     gleichmässige    Länge des  Moleküls von 3000     Angström,    gleichmässigen  Durchmesser von 13,6     Angström,    eine spezifische  Rotation von -415 , eine konstante Senkgeschwin  digkeit von 30     Svedberg-Einheiten,    eine     Denaturie-          rungstemperatur    von 37 C und eine Schrumpftempe  ratur von 60 C.

   Wenn man die ausgefällte     Collagen-          faser    im Elektronenmikroskop beobachtet, kann man  feststellen, dass sie ein quer gefurchtes Muster mit       einer    Periode von 700     Angström    aufweist, ebenso  wie es für die ungelöste, natürliche     Collagenfaser     charakteristisch ist.  



  <I>Beispiel 2</I>  Ähnlich wie im Beispiel 1 werden 3 kg Kuhhaut       mit        einem        Feuchtigkeitsgehalt        von        etwa        70        %,        aus     denen das     lösliche    Protein mit einer wässerigen  Lösung von     Natriumchlorid    und nachfolgendem Wa  schen entfernt wurde, oder die der Enthaarung durch       Äscherung,    der Neutralisation mit Salzsäure und Wa  schen mit Wasser unterzogen worden war, in 3 Liter  einer wässerigen Lösung eingebracht,

   die 6 g Pepsin       enthält    und deren     H-Ionenkonzentration    auf ein     pH     von 2-2,5 eingestellt ist. Die Kuhhaut wird darin bei  einer Temperatur von 25 C unter gelegentlichem  Rühren 48 Stunden lang behandelt. In diesem Fall       erfolgt    neben der Einwirkung des Enzyms eine teil  weise Auflösung des     Collagens,    da der optimale     pH-          Wert    für Pepsin bei etwa 2 liegt, zum     Unterschied     gegenüber Beispiel 1, in dem     Trypsin    verwendet  wird.

   Es löst sich aber nicht die ganze Menge der  Kuhhaut bei diesem Vorgang auf, da die     Löslichkeit     des     Collagens    in einer verdünnten Säurelösung     unge-          fähr        bei    1     %        liegt.        Nach        einer        Behandlungsdauer        von     48 Stunden mit dem Enzym wird das Volumen der  Lösung durch Zusatz von 0,005 n Salzsäure auf<B>100</B>  Liter erhöht     (pH    = 1-1,5). Im Verlauf von 24 Stun  den bei einer Temperatur von 25 C und dauerndem  Rühren löst sich alles Collagen auf.

   Das     gleiche    Er  gebnis     erhält    man, wenn man eine andere anorgani  sche Säure oder eine organische Säure an Stelle von       Salzsäure    verwendet, wie bereits im Beispiel 1 er  wähnt. Das     Ausfällungsverfahren    für das gelöste Col  lagen ist dasselbe wie im Beispiel 1. Durch Neutrali  sation der Lösung mit     Ätznatron    und Stehenlassen  während mehrerer Stunden wird das Collagen nie  dergeschlagen.

   Nach dem Auswaschen und Trocknen  des Niederschlags erhält man ungefähr 700 g     Colla-          genfasern.    Die durch die     Pepsinverdauung    gewonne  ne     Collagenfaser    unterscheidet sich ein wenig sowohl  von dem nach den bekannten Methoden der Säureex  traktion ohne Benutzung eines Enzyms erhaltenen  Produkt als auch von dem Erzeugnis nach Beispiel 1  in ihren molekularen Eigenschaften.

   Sie verhält sich  ebenso wie die beiden vorgenannten Typen in bezug  auf die     Denaturierungstemperatur,    die Schrumpftem-           peratur,    die spezifische Rotation, die Senkungskon  stante, die Homogenität des     Molekulargewichts,    usw.,  und sie zeigt auch dieselbe feste     Spiralstruktur    wie  die beiden anderen Arten. Die Viskosität beträgt aber  nur 9,5, ist also etwas geringer als bei den beiden an  deren Formen, und auch die Moleküllänge ist um un  gefähr 200     Angström    kleiner, in     Übereinstimmung     mit der Doppelbrechung.

   Die gewonnene     Collagenfa-          ser    ist sonach gegenüber der natürlichen Faser am  Ende etwas gekürzt. Wenn man dieses Collagen in  Wasser im Verhältnis von 1 Gewichtsteil Collagen zu  2 Gewichtsteilen Wasser suspendiert und es auf eine  Temperatur von 60-70 C erhitzt, wird das Collagen  denaturiert und löst sich in wenigen Minuten auf.  Beim Abkühlen der Lösung entsteht ein Gel, das bei  Trocknen Gelatine liefert. Wenn man diese Gelatine  mit dem Produkt aus bekannten Verfahren ver  gleicht, zeigt sich, dass das neue Verfahren dem be  kannten in folgenden Punkten überlegen ist:  1. Im Vergleich mit dem bisher benutzten     Äsche-          rungsverfahren    braucht das neue Verfahren nur ein  Fünftel der Zeit zu seiner Durchführung.  



  2. Die Ausbeute beträgt praktisch 100 0/0.  



  3. Die physikalischen Eigenschaften wie Festig  keit der Gallerte,     Erstarrungspunkt,        Schmelzpunkt,     usw., sind besser als bei den besten Qualitätserzeug  nissen nach dem bekannten Verfahren, wobei bei       dem        bekannten        Produkt        nur        etwa        30        %        des        gewonne-          nen        Erzeugnisses    von guter Qualität sind.  



  4. Es ist kein     Konzenrationsverfahren    erforder  lich, und die Ausgaben für den Wärmebedarf betra  gen nur die Hälfte, weil bei der früheren Methode  nach der Extraktion ein Eindampfen folgen musste.  



  5. Die Reinheit des Erzeugnisses ist viel grösser  als bei der Gelatine nach dem bekannten     Verfahren,     da bei dem neuen Verfahren die     Collagenfaser    zu  nächst in molekularem Zustand in einer Lösung dis  pergiert und dann ausgefällt wird. Der     Herstellungs-          prozess    schliesst also eine Art von Umkristallisation  ein. Eine solche Gelatine ist von besonders hohem  Wert für photographische Zwecke.  



  Wenn man die     Collagenlösung,    die nach Beispiel  1 oder 2 gewonnen wurde, auf eine Kunststoffplatte  aufbringt und bei Raumtemperatur trocknet, erhält  man einen klaren Film. Ein solcher Film ist beson  ders nützlich für medizinische     Kapseln,    zum     Verpak-          ken    für Nahrungsmittel, u. dgl.  



  Wenn man die nach Beispiel 1 erhaltene     Colla-          genlösung        filtriert    und durch eine Düse in eine 2 m       Natriumchloridlösung    bei einer Temperatur von  25 C einspritzt, die Faser ausfällt, das Wasser mit  Hilfe von Aceton entfernt, das erzeugte Produkt in       einer        Mischung        von        10        %        Formalin        und        0,02        m          Na2HP04    gerbt und an der Luft trocknet oder mit  Aceton behandelt,

   entsteht ein     Collagengarn.    Auch  wenn man eine     Collagenlösung,    die einen Zusatz von  nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren er  haltener     Gelatine    beigefügt enthält, durch eine Düse  in ein Gemisch aus 0,02 m     Na2HP04,    10 0/0 Forma-         lin    und 2 m     Natriumchlorid    einspritzt, entsteht ein  Garn, das eine geringere Elastizität aufweist. Bei der  Herstellung von Fasern aus Protein, wie Albumin,       Casein    oder Seide, nach     bekannten        Verfahren    wird  stets im Laufe des Prozesses die     Molekularstruktur     verändert.

   Im Gegensatz dazu ist die durch Anwen  dung des     erfindungsgemässen    Verfahrens gewonnene       Collagenfaser    dadurch charakterisiert, dass sie diesel  be     Molekularstruktur    wie das Ausgangsmaterial auf  weist.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Löslichmachung von unlöslichen Collagenfasern, und Gewinnung des Collagens ohne Änderung der Molekularstruktur, ausgehend von einem Collagen, das nicht in einer verdünnten Lösung einer Säure, eines Alkali oder eines neutralen Salzes löslich ist, dadurch gekennzeichnet,

   dass man das Collagen mit einem hydrolytischen Enzym bei einer Temperatur unterhalb von 60 C behandelt, mit einer verdünnten Säurelösung vom pH 1-4 bei einer Temperatur von weniger als 37 C in Lösung bringt und anschliessend aus der Lösung abscheidet. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Abscheidung des Collagens durch Neutralisation der Collagenlösung erfolgt. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Abscheidung des Collagens durch Dialyse der Collagenlösung erfolgt. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Abscheidung des Collagens durch Zusatz eines organischen Lösungsmittels zur Collagenlösung erfolgt. 4. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Abscheidung des Collagens mit Hilfe eines oberflächenaktiven Mittels erfolgt. 5.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man zur Abscheidung des Colla- gens die Collagenlösung durch eine Düse in eine 2 m Lösung von Natriumchlorid einspritzt, das Wasser mit Aceton entfernt, den Niederschlag in einem Ge- misch von 10 % Formalin und einer 0,

   02 m Lösung von Na2HP04 gerbt und an der Luft trocknet. 6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man zur Abscheidung des Colla- gens die Collagenlösung durch eine Düse in eine 2 m Lösung von Natriumchlorid einspritzt, das Wasser mit Aceton entfernt,

   den Niederschlag in einem Ge- misch von 10 % Formalin und einer 0,02 m Lösung von Na2HP04 gerbt und mit Aceton trocknet. 7.

   Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man zur Abscheidung des Colla- gens die Collagenlösung auf eine Kunststoffplatte giesst und bei Raumtemperatur trocknet.