Verfahren zur Herstellung des Antibioticums Capreomycin Die Erfindung schlägt ein Verfahren zur Her stellung von Capreomycin vor, das darin besteht, dass man einen Capreomycin bildenden Stamm von Streptomyces capreolus in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, .Stickstoff und anorganische Salze enthält, eingetaucht unter aeroben Bedingungen züchtet,
bis von -dem Orga nismus in dem Kulturmedium eine wesentliche Menge Capreomycin gebildet worden ist.
Die hier beschriebene neuartige Base wird als Capreomycin bezeichnet und ist eine weisse feste Substanz mit den folgenden Eigenschaften: Sie ist leicht löslich in Wasser. Dagegen ist sie in den meisten organischen Lösungsmitteln verhältnismässig unlöslich. Sie ist z.
B. verhältnismässig unlöslich in niederen Ketonen, wie Aceton und Methylisobutyl keton, in Alkoholen, wie Methanol, Äthanol und Butanol, in Estern, wie Amylacetat, und in Äthern, wie Diäthyläther. Ferner ist se. verhältnismässig un löslich in Lösungsmitteln wie Pyridin,
halogenierten Kohlenwasserstoffen, Benzol und Kohlenwasser- stoffen.
Die freie Base Capreomycin ist verhältnismässig beständig in wässrigen Lösungen innerhalb eines pH- B.ereiches von etwa 4 bis 8, ist aiber unbeständig .in stark basischen und stark sauren Lösungen. Im all gemeinen ist Capreomycin in sauren Lösungen be ständiger als in basischen Lösungen.
Die elektrometrische Titration von Capreomycn in Dimethylformamid - Wasser (2: 1 Volumteile) zeigt die Anwesenheit von .titrierbaren Gruppen mit den folgenden pK'a Werten: 6;5; 8,0; 10;0 und 13,0: Das durch elektrometrische Titration bestimmte Molekulargewicht von Capreomycin ist etwa 740.
Das Tetrahydrochlorid von Capreomycin ist in wasserfreiem Methanol zu etwa 6,.6 mg je cm3 .bei 26 C löslich.
Die Analyse von Capreomycin, das im Vakuum ,bei Raumtemperatur über wasserfreiem Cälciumsulfat 16 Stunden getrocknet wurde, ergab, ,dass es als freie Base vorlag und ungefähr -den folgenden Prozent gehalt hatte:
EMI0001.0076
Kohlenstoff <SEP> 44,08
<tb> Wasserstoff <SEP> 6,94
<tb> Stickstoff <SEP> 26,23
<tb> .Sauerstoff <SEP> (direkt) <SEP> 22,8 Diese Werte ergeben die empirische Formel C25-28H50 -53N14010, doch ist diese Formel natürlich nur eine Annäherung, die sieh bei der -genauen Aufklärung der Struktur der Verbindung noch etwas ändern kann.
Die Infrarotabsorptionskurve :des Capreomycin dihydrochlorids -als von Mineralöl. bedecktes Pulver zeigt Fzg. 1. Die erkennbaren Banden des Infrarot- absorptionssp:ektrums im Bereich von 2,0 bis 15,0 lü liegen wie folgt: 3,10; 6;00; 6;65 und 8,15.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Capreomycin zeigt intensive Absorptionsmaxima. von etwa 268 mit in 0,03n Salzsäure bei einem Absorptionswert von Ei @m = 269 und von etwa 283 m,u in 0,05n Kali lauge bei einem Absorptionswert von E i @m = 175-.
,Die spezifische optische Drehung einer im Va kuum bei Zimmertemperatur über wasserfreiem Cal ciumsulfat 16 Stunden .getrockneten Probe von Capreomycindisulfat ist.[a] D = - 27,6 (c =1 Gew.- Teil je 100 Volumteile in Wasser).
Die Substanz wurde nach bekannten Verfahren zur Analyse von Aminosäuren untersucht, z. B. nach dem von Moore und Stein in J.
Biol. Chem. 192, 663 (1951) angegebenen Verfahren, und die Analyse der Hydrolysate von Capreomycin, die durch Hydrolyse mit 5,7n Salzsäure bei 100 C erhalten wurden, zeigte die Anwesenheit von mehreren Ammosäureresten.. Die quantitative Bestimmbarkeit der in derartigen Säurehydrolysaten enthaltenen Aminosäurereste ist begrenzt,
weil die Beständigkeit :der Peptidbindungen gegenüber Spaltung und die Beständigkeit der Amino- säurereste in den Säurehydrolysaten sehr unterschied lich ist.
Unter dieser Voraussetzung und in der An nahme eines Molekulargewichtes von etwa 740 er gibt die vorläufige Aminosäureanalyse mindestens je einen Rest der folgenden Aminosäuren im -Molekül des Capreomycins: Ahnin, Serin, 2,3-Diaminopro- pionsäure und zwei basische Aminosäuren, von denen die eine sich wahrscheinlich von Ornithin herleitet und die andere wahrscheinlich .bisher unbekannt ist.
Die bisherigen Analysen haben noch keinen Auf schluss über die Anwesenheit von sauren (mehrere Carboxylgrappen enthaltenden), aromatischen oder Schwefel enthaltenden Aminosäuren gegeben.
Mit Capreomycin ausgeführte chemische Unter suchungen brachten die folgenden Ergebnisse: Die Ninhydrinprobe auf Anwesenheit von a-Aminogrup- pen war positiv. .Die Lowrysche [J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)] und die Folin-Ciocalteausche Protein probe waren positiv.
Die Anthron-, Bialsche und Taubersche Saccharidprobe waren negativ sowie auch die Ehrlichsche Indolprobe. Die Hydroxamsäure- probe auf Estergruppen, wie sie in J. Bol. Chem. <I>159, 21</I> (1945) :beschrieben ist, war auch negativ.
Capreomycin hat eine Hemmwirkung .gegenüber dem Wachstum bestimmter Mikroorganismen, ein- schliesslich grampositiver und grammnegativer Bak terien. Die Mengen, die eine Hemmwirkung gegen über dem Wachstum einer Reihe von Organismen hervorrufen, sind in Tabelle I angegeben.
Die Hemm- konzentrationen wurden durch Agarverdünnungs- probe oder durch Nährlösungsverdünnungsprobe, be- stimmt (in der Tabelle mit ad bzw. bd bezeich net).
Bei der Agarverdünnungsprobe wird der Probe organismus. auf eine Reihe von Agarplatten, die ver- verschiedene Konzentrationen an Capreomycin in dem Agar enthalten, ausgestrichen oder in diese im- plantiert, um die Mindestkonzentration an Capreo- mycin in y/cm3 ;
zu ermitteln, die das Wachstum des Organismus 48 Stunden lang hemmt.
Bei der Nährlösungsverdünnungspro'be; wird eine Reihe von Röhrchen, die eine Nährlösung mit ver schiedenen Konzentrationen an Capreomycin ent halten, mit dem Probeorganismus beimpft, um die Mindestkonzentration an Capreomycin in y/cm3 in der Nährlösung zu ermitteln, die das Wachstum des Organismus etwa 24 Stunden lang hemmt.
EMI0002.0117
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Hemm Untersuchter <SEP> Organismus <SEP> konzentration
<tb> (<U>y</U>/cm3)
<tb> <I>Bakterien</I>
<tb> -'Staphylöcoccus <SEP> .äureus <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> -_ <SEP> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 25 <SEP> ad
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 1,56 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> twberculosis <SEP> (607) <SEP> 6,25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> tubereulosis
<tb> (607, <SEP> streptomycinresistent) <SEP> 3,1 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 6,25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium
<tb> (streptomycinresistent) <SEP> 1,
56 <SEP> ad
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 125 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> pullorum <SEP> 62,5 <SEP> b@d
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 125 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> .berta <SEP> 125 <SEP> bd Wie hoben erwähnt, können Capreomycin und seine Säureadditionssalze zur Behandlung von Bakte rieninfektionen in der Veterinärmedizin verwendet werden. Die Verbindungen sind z.
B. wirksam zur Behandlung von Krankheiten, die von Salmonellen hervorgerufen werden. Im einzelnen reichen etwa 400 mg je kg Körpergewicht, subcutan gegeben, aus, um eine Infektion durch Salmonella typhimurium bei Mäusen zu bekämpfen. Ferner reichen etwa 1 bis 5 mg Capreomycin bei intramuskulärer Injektion je Eintagsküken zur Bekämpfung einer Infektion von Salmonella pullornm aus.
Die Verbindungen sind ferner wirksame Kontakt gifte für Hausfliegen. Ein geeignetes Präparat für diesen Zweck ist eine wässrige Lösung von 0,4 GewA Capreomycin, entweder als freie Base oder als wasserlösliches Säureadditionssalz.
Die Verbindungen haben blutdrucksenkende Wir kung, wie die genormte pharmakologische Prüfung an anästhesierten Hunden zeigt.
Capreomycin und seine Säureadditionssalze haben in vivo eine antibakterielle Wirkung gegenüber infi zierenden Organismen bei subcutaner Injektion bei Mäusen, wobei der ED5o-Wert (wirksame Menge, um<B>50%</B> der Versuchstiere zu schützen) bei einigen Beispielen wie folgt liegt: Streptomycetes pyogenes, 250 mg (X 2); Proteus vulgaris, 84 mg (X 2);
Salmonella typhosa, 90 mg (X 2); und Klebsiena pneumoniae, 30 mg (X 2).
(Die Werte bedeuten die Menge Capreomycin je kg Körpergewicht des Versuchstieres. X 2 bedeutet zwei Gaben.) Ferner ist Capreomycin in vivo hei Mäusen wirksam gegen experimentell verursachte Tuber- kuloseinfektionen. Es ist z.
B. wirksam gegenüber Mycobacterium tuberculosis var. hominis (Stamm H37RV) bei Infektionen an Mäusen, wenn es sub- cutan oder oral gegeben wird.
Bei subcutaner Injek tion ist es wirksam bei einer Dosierung in, dem all- gemeinen Bereich, in dem die gegenwärtig :ange wendeten antituberkulösen Antibiotika, wie Strepto- mycin, wirksam sind.
Das Capreomycin kann durch Züchten eines bisher unbekannten Organismus unter aeroben Be dingungen in einem Kulturmedium hergestellt wer- ,den, das as,simlierbare Quellen für Kohlenstoff; Stickstoff und anorganische Salze enthält.
Der Orga nismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, indem Teile der Bodenprobe in sterilem destilliertem Was ser .suspendiert und die Suspensionen auf Nähragar ausgestrichen wurden. Die beimpften Nähragar- platten wurden mehrere Tage bei etwa 25 bis 35 C bebrütet. Nach Ablauf der Bebrütungszeit wurden Kolonien der Capreomycin bildenden Organismen mit einer sterilen Platinöse auf Schrägagar übertra gen.
Die beimpften Schrägagarböden wurden bebrü tet, um grössere Mengen Inoculum für .die Herstel lung von Capreomycin zu erhalten.
Der zur Bildung von Capreomycin befähigte neuartige Organismus wurde zur ständigen Aufbe wahrung an The Culture Collection of the Northenn Utilization Research and Development Branch des United States Department of Agriculture in
Peoria, Illinois, gegeben und erhielt die Kulturbezeichnung NRRL 2773 und den Namen Streptomyces capreolus.
Die folgende ausführliche Beschreibung<U>nimm</U>t im einzelnen Bezug auf diesen neu gefundenen Orga nismus NRRL 2773. Selbstverständlich gehört aber auch die Herstellung von Capreomycin durch Züch ten von anderen Capreomycin bildenden Organismen oder Mutanten von Capreomycin bildend-en Orga nismen, einschliesslich Mutanten von NRRL 2773, in den Bereich der Erfindung: Derartige andere Organismen, Rassen oder Mutanten können durch bekannte Verfahren, z.
B. durch Behandeln eines Capreomycin bildenden Organismus mit Röntgen- strahlen oder ultravioletter Strahlung oder mit che mischen Mitteln, z. B. den Stickstoffsenfölen (englisch: Bitrogen mustards), hergestellt werden.
Es folgen nun die Ergebnisse einer eingehenden systematischen Untersuchung des neuen Organismus S. capreolus NRRL 2773. Die in der Beschreibung angegebenen Farben entsprechen den von Maerz und Paul, Dictionary of Color (1950), angegebenen Defi nitionen.
<I>Mikroskopische Morphologie</I> Tomatenpaste-Hafermehl-Agar (14 Tage bei 30 C) Die Kolonien bilden gerade oder gekrümmte Sporophoren und cylindrische Konidien. Die Konidien haben 1,0 bis 1,2 ,u Durchmesser und 3,0 bis 4,8 ,u Länge.
Agar <I>nach</I> Hickey <I>und</I> Tresner (14 Tage bei 30 C) Mikroskopische Morphologie wie oben. Salz-Stärke-Agar (14 Tage bei 30 C) Mikroskopische Morphologie wie oben. <I>Kennzeichen der Kultur</I> Czapekscher Agar <I>{14</I> Tage bei 30 C) Mässig gutes Wachstum. Grössere Mengen an Luftmycel,
weisse und sehr geringe Sporenbil- dung. Rückseite orangenbraun bis rotbraun. Keine löslichen Pigmente.
Glucose-Asparagin-Agar (14 Tags bei 30 C) Mässiges Wachstum. Geringes, schwach gelb braunes (P1. 10-2.B) Luftmycel. Geringe SSpporen- bildung, Rückseite rotbraun. Hellbraunes lös liches Pigment.
<I>Anorganische</I> Salze-Stärke-Agar (14 Tage bei 30 C) Mässiges Wachstum; ziemlich starkes, fast weisses Luftmycel, Rückseite rotbraun. Hell rotbraunes lösliches Pigment.
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar (14 Tage bei 30 C) Mässiges Wachstum. Ziemlich starkes; fast weisses Luftmycel; Rückseite rotbraun. Hell .rotbraunes lösliches Pigment. Emersofzscher Agar (14 Tage bei 30 C) Mässiges Wachstum. Geringes, weisses Luftmycel. Keine Sporenbildung. Rückseite rotbraun. Hell- braunes lösliches Pigment.
Kartof felpfropfen-Agar (14 Tage bei 30 C) Kein Wachstum 'bis ausgezeichnetes Wachstum von vegetativem Mycel je nach der Kartoffel- sorte. Kein sichtbares Lufünycel. Durch die hell orange Rückseite und vegetatives Wachstum wird der Kartoffelpfropfen etwas gedunkelt.
Tyrosin-Agar (14 Tage bei 30 C) Ziemlich gutes Wachstum. Luftmycel fast weiss. Rückseite hellbraun. Hellbraunes lösliches Pig ment.
<I>Physiologie</I> H2S-Bildung auf Pepton-Eisen-Agar unter Zusatz von Hefe extrakt keine, beobachtet.
Gelatineverflüssigung mässig unter Bildung eines rotbraunen löslichen Pigmentes.
Nitratreduktion keine Reduktion in organischer Nährlösung, ge ringe Reduktion in synthetischer Nährlösung. Stärkehydrolyse nur teilweise Hydrolyse nach 14 Tagen. Magermilch weder Koagulation noch Peptonisation in 14 Ta gen. Orangebrauner Ring, kein Häutchen. Geringer pH-Anstieg.
In Tabelle Il sind die Ergebnisse angegeben, die bei Versuchen zur Kohlenstoffverwertung mit dem Organismus NRRL 2773 erhalten wurden. In der Tabelle werden die folgenden Symbole verwendet: + = Wachstum und Verwertung - = kein erkennbares Wachstum bzw. keine Verwertung.
EMI0004.0020
<I>Tabelle <SEP> I1</I>
<tb> Kohlenstoffverwertung <SEP> von <SEP> NRRL <SEP> 2773
<tb> Verbindung <SEP> Wachstumsverhalten
<tb> L(+) <SEP> Arabinose <SEP> +
<tb> D(+)-Glucose <SEP> +
<tb> D(-)-Fructose <SEP> +
<tb> i-Inosit
<tb> Maltose <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> - <SEP> +
<tb> D(+) <SEP> Xylose <SEP> L(+)-Rhamnose <SEP> Saccharose <SEP> Lactose <SEP> D(+)-Raffinose <SEP> Inulin <SEP> Mannit <SEP> Salicin <SEP> Sorbit <SEP> Cellulose <SEP> D-Ribose <SEP> D(+)
<SEP> Trehalose <SEP> - Das zur Herstellung von Capreomycin durch Züchten von NRRL 2773 verwendbare Kultur- medium kann verschiedenartig gewählt werden, wie aus den obigen Verwertungsversuchen hervorgeht; der Organismus vermag verschiedene Energiequellen zu nutzen.
Wegen der billigen Herstellung, der gro ssen Ausbeute an Antibioticum und der leichten Iso lierung des Antibioticums werden bestimmte Kultur medien bevorzugt, die verhältnismässig einfache Nährquellen enthalten. So enthalten z.
B. die Medien, die zur Herstellung von Capreonlycin verwendbar sind; eine assimüierbare Quelle für Kohlenstoff, wie Glucose, Fructose, Maltose, Mannose, lösliche Stärke, Melassen, Dextrin, braunen Zucker, Maisquellflüssig- keiten und dergleichen mehr. Die bevorzugte Quelle für Kohlenstoff ist Glucose.
Ferner enthalten die ver- wendbaren Medien ,eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie Hafermehl, Rindfleischextrakt, Pep- tone (aus Fleisch oder Soja), hydrolysiertes Casein, Hefe, Aminosäurengemisohe und dergleichen mehr. Gegenwärtig werden als Stickstoffquellen Peptone, hydrolysiertes Casein und Rindfleischextrakt bevor zugt.
Mineralsalze, z. B. Salze mit Calcium-, Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat und Carbonationen, und eine Quelle für Wachstumsfaktoren, wie Hefe oder Hefeextrakt, können den Medien vorteilhaft zuge setzt werden.
Wie es auch für das Wachstum und die Ent wicklung anderer Mikroorganismen notwendig ist, müssen dem Kulturmedium ferner essentielle Spuren elemente zugesetzt werden, um den erfindungsgemäss verwendeten Actinomyceten zu züchten. Solche Spurenelemente gelangen gewöhnlich als Verunreini gungen beim Zusatz der anderen Bestandteile in das Medium.
Der anfängliche pH-Wert des Kulturmediums kann stark schwanken. Es hat sich jedoch als zweck mässig erwiesen, dass der anfängliche pH-Wert des Mediums zwischen etwa 5,5 und 8,0; bevorzugt zwi schen etwa 6,5 und 7,0, liegt.
Wie auch bei anderen Actinomyceten beobachtet wurde, steigt der pH-Wert des Mediums während des Wachstums des Orga nismus allmählich an; während das Capreomycin gebildet wird und kann Werte von etwa 7,2 bis 8,0 oder darüber erreichen, wobei der Endwert minde stens teilweise von dem anfänglichen pH-Wert des Mediums, den indem Medium enthaltenen Puffern und der Zeit abhängt, die der Organismus wachsen kann.
Eingetauchte .aerobe Kulturen sind Bedingungen der Wahl für die: Herstellung von Capreomyein. Zur Herstellung verhältnismässig kleiner Mengen können Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden, doch werden für die Herstellung grosser Mengen eingetauchte aerobe Kulturen in sterilen Tanks bevorzugt.
Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension be- impft werden, aber wegen der bei Verwendung einer Sporensuspension als Inoculum zu beobachtenden Wachstumsverzögerung wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt.
Wenn die Wachstumsverzö- gerung hierdurch vermieden wird, ist auch eine wirk samere Ausnutzung der Gärvorrichtung möglich.
Es ist also zweckmässig, zuerst ein vegetatives Inoculum der Organismen herzustellen, "indem eine verhältnis mässig kleine Menge Kulturmedium mit der Sporen form .des Organismus beimpft wird, und wenn ein junges, aktives vegetatives Inoculum erhalten worden ist, dieses Inoculum aseptisch in den grossen Tank überzuführen.
Das Medium, in dem das vegetative Inoculum gebildet wird, kann das ,gleiche oder ein anderes sein, wie es zur Herstellung von Capreo- mycin im grossen Massstab verwendet wird.
Die -Organismen wachsen am besten bei Tempe raturen im Bereich von etwa 28 bis 37 C. Die beste Capreomycinbildung scheint bei etwa 29 bis 33 C zu erfolgen. Wie es bei Eintauchkulturverfahren üblich ist, wird sterile Luft durch .das Kulturmedium geblasen.
Die wirksamste Förderung :des Wachstums. 'et Orga nismus und :der Bildung von Capreomycin wird dann erreicht, wenn :das bei .dem Tankverfahren ver wendete Luftvolumen mehr als 0,1 Votumteil Luft je Minute je Volumteil Kulturmedium beträgt. Wirksames Wachstum und beste Ausbeuten an Capreomycin werden erzielt, wenn das verwendete Luftvolumen mindestens 1 Volumteil Luft je Minute je Volumteil Kulturmedium beträgt.
Die Konzentration an Capreomycinaktivität in dem Kulturmedium kann leicht während der Gärungs zeit durch Untersuchung von Proben des Kultur mediums auf ihre Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum eines Organismus verfolgt werden, der durch Capreomycin gehemmt wird. Der Organismus Klebsiena pneumonia hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen.
Die Untersuchung kann in be kannter Weise durch Trübungsmessung oder in Schalen erfolgen.
Im allgemeinen wird die grösste Menge nach dem Beimpfen des Kulturmediums innerhalb von etwa 4 bis 7 Tagen gebildet, wenn eine eingetauchte aerobe Kultur oder eine Schüttelkolbenkultur ver wendet wird, und innerhalb von etwa 5 bis 10 Tagen, wenn eine Oberflächenkultur verwendet wird.
Das Mycel und. ungelöste Feststoffe werden aus der Gärlösung in üblicher Weise, z. B. durch Filtrie ren -oder Zentrifugieren, entfernt. Das Antibioticum ist in der filtrierten Lösung enthalten und kann. daraus z. B. durch Adsorption entfernt werden.
Die verschiedenen Adsorptionsmittel, die verwendet wer den können, sind Adsorptionskohlen und Ionen austauschharze mit saurem Charakter, ein geeignetes Harz ist Dowex 50 (ein sulfoniertes Polystyrol harz der Dow Chemical Company).
Bei Verwendung von Kohle .als Adsorptions- mittel kann Capreomycin durch Zusetzen von Aktiv- kohle als Adsorptionsmittel, z. B. Darco G-60 (von der Atlas Powder Company), zu der filtrierten Lösung unter Rühren gewonnen werden.
Das Ge misch wird lange genug gerührt, dass das Capreo- mycin wirksam an der Kohle adsorbiert wird. Wenn etwa 2 bis 5 Teile Kohle je 1 Teil Feststoffgehalt der Lösung zugesetzt werden, wird eine befriedigende Entfernung des Capreomycins aus der Lösung inner halb von etwa 1 .bis 2 Stunden erreicht.
Die Kohle, an der das Antibioticum adsorbiert ist, wird von dem Gemisch abfiltriert und ,gründlich zur Entfernung nicht ads:
orbierter Verunreinigungen gewaschen. Das Antibioticum wird dann aus der gewaschenen Kohle eluiert. Es wurde gefunden, dass eine Kombination einer verdünnten wässrigen .Säure .mit einem mit Was ser mischbaren organischen Lösungsmittel wirksam zur Entfernung des Antibioticums aus der Kohle dienen kann.
Ein Gemisch von 80 Volumteilen 0,05n Salzsäure und 20 Volumteilen Aceton hat sich z. B. als wirksam zum Eluieren von Capreomycin erwiesen. Nach einem anderen Verfahren kann Capreo- mycin aus der filtrierten Lösung durch Berührung mit einem sauren Harz entfernt werden. Das Harz wird normalerweise in Salzform, z. B. als Natrium salz" angewendet. Das ads,orbierte Capreomycin kann aus dem Harz z. B. mit einer wässri#gen Lösung eines löslichen Salzes, z.
B. eines Sulfats, eines Chlorids oder eines Citrats., elmert werden. Das verwendete Salz kann Triäthylaminsulfat, Natriumchlorid, Ka- liumchlori'd, Natriumcitrat oder dergleichen sein.
Die Capreomycineluate können .gegebenenfalls durch Behandeln mit Kohle entfärbt werden. Wenn, ein verhältnismässig unreines Präparat von Capreomycin erhalten werden soll, brauchen die .ge nannten Eluate nur zur Trockne eingedampft zu werden. Die Eluate oder der trockene Rückstand der selben können jedoch zur weiteren Reinigung von Capreomycin verwendet werden. So kann, z.
B. das durch Adsorption mit Kohle erhaltene Eluat auf etwa <B>1/5</B> bis i/lo seines Volumens eingedampft werden, wobei das Aceton entfernt wird, und das Cäpreo- mycin aus dem wässrigen Konzentrat ausgefällt wer den. Die Fällung kann durch Zusatz eines geeigne ten Salzes unter Rühren erfolgen, z.
B. eines üblicher weise .zum Ausfällen von Proteinen verwendeten Salzes, wie Ammoniumsulfat, durch Ansäuern mit einer Säure, die ein Anion für das Capreomycin salz liefert, oder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton erfolgen. Ein bevorzugtes Fällungsmittel ist Schwefelsäure.
Zur Ausfällung wird dem konzentrierten Eluat gewöhnlich 10n Schwefelsäure in einer Menge, von etwa 1 Volumteil Säure je 100 Volumteile Capreo- mycinkonzentrat zugesetzt.
Das als sein. Schwefel- säuread@ditionssalz ausgefällte Capreomycin wird ab- filtriert oder abzentrifugiert, gewaschen und ,gege- benenfalls getrocknet.
Das Capreomycin, kann :durch wiederholtes Ausfällen mit Schwefelsäure weiter .ge- reinigt werden.
Der Niederschlag von Capreomycin kann weiter zu einer weissen festen Substanz gerei nigt werden, indem er in. der gerade nötigen Menge Wasser gelöst und- die Lösung unter Rühren in ein grosses Volumen eines mit Wasser mischbaren Lö- sungsmittels, z. B. in die 10- bis 30fache Menge Methanol, gegeben wird, worauf das Capreomycin ausfällt.
Der weisse feste Niederschlag von -Capreo- mycin wird abgetrennt und gegebenenfalls getrock net. Die freie Base Capreomycin kann aus dem nach dem obigen Verfahren erhaltenen Säureadditionssalz durch Auflösen einer Menge des Salzes in Wasser, Neutralisieren der Lösung und Klären der neutrali- sierten Lösung durch Filtrieren erhalten werden.
Die filtrierte Lösung von Capreomycin kann über eine Säule eines basischen Harzes geschickt werden, z. B. Dowex-1 in der OH Form (ein stark basisches An ionenaustauschharz vom Styrol-Divinylbenzalmisch- RTI ID="0005.0215" WI="22" HE="4" LX="1084" LY="2516"> polymerisättyp mit quaternären Ammoniumgruppen von der Dow Chemical Company),
wodurch das Salz aus der Lösung entfernt wird, aber das Capreo- mycin als freie Base durch die Säule läuft. Die freie Base kann als trockene weisse feste Substanz erhal ten werden, indem die abfliessende Lösung der Ge friertrocknung unterworfen wird.
Weitere Säureadditionssalze des Capreomycins können ausser den oben erwähnten anorganischen Säureadditionssalzen hergestellt werden. Neben an organischen Säuren können auch organische Säuren zur Herstellung von Salzen von Capreomycin ver wendet werden, z. B. Pikrinsäure, p-(2-Hydroxy-l- naphthylazo) benzolsulfonsäure, Essigsäure und der gleichen mehr.
Das gewünschte Salz kann gewöhn lich erhalten werden, indem zu einer wässrigen Lö sung der freien Base Capreomycin mindestens, die äquivalente Menge der entsprechenden Säure je Mol Capreomycin gegeben wird. Wenn ein Überschuss an Säure verwendet wird, werden gewöhnlich 4 Äquiva lente Säure zur Herstellung des Salzes verbraucht, z.
B. wird mit einem überschuss an Salzsäure das Tetrahydrochlorid gebildet. Selbstverständlich können Salze, die 1, 2 oder 3 Aquivalente Säure enthalten, durch entsprechend bemessenen Säurezusatz erhalten werden. Wenn das gewünschte Säureadditionssalz nicht leicht ausfällt, kann die Ausfällung z.
B. durch Eindampfen der Lösung auf ein kleineres Volumen oder durch Zusetzen eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z. B. Methanol oder Aceton, geför dert werden.
Die Erfindung wird eingehender durch die fol genden Beispiele erläutert: <I>Beispiel 1</I> Herstellung von Capreomycin Eine Sporenkultur von NRRL 2773 wird her gestellt, indem der Organismus auf einem Schrägagar der folgenden Zusammensetzung gezüchtet wird:
EMI0006.0054
<I>Ha <SEP> f <SEP> ermehl-Tomatenpaste-Agar</I>
<tb> Tomatenpaste <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Vorgekochtes <SEP> Hafermehl <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> einem
<tb> Endvolumen <SEP> von <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 1 <SEP> Liter Der Schrägagar wird mit Sporen von NRRL 2773 beimpft und<B>10</B> Tage bei etwa 30 C bebrütet. Die auf dem Sehrägagar gewachsene Kultur wird mit 6 cm3 Nährlösung bedeckt, und der Agar wird vor sichtig gerieben, um die Sporen zu entfernen und eine wässrige Sporensuspension .zu erhalten.
2 cm3 der Sporensuspension werden unter asep- tischen Bedingungen zum Beimpfen von 80 cm3 eines sterilen vegetativen Kulturmediums der folgen den Zusammensetzung verwendet:
EMI0006.0079
<I>Hef <SEP> e-l-medium</I>
<tb> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Hefe <SEP> ....... <SEP> 15g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>1100</B> <SEP> cm3 Das beimpfte vegetative Medium wird 48 Stunden bei etwa 28 C bebrütet, wobei das Incubat mit einer Geschwindigkeit von 250 Perioden je Minute auf einer Schüttelvorrichtung mit einem Hub von 2,5 cm geschüttelt wird.
5 cm3 des vegetativen Inoculums werden verwen det, um jeweils 100 cm3 des folgenden sterilisierten Mediums in 500-cm3-Erlenmeyerkolben aseptisch zu beimpfen.
EMI0006.0091
Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 45 <SEP> g
<tb> Hydrolysieirtes <SEP> Casein <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Rummelasse <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>1100</B> <SEP> cm3 Die beimpfte Kultur wird 6 Tage bei etwa 30 C bebrütet.
Während der Bebrütungszeit wird das In- cubat 250mal je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 2,5 cm Hub geschüttelt. Der pH-Wert des Aus gangsmediums ist etwa 6,5. Nach Ablauf der Incu- bationszeit steigt der pH-Wert des Mediums auf etwa 7,0.
Die erhaltene Kulturlösung wird filtriert, um das Mycel und andere ungelöste Feststoffe zu entfernen. :Die filtrierte Lösung enthält das Capreomycin, das durch den Organismus gebildet worden ist.
<I>Beispiel 2</I> Herstellung von Capraomycindisulfat Eine Sporenkultur von NRRL 2773 wird herge stellt, indem der Organismus auf einem Schrägagar aus Hafermehl-Tomatenpaste-Agar wie in Beispiel 1 gezüchtet wird. Der Schrägagar wird mit Sporen von NRRL 2773 beimpft und der beimpfte Nährboden 9 Tage bei etwa 30 C bebrütet.
Nach dem Bebrüten wird die auf dem Schrägagar gewachsene Sporen kultur mit 5 cm3 Nährlösung bedeckt, und die Ober fläche des Agars wird vorsichtig gerieben, um die Sporen zu entfernen und eine wüssrige Sporensuspen- sion zu erhalten.
Auf aseptischem Wege werden mit dem von einem 2,5 cm Sch:rägagar erhaltenen Inocuium 500 cm3 eines sterilisierten vegetativen Kultur mediums der folgenden Zusammensetzung in einem 2 Liter-Erlenmeyerkolben beimpft:
EMI0006.0139
Lösliche <SEP> Stärke <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Rindfleischextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumchlorsd <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> <B>1100</B> <SEP> cm3 Die Bebrütung erfolgt 48 Stunden lang bei<B>281C</B> .unter Schütteln seit 250 Hüben. je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 2,5 cm Hub.
Um eine grössere Menge an vegetativem Inoculum herzustellen, werden die 500 cm3 vegetatives Inocu- lum aseptisch in einen 1310 Liter fassenden Gär- tank ,aus rostfreiem Stahl gegeben, der 940 Liter eines sterilen Mediums der folgenden Zusammen setzung enthält (Gewicht/Volumen)
EMI0007.0008
Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,5
<tb> Hefe <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 1,5
<tb> Antischaummttel <SEP> (Polyglykol <SEP> Nr. <SEP> 2000
<tb> ,der <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,02 Das Inoculum wird 22 Stunden bei 30 wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird das Me dium mit steriler Luft in einer Menge von 0;48 m3 je Minute belüftet und mit zwei 40-cm-Propellern, mit 160 Umdrehungen je Minute gerührt.
In einen 6350 Liter fassenden Gärtank aus rost freiem Stahl werden 4130 Liter eines Mediums der folgenden Zusammensetzung (Gewicht/Volumen) ge geben:
EMI0007.0021
<I>Peptonmedium <SEP> Nr. <SEP> 159</I>
<tb> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,5
<tb> Melasse <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Peptone <SEP> . <SEP> . <SEP> 4,0
<tb> Calciumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0;2
<tb> Hydrolysiertes <SEP> Casein <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0;
6
<tb> Antischaummittel <SEP> ( Polyglycol <SEP> Nr. <SEP> 2000
<tb> von <SEP> der <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> . <SEP> 0,005 Das Medium wird nach dem Sterilisieren mit 375 Liter des in dem Gärtank gezüchteten Inoculums beimpft. Die Gärung wird 5 Tage bei 30 C ausge führt. Der Schaum wird nötigenfalls durch Zusatz von Latex Nr.1 (Änti'schaummittelder Swift & Co.) beseitigt.
Das Medium wird wähnend der Gärung durch Zuführen von steriler Luft in einer Menge von 2,72 m3 je Minute belüftet und mit den beiden 56-cm-Rührern mit 140 Umdrehungen je Minute gerührt.
109 kg Dicaliie 476 (ein Perlit-Filter- mittel der Great Lakes Carbon Corporation) werden zu 3750 Litern .der Lösung des Antibioticums gege ben. Das Gemisch wird gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Leitungswasser gewaschen. Das Waschwasser und das Filtrat werden vereinigt zu einem Gesamtvolumen von 3750 Liter.
Zu 1875 Liter des vereinigten Filtrats werden 59,7 kg Darco G-60 gegeben. Das Gemisch wird gründlich gerührt und filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Der Kohle filterkuchen wird mit 200 Liter Leitungswasser- ge waschen. Das Waschwasser wird verworfen. Der gewaschene Kohlekuchen, an dem das Capreomycin adsorbiert ist, wird mit 200 Liter 0,05 n wässriger Salzsäure gewaschen.
Die Säure wird verworfen Der gewaschene Kohlekuchen wird 1 Stunde lang mit 400 Liter eines wässrigen Gemisches; das<B>1,65</B> Liter 11,7n wässriger Salzsäure und 80 Liter Aceton enthält, eluiert. Der Filterkuchen wird weiter durch Waschen mit 200 Liter eines wässrigen Acetonge- misches, das 825 cm3 11,7n Salzsäure und 40 Liter Aceton enthält,
innerhalb von 15 Minuten eluiert. Die Eluate werden vereinigt. Die vereinigten Eluate haben ein Gesamtvolumen von 575 Liter und wer den im Vakuum auf 52,5 Liter eingeengt. Der kon zentrierte Extrakt wird- unter Rühren zu 525 Liter Acetön gegeben. Das Acetongemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei sich ein öliger Niederschlag von Capreomycn aus scheidet.
Die überstehende Flüssigkeit wird abde- k.antiert und verworfen. Der ölige Niederschlag wird in 20 Liter destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird im Vakuum auf 12 Liter eingedampft, um alles anhaftende Aceton @zu entfernen. Das wäss- rige Konzentrat von Capreomycin wird zur Entfer nung eines geringen Niederschlages filtriert, worauf dieser verworfen wird.
Das das Cäpreomycin ent haltende Filtrat wird unter Rühren zu 240 Liter Methanol gegeben. Die methanolische Lösung von Capreomycin wird durch Zusatz von 1 Liter 10n Schwefelsäure angesäuert, worauf das Schwefelsäure- additionssalz ausfällt. Das Gemisch. wird zur voll ständigen Ausfällung über Nacht stehengelassen. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und ab filtriert.
Der Niederschlag, der aus :dem Additions- salz von Cap@reomycin mit 2 Mol Schwefelsäure be steht, wird mit 10 Liter Methanol :gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 2510<B>g</B>: Um das Tetrahydrochlorid von Capreomycin zu erhalten, wird die methanolische Lösung von. Capreo- mycin stakt mit 10n Schwefelsäure mit 11,7n Salz- säure angesäuert.
<I>Beispiel 3</I> Herstellung von Capreomycindisulfat Zu 360 Liter filtrierter Gärlösung, die nach dem Verfahren von Beispiel 2 erhalten worden ist, werden 585 g Oxalsäure und 260g Natriümhydroxyd--in 3 Liter destilliertem Wasser gegeben. Das Gemisch wird kräftig gerührt und zur Entfernung eines et waigen Niederschlages filtriert, der verworfen wird.
Das Volumen des Capreomycin enthaltenden Fil trats beträgt 317 Liter. Das Filtrat wird über eine Säule von Dowex 50 (2 % vernetzt, als -Natrium-- salz) geschickt. Die Säule hat einen Durchmesser von. 10 cm und, eine Höhe von 122 cm. Die Säule wird mit 2 Liter destilliertem Wasser gewaschen.
Das adsorbierte Capreomycin wird aus der Säule durch Waschen mit 25 Liter einer 20 %igen wässrigen Lösung von Triäthylaminsulfat mit einer Geschwindig- keit von 75 cm3 je Minute elmert. 2,5 kg Darco G-60 werden dann zur Entfärbung des Eluats zuge setzt.
Nachdem das Gemisch 15 Minuten gerührt worden ist; wird 1 kg Hyflo Supercel (Diatomeen- erde-Filtrierhilfsmittel von der Johns-Manville Co.) unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wird filtriert und der Filterkuchen .mit 1 Liter destilliertem Was ser gewaschen.
Das Filtrat und das Waschwasser werden zu einem Volumen von: <B>21,5</B> Liter vereinigt. Das vereinigte, Capreomycin enthaltende Filtrat wird unter Rühren zu 86 Liter Methanol gegeben, um das Capreomycin auszufällen. Das. Gemisch wird über Nacht stehengelassen, wobei das Capreomycin als Schwefelsäure.additionssalz ausfällt. Der.
Nieder schlag wird abfiltriert und mit 12 Liter Methanol gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wird ferner mit 7 Liter Chloroform gewaschen. Der gewaschene Niederschlag, der aus dem Additionssalz von 2 Mol Schwefelsäure an Capreomycin besteht, wird im Va kuum bei 35 C getrocknet. Ausbeute: 1,09 kg.
<I>Beispiel 4</I> Herstellung der freien Base Capreomycin 3 g Tetrahydrochlorid von Capreomycin werden in 15 cm3 Wasser .gelöst. Der pH-Wert der Lösung von Capreomycin wird mit 1n Natronlauge auf etwa 7,0 gebracht. Die Lösung wird zur Entfernung eines geringen Niederschlages filtriert. Der Niederschlag wird verworfen.
Das das Capreomycin enthaltende Filtrat wird auf eine Säule gegeben, die .aus Dowex 1 in .der Hydroxylform, mit 8 % Vernetzung und einer Teilchengrösse zwischen 1460 und 5840 Siebmaschen je cm2 besteht. Die Säule hat 2 cm Durchmesser und ist 30 cm hoch.
In der Säule wird das Salz aus der aufgegebenen Capreomycinlösung gespalten:, so dass aus der aus der Säule ablaufenden Flüssigkeit Capreomycin als freie Base gewonnen werden kann. Die Säule wird mit 350 cm3 Wassergewaschen. Das Waschwasser und die Reaktionslösung werden ver einigt und zu einer trockenen, weissen, festen Sub stanz gefriergetrocknet, die .aus der freien Base Capreomycin besteht; Ausbeute: 2,7 g.
Das Präparat hat - Capreomycinaktivität beider Prüfung mit Klebsiella pneumoniae.
Beispiel <I>5</I> Herstellung des Pikrinsäureaddtionssalzes von Capreomycin 1 g der freien Base Capreomycin wird in 10 cm3 destilliertem Wasser gelöst.
Eine 5 % ige Lösung von. Pikrinsäure (Gewicht/Volumen) in 95 % igem Äthanol wird- tropfenweise unter Rühren zu der Capreomycih- lösung gegeben, bis die Ausfällung des Pikrinsäure- additionssalzes von Capreomycin beendet war.
Der gelbe Niederschlag wind abfiltnert, gewaschen und im. Vakuum über wasserfreiem Calciumsulfat ge trocknet.
Das getrocknete Salz zeigt Aktivität gegen über Klebsiena pneumoniae. Ausbeute: 1,7 .g. <I>Beispiel 6</I> Herstellung des p-(2-Hydroxy-l-naphthylazo)- benzolsulfonsäureadditionssalzes von Capreomycin 3 g der freien Base Capreomycin werden in 8 cm3 Wasser gelöst.
Eine heiss gesättigte wässrige Lösung des Natriumsalzes von p-(2-Hydroxy-l-naphthylazo)- benzolsulfonsäure wird tropenweise unter Rühren zu der Capreomycinlösung gegeben.
Der Zusatz der p - (2 -Hydroxy -1- naphthylazo) - benzolsulfonsäure- lösung wird fortgesetzt, bis das gelöste, Capreomycin vollständig als p-(2-Hydroxy-l-naphthylazo)-#benzol- sulfonsäureadditionssalz ausgefällt ist. Das p-(2- Hydroxy-1 naphthylazo)-benzolsulfonsäuresalz des Capreomychls fällt als hochviskoses orange gefärbtes öl aus.
Der Niederschlag des Capreomycinadditions- salzes wird durch Dekantieren der überstehenden Lösung abgetrennt, gewaschen und im Vakuum über wasserfreiem Calciumsulfat getrocknet. Der getrock nete Rückstand .des p-(2-Hydroxy-l-naphthylazo)- benzolsulfonsäuread@ditionssalzes von Capreomycin ist eine orange gefärbte feste Substanz. Sie besitzt Aktivität gegenüber Klebsiena pneumoniae. Aus beute: 4,6 g.