Verfahren zur Herstellung des Antibioticums Capreomycin Die Erfindung schlägt ein Verfahren zur Her stellung von Capreomycin vor, das darin besteht, dass man einen Capreomycin bildenden Stamm von Streptomyces capreolus in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, .Stickstoff und anorganische Salze enthält, eingetaucht unter aeroben Bedingungen züchtet,
bis von -dem Orga nismus in dem Kulturmedium eine wesentliche Menge Capreomycin gebildet worden ist.
Die hier beschriebene neuartige Base wird als Capreomycin bezeichnet und ist eine weisse feste Substanz mit den folgenden Eigenschaften: Sie ist leicht löslich in Wasser. Dagegen ist sie in den meisten organischen Lösungsmitteln verhältnismässig unlöslich. Sie ist z.
B. verhältnismässig unlöslich in niederen Ketonen, wie Aceton und Methylisobutyl keton, in Alkoholen, wie Methanol, Äthanol und Butanol, in Estern, wie Amylacetat, und in Äthern, wie Diäthyläther. Ferner ist se. verhältnismässig un löslich in Lösungsmitteln wie Pyridin,
halogenierten Kohlenwasserstoffen, Benzol und Kohlenwasser- stoffen.
Die freie Base Capreomycin ist verhältnismässig beständig in wässrigen Lösungen innerhalb eines pH- B.ereiches von etwa 4 bis 8, ist aiber unbeständig .in stark basischen und stark sauren Lösungen. Im all gemeinen ist Capreomycin in sauren Lösungen be ständiger als in basischen Lösungen.
Die elektrometrische Titration von Capreomycn in Dimethylformamid - Wasser (2: 1 Volumteile) zeigt die Anwesenheit von .titrierbaren Gruppen mit den folgenden pK'a Werten: 6;5; 8,0; 10;0 und 13,0: Das durch elektrometrische Titration bestimmte Molekulargewicht von Capreomycin ist etwa 740.
Das Tetrahydrochlorid von Capreomycin ist in wasserfreiem Methanol zu etwa 6,.6 mg je cm3 .bei 26 C löslich.
Die Analyse von Capreomycin, das im Vakuum ,bei Raumtemperatur über wasserfreiem Cälciumsulfat 16 Stunden getrocknet wurde, ergab, ,dass es als freie Base vorlag und ungefähr -den folgenden Prozent gehalt hatte:
EMI0001.0076
Kohlenstoff <SEP> 44,08
<tb> Wasserstoff <SEP> 6,94
<tb> Stickstoff <SEP> 26,23
<tb> .Sauerstoff <SEP> (direkt) <SEP> 22,8 Diese Werte ergeben die empirische Formel C25-28H50 -53N14010, doch ist diese Formel natürlich nur eine Annäherung, die sieh bei der -genauen Aufklärung der Struktur der Verbindung noch etwas ändern kann.
Die Infrarotabsorptionskurve :des Capreomycin dihydrochlorids -als von Mineralöl. bedecktes Pulver zeigt Fzg. 1. Die erkennbaren Banden des Infrarot- absorptionssp:ektrums im Bereich von 2,0 bis 15,0 lü liegen wie folgt: 3,10; 6;00; 6;65 und 8,15.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Capreomycin zeigt intensive Absorptionsmaxima. von etwa 268 mit in 0,03n Salzsäure bei einem Absorptionswert von Ei @m = 269 und von etwa 283 m,u in 0,05n Kali lauge bei einem Absorptionswert von E i @m = 175-.
,Die spezifische optische Drehung einer im Va kuum bei Zimmertemperatur über wasserfreiem Cal ciumsulfat 16 Stunden .getrockneten Probe von Capreomycindisulfat ist.[a] D = - 27,6 (c =1 Gew.- Teil je 100 Volumteile in Wasser).
Die Substanz wurde nach bekannten Verfahren zur Analyse von Aminosäuren untersucht, z. B. nach dem von Moore und Stein in J.
Biol. Chem. 192, 663 (1951) angegebenen Verfahren, und die Analyse der Hydrolysate von Capreomycin, die durch Hydrolyse mit 5,7n Salzsäure bei 100 C erhalten wurden, zeigte die Anwesenheit von mehreren Ammosäureresten.. Die quantitative Bestimmbarkeit der in derartigen Säurehydrolysaten enthaltenen Aminosäurereste ist begrenzt,
weil die Beständigkeit :der Peptidbindungen gegenüber Spaltung und die Beständigkeit der Amino- säurereste in den Säurehydrolysaten sehr unterschied lich ist.
Unter dieser Voraussetzung und in der An nahme eines Molekulargewichtes von etwa 740 er gibt die vorläufige Aminosäureanalyse mindestens je einen Rest der folgenden Aminosäuren im -Molekül des Capreomycins: Ahnin, Serin, 2,3-Diaminopro- pionsäure und zwei basische Aminosäuren, von denen die eine sich wahrscheinlich von Ornithin herleitet und die andere wahrscheinlich .bisher unbekannt ist.
Die bisherigen Analysen haben noch keinen Auf schluss über die Anwesenheit von sauren (mehrere Carboxylgrappen enthaltenden), aromatischen oder Schwefel enthaltenden Aminosäuren gegeben.
Mit Capreomycin ausgeführte chemische Unter suchungen brachten die folgenden Ergebnisse: Die Ninhydrinprobe auf Anwesenheit von a-Aminogrup- pen war positiv. .Die Lowrysche [J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)] und die Folin-Ciocalteausche Protein probe waren positiv.
Die Anthron-, Bialsche und Taubersche Saccharidprobe waren negativ sowie auch die Ehrlichsche Indolprobe. Die Hydroxamsäure- probe auf Estergruppen, wie sie in J. Bol. Chem. <I>159, 21</I> (1945) :beschrieben ist, war auch negativ.
Capreomycin hat eine Hemmwirkung .gegenüber dem Wachstum bestimmter Mikroorganismen, ein- schliesslich grampositiver und grammnegativer Bak terien. Die Mengen, die eine Hemmwirkung gegen über dem Wachstum einer Reihe von Organismen hervorrufen, sind in Tabelle I angegeben.
Die Hemm- konzentrationen wurden durch Agarverdünnungs- probe oder durch Nährlösungsverdünnungsprobe, be- stimmt (in der Tabelle mit ad bzw. bd bezeich net).
Bei der Agarverdünnungsprobe wird der Probe organismus. auf eine Reihe von Agarplatten, die ver- verschiedene Konzentrationen an Capreomycin in dem Agar enthalten, ausgestrichen oder in diese im- plantiert, um die Mindestkonzentration an Capreo- mycin in y/cm3 ;
zu ermitteln, die das Wachstum des Organismus 48 Stunden lang hemmt.
Bei der Nährlösungsverdünnungspro'be; wird eine Reihe von Röhrchen, die eine Nährlösung mit ver schiedenen Konzentrationen an Capreomycin ent halten, mit dem Probeorganismus beimpft, um die Mindestkonzentration an Capreomycin in y/cm3 in der Nährlösung zu ermitteln, die das Wachstum des Organismus etwa 24 Stunden lang hemmt.
EMI0002.0117
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Hemm Untersuchter <SEP> Organismus <SEP> konzentration
<tb> (<U>y</U>/cm3)
<tb> <I>Bakterien</I>
<tb> -'Staphylöcoccus <SEP> .äureus <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> -_ <SEP> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 25 <SEP> ad
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 1,56 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> twberculosis <SEP> (607) <SEP> 6,25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> tubereulosis
<tb> (607, <SEP> streptomycinresistent) <SEP> 3,1 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 6,25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium
<tb> (streptomycinresistent) <SEP> 1,
56 <SEP> ad
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 125 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> pullorum <SEP> 62,5 <SEP> b@d
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 125 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> .berta <SEP> 125 <SEP> bd Wie hoben erwähnt, können Capreomycin und seine Säureadditionssalze zur Behandlung von Bakte rieninfektionen in der Veterinärmedizin verwendet werden. Die Verbindungen sind z.
B. wirksam zur Behandlung von Krankheiten, die von Salmonellen hervorgerufen werden. Im einzelnen reichen etwa 400 mg je kg Körpergewicht, subcutan gegeben, aus, um eine Infektion durch Salmonella typhimurium bei Mäusen zu bekämpfen. Ferner reichen etwa 1 bis 5 mg Capreomycin bei intramuskulärer Injektion je Eintagsküken zur Bekämpfung einer Infektion von Salmonella pullornm aus.
Die Verbindungen sind ferner wirksame Kontakt gifte für Hausfliegen. Ein geeignetes Präparat für diesen Zweck ist eine wässrige Lösung von 0,4 GewA Capreomycin, entweder als freie Base oder als wasserlösliches Säureadditionssalz.
Die Verbindungen haben blutdrucksenkende Wir kung, wie die genormte pharmakologische Prüfung an anästhesierten Hunden zeigt.
Capreomycin und seine Säureadditionssalze haben in vivo eine antibakterielle Wirkung gegenüber infi zierenden Organismen bei subcutaner Injektion bei Mäusen, wobei der ED5o-Wert (wirksame Menge, um<B>50%</B> der Versuchstiere zu schützen) bei einigen Beispielen wie folgt liegt: Streptomycetes pyogenes, 250 mg (X 2); Proteus vulgaris, 84 mg (X 2);
Salmonella typhosa, 90 mg (X 2); und Klebsiena pneumoniae, 30 mg (X 2).
(Die Werte bedeuten die Menge Capreomycin je kg Körpergewicht des Versuchstieres. X 2 bedeutet zwei Gaben.) Ferner ist Capreomycin in vivo hei Mäusen wirksam gegen experimentell verursachte Tuber- kuloseinfektionen. Es ist z.
B. wirksam gegenüber Mycobacterium tuberculosis var. hominis (Stamm H37RV) bei Infektionen an Mäusen, wenn es sub- cutan oder oral gegeben wird.
Bei subcutaner Injek tion ist es wirksam bei einer Dosierung in, dem all- gemeinen Bereich, in dem die gegenwärtig :ange wendeten antituberkulösen Antibiotika, wie Strepto- mycin, wirksam sind.
Das Capreomycin kann durch Züchten eines bisher unbekannten Organismus unter aeroben Be dingungen in einem Kulturmedium hergestellt wer- ,den, das as,simlierbare Quellen für Kohlenstoff; Stickstoff und anorganische Salze enthält.
Der Orga nismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, indem Teile der Bodenprobe in sterilem destilliertem Was ser .suspendiert und die Suspensionen auf Nähragar ausgestrichen wurden. Die beimpften Nähragar- platten wurden mehrere Tage bei etwa 25 bis 35 C bebrütet. Nach Ablauf der Bebrütungszeit wurden Kolonien der Capreomycin bildenden Organismen mit einer sterilen Platinöse auf Schrägagar übertra gen.
Die beimpften Schrägagarböden wurden bebrü tet, um grössere Mengen Inoculum für .die Herstel lung von Capreomycin zu erhalten.
Der zur Bildung von Capreomycin befähigte neuartige Organismus wurde zur ständigen Aufbe wahrung an The Culture Collection of the Northenn Utilization Research and Development Branch des United States Department of Agriculture in
Peoria, Illinois, gegeben und erhielt die Kulturbezeichnung NRRL 2773 und den Namen Streptomyces capreolus.
Die folgende ausführliche Beschreibung<U>nimm</U>t im einzelnen Bezug auf diesen neu gefundenen Orga nismus NRRL 2773. Selbstverständlich gehört aber auch die Herstellung von Capreomycin durch Züch ten von anderen Capreomycin bildenden Organismen oder Mutanten von Capreomycin bildend-en Orga nismen, einschliesslich Mutanten von NRRL 2773, in den Bereich der Erfindung: Derartige andere Organismen, Rassen oder Mutanten können durch bekannte Verfahren, z.
B. durch Behandeln eines Capreomycin bildenden Organismus mit Röntgen- strahlen oder ultravioletter Strahlung oder mit che mischen Mitteln, z. B. den Stickstoffsenfölen (englisch: Bitrogen mustards), hergestellt werden.
Es folgen nun die Ergebnisse einer eingehenden systematischen Untersuchung des neuen Organismus S. capreolus NRRL 2773. Die in der Beschreibung angegebenen Farben entsprechen den von Maerz und Paul, Dictionary of Color (1950), angegebenen Defi nitionen.
<I>Mikroskopische Morphologie</I> Tomatenpaste-Hafermehl-Agar (14 Tage bei 30 C) Die Kolonien bilden gerade oder gekrümmte Sporophoren und cylindrische Konidien. Die Konidien haben 1,0 bis 1,2 ,u Durchmesser und 3,0 bis 4,8 ,u Länge.
Agar <I>nach</I> Hickey <I>und</I> Tresner (14 Tage bei 30 C) Mikroskopische Morphologie wie oben. Salz-Stärke-Agar (14 Tage bei 30 C) Mikroskopische Morphologie wie oben. <I>Kennzeichen der Kultur</I> Czapekscher Agar <I>{14</I> Tage bei 30 C) Mässig gutes Wachstum. Grössere Mengen an Luftmycel,
weisse und sehr geringe Sporenbil- dung. Rückseite orangenbraun bis rotbraun. Keine löslichen Pigmente.
Glucose-Asparagin-Agar (14 Tags bei 30 C) Mässiges Wachstum. Geringes, schwach gelb braunes (P1. 10-2.B) Luftmycel. Geringe SSpporen- bildung, Rückseite rotbraun. Hellbraunes lös liches Pigment.
<I>Anorganische</I> Salze-Stärke-Agar (14 Tage bei 30 C) Mässiges Wachstum; ziemlich starkes, fast weisses Luftmycel, Rückseite rotbraun. Hell rotbraunes lösliches Pigment.
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar (14 Tage bei 30 C) Mässiges Wachstum. Ziemlich starkes; fast weisses Luftmycel; Rückseite rotbraun. Hell .rotbraunes lösliches Pigment. Emersofzscher Agar (14 Tage bei 30 C) Mässiges Wachstum. Geringes, weisses Luftmycel. Keine Sporenbildung. Rückseite rotbraun. Hell- braunes lösliches Pigment.
Kartof felpfropfen-Agar (14 Tage bei 30 C) Kein Wachstum 'bis ausgezeichnetes Wachstum von vegetativem Mycel je nach der Kartoffel- sorte. Kein sichtbares Lufünycel. Durch die hell orange Rückseite und vegetatives Wachstum wird der Kartoffelpfropfen etwas gedunkelt.
Tyrosin-Agar (14 Tage bei 30 C) Ziemlich gutes Wachstum. Luftmycel fast weiss. Rückseite hellbraun. Hellbraunes lösliches Pig ment.
<I>Physiologie</I> H2S-Bildung auf Pepton-Eisen-Agar unter Zusatz von Hefe extrakt keine, beobachtet.
Gelatineverflüssigung mässig unter Bildung eines rotbraunen löslichen Pigmentes.
Nitratreduktion keine Reduktion in organischer Nährlösung, ge ringe Reduktion in synthetischer Nährlösung. Stärkehydrolyse nur teilweise Hydrolyse nach 14 Tagen. Magermilch weder Koagulation noch Peptonisation in 14 Ta gen. Orangebrauner Ring, kein Häutchen. Geringer pH-Anstieg.
In Tabelle Il sind die Ergebnisse angegeben, die bei Versuchen zur Kohlenstoffverwertung mit dem Organismus NRRL 2773 erhalten wurden. In der Tabelle werden die folgenden Symbole verwendet: + = Wachstum und Verwertung - = kein erkennbares Wachstum bzw. keine Verwertung.
EMI0004.0020
<I>Tabelle <SEP> I1</I>
<tb> Kohlenstoffverwertung <SEP> von <SEP> NRRL <SEP> 2773
<tb> Verbindung <SEP> Wachstumsverhalten
<tb> L(+) <SEP> Arabinose <SEP> +
<tb> D(+)-Glucose <SEP> +
<tb> D(-)-Fructose <SEP> +
<tb> i-Inosit
<tb> Maltose <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> - <SEP> +
<tb> D(+) <SEP> Xylose <SEP> L(+)-Rhamnose <SEP> Saccharose <SEP> Lactose <SEP> D(+)-Raffinose <SEP> Inulin <SEP> Mannit <SEP> Salicin <SEP> Sorbit <SEP> Cellulose <SEP> D-Ribose <SEP> D(+)
<SEP> Trehalose <SEP> - Das zur Herstellung von Capreomycin durch Züchten von NRRL 2773 verwendbare Kultur- medium kann verschiedenartig gewählt werden, wie aus den obigen Verwertungsversuchen hervorgeht; der Organismus vermag verschiedene Energiequellen zu nutzen.
Wegen der billigen Herstellung, der gro ssen Ausbeute an Antibioticum und der leichten Iso lierung des Antibioticums werden bestimmte Kultur medien bevorzugt, die verhältnismässig einfache Nährquellen enthalten. So enthalten z.
B. die Medien, die zur Herstellung von Capreonlycin verwendbar sind; eine assimüierbare Quelle für Kohlenstoff, wie Glucose, Fructose, Maltose, Mannose, lösliche Stärke, Melassen, Dextrin, braunen Zucker, Maisquellflüssig- keiten und dergleichen mehr. Die bevorzugte Quelle für Kohlenstoff ist Glucose.
Ferner enthalten die ver- wendbaren Medien ,eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie Hafermehl, Rindfleischextrakt, Pep- tone (aus Fleisch oder Soja), hydrolysiertes Casein, Hefe, Aminosäurengemisohe und dergleichen mehr. Gegenwärtig werden als Stickstoffquellen Peptone, hydrolysiertes Casein und Rindfleischextrakt bevor zugt.
Mineralsalze, z. B. Salze mit Calcium-, Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat und Carbonationen, und eine Quelle für Wachstumsfaktoren, wie Hefe oder Hefeextrakt, können den Medien vorteilhaft zuge setzt werden.
Wie es auch für das Wachstum und die Ent wicklung anderer Mikroorganismen notwendig ist, müssen dem Kulturmedium ferner essentielle Spuren elemente zugesetzt werden, um den erfindungsgemäss verwendeten Actinomyceten zu züchten. Solche Spurenelemente gelangen gewöhnlich als Verunreini gungen beim Zusatz der anderen Bestandteile in das Medium.
Der anfängliche pH-Wert des Kulturmediums kann stark schwanken. Es hat sich jedoch als zweck mässig erwiesen, dass der anfängliche pH-Wert des Mediums zwischen etwa 5,5 und 8,0; bevorzugt zwi schen etwa 6,5 und 7,0, liegt.
Wie auch bei anderen Actinomyceten beobachtet wurde, steigt der pH-Wert des Mediums während des Wachstums des Orga nismus allmählich an; während das Capreomycin gebildet wird und kann Werte von etwa 7,2 bis 8,0 oder darüber erreichen, wobei der Endwert minde stens teilweise von dem anfänglichen pH-Wert des Mediums, den indem Medium enthaltenen Puffern und der Zeit abhängt, die der Organismus wachsen kann.
Eingetauchte .aerobe Kulturen sind Bedingungen der Wahl für die: Herstellung von Capreomyein. Zur Herstellung verhältnismässig kleiner Mengen können Schüttelkolben und Oberflächenkulturen in Flaschen verwendet werden, doch werden für die Herstellung grosser Mengen eingetauchte aerobe Kulturen in sterilen Tanks bevorzugt.
Das Medium in dem sterilen Tank kann mit einer Sporensuspension be- impft werden, aber wegen der bei Verwendung einer Sporensuspension als Inoculum zu beobachtenden Wachstumsverzögerung wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt.
Wenn die Wachstumsverzö- gerung hierdurch vermieden wird, ist auch eine wirk samere Ausnutzung der Gärvorrichtung möglich.
Es ist also zweckmässig, zuerst ein vegetatives Inoculum der Organismen herzustellen, "indem eine verhältnis mässig kleine Menge Kulturmedium mit der Sporen form .des Organismus beimpft wird, und wenn ein junges, aktives vegetatives Inoculum erhalten worden ist, dieses Inoculum aseptisch in den grossen Tank überzuführen.
Das Medium, in dem das vegetative Inoculum gebildet wird, kann das ,gleiche oder ein anderes sein, wie es zur Herstellung von Capreo- mycin im grossen Massstab verwendet wird.
Die -Organismen wachsen am besten bei Tempe raturen im Bereich von etwa 28 bis 37 C. Die beste Capreomycinbildung scheint bei etwa 29 bis 33 C zu erfolgen. Wie es bei Eintauchkulturverfahren üblich ist, wird sterile Luft durch .das Kulturmedium geblasen.
Die wirksamste Förderung :des Wachstums. 'et Orga nismus und :der Bildung von Capreomycin wird dann erreicht, wenn :das bei .dem Tankverfahren ver wendete Luftvolumen mehr als 0,1 Votumteil Luft je Minute je Volumteil Kulturmedium beträgt. Wirksames Wachstum und beste Ausbeuten an Capreomycin werden erzielt, wenn das verwendete Luftvolumen mindestens 1 Volumteil Luft je Minute je Volumteil Kulturmedium beträgt.
Die Konzentration an Capreomycinaktivität in dem Kulturmedium kann leicht während der Gärungs zeit durch Untersuchung von Proben des Kultur mediums auf ihre Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum eines Organismus verfolgt werden, der durch Capreomycin gehemmt wird. Der Organismus Klebsiena pneumonia hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen.
Die Untersuchung kann in be kannter Weise durch Trübungsmessung oder in Schalen erfolgen.
Im allgemeinen wird die grösste Menge nach dem Beimpfen des Kulturmediums innerhalb von etwa 4 bis 7 Tagen gebildet, wenn eine eingetauchte aerobe Kultur oder eine Schüttelkolbenkultur ver wendet wird, und innerhalb von etwa 5 bis 10 Tagen, wenn eine Oberflächenkultur verwendet wird.
Das Mycel und. ungelöste Feststoffe werden aus der Gärlösung in üblicher Weise, z. B. durch Filtrie ren -oder Zentrifugieren, entfernt. Das Antibioticum ist in der filtrierten Lösung enthalten und kann. daraus z. B. durch Adsorption entfernt werden.
Die verschiedenen Adsorptionsmittel, die verwendet wer den können, sind Adsorptionskohlen und Ionen austauschharze mit saurem Charakter, ein geeignetes Harz ist Dowex 50 (ein sulfoniertes Polystyrol harz der Dow Chemical Company).
Bei Verwendung von Kohle .als Adsorptions- mittel kann Capreomycin durch Zusetzen von Aktiv- kohle als Adsorptionsmittel, z. B. Darco G-60 (von der Atlas Powder Company), zu der filtrierten Lösung unter Rühren gewonnen werden.
Das Ge misch wird lange genug gerührt, dass das Capreo- mycin wirksam an der Kohle adsorbiert wird. Wenn etwa 2 bis 5 Teile Kohle je 1 Teil Feststoffgehalt der Lösung zugesetzt werden, wird eine befriedigende Entfernung des Capreomycins aus der Lösung inner halb von etwa 1 .bis 2 Stunden erreicht.
Die Kohle, an der das Antibioticum adsorbiert ist, wird von dem Gemisch abfiltriert und ,gründlich zur Entfernung nicht ads:
orbierter Verunreinigungen gewaschen. Das Antibioticum wird dann aus der gewaschenen Kohle eluiert. Es wurde gefunden, dass eine Kombination einer verdünnten wässrigen .Säure .mit einem mit Was ser mischbaren organischen Lösungsmittel wirksam zur Entfernung des Antibioticums aus der Kohle dienen kann.
Ein Gemisch von 80 Volumteilen 0,05n Salzsäure und 20 Volumteilen Aceton hat sich z. B. als wirksam zum Eluieren von Capreomycin erwiesen. Nach einem anderen Verfahren kann Capreo- mycin aus der filtrierten Lösung durch Berührung mit einem sauren Harz entfernt werden. Das Harz wird normalerweise in Salzform, z. B. als Natrium salz" angewendet. Das ads,orbierte Capreomycin kann aus dem Harz z. B. mit einer wässri#gen Lösung eines löslichen Salzes, z.
B. eines Sulfats, eines Chlorids oder eines Citrats., elmert werden. Das verwendete Salz kann Triäthylaminsulfat, Natriumchlorid, Ka- liumchlori'd, Natriumcitrat oder dergleichen sein.
Die Capreomycineluate können .gegebenenfalls durch Behandeln mit Kohle entfärbt werden. Wenn, ein verhältnismässig unreines Präparat von Capreomycin erhalten werden soll, brauchen die .ge nannten Eluate nur zur Trockne eingedampft zu werden. Die Eluate oder der trockene Rückstand der selben können jedoch zur weiteren Reinigung von Capreomycin verwendet werden. So kann, z.
B. das durch Adsorption mit Kohle erhaltene Eluat auf etwa <B>1/5</B> bis i/lo seines Volumens eingedampft werden, wobei das Aceton entfernt wird, und das Cäpreo- mycin aus dem wässrigen Konzentrat ausgefällt wer den. Die Fällung kann durch Zusatz eines geeigne ten Salzes unter Rühren erfolgen, z.
B. eines üblicher weise .zum Ausfällen von Proteinen verwendeten Salzes, wie Ammoniumsulfat, durch Ansäuern mit einer Säure, die ein Anion für das Capreomycin salz liefert, oder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton erfolgen. Ein bevorzugtes Fällungsmittel ist Schwefelsäure.
Zur Ausfällung wird dem konzentrierten Eluat gewöhnlich 10n Schwefelsäure in einer Menge, von etwa 1 Volumteil Säure je 100 Volumteile Capreo- mycinkonzentrat zugesetzt.
Das als sein. Schwefel- säuread@ditionssalz ausgefällte Capreomycin wird ab- filtriert oder abzentrifugiert, gewaschen und ,gege- benenfalls getrocknet.
Das Capreomycin, kann :durch wiederholtes Ausfällen mit Schwefelsäure weiter .ge- reinigt werden.
Der Niederschlag von Capreomycin kann weiter zu einer weissen festen Substanz gerei nigt werden, indem er in. der gerade nötigen Menge Wasser gelöst und- die Lösung unter Rühren in ein grosses Volumen eines mit Wasser mischbaren Lö- sungsmittels, z. B. in die 10- bis 30fache Menge Methanol, gegeben wird, worauf das Capreomycin ausfällt.
Der weisse feste Niederschlag von -Capreo- mycin wird abgetrennt und gegebenenfalls getrock net. Die freie Base Capreomycin kann aus dem nach dem obigen Verfahren erhaltenen Säureadditionssalz durch Auflösen einer Menge des Salzes in Wasser, Neutralisieren der Lösung und Klären der neutrali- sierten Lösung durch Filtrieren erhalten werden.
Die filtrierte Lösung von Capreomycin kann über eine Säule eines basischen Harzes geschickt werden, z. B. Dowex-1 in der OH Form (ein stark basisches An ionenaustauschharz vom Styrol-Divinylbenzalmisch- RTI ID="0005.0215" WI="22" HE="4" LX="1084" LY="2516"> polymerisättyp mit quaternären Ammoniumgruppen von der Dow Chemical Company),
wodurch das Salz aus der Lösung entfernt wird, aber das Capreo- mycin als freie Base durch die Säule läuft. Die freie Base kann als trockene weisse feste Substanz erhal ten werden, indem die abfliessende Lösung der Ge friertrocknung unterworfen wird.
Weitere Säureadditionssalze des Capreomycins können ausser den oben erwähnten anorganischen Säureadditionssalzen hergestellt werden. Neben an organischen Säuren können auch organische Säuren zur Herstellung von Salzen von Capreomycin ver wendet werden, z. B. Pikrinsäure, p-(2-Hydroxy-l- naphthylazo) benzolsulfonsäure, Essigsäure und der gleichen mehr.
Das gewünschte Salz kann gewöhn lich erhalten werden, indem zu einer wässrigen Lö sung der freien Base Capreomycin mindestens, die äquivalente Menge der entsprechenden Säure je Mol Capreomycin gegeben wird. Wenn ein Überschuss an Säure verwendet wird, werden gewöhnlich 4 Äquiva lente Säure zur Herstellung des Salzes verbraucht, z.
B. wird mit einem überschuss an Salzsäure das Tetrahydrochlorid gebildet. Selbstverständlich können Salze, die 1, 2 oder 3 Aquivalente Säure enthalten, durch entsprechend bemessenen Säurezusatz erhalten werden. Wenn das gewünschte Säureadditionssalz nicht leicht ausfällt, kann die Ausfällung z.
B. durch Eindampfen der Lösung auf ein kleineres Volumen oder durch Zusetzen eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z. B. Methanol oder Aceton, geför dert werden.
Die Erfindung wird eingehender durch die fol genden Beispiele erläutert: <I>Beispiel 1</I> Herstellung von Capreomycin Eine Sporenkultur von NRRL 2773 wird her gestellt, indem der Organismus auf einem Schrägagar der folgenden Zusammensetzung gezüchtet wird:
EMI0006.0054
<I>Ha <SEP> f <SEP> ermehl-Tomatenpaste-Agar</I>
<tb> Tomatenpaste <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Vorgekochtes <SEP> Hafermehl <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Agar <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> bis <SEP> zu <SEP> einem
<tb> Endvolumen <SEP> von <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 1 <SEP> Liter Der Schrägagar wird mit Sporen von NRRL 2773 beimpft und<B>10</B> Tage bei etwa 30 C bebrütet. Die auf dem Sehrägagar gewachsene Kultur wird mit 6 cm3 Nährlösung bedeckt, und der Agar wird vor sichtig gerieben, um die Sporen zu entfernen und eine wässrige Sporensuspension .zu erhalten.
2 cm3 der Sporensuspension werden unter asep- tischen Bedingungen zum Beimpfen von 80 cm3 eines sterilen vegetativen Kulturmediums der folgen den Zusammensetzung verwendet:
EMI0006.0079
<I>Hef <SEP> e-l-medium</I>
<tb> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Hefe <SEP> ....... <SEP> 15g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>1100</B> <SEP> cm3 Das beimpfte vegetative Medium wird 48 Stunden bei etwa 28 C bebrütet, wobei das Incubat mit einer Geschwindigkeit von 250 Perioden je Minute auf einer Schüttelvorrichtung mit einem Hub von 2,5 cm geschüttelt wird.
5 cm3 des vegetativen Inoculums werden verwen det, um jeweils 100 cm3 des folgenden sterilisierten Mediums in 500-cm3-Erlenmeyerkolben aseptisch zu beimpfen.
EMI0006.0091
Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 45 <SEP> g
<tb> Hydrolysieirtes <SEP> Casein <SEP> . <SEP> . <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Rummelasse <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>1100</B> <SEP> cm3 Die beimpfte Kultur wird 6 Tage bei etwa 30 C bebrütet.
Während der Bebrütungszeit wird das In- cubat 250mal je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 2,5 cm Hub geschüttelt. Der pH-Wert des Aus gangsmediums ist etwa 6,5. Nach Ablauf der Incu- bationszeit steigt der pH-Wert des Mediums auf etwa 7,0.
Die erhaltene Kulturlösung wird filtriert, um das Mycel und andere ungelöste Feststoffe zu entfernen. :Die filtrierte Lösung enthält das Capreomycin, das durch den Organismus gebildet worden ist.
<I>Beispiel 2</I> Herstellung von Capraomycindisulfat Eine Sporenkultur von NRRL 2773 wird herge stellt, indem der Organismus auf einem Schrägagar aus Hafermehl-Tomatenpaste-Agar wie in Beispiel 1 gezüchtet wird. Der Schrägagar wird mit Sporen von NRRL 2773 beimpft und der beimpfte Nährboden 9 Tage bei etwa 30 C bebrütet.
Nach dem Bebrüten wird die auf dem Schrägagar gewachsene Sporen kultur mit 5 cm3 Nährlösung bedeckt, und die Ober fläche des Agars wird vorsichtig gerieben, um die Sporen zu entfernen und eine wüssrige Sporensuspen- sion zu erhalten.
Auf aseptischem Wege werden mit dem von einem 2,5 cm Sch:rägagar erhaltenen Inocuium 500 cm3 eines sterilisierten vegetativen Kultur mediums der folgenden Zusammensetzung in einem 2 Liter-Erlenmeyerkolben beimpft:
EMI0006.0139
Lösliche <SEP> Stärke <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Rindfleischextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Natriumchlorsd <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> <B>1100</B> <SEP> cm3 Die Bebrütung erfolgt 48 Stunden lang bei<B>281C</B> .unter Schütteln seit 250 Hüben. je Minute auf einer Schüttelmaschine mit 2,5 cm Hub.
Um eine grössere Menge an vegetativem Inoculum herzustellen, werden die 500 cm3 vegetatives Inocu- lum aseptisch in einen 1310 Liter fassenden Gär- tank ,aus rostfreiem Stahl gegeben, der 940 Liter eines sterilen Mediums der folgenden Zusammen setzung enthält (Gewicht/Volumen)
EMI0007.0008
Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,5
<tb> Hefe <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 1,5
<tb> Antischaummttel <SEP> (Polyglykol <SEP> Nr. <SEP> 2000
<tb> ,der <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,02 Das Inoculum wird 22 Stunden bei 30 wachsen gelassen. Während der Wachstumszeit wird das Me dium mit steriler Luft in einer Menge von 0;48 m3 je Minute belüftet und mit zwei 40-cm-Propellern, mit 160 Umdrehungen je Minute gerührt.
In einen 6350 Liter fassenden Gärtank aus rost freiem Stahl werden 4130 Liter eines Mediums der folgenden Zusammensetzung (Gewicht/Volumen) ge geben:
EMI0007.0021
<I>Peptonmedium <SEP> Nr. <SEP> 159</I>
<tb> Glucose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,5
<tb> Melasse <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Peptone <SEP> . <SEP> . <SEP> 4,0
<tb> Calciumcarbonat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0;2
<tb> Hydrolysiertes <SEP> Casein <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0;
6
<tb> Antischaummittel <SEP> ( Polyglycol <SEP> Nr. <SEP> 2000
<tb> von <SEP> der <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP> . <SEP> 0,005 Das Medium wird nach dem Sterilisieren mit 375 Liter des in dem Gärtank gezüchteten Inoculums beimpft. Die Gärung wird 5 Tage bei 30 C ausge führt. Der Schaum wird nötigenfalls durch Zusatz von Latex Nr.1 (Änti'schaummittelder Swift & Co.) beseitigt.
Das Medium wird wähnend der Gärung durch Zuführen von steriler Luft in einer Menge von 2,72 m3 je Minute belüftet und mit den beiden 56-cm-Rührern mit 140 Umdrehungen je Minute gerührt.
109 kg Dicaliie 476 (ein Perlit-Filter- mittel der Great Lakes Carbon Corporation) werden zu 3750 Litern .der Lösung des Antibioticums gege ben. Das Gemisch wird gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Leitungswasser gewaschen. Das Waschwasser und das Filtrat werden vereinigt zu einem Gesamtvolumen von 3750 Liter.
Zu 1875 Liter des vereinigten Filtrats werden 59,7 kg Darco G-60 gegeben. Das Gemisch wird gründlich gerührt und filtriert. Das Filtrat wird verworfen. Der Kohle filterkuchen wird mit 200 Liter Leitungswasser- ge waschen. Das Waschwasser wird verworfen. Der gewaschene Kohlekuchen, an dem das Capreomycin adsorbiert ist, wird mit 200 Liter 0,05 n wässriger Salzsäure gewaschen.
Die Säure wird verworfen Der gewaschene Kohlekuchen wird 1 Stunde lang mit 400 Liter eines wässrigen Gemisches; das<B>1,65</B> Liter 11,7n wässriger Salzsäure und 80 Liter Aceton enthält, eluiert. Der Filterkuchen wird weiter durch Waschen mit 200 Liter eines wässrigen Acetonge- misches, das 825 cm3 11,7n Salzsäure und 40 Liter Aceton enthält,
innerhalb von 15 Minuten eluiert. Die Eluate werden vereinigt. Die vereinigten Eluate haben ein Gesamtvolumen von 575 Liter und wer den im Vakuum auf 52,5 Liter eingeengt. Der kon zentrierte Extrakt wird- unter Rühren zu 525 Liter Acetön gegeben. Das Acetongemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei sich ein öliger Niederschlag von Capreomycn aus scheidet.
Die überstehende Flüssigkeit wird abde- k.antiert und verworfen. Der ölige Niederschlag wird in 20 Liter destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird im Vakuum auf 12 Liter eingedampft, um alles anhaftende Aceton @zu entfernen. Das wäss- rige Konzentrat von Capreomycin wird zur Entfer nung eines geringen Niederschlages filtriert, worauf dieser verworfen wird.
Das das Cäpreomycin ent haltende Filtrat wird unter Rühren zu 240 Liter Methanol gegeben. Die methanolische Lösung von Capreomycin wird durch Zusatz von 1 Liter 10n Schwefelsäure angesäuert, worauf das Schwefelsäure- additionssalz ausfällt. Das Gemisch. wird zur voll ständigen Ausfällung über Nacht stehengelassen. Die überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und ab filtriert.
Der Niederschlag, der aus :dem Additions- salz von Cap@reomycin mit 2 Mol Schwefelsäure be steht, wird mit 10 Liter Methanol :gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 2510<B>g</B>: Um das Tetrahydrochlorid von Capreomycin zu erhalten, wird die methanolische Lösung von. Capreo- mycin stakt mit 10n Schwefelsäure mit 11,7n Salz- säure angesäuert.
<I>Beispiel 3</I> Herstellung von Capreomycindisulfat Zu 360 Liter filtrierter Gärlösung, die nach dem Verfahren von Beispiel 2 erhalten worden ist, werden 585 g Oxalsäure und 260g Natriümhydroxyd--in 3 Liter destilliertem Wasser gegeben. Das Gemisch wird kräftig gerührt und zur Entfernung eines et waigen Niederschlages filtriert, der verworfen wird.
Das Volumen des Capreomycin enthaltenden Fil trats beträgt 317 Liter. Das Filtrat wird über eine Säule von Dowex 50 (2 % vernetzt, als -Natrium-- salz) geschickt. Die Säule hat einen Durchmesser von. 10 cm und, eine Höhe von 122 cm. Die Säule wird mit 2 Liter destilliertem Wasser gewaschen.
Das adsorbierte Capreomycin wird aus der Säule durch Waschen mit 25 Liter einer 20 %igen wässrigen Lösung von Triäthylaminsulfat mit einer Geschwindig- keit von 75 cm3 je Minute elmert. 2,5 kg Darco G-60 werden dann zur Entfärbung des Eluats zuge setzt.
Nachdem das Gemisch 15 Minuten gerührt worden ist; wird 1 kg Hyflo Supercel (Diatomeen- erde-Filtrierhilfsmittel von der Johns-Manville Co.) unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wird filtriert und der Filterkuchen .mit 1 Liter destilliertem Was ser gewaschen.
Das Filtrat und das Waschwasser werden zu einem Volumen von: <B>21,5</B> Liter vereinigt. Das vereinigte, Capreomycin enthaltende Filtrat wird unter Rühren zu 86 Liter Methanol gegeben, um das Capreomycin auszufällen. Das. Gemisch wird über Nacht stehengelassen, wobei das Capreomycin als Schwefelsäure.additionssalz ausfällt. Der.
Nieder schlag wird abfiltriert und mit 12 Liter Methanol gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wird ferner mit 7 Liter Chloroform gewaschen. Der gewaschene Niederschlag, der aus dem Additionssalz von 2 Mol Schwefelsäure an Capreomycin besteht, wird im Va kuum bei 35 C getrocknet. Ausbeute: 1,09 kg.
<I>Beispiel 4</I> Herstellung der freien Base Capreomycin 3 g Tetrahydrochlorid von Capreomycin werden in 15 cm3 Wasser .gelöst. Der pH-Wert der Lösung von Capreomycin wird mit 1n Natronlauge auf etwa 7,0 gebracht. Die Lösung wird zur Entfernung eines geringen Niederschlages filtriert. Der Niederschlag wird verworfen.
Das das Capreomycin enthaltende Filtrat wird auf eine Säule gegeben, die .aus Dowex 1 in .der Hydroxylform, mit 8 % Vernetzung und einer Teilchengrösse zwischen 1460 und 5840 Siebmaschen je cm2 besteht. Die Säule hat 2 cm Durchmesser und ist 30 cm hoch.
In der Säule wird das Salz aus der aufgegebenen Capreomycinlösung gespalten:, so dass aus der aus der Säule ablaufenden Flüssigkeit Capreomycin als freie Base gewonnen werden kann. Die Säule wird mit 350 cm3 Wassergewaschen. Das Waschwasser und die Reaktionslösung werden ver einigt und zu einer trockenen, weissen, festen Sub stanz gefriergetrocknet, die .aus der freien Base Capreomycin besteht; Ausbeute: 2,7 g.
Das Präparat hat - Capreomycinaktivität beider Prüfung mit Klebsiella pneumoniae.
Beispiel <I>5</I> Herstellung des Pikrinsäureaddtionssalzes von Capreomycin 1 g der freien Base Capreomycin wird in 10 cm3 destilliertem Wasser gelöst.
Eine 5 % ige Lösung von. Pikrinsäure (Gewicht/Volumen) in 95 % igem Äthanol wird- tropfenweise unter Rühren zu der Capreomycih- lösung gegeben, bis die Ausfällung des Pikrinsäure- additionssalzes von Capreomycin beendet war.
Der gelbe Niederschlag wind abfiltnert, gewaschen und im. Vakuum über wasserfreiem Calciumsulfat ge trocknet.
Das getrocknete Salz zeigt Aktivität gegen über Klebsiena pneumoniae. Ausbeute: 1,7 .g. <I>Beispiel 6</I> Herstellung des p-(2-Hydroxy-l-naphthylazo)- benzolsulfonsäureadditionssalzes von Capreomycin 3 g der freien Base Capreomycin werden in 8 cm3 Wasser gelöst.
Eine heiss gesättigte wässrige Lösung des Natriumsalzes von p-(2-Hydroxy-l-naphthylazo)- benzolsulfonsäure wird tropenweise unter Rühren zu der Capreomycinlösung gegeben.
Der Zusatz der p - (2 -Hydroxy -1- naphthylazo) - benzolsulfonsäure- lösung wird fortgesetzt, bis das gelöste, Capreomycin vollständig als p-(2-Hydroxy-l-naphthylazo)-#benzol- sulfonsäureadditionssalz ausgefällt ist. Das p-(2- Hydroxy-1 naphthylazo)-benzolsulfonsäuresalz des Capreomychls fällt als hochviskoses orange gefärbtes öl aus.
Der Niederschlag des Capreomycinadditions- salzes wird durch Dekantieren der überstehenden Lösung abgetrennt, gewaschen und im Vakuum über wasserfreiem Calciumsulfat getrocknet. Der getrock nete Rückstand .des p-(2-Hydroxy-l-naphthylazo)- benzolsulfonsäuread@ditionssalzes von Capreomycin ist eine orange gefärbte feste Substanz. Sie besitzt Aktivität gegenüber Klebsiena pneumoniae. Aus beute: 4,6 g.
Process for the production of the antibiotic capreomycin The invention proposes a process for the production of capreomycin, which consists in that a capreomycin-producing strain of Streptomyces capreolus is immersed in a culture medium containing assimilable sources of carbon, nitrogen and inorganic salts breeds aerobic conditions,
until a substantial amount of capreomycin has been formed by the organism in the culture medium.
The novel base described here is called capreomycin and is a white solid substance with the following properties: It is easily soluble in water. In contrast, it is relatively insoluble in most organic solvents. She is z.
B. relatively insoluble in lower ketones such as acetone and methyl isobutyl ketone, in alcohols such as methanol, ethanol and butanol, in esters such as amyl acetate, and in ethers such as diethyl ether. Furthermore, it is relatively insoluble in solvents such as pyridine,
halogenated hydrocarbons, benzene and hydrocarbons.
The free base capreomycin is relatively stable in aqueous solutions within a pH range of about 4 to 8, but is also unstable in strongly basic and strongly acidic solutions. In general, capreomycin is more stable in acidic solutions than in basic solutions.
The electrometric titration of Capreomycn in dimethylformamide water (2: 1 parts by volume) shows the presence of titrable groups with the following pK'a values: 6; 5; 8.0; 10; 0 and 13.0: The molecular weight of capreomycin as determined by electrometric titration is about 740.
The tetrahydrochloride of capreomycin is soluble in anhydrous methanol to the extent of about 6.6 mg per cm3 at 26 C.
Analysis of capreomycin, which was dried in vacuo at room temperature over anhydrous calcium sulfate for 16 hours, showed that it was present as the free base and contained approximately the following percent:
EMI0001.0076
Carbon <SEP> 44.08
<tb> hydrogen <SEP> 6.94
<tb> nitrogen <SEP> 26.23
<tb>. Oxygen <SEP> (direct) <SEP> 22.8 These values result in the empirical formula C25-28H50 -53N14010, but of course this formula is only an approximation, which you can see when the exact structure of the compound is explained can change something.
The infrared absorption curve: of capreomycin dihydrochloride -as of mineral oil. vehicle 1 shows covered powder. The recognizable bands of the infrared absorption spectrum in the range from 2.0 to 15.0 μ are as follows: 3.10; 6; 00; 6; 65 and 8.15.
The ultraviolet absorption spectrum of capreomycin shows intense absorption maxima. of about 268 with in 0.03N hydrochloric acid with an absorption value of Ei @m = 269 and of about 283 m, u in 0.05N potassium hydroxide solution with an absorption value of E i @m = 175-.
The specific optical rotation of a sample of capreomycin disulfate dried in vacuo at room temperature over anhydrous calcium sulfate for 16 hours is. [A] D = -27.6 (c = 1 part by weight per 100 parts by volume in water).
The substance was examined by known methods for the analysis of amino acids, e.g. B. after that of Moore and Stein in J.
Biol. Chem. 192, 663 (1951), and the analysis of the hydrolysates of capreomycin, which were obtained by hydrolysis with 5.7N hydrochloric acid at 100 ° C., showed the presence of several amino acid residues. The quantitative determination of the acid hydrolysates in such contained amino acid residues is limited,
because the resistance of the peptide bonds to cleavage and the resistance of the amino acid residues in the acid hydrolyzates are very different.
Under this condition and assuming a molecular weight of about 740, the preliminary amino acid analysis gives at least one residue each of the following amino acids in the molecule of capreomycin: ahnine, serine, 2,3-diaminopropionic acid and two basic amino acids, of which the one is likely to be derived from ornithine and the other is likely. as yet unknown.
The analyzes to date have not yet provided any information about the presence of acidic (containing several carboxyl groups), aromatic or sulfur-containing amino acids.
Chemical tests carried out with capreomycin produced the following results: The ninhydrin test for the presence of α-amino groups was positive. The Lowrysche [J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)] and the Folin-Ciocalteau protein probe were positive.
The Anthron, Bial and Taubian saccharide samples were negative, as was Ehrlich's indole sample. The hydroxamic acid probe for ester groups, as described in J. Bol. Chem. <I> 159, 21 </I> (1945): was also negative.
Capreomycin has an inhibitory effect on the growth of certain microorganisms, including gram-positive and gram-negative bacteria. The amounts which produce an inhibitory effect on the growth of a number of organisms are given in Table I.
The inhibitory concentrations were determined by means of an agar dilution sample or a nutrient solution dilution sample (labeled ad or bd in the table).
In the agar dilution sample, the sample becomes an organism. on a series of agar plates containing different concentrations of capreomycin in the agar, streaked out or implanted in them, in order to achieve the minimum concentration of capreomycin in y / cm3;
to determine which inhibits the growth of the organism for 48 hours.
With the nutrient solution dilution sample; a series of tubes containing a nutrient solution with various concentrations of capreomycin are inoculated with the sample organism in order to determine the minimum concentration of capreomycin in y / cm3 in the nutrient solution which inhibits the growth of the organism for about 24 hours.
EMI0002.0117
<I> Table <SEP> 1 </I>
<tb> Inhibition of the examined <SEP> organism <SEP> concentration
<tb> (<U> y </U> / cm3)
<tb> <I> bacteria </I>
<tb> -'Staphylöcoccus <SEP> .äureus <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> -_ <SEP> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 25 <SEP> ad
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 1,56 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> twberculosis <SEP> (607) <SEP> 6.25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> tubereulosis
<tb> (607, <SEP> streptomycin-resistant) <SEP> 3,1 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium <SEP> 6.25 <SEP> ad
<tb> Mycobacterium <SEP> avium
<tb> (streptomycin resistant) <SEP> 1,
56 <SEP> ad
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 100 <SEP> ad
<tb> Salmonella <SEP> typhimurium <SEP> 125 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> pullorum <SEP> 62.5 <SEP> b @ d
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 125 <SEP> bd
<tb> Salmonella <SEP> .berta <SEP> 125 <SEP> bd As mentioned above, capreomycin and its acid addition salts can be used to treat bacterial infections in veterinary medicine. The connections are e.g.
B. effective in treating diseases caused by salmonella. In particular, about 400 mg per kg of body weight, given subcutaneously, is sufficient to combat an infection by Salmonella typhimurium in mice. Furthermore, about 1 to 5 mg of capreomycin for intramuscular injection per day-old chick are sufficient to combat an infection of Salmonella pullornm.
The compounds are also effective contact poisons for house flies. A suitable preparation for this purpose is an aqueous solution of 0.4 wtA capreomycin, either as a free base or as a water-soluble acid addition salt.
The compounds have antihypertensive effects, as the standardized pharmacological test on anesthetized dogs shows.
Capreomycin and its acid addition salts have an antibacterial effect in vivo against infecting organisms when injected subcutaneously in mice, the ED50 value (effective amount to protect 50% of the test animals) in some examples being as follows : Streptomycetes pyogenes, 250 mg (X 2); Proteus vulgaris, 84 mg (X 2);
Salmonella typhosa, 90 mg (X 2); and Klebsiena pneumoniae, 30 mg (X 2).
(The values mean the amount of capreomycin per kg of body weight of the test animal. X 2 means two doses.) Furthermore, capreomycin is effective in mice in vivo against experimentally caused tuberculosis infections. It is Z.
B. effective against Mycobacterium tuberculosis var. Hominis (strain H37RV) in infections in mice when given subcutaneously or orally.
When injected subcutaneously, it is effective at a dose in, the general range in which currently used anti-tuberculous antibiotics, such as streptomycin, are effective.
The capreomycin can be produced by cultivating a hitherto unknown organism under aerobic conditions in a culture medium which, as simulatable sources of carbon; Contains nitrogen and inorganic salts.
The organism was isolated from a soil sample by suspending parts of the soil sample in sterile distilled water and spreading the suspensions on nutrient agar. The inoculated nutrient agar plates were incubated at about 25 to 35 ° C. for several days. After the incubation time, colonies of the capreomycin-producing organisms were transferred to agar slants using a sterile platinum loop.
The inoculated slant agar bases were incubated in order to obtain larger amounts of inoculum for the production of capreomycin.
The novel organism, capable of producing capreomycin, was sent to The Culture Collection of the Northenn Utilization Research and Development Branch of the United States Department of Agriculture in
Peoria, Illinois, and given the culture designation NRRL 2773 and the name Streptomyces capreolus.
The following detailed description refers in detail to this newly found organism NRRL 2773. Of course, the production of capreomycin by breeding other capreomycin-producing organisms or mutants of capreomycin-producing organisms also belongs , including mutants of NRRL 2773, within the scope of the invention: Such other organisms, races or mutants can be identified by known methods, e.g.
B. by treating a capreomycin-forming organism with X-rays or ultraviolet radiation or with chemical agents such. B. the nitrogen mustards (English: Bitrogen mustards) are produced.
The following are the results of a detailed systematic investigation of the new organism S. capreolus NRRL 2773. The colors given in the description correspond to the definitions given by Maerz and Paul, Dictionary of Color (1950).
<I> Microscopic morphology </I> Tomato paste-oatmeal agar (14 days at 30 C) The colonies form straight or curved sporophores and cylindrical conidia. The conidia are 1.0 to 1.2, u in diameter and 3.0 to 4.8, u in length.
Agar <I> according to </I> Hickey <I> and </I> Tresner (14 days at 30 C) Microscopic morphology as above. Salt starch agar (14 days at 30 C) Microscopic morphology as above. <I> Characteristics of the culture </I> Czapek agar <I> {14 </I> days at 30 C) Moderately good growth. Larger amounts of aerial mycelium,
white and very little spore formation. The reverse is orange-brown to red-brown. No soluble pigments.
Glucose asparagine agar (14 days at 30 C) Moderate growth. Slight, pale yellow-brown (P1.10-2.B) aerial mycelium. Little spore formation, reverse red-brown. Light brown soluble pigment.
<I> Inorganic </I> Salts-Starch Agar (14 days at 30 C) Moderate growth; fairly strong, almost white aerial mycelium, red-brown reverse side. Light red-brown soluble pigment.
Tomato paste oatmeal agar (14 days at 30 C). Moderate growth. Fairly strong; almost white aerial mycelium; Red-brown back. Light red-brown soluble pigment. Emersofz agar (14 days at 30 C). Moderate growth. Slight, white aerial mycelium. No spore formation. Red-brown back. Light brown soluble pigment.
Potato plug agar (14 days at 30 ° C) No growth to excellent growth of vegetative mycelium depending on the potato variety. No visible air cells. The potato wad is slightly darkened by the light orange back and vegetative growth.
Tyrosine Agar (14 days at 30 C) Fairly good growth. Aerial mycelium almost white. Back light brown. Light brown soluble pigment.
<I> Physiology </I> H2S formation on peptone iron agar with the addition of yeast extract none observed.
Gelatine liquefaction moderately with the formation of a red-brown soluble pigment.
Nitrate reduction no reduction in organic nutrient solution, low reduction in synthetic nutrient solution. Starch hydrolysis only partial hydrolysis after 14 days. Skimmed milk, neither coagulation nor peptonization in 14 days. Orange-brown ring, no membrane. Little increase in pH.
Table II shows the results that were obtained in experiments on carbon utilization with the organism NRRL 2773. The following symbols are used in the table: + = growth and recovery - = no discernible growth or no recovery.
EMI0004.0020
<I> Table <SEP> I1 </I>
<tb> Carbon recovery <SEP> from <SEP> NRRL <SEP> 2773
<tb> connection <SEP> growth behavior
<tb> L (+) <SEP> Arabinose <SEP> +
<tb> D (+) - glucose <SEP> +
<tb> D (-) - fructose <SEP> +
<tb> i-inositol
<tb> Maltose <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> - <SEP> +
<tb> D (+) <SEP> Xylose <SEP> L (+) - Rhamnose <SEP> Sucrose <SEP> Lactose <SEP> D (+) - Raffinose <SEP> Inulin <SEP> Mannitol <SEP> Salicin < SEP> Sorbitol <SEP> Cellulose <SEP> D-Ribose <SEP> D (+)
<SEP> Trehalose <SEP> - The culture medium which can be used for the production of capreomycin by cultivating NRRL 2773 can be selected in various ways, as can be seen from the above utilization experiments; the organism can use different energy sources.
Because of the cheap production, the large yield of antibiotic and the easy isolation of the antibiotic, certain culture media are preferred which contain relatively simple nutrient sources. So contain z.
B. the media useful for making capreone lycine; an assimilable source of carbon such as glucose, fructose, maltose, mannose, soluble starch, molasses, dextrin, brown sugar, corn steep liquors and the like. The preferred source of carbon is glucose.
The usable media also contain a source of assimilable nitrogen such as oatmeal, beef extract, peptones (from meat or soy), hydrolyzed casein, yeast, amino acid mixtures and the like. At present, peptones, hydrolyzed casein and beef extract are preferred as nitrogen sources.
Mineral salts, e.g. B. salts with calcium, sodium, potassium, chloride, sulfate and carbonate ions, and a source of growth factors such as yeast or yeast extract, the media can advantageously be added.
As is also necessary for the growth and development of other microorganisms, essential trace elements must also be added to the culture medium in order to breed the actinomycetes used according to the invention. Such trace elements usually get into the medium as impurities when the other components are added.
The initial pH of the culture medium can vary widely. However, it has been found to be useful that the initial pH of the medium is between about 5.5 and 8.0; preferably between about 6.5 and 7.0.
As has also been observed with other Actinomycetes, the pH of the medium increases gradually as the organism grows; while the capreomycin is being formed and can reach values of about 7.2 to 8.0 or greater, the final value depending at least in part on the initial pH of the medium, the buffers contained in the medium, and the time the organism has grown can.
Immersed aerobic cultures are conditions of choice for: Making Capreomyein. Shake flasks and flask surface cultures can be used to prepare relatively small quantities, but submerged aerobic cultures in sterile tanks are preferred for large quantities.
The medium in the sterile tank can be inoculated with a spore suspension, but because of the growth retardation observed when using a spore suspension as an inoculum, the vegetative form of the culture is preferred.
If the growth retardation is avoided in this way, more effective utilization of the fermentation device is also possible.
It is therefore advisable to first produce a vegetative inoculum of the organism "by inoculating a relatively small amount of culture medium with the spore shape of the organism, and when a young, active vegetative inoculum has been obtained, this inoculum aseptically into the large tank convict.
The medium in which the vegetative inoculum is formed can be the same or different from that used for the large-scale production of capreomycin.
The organisms grow best at temperatures in the range of about 28 to 37 C. The best capreomycin formation seems to occur at about 29 to 33 C. As is customary with immersion culture methods, sterile air is blown through the culture medium.
The most effective promotion: growth. 'et organism and: the formation of capreomycin is achieved if: the volume of air used in the tank process is more than 0.1 part of the vote air per minute per part by volume of culture medium. Effective growth and the best yields of capreomycin are achieved if the volume of air used is at least 1 part by volume of air per minute per part by volume of culture medium.
The concentration of capreomycin activity in the culture medium can easily be followed during the fermentation period by examining samples of the culture medium for their inhibitory effect on the growth of an organism which is inhibited by capreomycin. The organism Klebsiena pneumonia has proven to be suitable for this purpose.
The investigation can be carried out in a known manner by measuring turbidity or in dishes.
Generally, after inoculation of the culture medium, the greatest amount will be formed within about 4 to 7 days if a submerged aerobic culture or shake flask culture is used, and within about 5 to 10 days if a surface culture is used.
The mycelium and. undissolved solids are removed from the fermentation solution in the usual way, e.g. B. by Filtrie ren or centrifugation removed. The antibiotic is contained in the filtered solution and can. from this z. B. be removed by adsorption.
The various adsorbents that can be used are adsorbent carbons and ion exchange resins of acidic character, a suitable resin is Dowex 50 (a sulfonated polystyrene resin from Dow Chemical Company).
When using charcoal as an adsorbent, capreomycin can be added by adding activated charcoal as an adsorbent, e.g. B. Darco G-60 (from Atlas Powder Company) to the filtered solution with stirring.
The mixture is stirred long enough for the capreomycin to be effectively adsorbed on the charcoal. If about 2 to 5 parts of charcoal per 1 part of solids content are added to the solution, a satisfactory removal of the capreomycin from the solution is achieved within about 1 to 2 hours.
The charcoal on which the antibiotic is adsorbed is filtered off from the mixture and, thoroughly to remove, not ads:
orbited impurities washed. The antibiotic is then eluted from the washed charcoal. It has been found that a combination of a dilute aqueous acid with a water-miscible organic solvent can effectively serve to remove the antibiotic from the carbon.
A mixture of 80 parts by volume of 0.05N hydrochloric acid and 20 parts by volume of acetone has z. B. proven effective in eluting capreomycin. Another method is to remove capreomycin from the filtered solution by contacting it with an acidic resin. The resin is usually supplied in salt form, e.g. B. as sodium salt ". The adsorbed capreomycin can be extracted from the resin, for example with an aqueous solution of a soluble salt, e.g.
B. a sulfate, a chloride or a citrate., Elmert. The salt used can be triethylamine sulphate, sodium chloride, potassium chloride, sodium citrate or the like.
The capreomycin eluates can, if necessary, be decolorized by treatment with charcoal. If a relatively impure preparation of capreomycin is to be obtained, the eluates mentioned only need to be evaporated to dryness. The eluates or the dry residue thereof can, however, be used for further purification of capreomycin. So can, for.
For example, the eluate obtained by adsorption with charcoal can be evaporated to about 1/5 to 1/10 of its volume, the acetone being removed and the cepemomycin precipitated from the aqueous concentrate. The precipitation can be carried out by adding a suitable salt with stirring, for.
B. a conventional way. To precipitate proteins, such as ammonium sulfate, by acidification with an acid that provides an anion for the capreomycin salt, or with a water-miscible solvent such as methanol or acetone. A preferred precipitant is sulfuric acid.
For precipitation, 10N sulfuric acid is usually added to the concentrated eluate in an amount of about 1 part by volume of acid per 100 parts by volume of capreomycin concentrate.
That as his. Capreomycin precipitated from the sulfuric acid addition salt is filtered off or centrifuged off, washed and, if necessary, dried.
Capreomycin can: be further purified by repeated precipitation with sulfuric acid.
The precipitate of capreomycin can be further purified to a white solid substance by dissolving it in the just necessary amount of water and pouring the solution into a large volume of a water-miscible solvent, e.g. B. in 10 to 30 times the amount of methanol is added, whereupon the capreomycin precipitates.
The white solid precipitate of capreomycin is separated off and, if necessary, dried. The free base capreomycin can be obtained from the acid addition salt obtained by the above process by dissolving an amount of the salt in water, neutralizing the solution and clarifying the neutralized solution by filtration.
The filtered solution of capreomycin can be passed through a column of basic resin, e.g. B. Dowex-1 in the OH form (a strongly basic anion exchange resin from the styrene-divinylbenzene mixture- RTI ID = "0005.0215" WI = "22" HE = "4" LX = "1084" LY = "2516"> polymerizättyp with quaternary Ammonium groups from Dow Chemical Company),
whereby the salt is removed from the solution, but the capreomycin flows through the column as a free base. The free base can be obtained as a dry white solid substance by subjecting the draining solution to freeze-drying.
Other acid addition salts of capreomycin can be prepared in addition to the above-mentioned inorganic acid addition salts. In addition to organic acids, organic acids can also be used to prepare salts of capreomycin, e.g. B. picric acid, p- (2-hydroxy-l-naphthylazo) benzenesulfonic acid, acetic acid and the like more.
The desired salt can usually be obtained by adding at least the equivalent amount of the corresponding acid per mole of capreomycin to an aqueous solution of the free base capreomycin. If an excess of acid is used, 4 equivalents of acid are usually consumed to make the salt, e.g.
B. the tetrahydrochloride is formed with an excess of hydrochloric acid. Of course, salts containing 1, 2 or 3 equivalents of acid can be obtained by adding an appropriate amount of acid. If the desired acid addition salt does not readily precipitate, the precipitation can e.g.
B. by evaporating the solution to a smaller volume or by adding a water-miscible solvent, e.g. B. methanol or acetone, geför changed.
The invention is illustrated in more detail by the following examples: <I> Example 1 </I> Preparation of Capreomycin A spore culture of NRRL 2773 is prepared by growing the organism on an agar slant of the following composition:
EMI0006.0054
<I> Ha <SEP> f <SEP> flour-tomato paste-agar </I>
<tb> Tomato paste <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Pre-cooked <SEP> oatmeal <SEP> 20 <SEP> g
<tb> agar <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 15 <SEP> g
<tb> tap water <SEP> to <SEP> to <SEP> one
<tb> final volume <SEP> of <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 1 <SEP> liter The agar slant is inoculated with spores from NRRL 2773 and incubated for <B> 10 </B> days at around 30 ° C. The culture grown on the very agar is covered with 6 cm3 of nutrient solution, and the agar is gently rubbed to remove the spores and to obtain an aqueous spore suspension.
2 cm3 of the spore suspension are used under aseptic conditions to inoculate 80 cm3 of a sterile vegetative culture medium with the following composition:
EMI0006.0079
<I> yeast <SEP> e-l-medium </I>
<tb> glucose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 15 <SEP> g
<tb> yeast <SEP> ....... <SEP> 15g
<tb> calcium carbonate <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1 <SEP> g
<tb> tap water <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> <B> 1100 </B> <SEP> cm3 The inoculated vegetative medium is incubated for 48 hours at about 28 C, the incubate at a rate of 250 periods per minute on a shaking device with a stroke of 2.5 cm is shaken.
5 cm3 of the vegetative inoculum are used to aseptically inoculate 100 cm3 of the following sterilized medium in 500 cm3 Erlenmeyer flasks.
EMI0006.0091
Glucose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 45 <SEP> g
<tb> Hydrolyzed <SEP> Casein <SEP>. <SEP>. <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Rummelasse <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 10 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 2 <SEP> g
<tb> tap water <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> <B> 1100 </B> <SEP> cm3 The inoculated culture is incubated for 6 days at around 30 C.
During the incubation period, the incubate is shaken 250 times per minute on a shaking machine with a 2.5 cm stroke. The pH of the starting medium is about 6.5. After the incubation period has elapsed, the pH of the medium rises to around 7.0.
The resulting culture solution is filtered to remove the mycelium and other undissolved solids. : The filtered solution contains the capreomycin produced by the organism.
Example 2 Production of Capraomycin Disulfate A spore culture of NRRL 2773 is produced by growing the organism on an agar slant of oatmeal tomato paste agar as in Example 1. The agar slant is inoculated with spores from NRRL 2773 and the inoculated nutrient medium is incubated for 9 days at about 30 ° C.
After incubation, the spore culture grown on the agar slant is covered with 5 cm3 of nutrient solution, and the surface of the agar is gently rubbed in order to remove the spores and to obtain an aqueous spore suspension.
500 cm3 of a sterilized vegetative culture medium of the following composition in a 2 liter Erlenmeyer flask are inoculated aseptically with the inocuium obtained from a 2.5 cm slice of agar:
EMI0006.0139
Soluble <SEP> starch <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Beef extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Sodium Chloride <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 5 <SEP> g
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 2.5 <SEP> g
<tb> tap water <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> <B> 1100 </B> <SEP> cm3 Incubation takes place for 48 hours at <B> 281C </B>, shaking for 250 strokes. per minute on a shaker with a 2.5 cm stroke.
In order to produce a larger amount of vegetative inoculum, the 500 cm3 of vegetative inoculum are aseptically placed in a 1310 liter fermentation tank made of stainless steel, which contains 940 liters of a sterile medium of the following composition (weight / volume)
EMI0007.0008
Glucose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.5
<tb> yeast <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 1.5
<tb> Anti-foam agent <SEP> (polyglycol <SEP> No. <SEP> 2000
<tb>, the <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.02 The inoculum is grown at 30 for 22 hours. During the growth period, the medium is aerated with sterile air in an amount of 0; 48 m 3 per minute and stirred with two 40 cm propellers at 160 revolutions per minute.
In a 6350 liter fermentation tank made of stainless steel, 4130 liters of a medium of the following composition (weight / volume) are given:
EMI0007.0021
<I> Peptone medium <SEP> No. <SEP> 159 </I>
<tb> glucose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 2.5
<tb> molasses <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.0
<tb> Peptone <SEP>. <SEP>. <SEP> 4.0
<tb> calcium carbonate <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0; 2
<tb> Hydrolyzed <SEP> Casein <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0;
6th
<tb> Antifoam agent <SEP> (Polyglycol <SEP> No. <SEP> 2000
<tb> from <SEP> of the <SEP> Dow <SEP> Chemical <SEP> Company) <SEP>. <SEP> 0.005 After sterilization, the medium is inoculated with 375 liters of the inoculum grown in the fermentation tank. The fermentation is carried out at 30 C for 5 days. If necessary, the foam is removed by adding latex No. 1 (anti-foaming agent from Swift & Co.).
During fermentation, the medium is aerated by supplying sterile air in an amount of 2.72 m 3 per minute and stirred with the two 56 cm stirrers at 140 revolutions per minute.
109 kg of Dicaliie 476 (a perlite filter medium from the Great Lakes Carbon Corporation) are added to 3750 liters of the solution of the antibiotic. The mixture is stirred and filtered. The filter cake is washed with tap water. The washing water and the filtrate are combined to a total volume of 3750 liters.
To 1875 liters of the combined filtrate is added 59.7 kg of Darco G-60. The mixture is stirred thoroughly and filtered. The filtrate is discarded. The charcoal filter cake is washed with 200 liters of tap water. The wash water is discarded. The washed charcoal cake on which the capreomycin is adsorbed is washed with 200 liters of 0.05N aqueous hydrochloric acid.
The acid is discarded. The washed charcoal cake is for 1 hour with 400 liters of an aqueous mixture; the <B> 1.65 </B> liters of 11.7N aqueous hydrochloric acid and 80 liters of acetone, eluted. The filter cake is further washed with 200 liters of an aqueous acetone mixture containing 825 cm3 of 11.7N hydrochloric acid and 40 liters of acetone,
eluted within 15 minutes. The eluates are combined. The combined eluates have a total volume of 575 liters and who concentrated in vacuo to 52.5 liters. The concentrated extract is added to 525 liters of acetone with stirring. The acetone mixture is left to stand overnight at room temperature, an oily precipitate of Capreomycn separating out.
The supernatant liquid is decanted and discarded. The oily precipitate is dissolved in 20 liters of distilled water. The aqueous solution is evaporated to 12 liters in vacuo in order to remove any adhering acetone @. The aqueous concentrate of capreomycin is filtered to remove a small amount of precipitate, which is then discarded.
The filtrate containing the cäpreomycin is added to 240 liters of methanol with stirring. The methanolic solution of capreomycin is acidified by adding 1 liter of 10N sulfuric acid, whereupon the sulfuric acid addition salt precipitates. The mixture. is left to stand overnight for complete precipitation. The supernatant liquid is decanted off and filtered off.
The precipitate, which consists of: the addition salt of Cap @ reomycin with 2 mol of sulfuric acid, is washed with 10 liters of methanol and dried in vacuo.
Yield: 2510 g: To obtain the tetrahydrochloride of capreomycin, the methanolic solution of. Capreomycin is acidified with 10N sulfuric acid with 11.7N hydrochloric acid.
<I> Example 3 </I> Production of capreomycin disulphate To 360 liters of filtered fermentation solution, which has been obtained by the method of Example 2, 585 g of oxalic acid and 260 g of sodium hydroxide are added in 3 liters of distilled water. The mixture is stirred vigorously and filtered to remove any precipitate, which is discarded.
The volume of the Capreomycin-containing Fil trate is 317 liters. The filtrate is passed through a column of Dowex 50 (2% crosslinked, as sodium salt). The column has a diameter of. 10 cm and a height of 122 cm. The column is washed with 2 liters of distilled water.
The adsorbed capreomycin is removed from the column by washing with 25 liters of a 20% strength aqueous solution of triethylamine sulfate at a rate of 75 cm3 per minute. 2.5 kg Darco G-60 are then added to decolorize the eluate.
After the mixture has been stirred for 15 minutes; 1 kg of Hyflo Supercel (diatomaceous earth filter aid from Johns-Manville Co.) is added with stirring. The mixture is filtered and the filter cake is washed with 1 liter of distilled water.
The filtrate and the washing water are combined to a volume of: <B> 21.5 </B> liters. The combined filtrate containing capreomycin is added to 86 liters of methanol with stirring to precipitate the capreomycin. The. The mixture is left to stand overnight, the capreomycin precipitating out as sulfuric acid addition salt. Of the.
Precipitation is filtered off and washed with 12 liters of methanol. The washed precipitate is further washed with 7 liters of chloroform. The washed precipitate, which consists of the addition salt of 2 moles of sulfuric acid with capreomycin, is dried in vacuo at 35.degree. Yield: 1.09 kg.
<I> Example 4 </I> Production of the free base capreomycin 3 g of tetrahydrochloride of capreomycin are dissolved in 15 cm3 of water. The pH of the solution of capreomycin is brought to about 7.0 with 1N sodium hydroxide solution. The solution is filtered to remove a small amount of precipitate. The precipitate is discarded.
The filtrate containing the capreomycin is applied to a column consisting of Dowex 1 in the hydroxyl form, with 8% crosslinking and a particle size between 1460 and 5840 meshes per cm2. The column is 2 cm in diameter and 30 cm high.
In the column, the salt is split from the capreomycin solution applied: so that capreomycin can be obtained as a free base from the liquid draining from the column. The column is washed with 350 cm3 of water. The wash water and the reaction solution are combined and freeze-dried to a dry, white, solid substance, which consists of the free base capreomycin; Yield: 2.7 g.
The preparation has - Capreomycin activity when tested with Klebsiella pneumoniae.
Example <I> 5 </I> Production of the picric acid addition salt of capreomycin 1 g of the free base capreomycin is dissolved in 10 cm3 of distilled water.
A 5% solution of. Picric acid (weight / volume) in 95% ethanol is added dropwise with stirring to the capreomyci solution until the precipitation of the picric acid addition salt of capreomycin has ended.
The yellow precipitate is filtered off, washed and im. Vacuum dried over anhydrous calcium sulfate.
The dried salt shows activity against Klebsiena pneumoniae. Yield: 1.7 g. <I> Example 6 </I> Preparation of the p- (2-hydroxy-1-naphthylazo) -benzenesulfonic acid addition salt of capreomycin 3 g of the free base capreomycin are dissolved in 8 cm3 of water.
A hot, saturated aqueous solution of the sodium salt of p- (2-hydroxy-1-naphthylazo) benzenesulfonic acid is added dropwise to the capreomycin solution with stirring.
The addition of the p - (2-hydroxy -1-naphthylazo) - benzenesulfonic acid solution is continued until the dissolved capreomycin has precipitated completely as p- (2-hydroxy-1-naphthylazo) - # benzenesulfonic acid addition salt. The p- (2-hydroxy-1 naphthylazo) -benzenesulfonic acid salt of capreomychl precipitates as a highly viscous orange colored oil.
The precipitate of the capreomycin addition salt is separated off by decanting the supernatant solution, washed and dried in vacuo over anhydrous calcium sulfate. The dried residue of the p- (2-hydroxy-l-naphthylazo) benzenesulfonic acid addition salt of capreomycin is an orange solid substance. It has activity against Klebsiena pneumoniae. From booty: 4.6 g.