CH408924A - Verfahren zur enzymatischen Acylierung von 6-Amino-penicillansäure - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen Acylierung von 6-Amino-penicillansäureInfo
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Description
Verfahren zur enzymatischen Acylierung von 6-Amino-penicillansäure Im schweizerischen Patent Nr. 388 962 ist ein Verfahren zur Herstellung von 6-Acylaminopenicil- lansäuren beschrieben, welches darin besteht, dass man auf 6-Aminopenicillansäure in Gegenwart von Carbonsäuren, deren Salzen oder Derivaten bei einem pH von 4,0 bis 6,5 Bakterien bzw.
aus diesen ge wonnene Extrakte, Enzyme oder Enzymanreicherun gen einwirken lässt, die fähig sind, Phenylessigsäure mit der 6ständigen Aminogruppe der 6-Aminopeni- cillansäure unter Wasseraustritt amidartig zu ver knüpfen.
Es wurde nun gefunden, dass sich dieses Ver fahren mit besonderem Vorteil dann anwenden lässt, wenn man als Derivate der Carbonsäuren-Derivate, vorzugsweise Ester oder Amide, von a-Amino- phenylessigsäuren verwendet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäuren, das sich dadurch aus zeichnet, dass man auf 6-Aminopenicillansäure in Gegenwart von Derivaten von a-Aminophenylessig- säuren, bei einem pH von 3,5 bis 9,5, solche Bakte rien bzw.
aus diesen gewonnene Extrakte, Enzyme oder Enzymanreicherungen einwirken lässt, die fähig sind, Phenylessigsäure mit der 6ständigen Amino- gruppe der 6-Aminopenicillansäure unter Wasser austritt amidartig zu verknüpfen.
Die chemische Verknüpfung von a-Amino- phenylessigsäure mit 6-Aminopenicillansäure kann nach den an sich bekannten Methoden der Peptid- chemie erfolgen, wobei allerdings beträchtliche Schwierigkeiten zu überwinden sind.
Man geht so vor, dass man die primäre Aminogruppe in der a-Aminophenylessigsäure durch Acylierung etwa mit Chlorameisensäure-benzylester schützt, das Carbobenzoxy-a-phenylglycin in ein reaktionsfähi ges gemischtes Säureanhydrid überführt und dieses mit 6-Aminopenicillansäure reagieren lässt.
Hierbei tritt eine säureamidartige Verknüpfung der Carboxyl- Gruppe der Carbobenzoxy-a-amino-phenylessig- säure mit der 6ständigen Amino-Gruppe der 6- Aminopenicillansäure ein. Als letzter Schritt bei der Synthese muss der Carbobenzoxy-Rest durch kataly tische Hydrierung abgespalten werden.
Durch das erfindungsgemässe Verfahren gelingt es, diese synthetischen Schwierigkeiten zu umgehen. Als Derivat der a-Aminophenylessigsäure wird bei dem erfindungsgemässen Verfahren vorzugsweise a- Phenylglycylamid oder a-Phenylglycinäthylester ver wendet. Diese Verbindungen werden enzymatisch direkt mit 6-Aminopenicillansäure verknüpft. Das erfindungsgemässe Verfahren wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 durchgeführt.
Die erhältlichen a-Aminobenzyl-penicilline sind deswegen von besonderer praktischer Bedeutung, weil sie im Gegensatz zu Penicillin G bei einer Reihe von gramnegativen Bakterien starke antibakterielle Wir kung besitzen.
<I>Beispiel 1</I> 160 Liter 2volumprozentige Maisquellwasser lösung, enthaltend 0,2 % Kaliumphenylacetat, werden mit KOH auf pH 7,0 eingestellt und 30 Minuten auf 120 erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und 40 Minuten bei 110 C im Fermenter sterilisiert. Diese Nährlösung wird nach Abkühlung mit 400 cm3 einer 18stündigen Schüttelkultur von E. coli ATCC <B>11105</B> beimpft.
Der Ansatz wird dann mit 150 Liter Luft pro Minute bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 Stunden bei<B>31'</B> C ohne überdruck kultiviert. Während der gesamten Wachs tumszeit werden durch eine von der Luftleitung des Fermenters getrennte Leitung 5 Liter Kohlendioxyd pro Minute in die Kultur eingeleitet.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 Liter 0,9 % iger NaCl-Lösung gewaschen und nach erneutem Abzentrifugieren in 1/1:, m Phosphatpuffer-Lösung von pH 6,0 resuspen- diert. Zu dieser Suspension gibt man<B>0,125</B> % 6- Aminopenicillansäure, 1 % a-Phenylglycylamid und 0,2 , ;
Toluol. Das Reaktionsgemisch wird dann mit NaOH auf pH 6,0 eingestellt und 1 Stunde bei 37 C aufbewahrt. Bei der enzymatischen Reaktion entstehen 509 Einheiten a-Aminobenzylpenicillin pro cm3 Reaktionsgemisch.
<I>Beispiel 2</I> 160 Liter 2volumprozentige Maisquellwasser lösung, enthaltend 0,2 % Kaliumphenylacetat, werden mit KOH auf pH 7,0 eingestellt und 30 Minuten auf 120 C erhitzt. Nach Abkühlung wird die Lösung durch Zentrifugieren geklärt und 40 Minuten bei 110 C im Fermenter sterilisiert. Diese Nährlösung wird nach Abkühlung mit 400 cm3 einer 18stündi- gen Schüttelkultur von E. coli ATCC <B>11105</B> beimpft.
Der Ansatz wird dann mit 150 Liter Luft pro Minute bei 150 Umdrehungen des Rührwerkes pro Minute belüftet und 17 Stunden bei 31 C ohne überdruck kultiviert. Während der gesamten Wachstumszeit werden durch eine von der Luftleitung des Fermen- ters getrennte Leitung 5 Liter Kohlendioxyd pro Minute in die Kultur eingeleitet.
Die Bakterienzellen werden aus der Kulturlösung abzentrifugiert, in 16 Liter 0,9 % iger NaCI-Lösung gewaschen und nach erneutem Abzentrifugieren in 1/15 m Phosphatpuffer-Lösung von pH 6,0 resuspen- diert. Zu dieser Suspension gibt man 0,125 % 6-Aminopenicillansäure, 1,0 % a-Phenylglycinäthyl- esterhydrochlorid und 0,
2 % Toluol. Das Reaktions gemisch wird dann mit NaOH auf pH' 6,0 eingestellt und 1 Stunde bei 37 C aufbewahrt. Bei der enzyma tischen Reaktion entstehen 625 Einheiten a-Amino- benzylpenicillin pro cm3 Reaktionsgemisch.
Claims (1)
- PATENTANSPRUCH Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 6-Acylaminopenicillansäuren, dadurch gekennzeich net, dass man auf 6-Aminopenicillansäure in Gegen wart von Derivaten von a-Aminophenylessigsäuren, bei einem pH von 3,5 bis 9,5 solche Bakterien bzw. aus diesen gewonnene Extrakte, Enzyme oder Enzym anreicherungen einwirken lässt, die fähig sind, Phenyl- essigsäure mit der 6ständigen Aminogruppe der 6- Aminopenicillansäure unter Wasseraustritt amidartig zu verknüpfen.UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass als Derivate der a-Aminophenyl- essigsäure, a-Phenylglycylamid oder a-Phenylgly- cinäthylester verwendet werden. 2.Verfahren nach Patentanspruch oder Unter anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die 6-Aminopenicillansäure in Form ihrer Rohlösungen verwendet, wie sie durch Einwirkung von Suspensio nen oder Extrakten von solchen penicillinspaltenden Bakterien, welche bevorzugt die Amidbindung in der 6-Stellung des Penicillinmoleküls angreifen bzw. aus diesen gewonnenen Enzymen oder Enzymanreiche rungen auf Penicilline gewonnen sind. 3. Verfahren nach Patentanspruch oder Unter anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man bei einem pH von 5,5-6,5 arbeitet.
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