CH408930A

CH408930A - Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids

Info

Publication number: CH408930A
Application number: CH99062A
Authority: CH
Inventors: Roger Dr Boissonnas; Pierre-Alain Dr Jaquenoud
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1962-01-26
Filing date: 1962-01-26
Publication date: 1966-03-15
Also published as: US3238188A; FR2904M

Description

Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptids Es wurde gefunden, dass man zu einem bisher unbekannten Polypeptid der Formel I
EMI1.1
gelangen kann, indem man das Nonapeptid-Derivat der Formel V
EMI2.1
durch Oxydation in wässriger Lösung in das End produkt I überführt.

Zum bisher unbekannten Nonapeptid-Derivat der Formel V gelangt man beispielsweise, indem man das neue Hexapeptid-Derivat II,
EMI2.2
in welchem R eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der SuKhydrylgruppe gebräuchliche Gruppe bedeutet, mit einem reaktionsfähigen Derivat der freien SÏure III,
EMI2.3
in welchem R'eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Aminogruppe gebräuchliche Gruppe und R"eine bei der Peptidsynthese zum Schutz der Sulf- hydrylgruppe gebräuchliche Gruppe bedeuten, zum Nonapeptid-Derivat IV
EMI3.1
kondensiert und dieses durch Reduktion mit einem Alkalimetall in flüssigem Ammoniak in das Nonapeptid-Derivat V umwandelt.

Nach diesem Verfahren können zur vorübergehenden Blockierung der Aminogruppe die zu diesem Zweck gebräuchlichen Grup- pierungen, wie die Carbobenzoxygruppe, die Carb-p chloro-benzyluxy-, die p-Toluolsulfonyl-, die Tri phenylmethyl-, die Trifluoracetyl-oder die Phthalylgruppe verwendet werden. Zum Schutz der Sulfhydrylgruppe führt man vorzugsweise eine Phenyl-, eine Benzyl-, eine p-Bromo-benzyl-, eine p-Chloro- benzyl-, eine p-NitrobenzylL, Tolyl-oder eine p Xylylgruppe ein. Mit besonderem Vorteil verwendet man jedoch den Benzylrest.

Es wurde gefunden, dass die Verbindung I eine praktisch gleich starke milchdrüsenkontrahierende Wirkung besitzt wie das natürliche Oxytocin, das anstelle von Glutamin Asparagin enthält. Dagegen beträgt die uteruskontrahierende Wirksamkeit der Verbindung I nur ein Drittel derjenigen des natürllichen Oxytocins. Diese überraschenden Eigenschaften stellen in der Therapie einen bedeutenden Vorteil dar und können besonders in der Gynäkologie bei Stillschwierigkeiten infolge schwer entleerbarer Milchdrüsen, bei Schmerzen beim Stillen oder Abpumpen, bei Milch stauungen und bei beginnender Mastitis puerperalis ausgenützt werden.

Dieser Befund ist deshalb besonders bemerkenswert, weil bis jetzt beim Ersetzen des Asparagins durch Isoasparagin, des Glutamins durch Isoglutamin, oder des Asparagins durch Glutamin, im Oxytocin- molekül praktisch keine uteruskontrahierende Wirksamkeit sowie keine Wirkung auf die Milchdrüsen mehr festgestellt wurde.

Der Ausgangsstoff der Formel V kann beispielsweise auch folgendermassen hergestelit werden :
Man kondensiert N-Carbobenzoxy-L-asparagin-p- nitrophenylester mit L-Asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-
L-prolyl-L-leucyl-glycinamid zu
N-Carbobenzoxy-L-asparaginyll L-asparaginyl-
S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl- glycinamid.

Nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe wird das erhaltene L-Asparaginyl-L-asparaginyl-S benzyl-L-cystei, nyl-L-prolyl-L-leucyl- glycinamid mit N-p-ToluolsulfonylLS-benzyl-L-cy. steihyl- L-tyrosyl-L-isoleucin-p-nirro-phenylester zu
N-p-Toluolsulfonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L- tyrosyl-L-isoleucyl-L-asparaginyl-L- asparaginyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-
L-leucyl-glycinamid kondensiert. Dieses Nonapeptid-Derivat wird mit einem Alkalimetall, vorzugsweise Natrium oder Kalium, in flüssigem Ammoniak behandelt, so dass das lineare Nonapeptid V entsteht.

Dieses wird nun erfindungsgemäss, wie schon gesagt, durch Oxydation, vorzugsweise mit Luft, Sauerstoff oder Wasserstoffperoxyd in wässeriger Lösung in das biologisch aktive, zyklische Polypepi I übergeführt. Das erfindungs- gemäss hergestellte, bisher unbekannte Polypeptid I kann in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten das Peptid in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen und anorganischen Trägermaterial.

Beispiel 1 a) N-Carbobenzoxy-L-asparaginyl-L-asparaginyl-S- benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid
29 g N-Carbobenzoxy-S-asparaginyl-S-benzyl-L cysteinyl-L-prolyl-L-leucylLglycinamid werden in 400 cm3 mit Bromwasserstoff gesättigter, wasserfreier Essigsäure gelost. Man lässt eine Stunde bei 20 stehen, verdampft !im Vakuum unterhalb 40 , wäscht den Rückstand sorgfältig mit Diäthyläther nach, und l¯st in 60 cm Dimethylformamid nach Zugabe von 5*6 cm5 Triäthylamin. Diese Lösung wird sofort mit 15, 5 g N-Carbobenzoxy-L-asparagin-p-nitro-phenylester versetzt.

Nach 20 Stunden bei 20 bekommt man eine feste Masse, die mit 500 cnfl Essigester aufgeschlämmt wird. Man filtriert den Niederschlag, wäscht mit Essigester und absolutem Sithanol nach und trocknet unter Vakuum. Man erhält 28, 4 g N Carbobenzoxy-L-asparaginyl-L-asparaginyl-S-benzyl- L-cysteinyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid vom Smp. 208¯.[a]21D =-51¯(c= 1 in Dimethyl- formamid). b) L-Isoleucin-p-nitro-phenylester-hydrobromid
50 g N-Carbobenzoxy-L-isoleucin-p-nitro-phenylester werden in 250 cm3 mit Bromwasserstoff ge sättigter, wasserfreier Essigsäure gelöst.

Man lässt eine Stunde bei 20 stehen, verdampft im Vakuum unterhalb 40 , kristallisiert im Diäthyläther, filtriert und trocknet. Man erhält 33, 3 g L-Isoleucin-p-nitrophenylester-hydrobromid vom Smp. 189 , [a] 21 + 30 (c = 2 in Wasser).

c) N-p-Toluolsulfonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L- tyrosyl-L-isoleucin-p-nitro-phenylester
Man versetzt die Lösung von 52, 9 g N-p-Toluol- sulfonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-I-tyrosin und 33, 3 g L Isoleucin-p-nitro-phenylester-hydrobromid in 750 cm3 Acetonitril und 11 cm3 Triäthylamin mit 16 g Dicyclohexylcarbodiimid bei 0 , rührt 4 Stunden bei 20 , filtriert dann das Reaktionsgemisch und dampft das Filtrat hierauf ein. Der Rückstand wird in 1500 cm3 Essigester gel¯st, mit verdünnter Salzsäure gewaschen. Man trocknet die organische Phase mit Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein, und kristallisiert den Rückstand in heissem absolutem Athanol um.

Man erhält 42, 0 g N-p-ToluolLsulfonyl-S-benzyl L-cysteiyl-L- tyrosyl-L- isoleucin - p-nitro-phenylester vom Smp. 168 . [a] 21D =-36 (c = 2 in Methanol). d) N-p-Toluolsulfonyl-S-benzyl-L-cysteinyl L- tyrosyl-L-isoleucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-
S-benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl- glycinamid
Man l¯st 17 g N-Carbobenzoxy-L-asparaginyl-L- asparaginyl-S-benzyl-L-;

cysteinyl-IL-prolyl-L-leucyl- glycinamid in 300 cm3 mit Bromwasserstoff gesät- tigter, wasserfreier Essigsäure, lässt während einer Stunde bei 20 stehen und verdampft im Vakuum unterhalb 40 . Der Rückstand wird mit wasserfreiem Diäthyläther sorgfältig gewaschen und hierauf zu einer Lösung von 15 g N-p-Toluolsulfonyl-S- benzyl - L- oysteinyl - L- tyrosyl - L- isoleucin - p-nitrophenylester und 2, 8 cm3 Triäthylamin in 60 cm3 Dimethylformamid gegeben. Es wird über Nacht bei 20 stehengelassen, und die gebildete feste Masse in 400 cm3 Essigester aufgeschlämmt. Man filtriert den Niederschlag, wäscht mit Essigester und heissem Methanol nach und trocknet unter Vakuum.

Man erhält 18 g N-p-Toluol-sulfonyl-S-benzyl-L-cysteinyl
L-tyrosyl-L- isoleucil-L- asparaginyl-L- asparaginyl-S benzyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl-glycinamid vom Smp. 240. [&alpha;] 2D =-34 (c = 1 in Dimethylformamid). e) L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-asparaginyl L-asparaginyl-L-cysteinyl-L-prolyl-L-leucyl- glycinamid
Man versetzt eine Lösung von 5 g N-p-Toluol sulfonylkS-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L- asparaginyl-L- asparaginyl - S - benzyl- L- cysteinyl -L prolyl-L-leucyl-glycinamid in 1200 cm3 trockenem flüssigem Ammoniak unter Rühren bei der Siedetemperatur der Lösung, mit so viel Natrium-oder Kaliummetall, bis eine beständige blaue Färbung eingetreten ist.

Nach Zusatz von 1 g Ammoniumchlorid wird die Lösung zur Trockne eingedampft.

Der Rückstand enthält das L-Cysteinyl-L-tyrosyl-L- isoleucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl-L prolyl-L-leucyl-glycinamid. f) Polypeptidverbindung 1
Der Rückstand, enthaltend L-Cysteinyl-L-tyrosyl- L-isoleucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-cysteinyl- L-prolyl-L-leucyl-glycinamid, wird in 5 Liter 0, 01-n Essigsäure gelöst und bei einem pH von 6, 5 bis 8, 0 durch Einleiten von Luft und Sauerstoff während einer Stunde bei 0 bis 40 oxydiert. Man bringt die Lösung, die die Substanz I enthält, auf einen pH von 4, 0 bis 5, 0 und dampft nach Zusatz von 50 g Natriumchlorid zur Trockne ein, wobei ein trokkenes Pulver erhalten wird, das gut haltbar ist.

Es kann aufbewahrt werden und bei Gebrauch klar gelöst werden. Man kann jedoch auch die Lösung direkt verwenden, eventuel, l nach Verdünnen mit Wasser oder einer Salzlösung.

Beispiel 2
Man verfährt wie in Beispiel 1, Abschnitt a. Man verfährt weiter wie in Abschnitt d, benützt aber anstatt N-p-Toluolsulfonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl- L-isoleucin-p-nitro-phenylester eine äquivalente Menge von N-p-Toluolsulfonyl-S-benzyl-L-cysteinyl L-tyrosyl-L-isoleucyl-azid. Man verfährt weiter wie in Abschnitt e und f.

Beispiel 3
Man verfährt wie in Beispiel 1, Abschnitt a. Man verfährt weiter wie in Abschnitt d, benützt aber anstatt N-p-Toluolsulfonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-tyrosyl- L-isoleucin-p-nitro-phenylester eine äquivalente Menge von N-Carbobenzoxy-S-benzyl-L-cysteinyl-L- tyrosyl-L-isoleucyl-azid. Man verfährt weiter wie in
Abschnitten e und f.

Beispiel 4
Man verfährt wie in Beispiel 1, 2 oder 3. Man oxydiert aber am Ende bei 0 bis 40 durch Zusatz von 7, 5 cm3 einer 1-n Lösung von Wasserstoffperoxyd in Wasser bei einem pH von 4, 0 bis 6, 0 (anstatt der
Oxydation durch Einleiten von Luft und Sauerstoff).

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekann ten Polypeptids I, EMI5.1 dadurch gekennzeichnet, dass man das Nonapeptid-Derivat der Formel V EMI5.2 durch Oxydation in wässriger Lösung in das End produkt I überführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oxydation von V zu I durch Zugabe von Wasserstoffperoxyd durchführt.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oxydation von V zu I durch Einleiten von Luft durchfiihrt.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man die Oxydation von V zu I durch Einleiten von Sauerstoff durchf hrt.