CH633523A5 - Verfahren zur herstellung von peptiden und peptidderivaten. - Google Patents

Verfahren zur herstellung von peptiden und peptidderivaten. Download PDF

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CH633523A5
CH633523A5 CH852477A CH852477A CH633523A5 CH 633523 A5 CH633523 A5 CH 633523A5 CH 852477 A CH852477 A CH 852477A CH 852477 A CH852477 A CH 852477A CH 633523 A5 CH633523 A5 CH 633523A5
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lys
phe
met
gly
boc
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Hendrik Marie Greven
David De Wied
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Akzo Nv
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Peptide der allgemeinen Formel I
A-L-B-D-Lys-L-Phe-Gly-(L oder D)-Lys-L-Pro-L-Val-Gly-L-Lys-L-Lys-X [I]
in welcher
A Wasserstoff, ein N-Acylrest, der abgeleitet ist von Alkylcarbonsäuren mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aralkyl-carbonsäuren mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aminosäuren, Peptiden, N-Alkylcarbonyl- oder N-Aralkylcarbonylderivaten der Aminosäuren oder N-Alkylcarbonyl-oder N-Aralkylcarbonylderivaten der Peptide,
B ein Aminosäurerest aus der Gruppe Phe, Tip, Tyr und -NH-CHRj-CO- ist, wobei Rj ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist,
O II
X einen Rest, der mit der terminalen -C- -Gruppe verbunden ist, bedeutet und für Hydroxyl einen Alkoholrest oder eine unsubstituierte Aminogruppe oder substituierte Aminogruppe steht,
und ihren Säureadditionssalzen. Diese Verbindungen besitzen wertvolle psychopharmakologische Eigenschaften und können angewandt werden zur Behandlung von Senilität oder allgemeiner zur Stimulierung der geistigen Leistungsfähigkeit.
Die Verbindungen führen zu einer Hemmung der Auslöschung der erworbenen Fluchtreaktion und sie sind daher ausserordentlich geeignet zur Behandlung von geistigen bzw. psychischen Störungen, bei denen eine Stimulierung der Hirnfunktion erwünscht ist, z.B. im Fallevon Senilität
Aus European Journal of Pharmacology 2,14, (1967) ist es bekannt, dass das natürliche adrenocorticotrope Hormon (ACTH) und besonders bestimmte Peptidfragmente davon die Auslöschung des sogenannten «erworbenen Fluchtverhaltens» verzögern. Insbesondere haben sich die Peptide, die die Aminosäuresequenz 4 bis 10 von ACTH enthalten als kleinstes Peptidfragment erwiesen, das in dieser Beziehung ebenso aktiv ist wie ACTH selbst.
Aus der US-PS 3 853 836 geht jedoch hervor, dass die vollständige Aminosäuresequenz 4 bis 10 ACTH nicht wesentlich ist für die psychopharmakologische Aktivität, sondern dass ein wesentliches kürzeres Peptid, nämlich 4 bis 6 ACTH, für diese Aktivität verantwortlich ist. Es hat sich ferner gezeigt, dass die N-terminale Aminosäure L-Met ohne Aktivitätsverlust ersetzt werden kann durch D-Met, L- oder D-Met (->0), L- oder D-Met (->02), Desamino-Met, Des-amino-Met (->-0), Desamino-Met (->02) oder durch die
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Gruppe H2N-Q-C-, wobei Q eine Alkylidengruppe mit 1 O
bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine Alkylengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet. 5
In der US-PS 3 856 770 wird ferner angegeben, dass der Ersatz des C-terminalen Peptidrestes -L-Trp-Gly-OH des ursprünglichen 4 bis 10 ACTH-Peptids durch eine der Gruppen L-Phe-OH, L-Phe-Gly-GH, eine Phenylalkylamino-gruppe oder eine (3-Indolyl)-alkylaminogruppe zu einer Zu- io nähme der psychopharmakologischen Aktivität führt.
Ferner wird in der US-PS 3 842 064 offenbart, dass eine bedeutende Zunahme der psychopharmakologischen Aktivität erreicht wird durch Ersatz der Aminosäure L-Arginin (L-Arg) in dem ursprünglichen 4 bis 10 ACTH-Peptid (oder in 15 einem der in den oben erwähnten Patentschriften angegebenen modifizierten Peptide) durch D-Lysin (D-Lys).
Eines der aktivsten Peptide, das in den oben angegebenen US-PS erwähnt ist, ist das Peptid
4-9 ACTH, 4-L-Met(-»0), 8-D-Lys, 9-L-Phe,
ein Peptid, das in Beziehung auf das ursprüngliche 4 bis 9 ACTH verändert ist in Übereinstimmung mit der in den Patentschriften erwähnten Verstärkungen 4, 8 und 9.
Dieses Peptid 25
H-L-Met( -> 0)-L-Glu-L-His-L-Phe-D-Ly s-L-Phe-OH
hat sich als ungefähr lOOOmal wirksamer erwiesen als das nicht veränderte 4 bis 9 ACTH.
Es hat sich gezeigt, dass das Peptidfragment dieses 4 bis 9 ACTH, 4-L-Met(->0), 8-D-Lys, 9-L-Phe, nämlich
L-Phe-D-Lys-L-Phe selbst auch eine gewisse pharmakologische Wirksamkeit besitzt, obwohl in latenter Form. Auf der Grundlage der US-PS 3 856 770 und der US-PS 3 842 064 ist es bekannt, dass ein sehr aktives Peptid erhalten wird durch Verlängerung der Peptidkette L-Phe-D-Lys-L-Phe an dem N-terminalen Ende, z.B. durch das Peptidfragment L-Met(->0)-L-Glu-L-His:
L-Met( -> 0)-L-Glu-L-His-L-Phe-D-Lys-L-Phe
Überraschenderweise hat es sich nun gezeigt, dass sehr aktive Peptide erhalten werden können durch Verlängerung der Kette an dem C-terminalen Ende des Peptids L-Phe-D-Lys-L-Phe. Diese deutliche Verstärkung (mit einem Faktor von mindestens 1000) bei Verlängerung der Kette an dem C-terminalen Ende war für den Fachmann aufgrund der bisher bekannten Tatsachen nicht zu erwarten. Es ist nämlich gezeigt worden, dass die C-terminale Kettenverlängerung des ursprünglichen 4 bis 10 oder 4 bis 9 ACTH zu keiner Erhöhung der Wirksamkeit führte [siehe z.B. European Journal of Pharmacology 2,14 (1967)], während es sich zeigte, dass die C-terminale Kettenverlängerung des 7 bis 9 ACTH-Peptids die Aktivität mindestens um den Faktor 10 erhöhte.
Diese überraschende Aktivität kann durch die in der folgenden Tabelle angegebenen Beispiele gezeigt werden.
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Tabelle 1
Peptid Wirksamkeitsverhältnis,
bezogen auf 4-10 ACTH
1. Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp (4-9 ACTH) 1
2. Phe-Arg-Trp (7-9 ACTH) 0,1
3. Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys (7-16 ACTH) 1
4. Phe-D-Lys-Phe 0,1
5. Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys 100
Ferner konnte gezeigt werden, dass die Verlängerung der Kette an dem C-terminalen Ende des oben angegebenen Peptids L-Phe-D-Lys-L-Phe von grosser Bedeutung ist, in dem Sinne, dass eine minimale C-terminale Kettenlänge wesentlich ist. Diese minimale Verlängerung der Kette erwies sich überraschend als das 10 bis 16 ACTH; eine kürzere Kettenlänge verringerte die Aktivität auf eine Stärke entsprechend derjenigen von nicht verändertem 7 bis 16 ACTH.
Es hat sich ferner überraschenderweise gezeigt, dass eine noch beachtlichere Verstärkung erreicht werden konnte 45 durch Ersatz der Aminosäure L-Lys (Stellung 11) in der minimalen essentiellen C-terminalen Kettenverlängerung (10 bis 16 ACTH) durch die Aminosäure D-Lys. Diese Modifizierung erhöht die Aktivität des Peptids um einen weiteren Faktor 100. Diese Tatsache geht deutlich aus den Beispielen so der folgenden Tabelle 2 hervor:
Tabelle 2
Peptid
Wirksamkeitsverhältnis, bezogen auf 4-10 ACTH
1. Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys (7-16 ACTH)
2. Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys
3. Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys
4. Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys
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Das Peptid L-Phe-D-Lys-L-Phe, dessen Aktivität wesentlich erhöht werden kann, wie oben angegeben, durch Verlängerung der C-terminalen Kette, kann weiter verstärkt werden durch eine weitere N-terminale Kettenverlängerung, nach den in den US-PS 3 853 836, 3 856 770 und 3 842 064 angegebenen Verfahren, auf die hier Bezug genommen wird.
Es hat sich gezeigt, dass die entstehenden Peptide psychopharmakologische Aktivitäten besitzen, die 106- bis 107mal 65 so stark sind wie diejenigen des ursprünglichen 4 bis 10 ACTH-Peptides.
Es hat sich ferner gezeigt, dass die erste Aminosäure Phe in dem ursprünglichen L-Phe-D-Lys-L-Phe nicht notwen-
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digerweise vorhanden sein muss, sondern, dass sie auch durch zi "ireiche andere Aminosäuren ersetzt sein kann, so dass der Hauptvorteil dieser Aminosäure offensichtlich darin besteht, zusätzlich die richtige Kettenlänge zu liefern.
In den neuen Verbindungen der Formel I bedeutet R: zum Beispiel Wasserstoff, Methyl, Isopropyl, Isobutyl und sec.-Butyl.
Bei der Definition von B in Formel I sind die bevorzugten Aminosäurereste Phe und Ala, wobei das letztere abgeleitet ist von -CH-CHRj-CO-, wobei Rt eine Methylgruppe ist.
Unter Alkoholresten in der Definition von X in der Formel I werden beispielsweise Reste verstanden, die sich von aliphatischen Alkoholen, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butano!, Hexanol, Decyalkohol, Laurylalkohol, Myristyl-alkohol und Stearylalkohol ableiten. Im allgemeinen besitzt die Gruppe X1 bis 18 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 8 Kohlenstoffatome.
Die bei der Definition von X angegebene substituierte Aminogruppe umfasse eine Mono- oder Dialkyiamino-gruppe, bei der die Alkylgruppe I bis 6 Kohlenstoffatome enthält, z.B. eine Methylamino-, Isobutylamino-, sec.-Butyl-amino-, n-Pentylamino- und n-Hexylaminogruppe, aber auch Aminosäuren oder Peptidreste mit der Sequenz 17, 17-18,17-19 usw. bis zu und einschliesslich 17-24 ACTH oder die entsprechenden C-terminalen Ester oder Amide unter der Voraussetzung, dass der Aminosäurerest Arg (wie er in den Positionen 17 und 18 des ACTH-Fragmentes vorhanden ist) gegebenenfalls durch Lys ersetzt sein kann.
Bei der Definition von A kann die N-Acylgruppe abgeleitet sein von irgendeiner Alkylcarbonsäure mit I bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Essigsäure, Propionsäure, Valerxan-säure und Capronsäure. Als Alternative kann A irgendeine Acylgruppe sein, die abgeleitet ist von einer Aralkylcarbon-säure mit 7 bis IQ Kohlenstoffatomen, wie Phenylessigsäure» Phenylpropionsäure und Phenylbuttersäure. Eine weitere Alternative besteht darin, dass die N-Acylgruppe abgeleitet sein kann von einer Aminosäure oder einem Peptid.
Schliesslich kann A ein N-Alkylcarbonylderivat (Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen) oder ein N-Aralkylcarbonyl-derivat (Aralkyl mit 7 bis IG Kohlenstoffatomen) Derivate dieser Aminosäure oder Peptidreste.
Bei der oben angegebenen Formel I wird der Ausdruck D-Lys-L-Phe-GIy-(L oder D)-Lys-L-Pro-L-Val-GIy-L-Lys-L-Lys im Folgenden, und in den Ansprüchen bezeichnet werden als «Grundeinheit ohne Verlängerung». In dieser Grundeinheit ohne Verlängerung stellt man fest, dass 4 Lysineinheiten vorhanden sind und dass, wenn man von dem N-terminalen zu dem C-terminalen Ende geht, die erste Lysingruppe in D-Form, die dritte und vierte in L-Form und die zweite erfindungsgemäss in L- oder D-Form vorliegen muss. Die Gruppe A und B kann im folgenden als «N-ter-minale Kettenverlängerung» bezeichnet werden, während X bezeichnet werden kann als «C-terminale Verlängerung».
Bevorzugte N-Acylderivate (bei der Definition von A) sind abgeleitet von einer Aminosäure oder einem Peptid und bestehen aus 1 bis 3 Aminosäureresten der Formel
U-Qi~, U-Q2-Q1— oder Q3-Q2-Q1—
wobei U ein Wasserstoffatom, eine N-Alkylcarbonylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine N-Aralkylcarbonyl-gruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen, Qx den Aminosäurerest L-His, D-His oder-NH-Z-CO, Q2 den Aminosäurerest L-GIu, D-Glu, L-GIn, D-Gln oder-NH-Z-CO-und Ch den Aminosäurerest U-L-Met, U-L-Met(-*0), U-L-Met(|02), U-D-Met, U-D-Met(-^O), U-D-Met(-*02), Desamino-Met, Desamino-Met(-)-O), Desamino-
Met(-»02) oder UNH-Z-CO- und Z eine nicht substituierte, monohydroxysubstituierte oder monoaminosubstituierte Alkylen- oder Alkylidengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.
Aminosäurereste, wie Gly, Ala, ß-AIa, (a-Me)Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr und Lys, fallen unter die durch die Formel -HN-Z-CO- angegebenen Aminosäurereste.
Besonders bevorzugte N-Acylgruppen entsprechen der Formel Q3-Q2~Qi- in der Q3 abgeleitet ist von Methionin oder Desaminomethionin [z.B. L-Met, L-Met(->0), L-Met(->02)], Desamino-Met, Desamino-Met( -+ O) und De-samino-Met(-»02)] und in der die Sequenz-Q2-Qi den Peptidrest -GIu-His- oder als Alternative einen Peptidrest aus zwei aliphatischen und vorzugsweise identischen natürlichen Aminosäuren, wie -Gly-GIy-, -Val-Val-, -Glu-Ala- ist und besonders -Ala-AIa- bedeutet.
Eine bevorzugte Gruppe von Peptiden der allgemeinen Formel I kann angegeben werden durch die Formel II
Q3-Q2-Qi-L-B-D-Lys-L-Phe-GIy-(L oder D)-Lys-L-Pro-L-Val-GIy-L-Lys-L-Ly s-X [II]
oder ein Salz oder Säureadditionssalz davon, wobei Ql3 Q2, Q3, B und X die oben angegebene Bedeutung haben.
Die Erfindung umfasst auch die Herstellung von Salzen oder Säureadditionssalzen der Peptide der allgemeinen Formel I, vorzugsweise der Alkalisalze, und der pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze und Metallkomplexen, die gebildet worden sind durch Zusammenbringen der erfindungsgemäss erhaltenen Peptide mit einem unlöslichen oder schwerlöslichen Salz, Hydroxid oder Oxid eines Metalles (vorzugsweise von Zink). Unter «Alkalisalzen» sind natürlich die Salze der Metalle der Gruppe I des Periodensystems zu verstehen. Pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze umfassen z.B. das HCl-, HBr-, Phos-phorsäure-, Essigsäure-, Weinsäure-, Zitronensäuresalz usw.
Wie oben für Verbindungen der Formel I angegeben, stellt der Alkoholrest bei der Definition von X in der Formel II einen Rest dar, der abgeleitet ist von einem aliphatischen Alkohol mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen und besonders Reste, die abgeleitet sind von aliphatischen Alkoholen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol usw. Die bei der Defintion von X angegebene substituierte Aromogruppe ist im allgemeinen eine Mono- oder dialkylsubstituierte Aminogruppe, in der die Aminogruppen 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten, aber es kann auch ein Aminosäure- oder Peptidrest mit der Sequenz 17,17-18, 17-19 usw. bis zu einschliesslich 17-24 ACTH oder der entsprechende C-terminale Ester oder das Amid davon sein, bei denen Arg gegebenenfalls durch Lys ersetzt sein kann. Bei der Definition von B in der Formel II sind die bevorzugten Aminosäurereste Phe oder Ala.
Die neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden nach dem Verfahren hergestellt wie in Patentanspruch 1 definiert.
Es ist sehr zu empfehlen, auch die e-Aminogruppe von Lysin, die y-Carboxylgruppe von Glu und gegebenenfalls die Imidazolgruppe von Histidin zu schützen. Übliche Schutzgruppen in diesem Zusammenhang sind eine tert.-Butyl-oxycarbonyl- oder eine Tosylgruppe für die s-Aminogruppe von Lysin, eine tert.-ButyIoxycarbonylgruppe für Glu und eine Benzyl- oder Tritylgruppe für His.
Die Schutzgruppen können nach verschiedenen üblichen Verfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, abgespalten werden, je nach der Art der betreffenden Gruppe, z. B. mit Hilfe von Trifiuoressigsäure oder durch milde Reduktion, z.B. mit Wasserstoff und einem Katalysator, wie Palladium oder mit HBr in Eisessig.
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Wege zur Herstellung von erfindungsgemässen Peptiden, bei denen der N-terminale Rest (L oder D)Met(-»0) oder Desamino-Met(->0) ist, können eine milde Oxidation auf bekannte Weise des entsprechenden Met- oder Desamino-Met-Peptids umfassen, z.B. mit verdünntem Wasserstoffperoxid oder einer Persäure. Eine derartige Oxidation liefert ein Gemisch des S- und R-Sulfoxids, das nach bekannten Verfahren, z.B. durch selektive Kristallisation, in die einzelnen Diastereo-Isomeren aufgespalten werden kann. Durch Kupplung von (L oder D)-Methionin-S-(oder -R-)-sulfoxid oder dem entsprechenden Desaminoderivat davon mit dem Rest des Peptidfragments können auch die einzelnen Diastereo-Isomeren direkt erhalten werden.
Die erfindungsgemässen Peptide mit (L oder D)-Met(-»02)- oder Desamino-Met( -> 02) als N-terminalen Rest können erhalten werden durch Oxidation des (Des-amino)Met-peptids I oder durch Kupplung von Met- oder Desamino-Met-sulfon mit dem Rest des Peptidfragments.
Die Durchführung des Verfahrens kann folgendermassen erfolgen:
a) Kondensation einer Verbindung (z.B. Säure oder Peptid), die eine freie Carboxylgruppe besitzt und in der andere reaktionsfähige Gruppen geschützt sind, mit einer Verbindung (z.B. Aminosäure, Peptid oder Amin), die eine freie Aminogruppe enthält und in der andere reaktionsfähige Gruppen ebenfalls geschützt sind in Gegenwart eines Kondensationsmittel oder b) Kondensation einer Verbindung (z.B. Säure oder Peptid), die eine aktivierte Carboxylgruppe enthält und in der andere reaktionsfähige Gruppen gegebenenfalls geschützt sind mit einer Verbindung (z.B. Aminosäure, Peptid oder Amin), die eine freie Aminogruppe enthält und in der die anderen reaktionsfähigen Gruppen auch gegebenenfalls geschützt sind und gegebenenfalls anschliessende Entfernung der Schutzgruppen.
Die üblichsten Verfahren für die oben angegebenen beiden Arten von Kondensationsreaktionen sind: das Carbodi-imid-Verfahren, das Azid-Verfahren, das gemischte Anhy-drid-Verfahren und das Verfahren der aktivierten Ester, wie sie beschrieben sind in der Literaturstelle «The Peptides» Band 1,1965 (Academic Press), E. Schröder und K. Lübke, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Das sogenannte «Festphasen»-Verfahren von Merrifield, das beschrieben ist in der Literaturstelle J.Am.Chem.Soc., Band 85, Seite 2149 (1963), auf die ebenfalls Bezug genommen wird, kann ebenfalls angewandt werden zur Herstellung der angegebenen Peptide und Peptidderivate der Formel I. Wie diese Literaturstellen zeigen, umfassen Wege, die Carboxylgruppe zu aktivieren, die Umwandlung dieser Carboxylgruppe in ein Säurehalogenid, ein Azid, Anhydrid, Imidazo-lid oder einen aktivierten Ester (wie den N-Hydroxysuccin-imidester oder p-Nitrophenylester). Ähnlich zeigen diese Literaturstellen, dass die Aminogruppe aktiviert werden kann durch Umwandlung in ein Phosphinamid oder nach dem «Phosphorazo»-Verfahren.
Wie aus den angegebenen und den dem Fachmann bekannten Literaturstellen hervorgeht, werden die reaktionsfähigen Gruppen, die davor bewahrt werden müssen an der Kondensationsreaktion teilzunehmen, wirksam geschützt durch sogenannte Schutzgruppen, die ihrerseits wieder leicht durch Hydrolyse oder Reduktion entfernt werden können. Eine Carboxylgruppe kann z.B. wirksam geschützt werden durch Veresterung mit beispielsweise Methanol, Äthanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol, oder durch Umwandlung in ein Amid. Die Aminogruppe kann jedoch ziemlich schwer entfernt werden, so dass es empfehlenswert ist, diese Gruppe nur zum Schutz der Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure in dem ent633 523
stehenden Peptid oder der y-Carboxylgruppe von Glutaminsäure anzuwenden. In diesem Falle führt die Peptidsynthese direkt zu dem Amid des Peptids der Formel I.
Gruppen, die wirksam eine Aminogruppe schützen können, sind im allgemeinen Säuregruppen, z.B. eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von (a) einer aliphatischen, aromatischen, araliphatisehen oder heterocyclischen Carbonsäure, wie eine Aeetyl-, Benzoyl- oder Pyridincarboxylgruppe, (b) eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von Kohlensäure, wie eine Äthoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, tert.-Butyloxy-carbonyl- oder p-Methoxy-benzyloxycarbonylgruppe, oder (e) eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von einer Sulfonsäure, wie Benzolsulfonyl oder p-Toluolsulfonyl.
Andere Gruppen können ebenfalls angewandt werden, wie substituierte oder nicht substituierte Aryl- oder Aralkvl-gruppen, z.B. die Benzyl- und Triphenylmethylgruppe, oder Gruppen, wie die o-Nitrophenylsulfenyl- und 2-Benzoyl-l-methylvinylgruppe.
Die Säureadditionssalze können erhalten werden durch Umsetzung des betreffenden Peptids mit einer pharmakologisch verträglichen Säure, wie einem Halogenwasserstoff, Phosphorsäure, Essigsäure, Weinsäure oder Zitronensäure.
Die erfindungsgemäss erhaltenen Peptide und deren oben angegebenen Derivate können oral und parenteral verabreicht werden. Für die parenterale Verabreichung können die Peptide in einem geeigneten flüssigen Medium gelöst, suspendiert oder emulgiert werden. Wenn sie mit geeigneten Exzipientien oder Füllstoffen vermischt werden, können sie zu einer Dosisform zur oralen Verabreichung, wie Pillen, Tabletten oder Dragees verarbeitet werden. Die angegebenen Peptide können auch in Form von Suppositorien oder Sprays verabreicht werden. Die orale Verabreichung ist bevorzugt. Beispiele für geeignete Flüssigkeiten zur parenteralen Verabreichung umfassen sterilisiertes Wasser, das isotonisch gemacht und gegebenenfalls auf einen pH-Wert von ungefähr 4 gepuffert worden ist, oder öle, wie Erdnussöl. Beispiele für geeignete Exzipientien und Füllstoffe sind Lactose, Mannit, Stärke, Magnesiumstearat usw.
Die erfindungsgemäss erhaltenen Peptide oder Peptidderivate werden vorzugsweise parenteral in einer Dosis von ungefähr 0,1 pg bis 1 (ig/kg Körpergewicht und Tag verabreicht und oral in einer Menge von ungefähr 1 |xg bis 1 mg/ kg Körpergewicht und Tag, je nach der Aktivität des Peptids.
Besonders wertvolle Zubereitungen können erhalten werden, wenn die angegebenen Peptide in eine Form mit verlängerter Aktivität gebracht worden sind, z.B. in sogenannte «Langzeitkapseln». Die Metallkomplexe der Peptide sind besonders geeignet, um diese verlängerte Aktivität zu erreichen. Diese Metallkomplexe werden erhalten, indem man die Peptide mit schwerlöslichen Metallsalzen, Metallhydroxiden oder Metalloxiden zusammenbringt. Die Metalle, die für dieses Verfahren angewandt werden können, sind solche, die zu den b-Gruppen der vierten Periode des Periodensystems gehören (Übergangsmetalle), z.B. Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen und (vorzugsweise) Zink, sowie Metalle, die zu den a-Gruppen der dritten Periode des Periodensystems gehören und die imstande sind, Komplexe zu bilden, wie Magnesium und Aluminium. Die Herstellung dieser Metallkomplexe findet auf übliche Weise statt.
Die Metallphosphate, Metallpyrophosphate und Metallpolyphosphate werden vorzugsweise als schwerlösliche Metallsalze angewandt. Ein Metallkomplex kann z. B. erhalten werden durch Zugabe des Peptids und eines molaren Überschusses eines schwerlöslichen Metallsalzes, Metallhydroxids oder Metalloxids zu einem wässrigen Medium. Der Metallkomplex kann auch erhalten werden durch Zugabe eines alkalischen Mediums zu einer wässrigen Lösung des
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Peptids und eines molaren Überschusses des löslichen Metallsalzes, wobei der unlösliche Peptid-Metallhydroxid-Komplex entsteht. Der Metallkomplex kann ferner erhalten werden durch Zugabe des Peptids, eines Überschusses eines löslichen Metallsalzes und eines löslichen Salzes (kein «Me-tall»-salz wie oben definiert) zu einem wässrigen, vorzugsweise alkalischen Medium, wobei ein unlöslicher Peptid-Metallsalz-Komplex in situ entsteht. Die Metallkomplexe können direkt als Suspensionen angewandt werden, oder sie können z.B. gefriergetrocknet und später erneut suspendiert werden.
Die folgenden Bemerkungen beziehen sich auf die gesamte Beschreibung und insbesondere auf die Beispiele, die Patentansprüche und die Tabellen 1 und 2:
1. Wenn keine optische Konfiguration angegeben ist, ist die L-Form gemeint.
2. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet in Beziehung auf die Schutzgruppen oder aktivierenden Gruppen: Boc = tert.-Butyloxycarbonyl tBu = tert.-Butyl °
Me = Methyl
ONP = p-Nitrophenyloxy
Bzl = Benzyl
ONB = Nitrobenzyloxy
OSu = Succinimido-N-oxy
Z = Benzyloxycarbonyl
3. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet für die angewandten Lösungsmittel oder Reagentien:
Bz = Benzol
To = Toluol
EtOH = Äthanol
Bu = Butanol
Py = Pyridin
Ac = Essigsäure
EtOAc = Äthylacetat
Wa = Wasser
Am = Amylalkohol iPro = Isopropanol
DMF = Dimethylformamid
THF = Tetrahydrofuran
DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid
DCHU = DicyclohexylharnstofF
TAA = Tri-äthylamin
TFA = Trifluoressigsäure
HOOBt= 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benztriazin NEM = N-Äthylmorpholin HOBt = N-Hydroxybenztriazol
4. Die folgenden Abkürzungen werden angewandt für die Aminosäuregruppen:
Met = Methionyl
Met(->0) = Sulfoxid von Methionyl
Met(-»02) = Sulfon von Methionyl
Glu oder Gin = Glutamyl (Glutaminsäure) bzw. Glutami-nyl
Ser = Seryl
His = Histidyl
Phe = Phenylalanyl
Arg = Arginyl
Lys = Lysyl
Trp = Tryptophyl
Gly = Glycyl
Val = Valyl
Leu = Leucyl
Ala = Alanyl
Ile oder Ileu = Isoleucyl
ß-Ala = ß-Alanyl
(a-Me)Ala = a-Methylalanyl
Pro = Prolyl
Tyr = Tyrosyl
Thr = Threonyl
5. Die folgenden Abkürzungen werden angewandt für 5 Gruppen, die mit den Aminosäureresten verwandt sind: Desamino-Met = Desamino-methionyl Desamino-Met( -> O) = Sulfoxid von Desamido-methionyl,
(oder 4-Methylsulfinylbutyryl) Desamino-Met( 02 ) = Sulfon von Desamino-methionyl, io (oder 4-Methylsulfonylbutyryl).
Präparation zur Herstellung der Ausgangssubstanzen I. N-terminaler Teil 15 A. Peptide mit den unten angegebenen Strukturformeln sind aus den US-PS 3 853 836, 3 856 770 und 3 842 064 bekannt, auf die hier Bezug genommen wird.
I. Boc-Met-Glu(OtBu)-His-N2H3:
Rf in Am : iPro : Wa (10:4: 5) = 0,39 (Si02) 20 2. Boc-Met( -» 02)-Glu(0tBu)-His-N2H3 ;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4:5) = 0,36
3. Boc-Val-D-Glu(OtBu)-His-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4: 5) = 0,33
4. Boc-Gly-Glu(OtBu)-His-N2H3;
25 Rf in Am : iPro : Wa (10:4:5) = 0,32
5. Boc-D-Met-Glu(OtBu)-His-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4:5) = 0,37
6. Boc-ß-Ala-Glu(OtBu)-His-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4:5) = 0,42
30 7. Boc-(a-Me)Ala-Glu(OtBu)-His-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10 :4: 5) = 0,31
8. Boc-Ala-Glu(OtBu)-His-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4: 5) = 0,33
9. Boc-Met-Glu(OtBu)-D-His-N2H3 ;
35 Rf in Am : iPro : Wa (10 :4: 5) = 0,35
10. Boc-Val-Glu(OtBu)-D-His-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4: 5) = 0,32
II. Boc-Met-Gln-His-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4:5) = 0,28 40 12. Desamino-Met-Glu(OtBu)-His-N2H3; . RfinBu:Ac:Wa(4:1:1) = 0,52
13. Desamino-Met-Glu(OtBu)-D-His-N2H3;
Rf in Bu : Ac : Wa (4: 1:1) = 0,50
14. Boc-Met-Ala-Ala-N2H3
45 (a) Boc-Ala-Ala-OMe: 20,79 g Boc-Ala-OH wurden in 150 ml DMF gelöst. Nach dem Abkühlen auf-10 °C wurden 15,84 ml TAA zugegeben und anschliessend 10,45 ml Äthylchlorformiat. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei -10 °C gerührt und anschliessend eine Lösung von 13,9 g H-50 Ala-OMe-HCl in 150 ml DMF und 14,4 ml TAA zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde nun auf geeignete mechanische Weise 15 Minuten bei -10 °C 2 Stunden bei 0 °C und schliesslich 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abkühlen auf -10 °C wurde das TAA-HCl abfiltriert 55 und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 250 ml Äthylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser, 0,05n HCl, 5% K2C03-Lösung und 30% NaCl-Lö-sung gewaschen. Nach dem Trocknen über Na2S04 wurde das Filtrat zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus 6o Äther/Petroläther umkristallisiert.
Ausbeute 19,3 g; Fp. 108-110 °C; RfinTo/EtOH (8:2) = 0,50 auf Si02
(b) H-Ala-Ala-OMe.HCl: 18,75 g Boc-Ala-Ala-OMe (a) wurden in 150 ml Methylenchlorid gelöst und 45 Minuten 65 HCl durch die Lösung geleitet, wobei in Eis-Wasser gekühlt wurde. Man erhielt 14,3 g des von der Schutzgruppe befreiten Produktes.
Rf in To : EtOH (8:2) = 0,01 auf Si02.
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(c) Boc-Met-Ala-Ala-OMe: 15,8 g Boc-Met-N2H3 in 150 ml DMF wurden bei -20 °C mit 28,0 ml 4,2n HCl in THF und 8,10 ml Isoamylnitrit aktiviert. Nach 20 Minuten langer Aktivierung bei -15 °C wurde die Lösung mit 14,5 ml NEM neutralisiert und anschliessend eine Lösung von 14,3 g H-Ala-Ala-OMe.HCl (b) in 75 ml DMF und 1 Äq. NEM zugegeben. Nachdem der pH-Wert mit NEM auf 7,2 eingestellt worden war, wurde das Reaktionsgemisch 48 Stunden auf ungefähr 4 °C gehalten. Das NEM.HC1 wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 300 ml Äthylacetat gelöst, mit Wasser, 0,05n HCl, 5% NaHC03 und schliesslich wieder mit Wasser gewaschen.
Nach dem Trocknen über Na2S04 wurde das Filtrat zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Äthylacetat in Petroläther (1:1) umkristallisiert.
Ausbeute: 16,2 g; Fp. 128-129 °C; Rf in To : EtOH (8:2) = 0,46 auf Si02.
(d) Boc-Met-Ala-Ala-N2H3:15,9 g Boc-Met-Ala-Ala-OMe (c) wurden in 160 ml Methanol gelöst und 16,0 ml Hy-drazinhydrat zugegeben. Nach 3,5 Stunden langem Rühren wurden 200 ml trockener Äther zugegeben. Nach dem Abkühlen auf 0 °C wurde der Feststoff abfiltriert. Ausbeute 12,6 g; Fp 207-208 °C; Rf in Am : iPro : Wa (10 :4: 5) = 0,41 auf Si02.
Die folgenden Peptide wurden ähnlich wie unter 14 angegeben hergestellt:
15. Boc-Ala-Ala-Ala-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10 :4 : 5) = 0,44
16. Boc-Val-Ala-Ala-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10 :4: 5) = 0,40
17. Boc-Met (-+02)-Gly-Ala-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4: 5) = 0,37
18. Boc-Met-Glu(OtBu)-Ala-N2H3
(a) Z-Glu-OtBu-Ala-OMe: Eine Lösung von 3,37 g Z-Glu(OtBu)OH in 30 ml Acetonitril wurde bei 0 °C zu einer Suspension von 1,40 g H-Ala-OMe.HCl in 15 ml Acetonitril gegeben und anschliessend ein Äquivalent TAA und daraufhin eine Lösung von 2 g DCCI in 20 ml Acetonitril bei
-10 °C. Nach 30 Minuten langem Rühren bei -10 °C wurde das Reaktionsgemisch anschliessend weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 30 ml Wasser zugegeben, das entstandene DCHU abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Äthylacetat gelöst und anschliessend mit H20, 5%
NaHC03, 30% NaCl-Lösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Na2S04 wurde das Filtrat zur Trockne eingedampft.
Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 : 2) = 0,89 auf Si02.
(b) H-Glu(OtBu)-Ala-OMe.HCl: 2,53 g Z-Glu(OtBu)-Ala-OMe (a) wurden in 30 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von 3,4 ml 2n HCl und 700 mg Pd/C wurde 2,5 Stunden Wasserstoff durch das Reaktionsgemisch geleitet (bis die C02-Entwicklung aufhörte). Der Katalysator wurde über Filterhilfe (Hyflo der Mansville Company) abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft.
Ausbeute 1,95 g Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 : 2 = 0,71 auf Si02.
(c) Boc-Met-Glu(OtBu)-Ala-OMe: Dieses geschützte Peptid wurde entsprechend 14 (c) hergestellt.
Ausbeute 90%; Fp 103-106 °C; Rf in Am : Py : Wa (5:3:2) = 0,95 auf Si02.
(d) Boc-Met-Glu(OtBu)-Ala-N2H3: entsprechend 14 (d). Ausbeute 74,9%. Rf in Am : Pro : Wa (10:4:5) = 0,70 auf Si02.
19. Boc-Met-Lys(Boc)-His-N2H3:
(a) Z-Lys(Boc)-His-OMe: 22,8 g Z-Lys(Boc)-OH wurden in 200 ml DMF gelöst und anschliessend 8,11 g HOBt zugegeben. Das Gemisch wurde auf-22 °C abgekühlt und anschliessend nacheinander bei -22 °C folgendes zugegeben: Eine Lösung von 14,52 g H-His-OMe.2HCl in 200 ml DMF, 2 Äq. TAA und 12,36 g DCCI. Nach 20 Minuten langem Rühren bei -22 °C, 2 Stunden bei 0 °C und 16 Stunden bei Raumtemperatur wurden DCHU und TAA.HC1 abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst, mit Wasser, 5% NaHC03-Lösung und schliesslich wieder mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Na2S04 wurde die Lösung auf ein kleines Volumen eingedampft. Es wurde Äther zugegeben und die Substanz kristallisierte aus. Ausbeute 19,2 g; Fp. 138-140 °C. RfinTo : EtOH (8:2) = 0,35 aufSi02.
(b) H-Lys(Bos)-His-OMe-HCI: 19, g Z-Lys(Boc)-His-OMe würden in 210 ml DMF und 2 Äq. HC1/DMF gelöst. Nach Zugabe von Pd/C wurde 3 Stunden Wasserstoff durch das Gemisch geleitet. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat auf ein Volumen von ungefähr 100 ml eingedampft.
Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 : 2) = 0,38 auf Si02.
(c) Boc-Met-Lys(Boc)-His-OMe: entsprechend Beispiel 14 (c).
Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 : 2) = 0,24 auf Si02.
(d) Boc-Met-Lys(Boc)-His-N2H3: entsprechend Beispiel 14 (d).
Rf in Am : iPro : Wa (100 : 40 : 50) = 0,42 auf Si02.
Die folgenden Verbindungen wurden ebenfalls auf entsprechende Weise hergestellt:
20. Desamino-Met-Ala-Ala-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10 : 4: 5) = 0,34 Si02.
21. Boc-Leu-Glu(OtBu)-His-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4: 5) = 0,31 Si02.
22. Boc-Met-Ser-His-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4:5) = 0,28 Si02.
23. Boc-Ala-Ala-N2H3;
Rf in Am : iPro : Wa (10:4: 5) = 0,47 Si02.
B. Synthese von H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH und Analogen.
101. H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH
(a) Z-Phe-D-Lys(Boc)-OMe: 29,9 g Z-Phe-OH und 14,8 g HOBt wurden in 200 ml DMF gelöst. Nach dem Abkühlen auf-22 °C wurde nacheinander folgendes zugegeben:
1. Eine Lösung von 32,6 g H-D-Lys(Boc)OMe.HCl in 210 ml DMF und 1 Äq TAA und
2. eine Lösung von 22,7 g DCCI in 100 ml DMF. Das Ganze wurde anschliessend mit einem geeigneten mechanischen Rührer 15 Minuten bei -22 °C, 2 Stunden bei 0 °C und ungefähr 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das Gemisch wurde auf -20 °C abgekühlt und anschliessend das entstandene DCHU abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und mit Wasser, einer 5%igen Zitronensäurelösung, 5% NaHC03-Lösung und wieder mit Wasser gewaschen und anschliessend die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus Diisopropyläther/Äther (1: 5) umkristallisiert.
Ausbeute: 51,6 g; Fp. 122-123 °C. Rf in To : EtOH (8:2) = 0,60 auf Si02.
(b) Z-Phe-D-Lys(Boc)-OH: 13,7 g Z-Phe-D-Lys(Boc)-OMe (a) wurden in 180 ml Dioxan/H20 (9 : 1) gelöst. Nach Zugabe von 15 ml 2n NaOH wurde das Reaktionsgemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und der pH-Wert mit In HCl auf 7 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde anschliessend auf ungefähr 50 ml (dioxanfrei) eingedampft und 250 ml Äthylacetat zugegeben. Das Gemisch wurde mit Wasser gewaschen und über Na2S04 getrocknet. Das Na2S04 wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne einge5
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dampft und anschliessend der Rückstand aus Äther/Pe-troläther (1:2) umkristallisiert.
Ausbeute 11,3 g; Fp. 72-75 °C. Rf in To : EtOH (8:2) = 0,12 auf Si02; Rf in Am : Py : Wa (5:3:2) = 0,69 auf Si02.
(c) Boc-Phe-Gly-OBzl: 1 Äq. NEM wurde zu einer Lösung von 12,6 g H-Gly-OBzl.HCl in 100 ml DMF gegeben und anschliessend eine Lösung von 25,5 g Boc-Phe-ONP in 100 ml DMF. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 300 ml Äthylacetat/Wasser (5:1) gelöst und die entstehende Lösung mit Wasser gewaschen.
Nach dem Trocknen über Na2So4 wurde das Filtrat auf ein Volumen von ungefähr 100 ml eingedampft. 50 ml Pe-troläther und 250 ml trockener Äther wurden anschliessend zugegeben.
Ausbeute 16,7 g; Fp. 126-127 °C. Rf in To : EtOH (8:2) = 0,56 auf Si02.
(d) H-Phe-Gly-OBzl • HCl: 8,25 g Boc-Phe-Gly-OBzl wurden in 120 ml Methylenchlorid gelöst und unter Rühren und Kühlen (Eis/Wasser) 1 Stunde HCl-Gas hindurchgeleitet.
Das Einleiten von HCl wurde nach 1 Stunde abgebrochen und das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft. Ausbeute 6,98 g eines schaumartigen Produktes. Rf in To : EtOH (8:2) = 0,33 auf Si02.
(e) Z-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-GIy-OBzl: Es wurde analog dem unter (a) beschriebenen Verfahren gearbeitet. Dabei wurden die folgenden Reagentien benötigt: 9,25 g Z-Phe-D-Lys(Boe)-OH (b), 2,92 g HOBt, 6,98 g H-Phe-Gly-
OBzl • HCl und 4,12 g DCCI. Es wurde aus Äthylacetat/Pe-troläther umkristallisiert.
Ausbeute: 12,0 g; Fp 157-159 °C.
(f) H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH: 4,11 gZ-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OBzl wurden in 75 ml DMF gelöst. Nach Zugabe von Pd/C wurde 3 Stunden Wasserstoff in das Gemisch geleitet. Der Katalysator wurde über Filterhilfe (Hy-flo/Asbest) abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft.
Ausbeute: 2,9 g. Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 0,75 : 0,25 : 1) = 0,46 auf Si2.
Die folgenden Peptide wurden unter den in Beispiel 101 angegebenen Bedingungen hergestellt:
102. H-Trp-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;
Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4: 0,75:0,25 :1) = 0,52 auf Si02
103. H-Leu-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;
Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4:0,75:0,25 :1) = 0,40 auf Si02
104. H-Val-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;
Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4:0,75:0,25 :1) = 0,42 auf Si02
105. H-Ala-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;
Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4:0,75: 0,25 :1) = 0,37 auf Si02
106. H-Tyr-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;
Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4:0,75 :0,25 :1) = 0,48 Si02
C. Synthese von H-Lys(Boc)-Pro-VaI-Gly-Lys(Boc)-Lys (Boc)-OH und Analogen
201. H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OMe (11-16 ACTH); C. A. 72,13 055 (1970);
202. H-Lys(Boc)-Pro-VaI-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 (11-16 ACTH-Amid); C. A. 72,13 055 (1970);
203. H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Pro-NH2
(11-19 ACTH-Amid); C. A. 63,16 405a (1965);
204. H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-Tyr-Pro-OtBu:
Helv. 44,1136(1961);
205. H-D-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH,;
(a) H-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 : 8,61 gZ-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 wurden in 110 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von Pd/C wurde 3 Stunden Wasserstoff in das Gemisch geleitet. Der Katalysator wurde über Filterhilfe (Hyflo) abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft.
Ausbeute 7,27 g; Rf in Am : Py : Wa (5:3:2) = 0,36 auf Si02.
(b) Z-D-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 :
4,18 g Z-D-Lys(Boc)-OH und 1,62 g HOBt wurden in
30 ml DMF gelöst.
Nach Abkühlen dieser Lösung auf-22 °C wurde eine Lösung von 7,26 g H-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OMe (a) in 30 ml DMF zugegeben und anschliessend 2,47 g DCCI. Nach 15 Minuten langem Rühren bei -22 °C, 2 Stunden bei 0 °C und 16 Stunden bei Raumtemperatur wurde das entstandene DCHU abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und nacheinander mit Zitronensäure, 5% NaHC03 und 30% NaCl gewaschen und über Na2S04 getrocknet. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Äthylacetat umkristallisiert.
Ausbeute 9,1 g; Fp. 114-119 °C Rf in To : EtOH (8:2) = 0,20 auf SiÓ2
(c) H-D-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 :
3,68 g des unter (b) erhaltenen geschützten Peptids wurden in 50 ml Methanol gelöst.
Nach Zugabe von Pd/C wurde 4 Stunden Wasserstoff durch das Gemisch geleitet. Der Katalysator wurde dann über Filterhilfe abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft.
Ausbeute 3,2 g; Rf in Bu : Ac : Wa (10:1:3) = 0,56 auf Si02.
Beim Lösen dieses Produktes in einer methanolischen Lösung von HCl erhielt man das HCl-Salz des entsprechenden Peptids.
206. H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH
Durch alkalische Hydrolyse des entsprechenden Methylesters (201) erhalten.
D. Synthese der durch Kupplung der unter A erhaltenen Peptide mit den unter B erhaltenen Peptiden nach dem Azid-verfahren.
301. Boc-Met-Ala-Ala-Ala-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (14 und 105)
1,62 g Boc-Met-Ala-Ala-N2H3 wurden in 20 ml DMF gelöst. Nach dem Abkühlen der Lösung auf-20 °C wurden 1,68 ml 4,74n HC1/THF zugegeben und anschliessend 0,60 ml Isoamylnitrit. Nach 20 Minuten langem Rühren bei -15 °C wurden 0,6 ml NEM, eine Lösung von 2,3 g H-Ala-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH in 20 ml DMF und 1,68 ml 4,74n HC1/THF zugegeben. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde mit NEM auf 7,2 eingestellt. Das Gemisch wurde anschliessend 2 Tage bei ungefähr 4 °C gehalten. Das NEM • HCl wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 125 ml sec.Butanol/ CHCLj (2: 3) gelöst und 25 ml Wasser zugegeben und anschliessend nacheinander mit Wasser, 5%iger Zitronensäurelösung und wieder mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Na2S04 wurde das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 40 ml Methanol gelöst, zu dem 160 ml Wasser anschliessend zugegeben wurden, und der Feststoff abfiltriert und getrocknet.
Ausbeute 2,6 g; Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4: 0,75 :0,25 :1) = 0,62 auf Si02; Fp. 202-203 °C (Zers.)
Die folgenden Peptide wurden unter den gleichen Bedingungen wie 301 hergestellt:
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302. Boc-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (14 und 101)
Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4: 0,75 : 0,25 : 1) = 0,63 auf Si02; Fp. 215-216 °C(Zers.)
303. Boc-Ala-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (15 und 101)
Rf = 0 59
304.' Boc-Val-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (16 und 101);
Rf = 0,61
305. Boc-Met(-> 02)-Gly-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (17 und 101);
Rf = 0,49
306. Boc-Met-Glu(OtBu)-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (18 und 101);
Rf = 0,64
307. Desamino-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (20 und 101);
Rf = 0,67
308. Boc-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (23 und 101);
Rf = 0,50
309. Boc-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;
Rf = 0,51
310. Boc-Met-Glu(OtBu)-Ala-Ala-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (18 und 105);
Rf = 0,64
311. Boc-Met(->02)-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (2 und 101)
2,98 g Boc-Met( ->■ 02)-Glu(0tBu)-His-N2H3 (4,82 mMol) wurden in 20 ml DMF gelöst und die Lösung auf 0 °C abgekühlt und anschliessend 2,65 ml 5,46n HCl/ THF zu der gekühlten Lösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann eine Weile gerührt und anschliessend weiter auf-20 °C gekühlt und 0,66 ml Isoamylnitrit zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei ungefähr-15 °C gerührt und anschliessend entsprechend 301 gearbeitet.
Die folgenden Peptide wurden entsprechend 311 hergestellt:
312. Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (1 und 101);
Rf = 0,69
313. Boc-Met-Glu(OtBu)-D-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (9 und 101);
Rf = 0,71
314. Boc-Val-D-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (3 und 101);
Rf = 0,65
315. Boc-Gly-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (4 und 101);
Rf = 0,60
316. Boc-D-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (5 und 101);
Rf = 0,68
317. Boc-ß-Ala-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (6 und 101);
Rf = 0,62
318. Boc-(a-Met)Ala-Glu)(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (7 und 101);
Rf = 0,60
319. Boc-Val-Glu(OtBu)-D-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (10 und 101);
Rf = 0,64
320. Boc-Met-Gln-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (11 und 101);
Rf = 0,75
321. Desamino-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (12 und 101);
Rf = 0,58
322. Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Trp-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (1 und 102);
Rf = 0,70
323. Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Leu-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (1 und 103);
Rf = 0,65
324. Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Val-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (1 und 104);
Rf = 0,70
325. Boc-Leu-Glu(OtBu)-His-Leu-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (2 und 103);
Rf = 0,66
326. Boc-Met-Ser-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (22 und 101);
Rf = 0,76
327. Boc-Met-Lys(Boc)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (19 und 101);
Rf = 0,69
328. N-acetyl-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH
(N-acetyl-Met-Ala-Ala-N2H3 wurde unter den gleichen Bedingungen und auf die gleiche Weise wie unter 14 angegeben hergestellt, unter der Voraussetzung, dass in diesem Falle N-Acetyl-Met-N2H3 anstelle von Boc-Met-N2H3 verwendet wurde.
Rf = 0,55
329. Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Tyr-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (1 und 106);
Rf = 0,75
Die für die obigen Peptide angegebenen Rf-Werte beziehen sich auf Si02 und Bu : Py : Ac : Wa (4:0,75:0,25:1) als Eluens.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel 1
Herstellung von H-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys- Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2
(a) Boc-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-D-Lys (Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2
2,53 g Boc-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (2,6 mMol) (302) und 422 mg HOBt (1,2 Äq.) wurden in 25 ml DMF gelöst. Die Lösung wurde auf 0 °C gekühlt und anschliessend eine Lösung von 2,48 g H-D-Lys(Boe)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 • HCl (2,5 mMol) in 20 ml DMF (205) und 1,1 Äq. TEA zugegeben. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wurde auf ungefähr 35 °C eingestellt und anschliessend 857 mg DCCI (1,6 Äq.) bei dieser Temperatur zugegeben und das Ganze über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde anschliessend auf-20 °C gekühlt, das entstandene DCHU abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml sec.-Butanol/ CHC13 (2 : 3) gelöst und 50 ml H20 zugegeben und die Lösung anschliessend mit Wasser, 5% NaHC03-Lösung und wieder mit Wasser gewaschen und über Na2S04 getrocknet. Das Na2S04 wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft.
Ausbeute: 4,2 g. Rf in Bu : AC : Wa (10:1:3) = 0,75 auf Si02.
(b) H-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 • Acetat
3,97 g der 4,2 g Boc-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-D-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 wurden in 80 ml 90% TFA gelöst und die Lösung in der Dunkel-
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heit 1,5 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde dann zu 500 ml trockenem Äther zugetropft. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet und anschliessend der Rückstand in tert.-Butanol/H20 (1 : 1) gelöst und mit einem lonenaus-tauscherharz in Acetatform gerührt. Nach 1 stündigem Rühren wurde das Ionenaustauscherharz abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Das rohe Produkt wurde im Gegenstrom gereinigt (System sec.-Butanol/0,l% TFA). Die gesammelten Fraktionen wurden zur Trockne eingedampft und der Rückstand in tert.-Butanol/H20 (1: 1) gelöst und anschliessend erneut mit dem Ionenaustauscherharz in Acetatform behandelt und filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft.
Ausbeute 2,27 g (65,8%); Rf in Bu : Py : Ac : Wa (28 : 24: 8 : 30) = 0,40 auf Woelm.
Beispiel 2
Herstellung von H-Met(->02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D- Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 • Acetat 2,0 g H-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 • Acetat (Beispiel 1) wurden in 10 ml H20 gelöst und anschliessend 0,25 ml 0,5m Ammonium-molybdat, 1,25 ml 4m HC104 und 0,75 ml 30% H202 zugegeben. Das Ganze wurde dann 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend 50 ml tert.-Butanol/H20 (1 : 1) zugegeben und 1 g entsprechendes Ionenaustauscherharz (Dowex 2 x 8) in Acetatform zugegeben. Nach 30 Minuten langem Rühren wurde das Ionenaustauscherharz abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft.
Ausbeute 1,9 g; Rf in Bu : Py : Ac : Wa (38 : 24: 8 : 30) = 0,32 auf Woelm
Beispiel 3
Herstellung von H-Met (->0)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D- Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 • Acetat 0,06 Mol des in Beispiel 1 erhaltenen Peptids wurden in 5 ml Essigsäure gelöst und anschliessend 15 jj.1 30% Wasserstoffperoxid zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend eine Suspension von 20 ml Platinmoor in 2,5 ml Eisessig zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und anschliessend filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand zu 10 ml tert.-Butanol/Wasser gegeben. Das Gemisch wurde gefriergetrocknet.
Rf in Bu : Py : Ac : Wa (38 : 24: 8 : 30) = 0,29 auf Woelm
Beispiel 4
Herstellung von H-Met(-»02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly- D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 • Acetat
4,0 g des unter 311 erhaltenen Peptids wurden an das Peptid 205 gekuppelt unter Anwendung des in Beispiel 1 (a) beschriebenen DCCI/HOBt-Verfahrens. Das geschützte Endprodukt besass einen Rf-Wert in Bu : Ac : Wa (10 :1: 3) von 0,73 auf Si02.
Die Entfernung der Schutzgruppe und weitere Aufarbeitung wurden wie in Beispiel 1 (b) beschrieben durchgeführt.
Ausbeute 1,55 g; Rf in Bu : Py : Ac : Wa (38 : 24 : 8 :30) = 0,19 auf Woelm
Beispiel 5
Die Acetate der folgenden Peptide wurden unter den gleichen Bedingungen und auf die gleiche Weise erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben:
1. H-Met-Ala-Ala-Ala-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (301 und 205);
Rf = 0,20
2. H-Ala-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 303 und 205)
Rf = 0,35
3. H-Val-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 304 und 205)
Rf = 0,42
4. H-Met( -> 02)-Gly-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 305 und 205)
Rf = 0,19
5. H-Met-Glu-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 306 und 205)
Rf = 0,34
6. Desamino-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 307 und 205)
Rf = 0,47
7. H-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 308 und 205)
Rf = 0,40
8. H-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 309 und 205)
Rf = 0,42
9. H-Met-Gly-Ala-Ala-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 310 und 205)
Rf = 0,18
10. H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 312 und 205)
Rf = 0,29
11. H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 312 und 202)
Rf = 0,36
12. H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-OMe (aus 312 und 201)
Rf = 0,52
13. H-Met-Ala-Ala-Ala-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Lys-Lys-OMe (aus 301 und 201)
14. H-Met-Glu-D-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 313 und 205)
Rf = 0,31
15. H-Val-D-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 314 und 205)
Rf = 0,25
16. H-Gly-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 315 und 205)
Rf = 0,20
17. H-D-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 316 und 205)
Rf = 0,33
18. H-(a-Me) Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Ly s-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 318 und 205)
Rf = 0,28
19. H-ß-Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 317 und 205)
Rf = 0,19
20. H-Met-Gln-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 320 und 205)
Rf = 0,32
21. Desamino-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 321 und 205)
Rf = 0,37
22. H-Met-Glu-His-Trp-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 322 und 205)
Rf = 0,31
23. H-Met-Glu-His-Leu-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 323 und 205)
Rf = 0,27
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24. H-Met-Glu-His-Val-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 324 und 205)
Rf = 0,28
25. H-Leu-Glu-His-Leu-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 325 und 205)
Rf = 0,25
26. H-Met-Ser-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 326 und 205)
Rf = 0,31
27. H-Met-Lys-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 327 und 205)
Rf= 0,15
28. N-acetyl-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 328 udn 205)
Rf = 0,50; und
29. H-Met-Glu-His-Tyr-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 329 und 205)
Rf = 0,26
Alle Rf-Werte in Bu : Py : Ac : Wa (38 :24 : 8 : 30) auf Woelm
Beispiel 6
Die Acetate der folgenden Peptide (bei denen keine N-terminale Kettenverlängerung durchgeführt wurde) wurden auf die gleiche Weise und unter den gleichen Bedingungen hergestellt wie in Beispiel 1 angegeben.
H-Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 101 und 202);
Rf = 0,11
H-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 101 und 105)
Rf = 0,13
H-Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-OMe (aus 101 und 201)
Rf = 0,25
H-Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-NH2 (aus 101 und 203)
Rf = 0,01
H-Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-OH (aus 101 und 204) Rf = 0,05
H-Ala-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 (aus 105 und 205)
Rf = 0,12.
Rf-Werte auf Si02 mit Bu : Py : Ac : Wa (2:0,75:0,25:1) als Eluens.
Beispiel 7
Die folgenden Peptide, deren Herstellung in Beispiel 5 beschrieben ist, wurden zu den entsprechenden Sulfonen unter den Bedingungen und auf die Weise oxidiert wie in Beispiel 2 angegeben. Die Peptide wurden als Acetate erhalten.
H-Met( -> 02)-Ala-Ala-Ala-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 Rf = 0,16
Desamino-Met( -> 02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 Rf = 0 12
H-Met( -> 02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 Rf = 0,14
H-Met( -> 02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-OMe Rf = 0,22
Desamino-Met( -> 02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 Rf = 0,17.
Rf-Werte auf Woelm mit Bu : Py : Ac : Wa (38 : 24: 8 : 30) als Eluens.
Beispiel 8
Die folgenden Peptide, deren Herstellung in Beispiel 5 beschrieben ist, wurden zu den entsprechenden Sulfoxiden oxidiert unter den Bedingungen und auf die Weise wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Peptide wurden als Acetate erhalten:
H-Met( -» 0)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 Rf = 0,19
H-Met( -> 0)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 Rf = 0,21
Desamino-Met( -> 0)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 Rf = 0,10.
Rf-Werte auf Woelm mit Bu : Py : Ac : Wa (38 : 24 : 8 : 30) als Eluens.
Beispiel 9
Herstellung von H-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-OH
3,3 g Boc-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (302) und 571,0 mg HOOBt wurden in 20 ml DMF gelöst und anschliessend die Lösung auf 0 °C gekühlt.
Zu dieser Lösung wurden 760 mg DCCI zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 0 °C und 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Niederschlag (DCHU) wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der erhaltene Rückstand (3,8 g), der der entsprechende Benztriazinester des oben angegebenen Ausgangspeptids war, und 4,06 g des Peptids H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH (206) wurden in 50 ml DMF gelöst. Das Gemisch wurde ungefähr 16 Stunden gerührt und dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml sec.-Butanol/Chlo-roform (2 : 3) gelöst und mit Wasser, 0,01 HCl und wieder mit Wasser gewaschen. Die Lösung wurde über Na2S04 getrocknet, dann filtriert und zur Trockne eingedampft. Ausbeute 6,7 g.
Auf die in Beispiel 1b beschriebene Weise wurde das erhaltene Peptid von der Schutzgruppe befreit.
Ausbeute 4,0 g. Rf in Bu : Py : Ac : Wa (38 : 24 : 8 : 30) = 0,35 auf Woelm
Beispiel 10 Zinkkomplex
1,5 ml einer Lösung von Zinkchlorid, enthaltend 50 mg Zink/ml, wurden zu einer Lösung von 31,5 mg Na2HP04 • 2H20 in 30 ml destilliertem Wasser gegeben. Das ausgefallene Zinkphosphat wurde erneut durch Zugabe von 4n HCl gelöst. Dann wurden 175 mg NaCl und 0,5 Ben-zylalkohol zu diesem Gemisch gegeben. Anschliessend wurden 1,5 mg des Peptids H-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-D-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-NH2 in diesem Gemisch gelöst und dann ausreichend In Natriumhydroxidlösung zugegeben, um den pH-Wert des Gemisches auf 8,5 einzustellen. Anschliessend wurde das Volumen mit destilliertem Wasser auf 50 ml aufgefüllt.
1 ml Suspension enthielt:
30 (ig Peptid 1,5 mg Zink
0,63 mg Na2HP04 • 2H20 3,5 mgNaCl
10 mg Benzylalkohol.
1 ml der Suspension wurde lyophilisiert und in einer Ampulle aufbewahrt. Durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser zu der Ampulle wurde die Suspension für Injektionszwecke aufbereitet.
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Claims (10)

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1. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide der allgemeinen Formel I
A-L-B-D-Lys-L-Phe-Gly-(L oder D)-Lys-L-Pro-L-Val-Gly-L-Lys-L-Lys-X [I]
in welcher
A Wasserstoff, ein N-Acylrest, der abgeleitet ist von Alkylcarbonsäuren mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aralkyl-carbonsäuren mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aminosäuren, Peptiden, N-Alkylcarbonyl- oder N-Aralkyl-carbonylderivaten der Aminosäuren oder N-Alkylcarbonyl-oder N-Aralkylcarbonylderivaten der Peptide,
B ein Aminosäurerest aus der Gruppe Phe, Trp, Tyr und -NH-CHRi-CO- ist, wobei Rj ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist,
O II
X einen Rest, der mit der terminalen -C- -Gruppe verbunden ist, bedeutet und für Hydroxyl einen Alkoholrest oder eine unsubstituierte Aminogruppe steht,
und ihren Säureadditionssalzen, dadurch gekennzeichnet, dass man die entsprechenden Säuren und Amine oder deren aktivierte Derivate in beliebiger zeitlicher Reihenfolge und unter intermediärem Schutz von jeweils von der Reaktion auszuschliessenden reaktiven, funktionellen Gruppe unter Bildung von Peptidbrücken miteinander kondensiert und gegebenenfalls anschliessend mit einer pharmakologisch unbedenklichen anorganischen oder organischen Säure in ein Säureadditionssalz überführt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in dem erhaltenen Peptid eine C-termina-le, freie Carboxylgruppe verestert.
2
PATENTANSPRÜCHE
3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in dem erhaltenen Peptid eine freie Carboxylgruppe mit einer anorganischen Base in ein Salz überführt.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in dem erhaltenen Peptid eine freie Aminogruppe acyliert.
5. Verfahren nach Patentanspruch 1 zur Herstellung eines Peptides, in welchem X einen nichtsubstituierten Amino-rest oder eine substituierte Aminosäure oder einem Peptid mit der Sequenz 17,17-18,17-19 bis zu und einschliesslich 17-24 des ACTH-Moleküls oder einem C-terminalen Ester oder einem Amid davon, wobei Arg ersetzt sein kann durch Lys.
6. Verfahren nach Patentanspruch 1 oder 5 zur Herstellung eines Peptides, in welchem B den Aminosäurerest Phe oder Ala bedeutet.
7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1, 5 oder 6 zur Herstellung von Peptiden, in welchen A ein N-Acylrest der Formel U-Qi, U-Q2-Qi oder Q3-Q2-Qi ist, wobei U ein WasserstofFatom, eine N-Alkylcarbonylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine N-Aralkylcarbonylgruppe mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen, Qi der Aminosäurerest L-His, D-His oder NH-Z-CO, wobei Z eine unsubstituierte, monohydroxysubstituierte oder monoaminosubstituierte Al-kylen- oder Alkylidengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, Q2 den Aminosäurerest L-Glu, D-Glu, L-Gln, D-Gln oder-NH-Z-CO- und Qs den Säurerest U-L-Met, U-L-Met-(->0), U-L-Met-(->02), U-D-Met, U-D-Met-(->0), U-D-Met-(-»02), Desamino-Met, Desamino-Met-(->Q), Desamino-Met-( -> 02) oder UNH-Z-CO-bedeutet.
8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Methionin oder Des-
aminomethionin enthaltendes, erhaltenes Peptid durch Oxi-dation in ein Sulfoxid oder Sulfon überführt.
9. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1, 5,6,7 oder 8 zur Herstellung eines Peptides, in welchem A H-Met-Glu-His, Desamino-Met-Glu-His, H-Met-Ala-Ala oder Des-amino-Met-Ala-Ala oder das Sulfoxid oder Sulfon einer dieser Gruppen ist.
10. Verfahren zur Herstellung von Metallkomplexverbindungen der Peptide der Formel I, die eine verlängerte pharmakologische Wirkung besitzen, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 ein Peptid der Formel I herstellt und das erhaltene Peptid mit einem Metallsalz, -hydroxid oder -oxid umsetzt.
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