Verfahren zur Herstellung neuer Hexapeptide
EMI1.1
worin Ri eine Aminoniederalky'Pgruppe bedeutet, sowie entsprechender Verbindungen, die statt des Glutaminsäurerestes den Rest des Glutamins aufweisen.
Die neuen Verbindungen haben die Wirkung der natürlichen melanocytenstimulierenden Hypophysenhormone (MSH-Wirkung), weisen aber diesen gegen über den Vorteil auf, dass sie viel leichter synthetisiert werden k¯nnen, da sie eine Sequenz von nur 6 Aminosäuren besitzen, während das a-MSH aus 13 und das ssMSH aus 18 Ami, nosäuren aufgebaut ist.
Die neuen Hexapeptide können an Stelle der nat rlichen MSH als Heilmittel oder als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Aminosäuren aufweisen, verwendet werden, insbesondere das L-Glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl- L-arginyl ; L-tryptophyl-glycin und das entsprechende L-Glutaminylpeptid. Als Reste der a- (Amino-nieder- alkyl)-amino-essigsäure sind insbesondere L-Arginyl, L-Ornityl und L-Lysyl zu nennen.
Die neuen Peptide können nach den für die Pep tidherstellung bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man L-Glutaminsäure oder sein γ-Amid, L-Histidin, L-Phenylalanin- L-α-Aminonie- deralkyl-amino-essigsäure, L-Tryptophan und Glycin unter intermediärem Schutz van Amino-bzw. Carboxylgruppen miteinander durch Kondensation ver einigt.
Es werden zweckmϯig alle an der Reaktion nicht beteiligten, freien, funktionellen Gruppen geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vor- zugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol, die Amino- gruppe beispielsweise durch Einführung des Tosyloder Tritylrestes oder insbesondere der Carbobenz- oxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p Phenylazo-benzyloxy-carbonylgruppe und der p- (p'- Methoxy-phenylazo)-benzyloxy-carbonylgruppe (MZ).
Zum Schutz der hnidazolgruppe (im) des Histidins verwendet man beispielsweise den Benzylrest und fur die Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins die Niltrogruppe ; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden.
Die Umwandlung ei, ner geschützten NHr oder NH-Gruppe in eine freie Gruppe sowie die Überfüh- rung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Hexapeptide und Zwischenprodukte kann nach an sich bekannten Metho den durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. re- duzierenden Mitteln erfolgen.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen.
Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Hexapeptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1
N-Trityl-L-tryptophamnethylester 13 g (0, 051 Mol) L-Tryptophanmethylester- hydrochlorid werden in einem 500-ml-Rundkolben in
180 ml abs. Chioroform aufgeschlämmt, auf 0 ab- gekühlt und mit 15, 7 ml (0, 113 Mol) trockenem Tri äthylamin versetzt. Anschliessend tägt man unter r Umschütteln portionenweise 14, 3 g (0, 051 Mol) Tri tylchlorid in das gekühlte Reaktionsgemisch ein. Man lässt 30 Minuten bei 0 und 6 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren.
Die Chloroformlösung wäscht man mit Wasser, 10 oiger Zitronensäurelösung, ln Na- triumbicarbonatlösung und zum Schluss mit Wasser neutral und trocknet sie über Natriumsulfat. Im Vakuum dampft man auf ein kleines Volumen ein, gibt, zur Vermeidung von allzu starkem SchÏumen, Metha- nol dazu und wiederholt diese Operation noch zwei weitere Male. Durch Lösen des Verdampfungsrück- standes in 10 ml Methanol tritt sponbane Kristallisa- tion ein.
Man isoliert 20, 9 g (88 % der Theorie) N Trityl-tryptophanmethylester, F. 150-152 . Nach einmaligem Kristallisieren aus Methanol zeigt die Substanz F. 156-157 , [α]D = + 45¯ ¯ 1¯ (c = 1, 075 ; Methanol).
N-Trityl-L-tryptophan
14, 8 g (0, 033 Mol) N-Trityl-L-tryptophanmethylester werden in 30 ml Propylenglykol in einem Ílbad bei 200-205 gelöst. Zur heissen L¯sung gibt man 45 ml einer 20 igen Lösung von Kaliumhydroxyd in Propylenglykol ; dabei scheidet sich wieder ein Teil des gelösten Esters ab. Nach 2 Minuten tritt wieder klare Lösung ein. Die Verseifung führt man während 6 Minuten bei einer Badtemperatur von 205 aus, kühlt anschliessend das Hydrolyseprodukt rasch ab und giesst es auf 600 ml Eiswasser. Unter intensivem Rühren und Kühlen bringt man die stark alkalische L¯sung mit 10% iger Zitronensäurelösung auf pH 6 und extrahiert das abgeschiedene Trityl-tryptophan mit viel Chloroform.
Durch Zugabe von mehr Zitronensäurelösung zur abgetrennten wässrigen Phase stellt man auf pH 5 ein und extrahiert noch zwei weitere Male mit frischem Chloroform. Die organischen Phasen wäscht man zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft im Vakuum auf ein kleines Volumen ein. Mit ti'efsiedendem PetrolL äther fällt man die Hauptmenge des N-Trityl-tryptophans aus. Nach dem Trocknen im Hochvakuum erhÏlt man 14, 38 g (98 o der Theorie) amorphes Produkt, das direkt zur weiteren Umsetzung verwendet werden kann.
F. 110-120 ; + 29' l' (c = 1, 397 in Methanol).
N-Trityl-L-tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylester
1, 84 g (8, 75 mMol) Glycin-p-nitrobenzylester in 10 ml trockenem Acetonitril werden auf 0 gekühlt, die L¯sung von 2 g (9, 7 mMol) N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 8 ml Acetonitril dazu gegeben und nach 5 Minuten mit der gekühlten Lösung von 4, 3 g (9, 6 mMol) N-Trityl-L-tryptophan in 10 ml Acetonitril versetzt. Sofort beginnt die Abscheidung von Harnstoff, die nach 2 Stunden beendet ist. Gleichzeitig mit dem Dicyclohexylharnstoff scheidet sich auch der Trityldipeptidester als gallertiges Produkt ab.
Man lϯt 4 Stunden bei 0 reagieren, dampft anschliessend das Lösungsmittel im Vakuum vollständig ab und zerreibt zur Entfernung des nicht umgesetzten N, N'-Dicyclo-hexylcarbodiimids den Verdampfungs rückstand mit viel Petroläther.
Durch wiederholtes Extrahieren des Reaktions- gemisches mit eiskaltem Methylenchlorid und Methy lenchlorid/Ather trennt man 1, 7 g Dicyclohexylharn- stoff ab.
Die Methylenchloridextrakte werden auf ein klei- nes Volumen eingeengt und mit viel tiefsiedendem Petroläther der Trityldipeptidester ausgefällt. Aus 85 ml 95 % igem Methanol kristallisieren 5, 3 g N-Tri tyl-L-tryptophyl-glycin-o-nitrobenzylester als feine Nadeln. F. 169-170¯ ; [α]D = - 10¯ ¯ 1¯(c = 0, 95 in Methanol).
Die Mutterlauge wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Chloroform mit eiskalter 10% iger Zitronensäure, einmal mit eiskalter ln Salzsäure, ln Natriumbicarbonat und zum Schluss mit Wasser neu tral gewaschen. Nach Verdampfen der getrockneten Chloroformphasen hinterbleiben 1, 3 g schaumiges Material, das, aus 95%igem Methanol kristallisiert, noch weitere 500 mg Trityldipeptidester ergibt.
F. 165-167 .
Die Totalausbeute beträgt 4 g (= 74 % der Theorie).
N-Carbobenzyloxy-L-tryptophylwglycin-benzylester
Zur L¯sung von 1 g (3 mMol) Carbobenzoxytryptophan in 20 ml trockenem Essigester gibt man eine L¯sung von 660 mg (4 mMo1) Glycinbenzylester in 5 ml Essigester und zum Schluss 650 mg (3, 15 mMoT) N. N-Dicyclohexyl-carbodiimid. Schon nach 15 Minuten beginnt die Abscheidung von Dicyclo- hexyl-harnstoff. Man lässt 16 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren, filtriert vom auskristallisierten Harnstoff ab und gibt zum Filtrat 0, 1 ml Eisessig.
Nach 15minutigem Stehen wäscht man die Essigesterlösung mit In SalzsÏure, Wasser, 1, 4% iger Ammoniaklösung und wieder mit Wasser neutral. Die organischen Phasen werden auf ein kleines Volumen ein geengt, mit tiefsiedendem Petroläther bis zur schwa chen Trübung versetzt und bei 0 belassen. Der Carbobenzyloxy-dipeptidester scheidet sich als galler- tiges Produkt ab. Durch Zugabe von mehr Petrol- äther und intensives Kratzen unter öfterem Aufwär- men in einem Wasserbad von 40 erhält man ein weisses mikrokristallines Pulver.
Die Ausbeute ist 950 mg (= 66% der Theorie) Carbobenzyl-L-tryptophyl-glycin-benzylester, F. 117 bis 118 ; [α]25D=-19¯ ¯ 1¯ (c = 0, 950 in Methanol). p- ; benzyloxy-carbonyl- L-tryptophyluglycin-benzylester
950 mg (2 mMol) MZ-tryptophan, hergestellt nach Patent Nr. 364 780, werden unter gelindem Erwärmen in 20 ml abs. Essigester gelöst, wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt und mit der L¯sung von 500 mg (3 mMol) Glycinbenzylester in 5 ml abs. Essigester vereinigt. Dazu gibt man 500 mg (2, 1 mMol) 1-Cyclohexyl-3-morpholinylÏthy-carbodiimid in 2 ml Essigester und lässt 16 Stunden bei Zimmertemperatur stehen.
Die Essigesterlösung wÏscht man im Scheidetrichter mit Wasser, 0, 5n Salzsäure, In Natriumbicarbonat und wieder mit Wasser neutral.
Die getrocknete Essigesterlösung dampft man auf ein kleines Volumen ein und fällt den MZ-dipeptidester mit viel Petoläther aus. Nach dem Trocknen im Hochvakuum erhält man 1, 2 g Rohprodukt, das noch mit Ausgangsmaterial verunreinigt ist.
Einmaliges Umkristallisieren aus 30 ml heissem Acetonitril ergeben 610 mg reines Produkt, F. 152 bis 153 ; die Auf arbeitung der Mutterlauge ergibt weitere 170 mg MZ-dipepfidester vom gleichen Schmelz- punkt. Die Gesamtausbeute beträgt 770 mg (= 63 % der Theorie). F. 152-153 . Das Ultraviolettspektrum in Methanol zeigt Maxima bei 240 m// (E = 11 000) und 748 m, u (e = 20 800).
L-Tryptophyl-g ? ycin-p-nitrobenzylester-hydrochlorid
1, 7 g (2, 65 mMol) N-Trityl-L-tryptophyl-glycin p-nitrobenzylester werden in 10 ml Eisessig gelöst und mit 1, 45 ml 2n Salzsäure während 5 Minuten im Wasserbad von 50 detitryliert. Anschliessend dampft man das Lösungsmittel bei 30 im Vakuum ab und trocknet den Rückstand während 2 Stunden im Hochvakuum bei 45 . Das Triphenylcarbinol l¯st man mit viel Ather aus dem kristallinen HCl-Salz des L-Tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylesters.
Die Ausbeute beträgt 100% der Theorie = 1, 15 g.
F. 150-153 .
L-Tryptophyl-glycin-benzylester-hydrobromid
870 mg (2 mMol) Carbobenzoxy-L-tryptophyl glycin-benzylester werden in 2 ml abs. Nitromethan aufgeschlämmt und unter Stickstoffatmosphäre mit 2 ml 4n Bromwasserstoff in Eisessig versetzt. Die L¯sung verfärbt sich dabei sofort violett. Man lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur und unter Lichtausschluss reagieren, dampftanschliessend bei 30 den überschüssigen Bromwasserstoff ab und fällt das Hydrobromid des Dipeptidesters mit viel absolutem Ather aus. Das 6lige Decarbobenzoxylierungsprodukt erstarrt sofort beim Verreiben mit frischem absolutem Ather.
Nach zweimaligem Umfällen aus Aceton/Äther erhält man 300 mg (= 92 % der Theorie) eines körni- gen, leicht grau gefärbten Produktes.
Das Papierchromatogramm (sek. Butanol : 5 % Veronalnatrium : Wasser : Isopropanol = 100 : 10 : 60 : 15) zeigt nur 1 ninhydrinpositiven Fleck.
Das Hydrobromid kann zur weiteren Verarbei- tung direkt verwendet werden.
Es ist in Aceton und Essigester gut, in Wasser dagegen nur teilweise löslich.
N-Carbobenzyloxy-L-phenylalanin-L-arginin methylester-carbonat 1. tuber das gemischte Anhydrid
Zu einer L¯sung von 600 mg (2 mMol) N-Carbo- benzoxy-L-phenylalanin in 10 ml abs. Tetrahydro- furan gibt man bei-10 0, 28 ml (2 mMol) Triäthyl- amin und nach 5 Minuten, bei der gleichen Temperatur, 0, 2 ml (2 mMol) Chlorameisensäureäthylester.
Das Triäthylamihhydrochlörid fÏllt sofort als weisser Niederschlag aus. Zur vollständigen Bildung des ge mischten Anhydrids lässt man noch 10 Minuten bei -10 reagieren und versetzt anschlie¯end mit der ebenfalls auf - 10¯ gek hlten L¯sung von L-Arginin methytester-hydrochlorid, aus SSO mg (2, 2 mMol) Arginin-methylester-dihydrochlorid und 0, 31 (2, 2 mMol) Triäthylamin, in 6 ml N,N-Dimethylformamid.
Es wird 15 Minuten bei-10 und 1 Stunde bei Zimmertemperatur weiter gerührt, die L¯sung vom Triäfthylamin-hydrochlorid befreit (400 mg) und das Lösungsmittel im Vakuum bei 50 verdampft. Den Verdampfungsrückstand wäscht man in Methylen- chlorid mit Wasser und Natriumbicarbonat und dann man Wasser neutral, trocknet das Lösungsmittel über Magnesiumsulfat und dampft zur Trockne ein. Man isoliert 810 mg (85%) rohen Carbobenzoxydipeptidester, der für die Decarbobenzoxylierung genügend rein ist.
Eine Probe des amorphen Carbobenzoxydipeptid- esters mit Pikrinsäure umgesetzt ergibt in quantitati- ver Ausbeute das Pikrat.
Das Analysenpräparat, zweimal aus Methanol Wasser umkristallisiert, schmilzt bei 161-162 .
2. Mittels Dicyclohexyl-carbodiimid
4, 92 g (19 mMol) L-Argininmethylester-dihydro- chlorid werden in 100 ml heissem absolutem Metha nol gelöst, auf-10 abgekühlt und mit 2, 64 ml (19 mMol) Triäthylamin ins Monohydrochlorid übergeführt. Dann gibt man 3, 9 g (19 Mol31 N, N'-Dicyclohexyl-carbodiimid in 15 ml absolutem Methanol dazu und trÏgt zum Schluss bei der genannten Tem peratur unter kräftigem Umschwenken 5, 2 g (17, 1 mMol) N-Carbobenzoxy-L-phenylalanin in Portionen ein. Das Carbobenzoxy-phenylalanin geht sogleich in L¯sung, und nach 5 Minuten beginnt die Kristallisation von Dicyclohexylharnstoff.
Man lässt 16 Stunden bei 0 stehen, filtriert vom Harnstoff (2, 75 g = 71 %) ab, zerstört den Überschuss an Dicyclohexyl- carbodiimid mit wenig Essigsäure und dampft im Vakuum das Methanol ab. Den Verdampfungsrück- stand nimmt man in Methylenchlorid auf, wäscht mit 2n SalzsÏure, 2n Natriumbicarbonatlösung und Wasser neutral.
Zweimaliges Umfällen aus Methylenchlo- rid/Petroläther ergeben 2, 47 g (87 S) amorphen Carbobenzoxy-dipeptidester, der direkt decarbobenzoxyliert wird. p- (p-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonyl-L- phenyManyl-L-arginin-methylester-hydrochlorid
Zu einer L¯sung von 8, 66 g (20 mMol)'MZ-L- phenylalanin (hergestellt nach Patent Nr.
364 780) in 150 ml absolutem Tetrahydrofuran gibt man bei -10 2, 8 ml (20 mMol) Triäthylamin und nach 10 Minuten bei der gleichen Temperatur 2, 0 ml (20 mMol) Chlorameisensäureäthylester. Nach weiteren 15 Minuten versetzt man mit der gekühlten L¯sung von L-Argininmethylester-hydrochlorid, hergestellt aus 5, 8 g (22 mMol) Argininmethylester-dihydrochlorid und 3, 06 ml (22 mMol) Triäthylamin in 30 ml Dimethylformamid. Man lässt 30 Minuten bei-10 und 1 Stunde bei Zimmertemperatur reagieren, filtriert vom Triäthylamin-hydrochlorid ab (5, 2 g) und verdampft das Lösungsmittel bei 50 im Vakuum.
Zum Rückstand gibt man viel Äther, dekantiert ab, trocknet das ölige Produkt im Vakuum und verreibt es mit viel Wasser. Dabei erstarrt die rohe MZ-Ver bi, ndung. Die wässrige Phase wird abzentrifugiert, der Rückstand zweimal mit je 50 ml frischem Wasser durchgeknetet und lyophil getrocknet. Die Rohaus- beute betrÏgt 11, 7 g.
Obige 11, 7 g bringt man, in 70 ml 95% igem Äthanol gelöst, auf eine 23 cm lange Aluminium oxydsäule (° 5 cm) und eluiert mit viel 95%igem Alkohol. Neben einer kl'einen Vorfraktion (110 mg) kristallisieren 5, 05 g MZ-dipeptidester-hydrochlorid aus der alkoholischen L¯sung aus. F. 185-186 .
Aus der Mutterlauge gewinnt man noch weitere 3, 36 g reine Substanz. F. 184-185 . Die Gesamtaus- beute ist 8, 41 g (66% der Theorie).
Das Sulfat F. 145-146 lässt sich durch Zugabe von Schwefelsäure 1 : 1 verdünnt zu einer alkoholi- schen L¯sung von MZ-L-phenylalanyl-L-argnin methylester-hydrochlorid in quantitativer Ausbeute erhalten.
L-Phenylalanyl-L-arginin-methylester-hydro- bromid, hydrochlorid
2, 5 g (3, 9 mMol) MZ-L-phenylalanyl-L-arginin- methylester hydrochlorid werden in 6 ml Nitromethan gelöst und mit 6 ml 4n Bromwasserstoff (24 mMol) in Eisessig versetzt und 90 Minuten bei Zimmertemperatur belassen. Gegen das Ende der Reaktionszeit kri stallisiert das p-(p'-Methoxyphenylazo) ; benzylbromid in prächtig roten Plättchen aus der Reaktionslösung aus. Bromwasserstoff und den grössten Teil des Lösungsmittels dampft man im Vakuum ab und zerreibt den Rückstand dreimal mit absolutem Ather. Anschliessend verteilt man das rohe Decarbobenzoxylie- rungsprodukt zwischen viel Chloroform und Wasser.
Wasser und Chloroformphasen werden noch je einmal mit frischem L¯sungsmittel extrahiert, die wäss- rigen Auszüge vereinigt und im Vakuum bei 40¯ zur Trockne eingedampft.
Das Hydrobromid, Hydrochlorid des Phenylala- nyl-arginin-methylesters fÏllt dabei als leicht rötlich gefärbtes amorphes Produkt an, das direkt zur weiteren Kondensation verwendet wird.
Die Ausbeute ist 1, 4 g (= 80 % der Theorie).
Das Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-argininmethylestercarbonat (Beispiel 8), unter den gleichen Bedingungen decarbobenzoxyliert, ergibt ein Dihydro bromid, das papierchromatographisch identisch mit dem oben beschriebenen Hydrochlorid, Hydrobromid ist.
Na-Carbobenzyloxy-N (im)-benzyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-argininmethylester-carbonat
Zu 5, 32 g (0, 014 Mol) Na-Carbobenzoxy-N (im) benzyl ; L-histidin in 110 ml Dimethylformamid gibt man bei 15 die Lösung von 3, 02 g (0, 0147 Mol) N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Dimethylformamid.
Gleichzeitigwerden 7, 7 g (0, 0154 Mol) L-Phenyl- alanyl-L-argininmethylester-dihydrobromid in 20 ml Dimethylformamid mit 2, 15 ml (0, 0154 Mol) Tri äthylamin ins Monohydrobromid übergeführt, auf 0 abgekühlt und zur Na-Carbobenzoxy-N (im)-benzyl L-histidinlösu, ng gegeben.
Nach 20stündigem Stehen wird vom Dicyclo- hexylbarnstoff (2, 27 g = 74 %} filtriert, zum Filtrat 0, 6 ml Eisessig gegeben und nach 15 Minuten das Lösungsmittel auf ein kleines Volumen eingedampft, nochmals vom auskristallisierten Salz befreit und dann vollständig zur Trockne eingedampft. Den amorphen Rückstand behandelt man mit viel Ather und trocknet anschliessend 4 Stunden bei 50 .
Das pulverige Rohprodukt wird dreimal mit je 40 ml und einmal mit 30 ml 0, 5n Ammoniumhydroxyd in der Kälte zerrieben, die überstehende Flüssigkeit jeweils gut abzentrifugiert und in 100 ml Butanol/Chloroform 1 : 1 aufgenommen. Mit zweimal 20 ml 2n Salzsäure stellt man kongosauer und wÏsch t anschliessend zuerst mit 2n Natriumbicarbonat und dann mit Wasser neutral.
Die getrockneten Extraktionslösungen werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Verdamp fungsrückstand in 135 ml 0, 25n Salzsäure aufgelöst, filtriert und unter Eiskühlung mit 2n Natriumbicarbonat auf pH 7-8 gestellt.
Den abgeschiedenen Carbobenzoxy-tripeptidester nimmt man wieder im Gemisch Butanol/Chloroform 1 : 1 auf, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Butanol-Chloroformgemisch auf ein kleines Volumen ein. Zweimaliges Umfällen aus Chloroform-Petroläther ergeben 7, 16 g (70% der Theorie) Nα-Carbobenzoxy-N (im)-benzyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-argininwmethylester-car- bonat.
Das Analysenpräparat zeigt nach zweimaligem Umkristallisieren aus 50% igem Methanol den F. 13j1 bis 135¯. [α]25D=-13¯ ¯ 1¯ (c= 0, 7822 in Methanol).
Nu-Carbobenzyloxy-N (im)-benzyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginin
6, 52 g (8, 9 mMol) Carbobenzoxy-N (im)-benzyl I,-histi, dyl-L-phenylalanyl-L-argininmethylester-car- bonat in 50 ml Methanol werden mit 19, 5 ml In Natronlauge während 1 Stunde bei Zimmertemperatur verseift. Mit In Salzsäure stellt man das pH auf 6 und gibt zum Verseifungsprodukt 300 ml Wasser.
Nach einstündigem Stehen bei 0 filtriert man vom Carbobenzoxytripeptid ab und kristallisiert das noch feuchte Produkt aus 50% igem Methanol um. Ausbeute : 4, 27 g (70%), F. 136-139 . M=-10, 5 0, 9 (c = 1, 062 in Methanol).
Die Mikroanalyse zeigt, dass das Carbobenzoxy- tripeptid mit 1 Mol Wasser kristallisiert.
Na-Carbobenzyloxy-N (im)-benzyl=L-histidyll-L- phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-p nitrobenzylester-carbonat
4, 2 g (6 mMa1) Carbobenzoxy-N (im)-benzyl-L histidyl-Lphenylalanyl-L-arginin und 2, 87 g (6, 6 mMol) L-Tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylester-hydro- chlorid (vgl. Beispiel 6) löst man in 20 ml frisch destilliertem N, N-Dimethylformamid und versetzt unter Eiskühlung mit der L¯sung von 1, 35 g (6 mMol) N, N'-DicyclohexyScarbodiimid in 7 ml Di methylformamid. Das Reaktionsgemisch lässt man 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, filtriert vom Dicyclohexylharnstoff ab (890 mg = 67 %) und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum.
Man erhält 8, 3 g Rohprodukt, das noch mit Dicyclohexyl- harnstoff verunreinigt ist.
6, 3 g Rohprodukt werden zwischen 500 ml Essigester und 50 ml In Natriumbicarbonatlösung verteilt, die Essigesterpbasen mit Wasser, fünfmal mit je 10 ml 10% iger Essigsäurelösung gewaschen, dann wiederholt mit In und 2n Natriumbicarbonat und zum Schluss mit Wasser neutral gewaschen.
Beim Eindampfen der getrockneten Essigesterlösung kristallisiert ein Teil des Produktes aus dem Lösungsmittel aus. Durch Zugabe von tiefsiedendem Petroläther erreicht man eine vollständige Ausfällung des Carbobenzoxypentapeptidesters. Die Ausbeute ist 4, 6 g.
Zur weiteren Reinigung werden 3, 5 g an 100 g Alumihiumoxyd der Aktivität III chromatographiert.
Mit Methanol werden wieder 2, 78 g Carbobenzoxy pentapeptidester eluiert und direkt zur Decarbobenz- oxylierung verwendet.
N (im)-Benzyl-L-histidyl ; L-phenylalanyl-L- arginyl-L-trypophylLglyci, n-p-nitrobenzylester- trihydrobromid
1, 75 g (1, 67 mMol) Carbobenzoxy-N (im) benzyl- L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylester-carbonat werden mit 5 ml 2n Bromwasserstoff in Eisessig wahrend 1 Stunde bei Zimmertemperatur decarbobenzoxyliert. Den überschüssigen Bromwasserstoff saugt man im Vakuum bei Zimmertemperatur ab und verreibt den Rückstand wiederholt mit viel absolutem ¯ther.
Das rohe Decarbobenzoxylierungsprodukt unterwirft man einer multiplikativen Verteilung nach Craig über 85 Stufen mit 0, 3n Ammoniumacetat (pH 7, 1) als untere Phase und n-Butand als Oberphase. Die Hauptmenge der Substanz ist in den Elementen 73 bis 85 verteilt. Die genannten Fraktionen werden vereinigt, von der Unterphase abgetrennt, letztere nochmals mit frischem Butanol extrahiert und die vereinigten Butanolextrakte im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft und der freie Pentapeptidester mit viel Petroläther ausgefÏllt. Nach weiterem UmfÏllen aus Chloroform-Petroläther erhält man 1, 2 g papierchromatographisch reinen N (im)-Benzyl-L- histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl L-tryptophylLgly- p-nitrobenzylester.
N-Ca, rbobenzyloxy-y-benzyl-L-glutamyl-N (im)- benzyl-L-hystidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L- tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylester-carbonat
Zu einer L¯sung von 370 mg (1 mMol) N-Carbo- benzoxy-L-glutaminsäure-y-benzylester in 10 ml abs.
Dioxan gibt man bei 10-11 (ein Teil des Dioxans ist immer gefroren) 0, 26 ml (1, 1 mMod) Tributylamin und nach 10 Miinuten bei der gleichen Temperatur 0, 11 ml (1, 1 mMol} Chlorameisensäure-äthylester.
Zur vollständigen Bildung des gemischten Anhydrids lässt man noch 20 Minuten bei der angegebenen Tem peratur reagieren und versetzt dann mit 820 g N (im) Benzyl-pentapeptid-nitrobenzylester in einem Gemisch von Acetonitril-Dioxan (10 ml). Nach 30minutigem Stehen im Eisbad und 60 Minuten bei Zimmertempe- ratur dampft man zur Trockne ein, nimmt den R ckstand in Chloroform auf und wäscht mit eiskalter In Salzsäure, In Natriumbicarbonatlösung und zum Schluss mit Wasser neutral. Das getrocknete Chloroform wird im Vakuum verdampft und der Carbobenz- oxy-heptapeptidester (1 g = 90 %), der noch mit Ausgangsmaterial verunreinigt ist, mit Petroläther umgefällt.
200 mg Rohprodukt werden in abs. Chloroform auf eine Aluminiumoxyd-Säule Aktivität III aufgezogen. Die Hauptmenge (160 mg) lässt sich wieder mit Methanol eluieren. Diese werden nach Craig über 3 ! 0 Stufen zwischen 80 % igem Methanol und Chloro- form/Tetrachlorkohlenstoff 1 : 1 multiplikativ verteilt. G = 4, 65.
Die Hauptmenge der Substanz ist in den Elementen 19-30 verteilt.
Diese Fraktionen werden vereinigt, das Lösungs mittelgemisch verdampft und der Verdampfungsrück- stand weiter umgesetzt.
L-Glutamyl-L-histidyl, L-phenylalanyl-L-arginyl-
L-tryptophyl-glycin 1. 350 mg (0, 37 mMol), durch Aluminiumoxyd gereinigten Carbobenzoxy-hexapeptidester werden mit I, 1 ml 2n Bromwasserstoff in Eisessig während 1 Stunde bei Zimmertemperatur decarbobenzoxyliert.
Den überschüssigen Bromwasserstoff dampft man im Vakuum ab und fällt das Trihydrobromid mit viel absolutem Ather. Wiederholtes Verreiben mit frischem Äther ergibt ein körniges, leicht grau gefärbtes Pulver.
Ausbeute : 550 mg rohes Hexapeptidester-tri- hydrobromid.
Dieses Produkt wird zwischen 0, 3n Ammoniumacetat (pH 7, 5) und n-Butanol über 30 Stufen verteilt, die Fraktionen 25-30 vereinigt und die Unterphasen noch einmal mit frischem Butanol extrahiert. Nach dem Abdampfen des Butanols gewinnt man 280 mg y-Benzyl-L-glutamyl-N (im)-benzyl-L-histidyl-L-phe- nylalanyl-arginyl-L-tryptophyl-glycin-nitrobenzylester.
Dieses Produkt wird in 90 % iger Essigsäure mit 10% igem Palladiumkohlekatalysator hydriert.
Nach 171/2 Stunden kommt die Hydrierung zum Stillstand, nachdem 21 ml Wasserstoff aufgenommen sind. Man befreit die L¯sung vom Katalysator und dampft bei 40 zur Trockne ein. Den Verdampfungs- rückstand nimmt man in wenig 95 % igem Alkohol auf und fällt das hydrierte Produkt mit viel Ather aus.
Ausbeute : 190 mg.
Auf dem Papierchromatogramm lassen sich noch unhydrierte Verbindungen feststellen.
Die 190 mg Glu-(im)-Bz-His-Phe-Arg-Try-Gly gibt man zu 50 ml trockenem frisch kondensiertem Ammoniak. Unter gutem Rühren mit einem Magnetrührer trÏgt man langsam kleine blanke Natriumstück- chen in die Suspension ein. Erst durch Zugabe von Natrium erreicht man eine klare L¯sung. Nach dem Eintragen von 2, 25 mMol Natrium bleibt die L¯sung für längere Zeit dunkelblau gefärbt.
Man trÏgt in kleinen Portionen 3 g Dowex-50 in der Ammoniumform in die Reaktionslösung ein, wobei sofortige Entfärbung stattfindet. Das Ammoniak wird unter kräftigem Rühren und unter Feuchtigkeitsausschluss bei Zimmertemperatur abgedampft.
Die letzte Phase Ammoniak verdampft man im Hochvakuum über Schwefelsäure.
Den Dowexp extrahiert man viermal mit 10 ml Wasser, säuert die farblose wässrige L¯sung (pH 9) mit 0, 5 ml Eisessig an und dampft zur Trockne ein.
Den Rückstand dampft man wiederholt mit abs.
¯thanol ab, l¯st ihn in 5 ml Wasser, filtriert von den Verunreinigungen ab und verdampft wieder zur Trockne.
Das Hexapeptid wird mit 10 ml abs. Alkohol verrieben, die Mutterlauge abzentrifugiert und im Hochvakuum getrocknet.
Man erhält 44 mg Hexapeptid alls wei¯es Pulver.
Im Tierversuch zeigt es MSH-Aktivität.
2. 124 mg (0, 1 mMol) N-Carbobenzoxy-γ-benzyl- L-glutamyl-N (im)-benzyl-L-histidyl-L-phenylalanyl L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-nitrobenzylester werden in 30 ml flüssigem Ammoniak direkt mit 1, 2 mMol Natrium gespalten. Nach der analogen Aufarbeitung, wie oben beschrieben, gewinnt man 25 mg Hexapeptid, das sich papierchromatographisch als identisch mit dem Produkt des 1. Versuches erweist.
Beispiel 2 L-Phenylalanyl-nitro-L-arginin-methylester
25, 14 g (0, 049 Mol) Carbobenzoxy-L-phenylala nyl-nitro-L-arginin-methylester [vgl. K. Hofmann et al. J. A. C. S. Band 78, 240 (1956)] werden in 50 ml Eisessig unter gelindem Erwärmen gelöst und mit 50 ml 4n Bromwasserstoff in Eisessig während 90 Mihuten bei Zimmertemperatur decarbobenzoxyliert.
Die Reaktionslösung dampft man bei 40 im Vakuum auf ein kleines Volumen ein und gibt den siru pösen Rückstand unter starkem Rühren in 1 1 abs.
Äther. Nach l5minutigem Rühren lässt man den flokkigen Niederschlag absitzen und trocknet den Rück stand bei 40 im Vakuum über Phosphorpentoxyd.
Das rohe Hydrobromid nimmt man in 40 ml eiskaltem Wasser auf, stellt die mit Eis gekühlte L¯sung mit 2n Sodalösung phenolphthailemalkalisch und extrahiert zuerst dreimal mit je 100 ml Äther-zur Ent- fernung der Verunreinigungen-und anschliessend mit je 200 ml, 100 ml und 50 ml eines Gemisches von n-ButanolLChloroform 1 : 9. Die Chloroform-Butanol Extrakte werden noch zweimal mit je 10 ml 1/2-gesÏttigter Natriumchloridlösung gewaschen und zum Schlu¯ mit Magnesiumsulfat getrocknet. Im Vakuum dampft man das Chloroform und einen Teil des Butanols bei 40-45¯ ab und fällt hierauf den freien Dipeptidester mit viel Äther aus.
Man filtriert durch eine feine Glasnutsche ab, wÏscht mit viel Äther nach un'd trocknet den Rückstand im Hochvakuum bei 40 .
Die Ausbeute beträgt 16 g amorphen L-Phenyl alanin-nitro-L-arginin-methylester ; dies sind 71 % der Theorie.
Der Dipeptidester zeigt in den 3 folgenden Systemen : 43 : t-Amyqlalkohol : Isopropanol : Wasser = 100 : 40 : 55 ; 54 : sek. Butanol : Isopropanol : Monochloressig säure : Wasser = 70 : 10 : 3 g : 40 ; 56 : sek. Butanol : Isopropanol : 5 % Veronal
Natrium : Wasser = 100 : 15 : 10 : 60 nur einen ninhydrinpositiven Fleck.
Das amorphe Produkt wird f r die weitere Umsetzung ohne zusätzliche Reinigung direkt verwendet.
Na, N (im)-Dicarbobenzyloxy-L-histidyl-L- phenyl'alanylLnitro-L-arginin-methylester 16 g (0, 042 Mol) L-PhenyWalanyl-nitro-L-arginin- methylester in 50 ml Acetonitril werden auf-10 gekühlt und mit dea-ebenfalls vorgekühlten Lösung von 19, 2 g Dicarbobenzoxy-L-histidin (0, 042 Mol) in 140 ml Acetonitril vereinigt, wobei sich wieder ein Teil der gelösten Substanzen ausscheidet. Nach der Zugabe von 10 ml Dimethylformamid und anschlie- ssendem kräftigem Durchschütteln tritt wieder klare L¯sung ein.
Hierauf trÏgt man die vorgekühlte Lösung von 9, 7 g Dicyclohexyl-carbodiimid (0, 047 Mol) ? in 45 ml Acetonitril ein und lässt bei 0 bis + 3 reagieren. Nach kurzer Zeit beginnt die Abscheidung von Dicyclohexylharnstoff neben dem Dicarbobenz- oxy-dieptidester. Das Reaktionsgemisch wird mit 100 ml Acetonitril/Dimethylformamid 9 : 1 verdünnt und über Nacht bei 0 stehengelassen. Den kompak- ten, gallertigen, zum Teil kristallinen Kuchen zerreibt man gut mit weiteren 100 ml Acetonitril, filtriert durch eine Glasfritte G-2 und wÏscht nochmals mit zweimal 50 ml Acetonitril gut nach.
Zur Mutterlauge gibt man 0, 5 ml Eisessig, lässt 15 Minuten reagieren und verdampft anschliessend zur Trockne. Als Rückstand bleibt wenig mit Ausgangsmaterial verunreinigtes Produkt, das nitht weiter aufgearbeitet wurde.
Den feuchten Nutschenrückstand extrahiert man mit total 60 ml Dimethylformamid und trennt auf diese Weise 9, 3 g unlöslichen Dicyclohexythamstoff (= 98 % der Theorie). F. 226-228 ab.
Die Dimethylformamidlösung dampft man bei 40 im Hochvakuum zur Trockne ein und gewinnt 26, 7 g rohes Material.
Nach einmaligem Umkristallisieren aus 100 ml Methanol erhält man 23, 1 g (= 70% der Theorie) Dicarbobenzoxy-tripeptidester.
Das Analysenpräparat kristallisiert mit 1 Mol Kristallmethanol, F. 125-128¯. [α]26D=-19¯ ¯ 15¯ (c = 0, 9787 in Methanol). Die Dicarbobenzoxyver- bindungen sind äusserst empfindlich gegenüber Basen.
L-Histidyl-L-phenylalanyl-L-argininWmethylester- diacetat
16, 5 g (20 mMol) Dicarbobenzyloxy-L-histidyl-Ir phenylalanyl-nitro-L-arginin-methylester werden in 300 ml abs. Methanol unter Zusatz von 4, 4 Aquiva- lenten methanolischer Salzsäure und in Gegenwart von 4 g 10% igem PaiHadiumkoMe-Katalysator bis zur Sättigung hydriert. Das gebildete Kohlendioxyd wird' in einer zweiten dazwischengeschalteten Hydrierente mit Kali'lauge adsorbiert. Nach 10 Stunden sind von den berechneten 2700 ml Wasserstoff 2515 ml Was serstoff aufgenommen, und die Hydrierung ist beendet.
Die vom Katalysator befreite L¯sung dampft man bei 40 im Vakuum ein, löst den Rückstand in 20 ml Wasser und lässt die L¯sung langsam durch eine lonenaustauschersäulc von 120 ml ?Amberlite IR4-B? (Acetatform) laufen. Man wäscht mit Wasser so lange nach, bis die Eluate nicht mehr ninhydrin- positiv reagieren. Es wird mit total 360 ml Wasser nachgewaschen.
Die wässrige Losung wird bei 40 im Vakuum zur Trockne verdampft und der gut getrocknete Rück- stand mit abs. ¯ther aus der Methandl'lösung ausgefällt. Die Ausbeute beträgt 13, 1 g amorphes Tri peptidester-diacetat.
Papierchromatographisch zeigt der Tripeptildester in den 2 Systemen 56 (vgl. S. 6) und sek. Butanol : Isopropanol : TriÏthylamin : Veronal : Wasser = 100 : 10 : 0, 8 : 1, 8 g : 60 nur einen ninhydrin-, pauly-und sagaguchipositiven Fleck. Das amorphe Produkt wird direkt weiter verarbeitet.
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L- phenylal'anyl-L-arginwin-methylester
13, 1 g (22 mMol) L-Histidyl-L-phenylalanylLL- arginin-methylester-diacetat werden in 60 ml Di methylformamid auf-10 gekühlt und portionen weise mit 6, 1 g Carbobenzoxy-L-glutaminazid (20 mMol) versetzt. Dabei geht das Azid sofort in Lö- sung. Man lässt 2 Tage bei 0 reagieren und fällt an schlieSend den rohen Tetrapeptidester mit 1 1 Essig- ester aus. Den gallertigen Niederschlug filtriert man ab und wÏscht mit viel Essigester und Ather.
Einmaliges Umkristallisieren aus Methanol/Essig- ester liefert 11, 3 g papierchromatographisch reinen Carbobenzoxy-tetrapeptid-methylester, F. 162-165 (Sintern bei 155 ).
Das Analysenpräparat zeigt nach einer weiteren KristaMs ation von dem gleichen Lösungsmittelgemisch F. 167-169¯.
Der Verteilungskoeffizient für das System 80% Methanol : (Chloroform : Tetrachlb. = 1 : 1) = 1 : 1 betragt 5, 9 ; [a] D =-18, 4 1, 6 , c = 0, 979 in Eisessig. Die Rf-Werte in den 3 Systemen 54, 56 (vgl. S. 6) und Methyläthylketon : Pyridin : Wasser = 60 : 15 : 25 sind 0, 59 bzw. 0, 82 bzw.
0, 85.
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L- phenylÏlanyl-L-arginin 2-, 5 g (3, 1 mMol) Carbobenzoxy-tetrapeptidester- acetat werden in 80 mit jaithandLWasser 3 : 5 unter Erwärmen gelöst und bei Zimmertemperatur mit 6, 5 ml 1n Natronlauge versetzt. Nach 10 Minuten trübt sich die L¯sung, und es beginnt sich gallertige Substanz abzuscheiden. Das pH beträgt während der 60minutigen Verseifulng 11, 5. Mit 6, 5 ml ln Salz- sÏure wird die L¯sung neutral'gestellt und bei 40 zur Trockne eingedampft.
Den gallertigen Rückstand nimmt man in 50 ml heissem Wasser auf, filtriert durch Watte, engt die L¯sung auf ein Volumen von 20 ml ein und lässt 16 Stunden bei 0¯ stehen.
Die gallertige Ausfällung wird duch eine Glasfritte G-2 vorsichtig filtriert, mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen und ber Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet.
Die Ausbeute ist 1, 65 g = 75 % der Theorie, F. 167-169 (Sintern bei 165¯).
Das Analysenpräparat, aus Wasser umkristalli- siert, zeigt nach dem Trocknen im Hochvakuum und anschliessendem Stehenlassen am der Luft den Gehalt von 4 Kristallwasser, F. 159-160 .
Der Verteilungskoeffizient f r das System n-Buta- ne AcOH ist 1 : 1, ist 0, 16. [α]26D=- 33,6¯ 1, 3 (c = 0, 923 in In n SalzsÏure).
Eine Probe des reinen Carbobenzoxy-tetrapeptid- esters mit 2n Bromwasserstoff in Eisessig decarbobenzoxyliert lässt sich mit Leucinaminopeptidase unter den Standardbedingungen in die 4 Aminosäuren aufspalten.
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl1-L-histidyl-L- phenylalanyI-L-arginyl-Ltryptophyl-glycin- nitrobenzylester
2, 0 g (2, 5 mMol) Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L- histidyl-L-phenylalanyl-L-arginin. 4Hz0 werden unter Erhitzen in 45 ml Dimethylformamid gelöst, wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt und mit 1, 93 g (4, 5 mMol) L-Tryptophyl-glycin-nitrobenzylester (vgl.
Beispiel 1) versetzt. Das Gemisch rührt man mit einem Magnetrührer während 50 Minuten ; dabei l¯st sich der grösste Teil der Suspension. Anschliessend kühlt man im Eisbad auf 0 ab, gibt die vorgekühlte L¯sung von 620 mg Dicycal'ohexylcarbodiimid (13 mMol) in 5 ml Dimethylformamid dazu und läX3t während 3 Tagen bei 0 reagieren.
Die Reaktionslösung befreit man vom Harnstoff (370 mg = 66, o), versetzt mit 3 Tropfen Eisessig und dampft das Dimethylformamid im Hochvakuum auf ein kleines Volumen ein. Das rohe Reaktionsprodukt fällt man mit viel Essigester aus, filtriert es und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd.
Die Rohausbeute beträgt 3, 1 g. Zur Abtrennung der Ausganasstoffe verteilt man das Rohprodukt zwischen n-Butanol und 1 % Essigsäure über 30 Stufen.
Die Fraktionen 0-8 (730 mg) sind zur Hauptsache Carbobenzoxy-tetrapeptid, während sich in den Elementen 10-26 neben dem Carbobenzoxy-hexa peptid-nitrobenzylester auch noch L-Tryptophyl-gly- cin-nitrobenzylester befindet.
Zur weiteren Reinigung werden die Fraktionen 10-26 nochmals zwischen n-Butanol und 1 % Essigsäure über 40 Stufen verteilt und die Fraktionen 16-19, 20-23, 24-27 und 28-31 vereinigt. Die Fraktionen 12-15 enthalten noch wenig Carbobenzoxy- tetrapeptid, während die übrigen im Papierchromatogramm nur Carbobenzoxy-hexapeptid-nitrobenzyl- ester anzeigen.
Die Ausbeute der vereinigten Fraktionen ist 1, 4 g (50% der Theorie).
Der Verteilungskoeffizient der analytisch reinen Verbindung ist l. [α] 25D=-27,3¯ ¯ 1,4¯ (c = 1, 064 in Dimethylformamid).
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin- methylester. hydrochlorid a) aus Cbo-GluÀ(NH2)-His-Phe-ArgÀOH + H-Try
Gly-OCH3-HCl
5 g (6, 25 mMol) Carbobenzoxy-tetrapeptid werden in einem Gemisch von 70 ml Dimethylformamid und 15 ml Diäthylphosphat unter Erwärmen gelöst ; die L¯sung kühlt man wieder auf Zimmertemperatur ab und versetzt hierauf mit 3,, 7 g (12 mMo1) L-Tryp tophyl-glycin-methylester-hydrochlorid (vgl.
Beispiel 1). Anschlie¯end rührt man 3 Stunden bei Zimmertemperatur und lässt über Nacht bei 0c stehen. Zur gekühlten L¯sung gibt man 1, 85 g (9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dimethylformamid und lässt 77 Stunden bei 0 und 6 Stunden bei Zim mertemperatur reagieren.
Den abgeschiedenen Harnstoff filtriert man ab (780 mg = 56%), versetzt das Filtrat mit 0, 1 ml Eisessig, dampft das Dimethylformamid auf wenige ml ein und fällt mit viel Essigester aus. Nach dem Filtrieren und Trocknen im Hochvakuum erhält man 8, 3 g Gemisch von Carbobenzoxy-hexapeptidester und Ausgangsmaterial.
Das gesamte Rohprodukt wird zwischen n-Butanol und 1 % Essigsäure in einer Craig-Apparatur mit
100 ml Phasenvolumen verteilt.
Die Fraktionen 11-35 reagieren positiv auf Pauly- Reagens, und 15-35 zeigen positive Ehrlich-Reaktion an. Die Elemente 11-14 und 15--16 enthalten zur Hauptsache Carbobenzoxy-tetrapeptid neben wenig Carbobenzoxy-hexapeptidester, während die Fraktionen 19-35 reinen geschützten Hexapeptidester enthalten.
Die Phasen der Fraktionen 19-35 werden ver einigt, zur Trockne eingedampft und einmal aus Di methylformamid-Essigester ausgefäll't.
Die Ausbeute des amorphen papierchromatogra- phisch einheitlichen Carbobenzoxy-hexapeptidesterhydrochlorids ist 3, 8 g. [α]25D-16,4¯ ¯ 0,3¯ (c = 0, 793 in Pyridin}. b) aus Cbo-Glu- (NH2)-His-OH+H-Phe-Arg-Try Gly-OCHs-HOL
680 mg (0, 05 mMol) L-Phenylalanyl-L-arginyi- L-tryptophyl-glycin-methylester-dihydrochlorid, das noch Ammoniumchlorid von der katalytischen Hy drierung des Cbo-tetrapeptidesters enthält, l¯st man in 4, 5 ml Dimethylformamid, kühlt im Eisbad und gibt 0, 139 ml Triäthylamin (1 mMol) dazu.
Nach 20 Minuten beginnt die Abscheidung von Triäthylamin- hydrochllorid. Man lässt 50 Minuten reagieren, filtriert anschliessend vom abgeschiedenen Salz ab und gibt die auf 0 gekühlte L¯sung von 630 mg (1, 5 mMol) Carbobenzoxy-L-gl'utaminyl'-L-histidin (vgl. Beispiel 1) in 3, 5 ml Dimethylformamid dazu. Nach weiteren 30 Minuten versetzt man mit dem Dicyclohexylcarbo- diimid (3s10 mg in 1 ml Dimethylformamid = 1, 5 mMol). Nach 3tägigem Stehen bei + 3 filtriert man vom Harnstoff ab (260 mg) und fällt anschliessend mit viel'Essigester aus.
Man erhält 1, 1g noch mit Ausgangsmaterial ver unreinigtes Produkt. Zur Entfernung der Ausgangsmaterialien behandelt man das Rohprodukt einmal mit 5 mT, viermal mit 2 ml ln Salzsäure und zum Schluss zweimal mit 2 ml Wasser. Das über Phosphorpentoxyd getrocknete Produkt wiegt 600 mg = 60% der Theorie.
Der Carbobenzoxy-hexapeptidester fällt dabei ah amorphes Dihydrochlorid an und ist leicht rosa gefärbt. [a] 25 =-12, 5 ¯ 1,7¯ (c = 0, 961 in Pyridin).
In den Systemen 43, 54 und 56 (vgl. S. 26) zeigt die Verbindung nur einen pauly-und ehrlichpositiven Fleck und die gleichen Rf-Werte wie das unter a beschriebene Produkt. In diesem Fall ist eine Verteilung nach Craig nicht notwendig. Der geschützte Hexapeptidester kann mit Natronlauge direkt verseift werden.
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L- phenylalanylLL-arginyl-L-tryptophyl-glycin. acetat 450 mg (0, 39 mMol3 Carbobenzoxy-hexapeptidnitrobenzylester werden in 10 ml 50% igem Dioxan gel¯st und mit l/2n Natronlauge während 45 Minuten verseift. Die Natronlauge gibt man portionenweise dazu, so dass der pH der L¯sung immer zwischen 10, 5 und 11 ist. Nach der Zugabe der ersten 3 ml '/, on Natronlauge beginut die Abscheidung von gal lertiger Substanz. Zur Verdünnung der L¯sung werden nochmals 10 ml 50% iges Dioxan zugegeben. Es werden total 7 ml 1/2n Natronlauge verbraucht.
Zum Schluss verdünnt man mit Wasser, neutralisiert mit In n Salzsäure und stellt die L¯sung mit einem Tropfen Eisessig auf pH 5, 5.
Man filtriert das gallertige Produkt ab, wäscht mit eiskaltem Wasser nach und trocknet den Filterrückstand im Vakuum über Kaliumhydroxyd und Phos phorpentoxyd. Das trockene Produkt wiegt 200 mg, F. (199 ) 203-205 .
Aus der Mutterlauge lassen sich noch weitere 150 mg Carbobenzoxy-hexapeptid isolieren, F. 155 bis 163 .
Diese Fraktion liegt aber, im Gegensatz zur Fraktion mit dem Schmelzpunkt 203-205 , nur teilweise als Acetat vor, was eindeutig aus den Acetylbestim- muhgen hervorgeht.
Im Papierchromatogramm zeigen die beiden Fraktionen in allen 3 Systemen 43, 54 und 56 die gleichen Rf-Werte
System 43 Rf = 0, 45
System 54 Rf = 0, 55
System 56 Rf = 0, 62
Die Verteil'ungskoeffizienten G im System sek. Butanol : 1% EssigsÏure 1 : 1 sind für beide Fraktio- nem ebenfalls identisch. [a] 25D =-15, 9 +1, 1 , c = 0, 944 in Eisessig.
Das Produkt kann in üblicher Weise durch Decarbobenzoxylierung in das freie Hexapeptid über- geführt werden, z. B. mittels Bromwasserstoff in Eisessig (vgl. Beispiel 1) oder durch Hydrierung in Gegenwart von 10% igem Palladiumkohle-Katalysator.
Beispiel 3
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidin methylester a) Mit Dicyclohexyl-carbodiimid
15, 1 g (0, 054 Mol) Carbobenzoxy-L-glutamin werden im Gemisch von 18 ml Dimethylformamid und 81 ml Acetonitril gelöst, auf 0 gekühlt und mit der ebenfalls vorgekühlten L¯sung von 9, 81 g L-Histi- dih-methylester (0, 058 Mol) in 9 ml Dimethylform- amid und 36 ml Acetonitril versetzt. Dabei scheidet sich wieder ein Teil der gelösten Substanz ab.
Durch Zugabe von weiteren 20 yn ; l Dimethylformamid erhält man wiederum eine klare Losung. Dazu gibt man 12, 2 g (0, 059 Mol) Dicydohexyl-carbodiimid in 13 ml Dimethylformamid und lϯt ber Nacht bei 0 reagieren. Dabei scheidet sich der Carbobenzoxy- dipeptidester neben dem Harnstoff als gallertiger Nie derschlag ab. Die gallertige zum Teil kristalline Ab scheidung wird abfiltriert, gut mit Acetonitril gewaschen und im Hochvakuum getrocknet.
Das Gemisch Carbobenzoxy-dipeptidester und Dicyclohexylgharn- stoff schlämmt man in 35 ml 2n Salzsäure auf, nutsch, t vom unlöslichen Harnstoff ab und wäscht noch mit 11 ml 2n Salzsäure nach. Die salzsaure Lösung wird mit der berechneten Menge In Natronlauge neutralisiert ; dabei scheidet sich der Carbobenzoxy- dipeptidester als dicke Gallerte aus, so dass mit weiteren 150 ml Wasser verdünnt werden muss. Das gallertige Produkt wird mit der Mutterlauge gut durchgeknetet und durch eine G-2-Glasfritte filtriert.
Zur r vollständigen Neutralisation vereinigt man den Filter- rückstand nochmals mit der alkalisch reagierenden Mutterlauge und knetet wiederum gut durch (pH der Mutterlauge = 8). Nach dem Trocknen erhÏlt man 14, 5 g geschützten Dipeptidester (63 % der Theorie) F. 167-169¯.
Die Analysenfraktion aus Wasser umkristallisiert zeigt F. 171-174 ; [a] 24D=-32,4¯ ¯ 0, 6 (c = 1, 17 in In Salzsäure).
Aus der Mutterlauge lassen sich noch weitere 2, 4 g papierchromatographisch reinen Carbobenzoxy-dipeptidester vom F. 158 gewinnen. Die Halogenprobe ist bei dieser Fraktion hingegen positiv. b) mit N, N'-DiimidazolWcarbonyl
140 ml (0, 5 mMol) Carbobenzoxy-Lglutamin (über Phosphorpentoxyd getrodknet) werden in 1, 5 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelost und un ter Feuchtigkeitsausschlu¯ mit 97 ml (0, 6 mMol) Di- imidazol-carbonyl versetzt. Sobald die Kohlendioxyd- Entwicklung aufgehört hat, gibt man die L¯sun von 85 ml Histidinmethylester (0, 5 mMol) in 1 ml Dimethylformamid dazu und lässt über Nacht bei 0 reagieren.
Der geschützte Dipeptidester wird mit viel ¯ther ausgefällt. Die Ausbeute beträgt nach dem Trocknen 190 mg (= 88 % der Theorie) Carbobenzoxy-L-glut- aminyl-L-histidin-methylester. F. 17-0-173,'unter Zersetzung ; M =-32, 2 1, 1 (c= 1, 025 in In Salzsäure).
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidin
5, 9 g Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-histidinmethylester werden in einem Gemisch von 42 ml Methanol und 28 ml Wasser unter Erwärmen gelöst, wieder auf Raumtemperatur gekühlt und mit 35, 5 ml 0, 45n Bariumhydroxydlösung versetzt. Nach 5 Minuten beginnt sich das Bariumsalz als dicker weisser Niederschlag abzuscheiden. Man verdünnt mit weiteren 140 ml Wasser, rührt mit einem Magnetrührer und lässt total 45 Minuten verseifen. Mit der berechneten Menge ln Schwefelsäure (15 ml) stellt man die Lö- sung neutral, filtriert vom Bariumsulfat ab und dampft die L¯sung zur Trockne ein.
Den gtasigen Rückstand nimmt man in wenig Dimethylformamid auf, filtriert die L¯sung nochmals durch eine Glasfritte G-4 und fällt hierauf das Carbobenzoxy-dipeptid mit viel Essigester aus.
Nach dem Trocknen im Hochvakuum erhält man 5, 72 g amorphes papierchromatographisch reines Carbobenzoxy-dipeptid.
Die Kristallisation aus Methanol ergibt 5, 1 g Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-histidin, F. 196-197 .
Der Verteilungskoeffizient im System 80 % Mehanol : (Chloroform : Tetrachlorkohlenstoff = 1 : 1) = 1 : 1 ist 4, 6. p-(?-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonyl-L glutamin (MZ-L-Glutamin)
11, 7 g (51 mMol) L-Glutamin-hydrobromid (durch Decarbobenzoxylierung der entsprechenden Carbobenzoxyverbindung gewonnen) werden in 75 ml Wasser gelöst, dann mit 200 ml Aceton verdünnt und 5 g Magnesiumoxyd (20% Überschuss) eingetragen.
Anschliessend gibt man bei 0 17 g p- (p'-Methoxy- phenylazo)-benzyloxycarbonylchlorid (56 mMol) während 1 Stunde in kleinen Portionen dazu, verd nnt mit 200 ml Wasser und rührt weitere 90 Minuten bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch stellt man mit 2n Salzsäure kongosauer, lässt während 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, zentrifu- giert den gaCtertigen Rückstand ab und trocknet bei 50¯ im Vakuum.
Das Rohprodukt aus 500 ml 95 % igem Methanol kristallisiert zeigt den F. 183-184¯. Die Ausbeute betrÏgt 13, 48 g.
Aus der Mutterlauge lassen sich noch weitere 2, 56 g F. 183-184¯ isolieren.
Die Gesamtausbeute beträgt demnach 16, 04 g, was 76, 3 % der Theorie entspricht.
Das Ultraviolett-Spektrum zeigt Amax 237 m u (?=13 100) und 349 my (e = 2600). p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonyl-
L-glutaminyl-L-histidin-methylester
2, 86 g MZL-Glutamin (6, 9 mMo2) lbst man in 10 ml Dimethylformamid und gibt die L¯sung von 1, 3 g L-Histidinmethylester (7, 8 mMol) in 15 ml Dimethylformamid dazu. Die vereinigten Lösungen kühlt man auf 0 ab und versetzt mit 1, 6 g (7, 8 mMol) Dicydiohexylcarbodiimid in 3 ml Dimethylformamid.
Man lässt über Nacht bei 0 reagieren, filtriert vom Harnstoff ab, versetzt das nicht umgesetzte Carbodiimid mit 3 Tropfen Eisessig und dampft das Dimethylformamid im Vakuum zur Trockne ein. Den Rückstand zerreibt man mit viel Essigester und lässt 2 Tage bei 0 stehen, filtriert und trocknet das orangerote Produkt bei 40¯ im Vakuum.
Die Ausbeute ist 2, 8 g Rohprodukt.
Zur Reitnigung löst man 2, 5 g Rohprodukt in 10 ml mit Wasser gesättigtem sek.-Butanol und filtriert durch eine AluminiumoxydsÏule.
Es lassen sich 2, 3 g reinen MZ-Dipeptidester eluieren, während das nicht umgesetzte MZ-L-Glut- amin am Anfang der Aluminiumoxyd-Kolonne als orangerote Zone zurückgehalten wird.
Aus 90 % igem Athanol schmilzt das Präparat bei 167-169 .
Das Ul'traviolett-Spektrum zeigt : max x237 mÁ (?=12 700), 340 mlt 21200) und Am.,, 435 mu u (?=2000). p-(?-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonyl
L-glutaminyl-L-histidin
1, 13 g (2 mMol) MZ-Dipeptidester l¯st man in 30 ml 75 % igem Dioxan und verseift mit 2, 4 ml 1 n Natronlauge; nach 10 Minuten wird noch mit 10 ml Wasser verdünnt. Nach 60 Minuten versetzt man unter Kühlung mit 30 ml 10 % iger Essigsäure und dampft das Lösungsmittel im Vakuum ab. Den gallertigen Rückstand trocknet man scharf bei 50 und zerkratzt ihn mit 100 ml Wasser.
Durch Zentrifugie- ren trennt man von der Mutterlauge ab, wÏscht noch gut mit Wasser nach und trocknet anschliessend den Rückstand lyophil. Die Ausbeute beträgt 750 mg (68%). Zur Entfernung anhaftender Verunreinigungen wäscht man das MZ-Dipeptid mit 50 Methanol und zum Schlu¯ mit viel Ather. Es bleiben 670 mg, F. 207-208 .
Das Analysenpräparat schmilzt nach einmaligem Kristallisieren aus 75% igem Dioxan bei 214-215 .
N-Carbobenzyloxy-L-phenylalanyl-nitro-L arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester
8 g (0, 016 Mol3 Carbobenzoxy-L-phenylalanyl- nitro-L-arginin [vgl. K. Hofmann et al. J. A. C. S.
Band 78, 240, (1956)] werden im Gemisch von 8 ml Dimethylformamid und 45 ml Acetonitril unter Erwärmen gelöst, dann auf 0 gekühlt und mit der vorgek hlten L¯sung von 5,71 g (0,02 Mol) L-Tryptophyl-glycin-methylester in 4,5 ml Dimthylformamid und 18 ml Acetonitril versetzt. Man verd nnt mit 45 ml Acetonitril und rührt während 15 Minuten weiter. Bei 0 wrden 4, 1 g (0, 02 Mol) Dicyclohexyl- carbodiimid in 9 ml Acetonitril eingetragen und 24 Stunden bei dieser Temperatur stehengelassen. Der abgeschiedene Harnstoff (3, 22 g) wird abfiltriert, die L¯sung mit 0, 5 ml Eisessig versetzt und nach 15minu- tigem Stehen zur Trockne verdampft.
Den öligen Rückstand l¯st man in Essigeser, filtriert vom ab geschiedlenen Harnstoff ab und wÏscht die organischen Phasen dreimal mit 1n SalzsÏure, zweimal mit Wasser, dann dreimal mit In Natriumbicarbonat und zum Schluss mit Wasser neutral.
Beim Waschen mit Bicarbonat scheiden sich 1, 45 g gallertiges Material ab. Der Schmelzpunkt ist identisch mit dem Carbobenzoxy-tetrapeptidester.
Die Essigesterphasen werden über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne verdampft. Nach einmali gem Umkristallisieren aus vieQ Essigester erhält man 7, 97 g geschützten Tetrapeptidester, F. 126-130 .
Die Totalausbeute beträgt 9, 42 g = 78 % der Theorie.
Das Analysenpräparat schmilzt nach einer weiteren Krisallisation aus Essigester bei 126-130 .
[a] 28¯D=-18,5¯ ¯ 0, 5 , c = 1, 336 in Methanol.
Der Verteilungskoeffizient G im System 80% Methanol. (Chloroform : Tetrachlorkohlenstoff = 1 : 1) = 1 : 1, ist 1, 2.
Die gleiche Substanz aus verschiedenen Lösungs- mitteln kristallisiert zeigt verschiedene Schmelzpunkte, z. B. aus Methanol F. 136-140 .
L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin- methylester-dihydrochlorid
7 g (9, 2 mMol) Carbobenzoxy-tetrapeptidester gemäss Beispiel 1 werden in 180 ml Athanol unter Zusatz von 5 Aq. methanolischer Sallzsäure und in Gegenwart von 2 g 10 % igem Palladiumkohle-Kataly- sator bis zur Sättigung hydriert. Das gebildete Koh- lendioxyd wird in einer zweiten dazwischen geschalte- ten Hydrierente mit Kalilauge adsorbiert. Nach 12 Stunden ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Total werden 997 ml Wasserstoff verbraucht (Theorie : 1035 ml). Man filtriert vom Katalysator ab und dampft das Losungsmittel zur Trockne ein.
Den Verdampfungsrückstand nimmt man in 15 ml absolutem Methanol auf und fällt das Produkt wieder mit viel abs. Ather aus.
Die Ausbeute an rohem Dihydrochlorid des Tetrapeptidesters ist 6, 68 g.
Dieses Produkt enthält noch Ammoniumchlorid, ist aber genügend rein und wird direkt zur Umsetzung zum Carbobenzoxy-hexapeptidester verwendet. p-(?-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonyl
L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester.hydrochlorid
470 mg (0, 85 mMol) p-(?-Methoxyphenylazo)benzyloxy-carbonyl-L-glutaminyl-L-histidin in 14 ml Dimethylformamid werden mit der L¯sung von 510 mg (0, 84 mMol) L,-Phenylalanyl-L-arginyl-L- tryptophyl - glycin-methylester-hydrochlorid (vgl.
Beispiel 1) in 2 ml Dimethylformamid vereinigt, auf 0 gekühlt und mit 210 mg (1 mMol) Dicyclehexyl- carbodumid in 2 mi Dimethylformamid versetzt. Nach 3tägigem Stehen bei 0¯ lϯt man Zimmertemperatur annehmen, filtriert vom Harnstoff ab, zersetzt das nicht umgesetzte Carbodiiinid mit 0, 1 ml Eisessig und dampft auf ein kleines Flüssigkeitsvolumen ein. Mit viel Essigester fällt man das Rohprodukt aus. Die Rohausbeute beträgt 760 mg.
Zur Reinigung l¯st man 500 mg Substanz in 10 ml 75 % igem Dioxan und filtriert durch eine Alu miniumoxydsäule (8 g). Am Start bleibt die Verunreinigung als orangerote Zone haften.
Die eluierten 420 mg werden zwischen n-Butanol und 1 % iger Essigsäure über 30 Stufen verteilt. Die Hauptmenge des MZ-Hexapeptidesters befindet sich in den Elementen 8-19 (G = 0, 8, 8).
Die Fraktionen 1, 0-18 werden vereinigt und nochmals zwischen sek.-Butanol und 1 % Essigsäure über 40 Stufen verteilt. Die Fraktionen 11-19 werden aus 95 % igem Methanol umkristallisiert. Man erhält 180 mg p- (p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonyl- L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-Ltryptophyl-glycin-methylester.hydrochlorid, F. 202 bis 203 .
Das Ultraviolett-Spektrum zeigt : ?max 284 mÁ(? = 9800), ?max 290 mÁ(? = 10 000), ?max 349 mÁ(? = 21 200), ?max 435 mÁ(? = 2000).
Process for the production of new hexapeptides
EMI1.1
where Ri denotes an amino lower alkyl group, as well as corresponding compounds which have the remainder of glutamine instead of the glutamic acid residue.
The new compounds have the effect of the natural melanocyte-stimulating pituitary hormones (MSH effect), but have the advantage over them that they can be synthesized much more easily because they have a sequence of only 6 amino acids, whereas the a-MSH from 13 and the SSMSH from 18 amino acids.
The new hexapeptides can be used in place of the natural MSH as medicinal products or as intermediates for the production of medicinal products which have a longer chain of amino acids, in particular L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl; L-tryptophyl-glycine and the corresponding L-glutaminyl peptide. The residues of α- (amino-lower-alkyl) -amino-acetic acid are in particular L-arginyl, L-ornityl and L-lysyl.
The new peptides can be obtained by the methods known for peptide production, the amino acids being linked individually in the order mentioned or after prior formation of smaller peptide units.
The process according to the invention is characterized in that L-glutamic acid or its γ-amide, L-histidine, L-phenylalanine-L-α-amino-deralkyl-amino-acetic acid, L-tryptophan and glycine with intermediate protection of amino -or. Carboxyl groups united with one another by condensation.
All free, functional groups not involved in the reaction are expediently protected, in particular by means of residues which can be easily split off by hydrolysis or reduction, the carboxyl group preferably by esterification, e.g. B. with methanol, benzyl alcohol or p-nitrobenzyl alcohol, the amino group, for example by introducing the tosyl or trityl radical or in particular the carbobenzoxy group or colored protective groups, such as the p phenylazo-benzyloxycarbonyl group and the p- (p'-methoxy-phenylazo ) -benzyloxy-carbonyl group (MZ).
For example, the benzyl radical is used to protect the hnidazole group (im) of the histidine and the nitro group is used for the amino group in the guanido grouping of the arginine; However, the said amino group of arginine does not necessarily have to be protected during the reaction.
The conversion of a protected NHr or NH group into a free group and the transfer of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process for the preparation of the hexapeptides and intermediates can according to methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents.
Depending on the procedure, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts.
The bases can be obtained from the salts in a manner known per se.
The hexapeptides obtained according to the method can be used in the form of pharmaceutical preparations.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius.
Example 1
N-Trityl-L-tryptophan methyl ester 13 g (0.051 mol) of L-tryptophan methyl ester hydrochloride are placed in a 500 ml round bottom flask in
180 ml abs. Slurried Chioroform, cooled to 0 and treated with 15.7 ml (0.113 mol) of dry triethylamine. Subsequently, 14.3 g (0.051 mol) of tri tyl chloride are introduced into the cooled reaction mixture in portions while shaking. The reaction is allowed to take place for 30 minutes at 0 and 6 hours at room temperature.
The chloroform solution is washed with water, 10% citric acid solution, in sodium bicarbonate solution and finally with water until neutral and dried over sodium sulfate. In a vacuum you evaporate to a small volume, add methanol to avoid excessive foaming and repeat this operation two more times. When the evaporation residue is dissolved in 10 ml of methanol, spontaneous crystallization occurs.
20.9 g (88% of theory) of N trityl tryptophan methyl ester, mp 150-152, are isolated. After crystallizing once from methanol, the substance shows F. 156-157, [α] D = + 45¯ ¯ 1¯ (c = 1.075; methanol).
N-trityl-L-tryptophan
14.8 g (0.033 mol) of N-trityl-L-tryptophan methyl ester are dissolved in 30 ml of propylene glycol in an oil bath at 200-205. 45 ml of a 20% solution of potassium hydroxide in propylene glycol are added to the hot solution; part of the dissolved ester separates out again. After 2 minutes, clear solution occurs again. The saponification is carried out for 6 minutes at a bath temperature of 205, then the hydrolysis product is rapidly cooled and poured into 600 ml of ice water. While stirring and cooling vigorously, the strongly alkaline solution is brought to pH 6 with 10% citric acid solution and the trityl-tryptophan which has separated out is extracted with plenty of chloroform.
By adding more citric acid solution to the separated aqueous phase, the pH is adjusted to 5 and the mixture is extracted two more times with fresh chloroform. The organic phases are washed twice with water, dried over sodium sulfate and evaporated to a small volume in vacuo. Most of the N-trityl-tryptophan is precipitated with high-boiling petroleum ether. After drying in a high vacuum, 14.38 g (98 o of theory) of amorphous product are obtained, which can be used directly for further reaction.
F. 110-120; + 29 'l' (c = 1.397 in methanol).
N-trityl-L-tryptophyl-glycine-p-nitrobenzyl ester
1.84 g (8.75 mmol) of glycine p-nitrobenzyl ester in 10 ml of dry acetonitrile are cooled to 0, and the solution of 2 g (9.7 mmol) of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide in 8 ml of acetonitrile is added and after 5 minutes the cooled solution of 4.3 g (9.6 mmol) of N-trityl-L-tryptophan in 10 ml of acetonitrile is added. The deposition of urea begins immediately and ends after 2 hours. At the same time as the dicyclohexylurea, the trityl dipeptide ester is also deposited as a gelatinous product.
It is allowed to react for 4 hours at 0, then the solvent is completely evaporated off in vacuo and the evaporation residue is triturated with a lot of petroleum ether to remove the unreacted N, N'-dicyclohexylcarbodiimide.
By repeatedly extracting the reaction mixture with ice-cold methylene chloride and methylene chloride / ether, 1.7 g of dicyclohexylurea are separated off.
The methylene chloride extracts are concentrated to a small volume and the trityl dipeptide ester is precipitated with a lot of low-boiling petroleum ether. From 85 ml of 95% methanol, 5.3 g of N-Tri tyl-L-tryptophyl-glycine-o-nitrobenzyl ester crystallize as fine needles. F. 169-170¯; [α] D = - 10¯ ¯ 1¯ (c = 0.95 in methanol).
The mother liquor is evaporated to dryness, the residue is washed neutral in chloroform with ice-cold 10% citric acid, once with ice-cold 1N hydrochloric acid, 1N sodium bicarbonate and finally with water. After evaporation of the dried chloroform phases, 1.3 g of foamy material remain which, crystallized from 95% methanol, gives a further 500 mg of trityl dipeptide ester.
F. 165-167.
The total yield is 4 g (= 74% of theory).
N-carbobenzyloxy-L-tryptophylwglycine benzyl ester
To dissolve 1 g (3 mmol) of carbobenzoxytryptophan in 20 ml of dry ethyl acetate, add a solution of 660 mg (4 mmol) of glycine benzyl ester in 5 ml of ethyl acetate and finally 650 mg (3, 15 mmol) of N. N- Dicyclohexyl carbodiimide. Deposition of dicyclohexyl urea begins after just 15 minutes. The mixture is left to react for 16 hours at room temperature, the urea which has crystallized out is filtered off and 0.1 ml of glacial acetic acid is added to the filtrate.
After standing for 15 minutes, the ethyl acetate solution is washed neutral with 1N hydrochloric acid, water, 1.4% ammonia solution and again with water. The organic phases are concentrated to a small volume, low-boiling petroleum ether is added to the point of weak cloudiness and left at 0. The carbobenzyloxy dipeptide ester is deposited as a gelatinous product. A white microcrystalline powder is obtained by adding more petroleum ether and intensive scratching with frequent warming up in a water bath of 40.
The yield is 950 mg (= 66% of theory) of carbobenzyl-L-tryptophyl-glycine-benzyl ester, mp 117 to 118; [α] 25D = -19¯ ¯ 1¯ (c = 0.950 in methanol). p-; benzyloxy-carbonyl-L-tryptophyluglycine benzyl ester
950 mg (2 mmol) of MZ-tryptophan, manufactured according to patent no. 364 780, are dissolved in 20 ml of abs with gentle heating. Dissolved ethyl acetate, cooled again to room temperature and treated with the solution of 500 mg (3 mmol) of glycine benzyl ester in 5 ml of abs. Ethyl acetate combined. To this are added 500 mg (2.1 mmol) of 1-cyclohexyl-3-morpholinylÏthy-carbodiimide in 2 ml of ethyl acetate and the mixture is left to stand for 16 hours at room temperature.
The ethyl acetate solution is washed neutral in a separating funnel with water, 0.5N hydrochloric acid, sodium bicarbonate and again with water.
The dried ethyl acetate solution is evaporated to a small volume and the MZ-dipeptide ester is precipitated with a lot of petol ether. After drying in a high vacuum, 1.2 g of crude product are obtained, which is still contaminated with starting material.
Single recrystallization from 30 ml of hot acetonitrile gives 610 mg of pure product, mp 152 to 153; Working up the mother liquor yields a further 170 mg of MZ-dipepfidester of the same melting point. The total yield is 770 mg (= 63% of theory). F. 152-153. The ultraviolet spectrum in methanol shows maxima at 240 m // (E = 11,000) and 748 m, u (e = 20,800).
L-tryptophyl-g? ycin-p-nitrobenzyl ester hydrochloride
1.7 g (2.65 mmol) of N-trityl-L-tryptophyl-glycine p-nitrobenzyl ester are dissolved in 10 ml of glacial acetic acid and detitrylated with 1.45 ml of 2N hydrochloric acid for 5 minutes in a 50 ml water bath. The solvent is then evaporated off at 30 in a vacuum and the residue is dried for 2 hours in a high vacuum at 45. The triphenylcarbinol is dissolved from the crystalline HCl salt of the L-tryptophyl-glycine-p-nitrobenzyl ester with a lot of ether.
The yield is 100% of theory = 1.15 g.
F. 150-153.
L-tryptophyl glycine benzyl ester hydrobromide
870 mg (2 mmol) of carbobenzoxy-L-tryptophyl glycine benzyl ester are dissolved in 2 ml of abs. Slurried nitromethane and treated with 2 ml of 4N hydrogen bromide in glacial acetic acid under a nitrogen atmosphere. The solution immediately turns purple. The reaction mixture is allowed to react for 1 hour at room temperature and with exclusion of light, then the excess hydrogen bromide is evaporated at 30 and the hydrobromide of the dipeptide ester is precipitated with a lot of absolute ether. The 6lige decarbobenzoxylation product solidifies immediately when rubbed with fresh absolute ether.
After reprecipitating twice from acetone / ether, 300 mg (= 92% of theory) of a granular, slightly gray-colored product are obtained.
The paper chromatogram (sec. Butanol: 5% veronal sodium: water: isopropanol = 100: 10: 60: 15) shows only 1 ninhydrin-positive spot.
The hydrobromide can be used directly for further processing.
It is good in acetone and ethyl acetate, but only partially soluble in water.
N-Carbobenzyloxy-L-phenylalanine-L-arginine methyl ester carbonate 1. via the mixed anhydride
To a solution of 600 mg (2 mmol) of N-carbobenzoxy-L-phenylalanine in 10 ml of abs. Tetrahydrofuran is added at 10 0.28 ml (2 mmol) of triethylamine and, after 5 minutes, at the same temperature, 0.2 ml (2 mmol) of ethyl chloroformate.
The triethylamine hydrochloride precipitates out immediately as a white precipitate. For complete formation of the mixed anhydride, the mixture is left to react for another 10 minutes at -10 and then the solution of L-arginine methyl ester hydrochloride, also cooled to -10¯, from SSO mg (2.2 mmol) is added Arginine methyl ester dihydrochloride and 0.31 (2.2 mmol) triethylamine, in 6 ml of N, N-dimethylformamide.
Stirring is continued for 15 minutes at -10 and 1 hour at room temperature, the solution is freed from triethylamine hydrochloride (400 mg) and the solvent is evaporated at 50 in vacuo. The evaporation residue is washed in methylene chloride with water and sodium bicarbonate and then water is neutral, the solvent is dried over magnesium sulfate and evaporated to dryness. 810 mg (85%) of crude carbobenzoxydipeptide ester, which is sufficiently pure for decarbobenzoxylation, is isolated.
A sample of the amorphous carbobenzoxydipeptide ester reacted with picric acid gives the picrate in quantitative yield.
The analysis preparation, recrystallized twice from methanol-water, melts at 161-162.
2. Using dicyclohexyl carbodiimide
4.92 g (19 mmol) of L-arginine methyl ester dihydrochloride are dissolved in 100 ml of hot absolute metha nol, cooled to -10 and converted into monohydrochloride with 2.64 ml (19 mmol) of triethylamine. Then add 3.9 g (19 mol31 N, N'-dicyclohexyl-carbodiimide in 15 ml absolute methanol) and finally add 5.2 g (17.1 mmol) N-carbobenzoxy- L-phenylalanine in portions. The carbobenzoxyphenylalanine immediately dissolves and after 5 minutes the crystallization of dicyclohexylurea begins.
The mixture is left to stand at 0 for 16 hours, urea (2.75 g = 71%) is filtered off, the excess of dicyclohexylcarbodiimide is destroyed with a little acetic acid and the methanol is evaporated off in vacuo. The evaporation residue is taken up in methylene chloride, washed neutral with 2N hydrochloric acid, 2N sodium bicarbonate solution and water.
Two reprecipitations from methylene chloride / petroleum ether give 2.47 g (87 S) of amorphous carbobenzoxy dipeptide ester, which is decarbobenzoxylated directly. p- (p-Methoxyphenylazo) -benzyloxy-carbonyl-L-phenyManyl-L-arginine methyl ester hydrochloride
To a solution of 8.66 g (20 mmol) 'MZ-L-phenylalanine (prepared according to patent no.
364 780) in 150 ml of absolute tetrahydrofuran are added at -10 2.8 ml (20 mmol) of triethylamine and after 10 minutes at the same temperature 2.0 ml (20 mmol) of ethyl chloroformate. After a further 15 minutes, the cooled solution of L-arginine methyl ester hydrochloride, prepared from 5.8 g (22 mmol) of arginine methyl ester dihydrochloride and 3.06 ml (22 mmol) of triethylamine in 30 ml of dimethylformamide, is added. It is allowed to react for 30 minutes at -10 and 1 hour at room temperature, the triethylamine hydrochloride is filtered off (5.2 g) and the solvent is evaporated off at 50 in a vacuum.
A lot of ether is added to the residue, decanted off, the oily product is dried in a vacuum and rubbed with a lot of water. The raw MZ connection solidifies. The aqueous phase is centrifuged off, the residue is kneaded twice with 50 ml of fresh water each time and dried lyophilically. The raw hive is 11.7 g.
The above 11.7 g, dissolved in 70 ml of 95% strength ethanol, are placed on a 23 cm long aluminum oxide column (° 5 cm) and eluted with a large amount of 95% strength alcohol. In addition to a small preliminary fraction (110 mg), 5.05 g of MZ dipeptide ester hydrochloride crystallize out of the alcoholic solution. F. 185-186.
A further 3.36 g of pure substance are obtained from the mother liquor. F. 184-185. The total yield is 8.41 g (66% of theory).
The sulfate F. 145-146 can be obtained in quantitative yield by adding sulfuric acid diluted 1: 1 to an alcoholic solution of MZ-L-phenylalanyl-L-argnine methyl ester hydrochloride.
L-phenylalanyl-L-arginine methyl ester hydrobromide, hydrochloride
2.5 g (3.9 mmol) of MZ-L-phenylalanyl-L-arginine methyl ester hydrochloride are dissolved in 6 ml of nitromethane, 6 ml of 4N hydrogen bromide (24 mmol) in glacial acetic acid are added and left at room temperature for 90 minutes. Towards the end of the reaction time the p- (p'-methoxyphenylazo) crystallizes; benzyl bromide from the reaction solution in gorgeous red plates. Hydrogen bromide and most of the solvent are evaporated off in vacuo and the residue is triturated three times with absolute ether. The crude decarbobenzoxylation product is then distributed between a large amount of chloroform and water.
The water and chloroform phases are each extracted once more with fresh solvent, the aqueous extracts are combined and evaporated to dryness in a vacuum at 40 °.
The hydrobromide, hydrochloride of the phenylalanyl-arginine methyl ester accumulates as a slightly reddish colored amorphous product which is used directly for further condensation.
The yield is 1.4 g (= 80% of theory).
The carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginine methyl ester carbonate (Example 8), decarbobenzoxylated under the same conditions, gives a dihydrobromide which, according to paper chromatography, is identical to the hydrochloride described above, hydrobromide.
Na-carbobenzyloxy-N (im) -benzyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginine methyl ester carbonate
To 5.32 g (0.014 mol) Na-carbobenzoxy-N (im) benzyl; L-histidine in 110 ml of dimethylformamide is added at 15 to the solution of 3.02 g (0.0147 mol) of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide in 5 ml of dimethylformamide.
At the same time, 7.7 g (0.0154 mol) of L-phenylalanyl-L-arginine methyl ester dihydrobromide in 20 ml of dimethylformamide with 2.15 ml (0.0154 mol) of triethylamine are converted into the monohydrobromide, cooled to 0 and Carbobenzoxy-N (im) -benzyl L-histidine solution given.
After 20 hours of standing, the dicyclohexylbarnstoff (2.27 g = 74%} is filtered off, 0.6 ml of glacial acetic acid is added to the filtrate and, after 15 minutes, the solvent is evaporated to a small volume, again freed from the crystallized salt and then completely evaporated to dryness The amorphous residue is treated with a lot of ether and then dried at 50 for 4 hours.
The powdery crude product is triturated three times with 40 ml each and once with 30 ml of 0.5N ammonium hydroxide in the cold, the supernatant liquid is centrifuged off thoroughly and taken up in 100 ml of butanol / chloroform 1: 1. With twice 20 ml of 2N hydrochloric acid, the mixture is acidified to the Congo and then washed first with 2N sodium bicarbonate and then with water until neutral.
The dried extraction solutions are evaporated to dryness in vacuo, the evaporation residue is dissolved in 135 ml of 0.25N hydrochloric acid, filtered and adjusted to pH 7-8 with 2N sodium bicarbonate while cooling with ice.
The precipitated carbobenzoxy tripeptide ester is taken up again in a butanol / chloroform 1: 1 mixture, washed neutral with water, dried over sodium sulfate and the butanol / chloroform mixture is evaporated to a small volume. Reprecipitation twice from chloroform petroleum ether yields 7.16 g (70% of theory) of Nα -carbobenzoxy-N (im) -benzyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginine / methyl ester carbonate.
After two recrystallizations from 50% methanol, the analysis preparation shows the F. 13j1 to 135¯. [α] 25D = -13¯ ¯ 1¯ (c = 0.7822 in methanol).
Nu-carbobenzyloxy-N (im) -benzyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginine
6, 52 g (8, 9 mmol) of carbobenzoxy-N (im) -benzyl I, -histi, dyl-L-phenylalanyl-L-arginine methyl ester carbonate in 50 ml of methanol are mixed with 19.5 ml of sodium hydroxide solution for 1 Saponified at room temperature for an hour. The pH is adjusted to 6 with 1N hydrochloric acid and 300 ml of water are added to the saponification product.
After standing for one hour at 0, the carbobenzoxy tripeptide is filtered off and the still moist product is recrystallized from 50% methanol. Yield: 4.27 g (70%), m.p. 136-139. M = -10.5 0.9 (c = 1.062 in methanol).
The microanalysis shows that the carbobenzoxy tripeptide crystallizes with 1 mol of water.
Na-carbobenzyloxy-N (im) -benzyl = L-histidyll-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine-p nitrobenzyl ester carbonate
4.2 g (6 mMa1) carbobenzoxy-N (im) -benzyl-L histidyl-Lphenylalanyl-L-arginine and 2.87 g (6.6 mmol) L-tryptophyl-glycine-p-nitrobenzyl ester hydrochloride ( See Example 6) is dissolved in 20 ml of freshly distilled N, N-dimethylformamide and mixed with a solution of 1.35 g (6 mmol) of N, N'-dicyclohexyScarbodiimide in 7 ml of dimethylformamide while cooling with ice. The reaction mixture is left to stand for 24 hours at room temperature, the dicyclohexylurea is filtered off (890 mg = 67%) and the solvent is evaporated off in vacuo.
8.3 g of crude product are obtained, which is still contaminated with dicyclohexyl urea.
6.3 g of crude product are distributed between 500 ml of ethyl acetate and 50 ml of sodium bicarbonate solution, the ethyl acetate bases are washed with water, five times with 10 ml of 10% acetic acid solution each time, then repeatedly washed with 1N and 2N sodium bicarbonate and finally with water until neutral.
When the dried ethyl acetate solution is evaporated, part of the product crystallizes out of the solvent. By adding low-boiling petroleum ether, the carbobenzoxypentapeptide ester is completely precipitated. The yield is 4.6 g.
For further purification, 3.5 g of 100 g of activity III aluminum oxide are chromatographed.
2.78 g of carbobenzoxy pentapeptide ester are again eluted with methanol and used directly for the decarbobenzoxylation.
N (im) -benzyl-L-histidyl; L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypophylLglyci, n-p-nitrobenzyl ester trihydrobromide
1.75 g (1.67 mmol) of carbobenzoxy-N (im) benzyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine-p-nitrobenzyl ester carbonate are kept with 5 ml of 2N hydrogen bromide in glacial acetic acid Decarbobenzoxylated for 1 hour at room temperature. The excess hydrogen bromide is suctioned off in vacuo at room temperature and the residue is repeatedly triturated with plenty of absolute ether.
The crude decarbobenzoxylation product is subjected to a multiplicative distribution according to Craig over 85 stages with 0.3N ammonium acetate (pH 7.1) as the lower phase and n-butane as the upper phase. The majority of the substance is distributed in elements 73 to 85. The fractions mentioned are combined, separated from the lower phase, the latter extracted again with fresh butanol and the combined butanol extracts evaporated to a small volume in vacuo and the free pentapeptide ester precipitated with plenty of petroleum ether. After further refilling from chloroform-petroleum ether, 1.2 g of N (im) -benzyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl L-tryptophylLgly-p-nitrobenzyl ester are obtained.
N-Ca, rbobenzyloxy-y-benzyl-L-glutamyl-N (im) -benzyl-L-hystidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine-p-nitrobenzyl ester carbonate
To a solution of 370 mg (1 mmol) of N-carbobenzoxy-L-glutamic acid γ-benzyl ester in 10 ml of abs.
Dioxane is added at 10-11 (some of the dioxane is always frozen) 0.26 ml (1.1 mmol) of tributylamine and after 10 minutes at the same temperature 0.11 ml (1.1 mmol) of ethyl chloroformate.
For complete formation of the mixed anhydride, the mixture is left to react for a further 20 minutes at the stated temperature and then 820 g of N (im) benzyl pentapeptide nitrobenzyl ester in a mixture of acetonitrile-dioxane (10 ml) are added. After standing for 30 minutes in an ice bath and 60 minutes at room temperature, the mixture is evaporated to dryness, the residue is taken up in chloroform and washed neutral with ice-cold 1N hydrochloric acid, 1N sodium bicarbonate solution and finally with water. The dried chloroform is evaporated in vacuo and the carbobenzoxy-heptapeptide ester (1 g = 90%), which is still contaminated with the starting material, is reprecipitated with petroleum ether.
200 mg of crude product are in abs. Chloroform drawn up on an alumina column activity III. The majority (160 mg) can be eluted again with methanol. These are about 3 according to Craig! 0 levels between 80% methanol and chloroform / carbon tetrachloride 1: 1 multiplicatively distributed. G = 4.65.
The bulk of the substance is distributed in elements 19-30.
These fractions are combined, the solvent mixture is evaporated and the evaporation residue is reacted further.
L-glutamyl-L-histidyl, L-phenylalanyl-L-arginyl-
L-tryptophyl-glycine 1. 350 mg (0.37 mmol) of carbobenzoxy-hexapeptide ester purified by aluminum oxide are decarbobenzoxylated with 1.1 ml of 2N hydrogen bromide in glacial acetic acid for 1 hour at room temperature.
The excess hydrogen bromide is evaporated off in vacuo and the trihydrobromide is precipitated with a great deal of absolute ether. Repeated rubbing with fresh ether results in a granular, slightly gray colored powder.
Yield: 550 mg of crude hexapeptide ester tri-hydrobromide.
This product is distributed between 0.3N ammonium acetate (pH 7.5) and n-butanol over 30 stages, the fractions 25-30 are combined and the lower phases are extracted once more with fresh butanol. After the butanol has evaporated, 280 mg of γ-benzyl-L-glutamyl-N (im) -benzyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-arginyl-L-tryptophyl-glycine-nitrobenzyl ester are obtained.
This product is hydrogenated in 90% acetic acid with a 10% palladium-carbon catalyst.
After 17/2 hours, the hydrogenation comes to a standstill after 21 ml of hydrogen have been absorbed. The solution is freed from the catalyst and evaporated to dryness at 40 °. The evaporation residue is taken up in a little 95% alcohol and the hydrogenated product is precipitated with a lot of ether.
Yield: 190 mg.
Unhydrogenated compounds can still be found on the paper chromatogram.
The 190 mg Glu- (im) -Bz-His-Phe-Arg-Try-Gly are added to 50 ml of dry, freshly condensed ammonia. While stirring well with a magnetic stirrer, small, shiny bits of sodium are slowly added to the suspension. A clear solution is only achieved by adding sodium. After adding 2.25 mmol of sodium, the solution remains dark blue for a long time.
3 g of Dowex-50 in the ammonium form are introduced into the reaction solution in small portions, with immediate discoloration taking place. The ammonia is evaporated off at room temperature with vigorous stirring and with exclusion of moisture.
The last phase, ammonia, is evaporated over sulfuric acid in a high vacuum.
The Dowexp is extracted four times with 10 ml of water, the colorless aqueous solution (pH 9) is acidified with 0.5 ml of glacial acetic acid and evaporated to dryness.
The residue is repeatedly evaporated with abs.
Ethanol, dissolve it in 5 ml water, filter off the impurities and evaporate again to dryness.
The hexapeptide is abs with 10 ml. Triturated alcohol, centrifuged off the mother liquor and dried in a high vacuum.
44 mg of hexapeptide are obtained as a white powder.
It shows MSH activity in animal experiments.
2. 124 mg (0.1 mmol) of N-carbobenzoxy-γ-benzyl-L-glutamyl-N (im) -benzyl-L-histidyl-L-phenylalanyl L-arginyl-L-tryptophyl-glycine-nitrobenzyl ester are added to 30 ml of liquid ammonia were split directly with 1.2 mmol of sodium. After the analogous work-up, as described above, 25 mg of hexapeptide are obtained which, according to paper chromatography, is identical to the product of the 1st experiment.
Example 2 L-phenylalanyl-nitro-L-arginine methyl ester
25.14 g (0.049 mol) carbobenzoxy-L-phenylalanyl-nitro-L-arginine methyl ester [cf. K. Hofmann et al. J. A. C. S. Volume 78, 240 (1956)] are dissolved in 50 ml of glacial acetic acid with gentle heating and decarbobenzoxylated with 50 ml of 4N hydrogen bromide in glacial acetic acid for 90 minutes at room temperature.
The reaction solution is evaporated to a small volume at 40 in a vacuum and the syrupy residue is added to 1 l of abs with vigorous stirring.
Ether. After stirring for 15 minutes, the flaky precipitate is allowed to settle and the residue is dried at 40 in vacuo over phosphorus pentoxide.
The crude hydrobromide is taken up in 40 ml of ice-cold water, the solution, cooled with ice, is made of phenolphthalemalkaline with 2N soda solution and extracted first three times with 100 ml of ether each time - to remove the impurities - and then with 200 ml, 100 ml each time and 50 ml of a mixture of n-butanol / chloroform 1: 9. The chloroform-butanol extracts are washed twice with 10 ml of 1/2 saturated sodium chloride solution each time and finally dried with magnesium sulfate. The chloroform and some of the butanol are evaporated in vacuo at 40-45¯ and the free dipeptide ester is then precipitated with a lot of ether.
It is filtered through a fine glass suction filter, washed with a lot of ether and the residue is dried in a high vacuum at 40.
The yield is 16 g of amorphous L-phenyl alanine-nitro-L-arginine methyl ester; this is 71% of theory.
The dipeptide ester shows in the 3 following systems: 43: t-amyql alcohol: isopropanol: water = 100: 40: 55; 54: sec. Butanol: isopropanol: monochloroacetic acid: water = 70: 10: 3 g: 40; 56: sec. Butanol: isopropanol: 5% veronal
Sodium: water = 100: 15: 10: 60 only one ninhydrin positive spot.
The amorphous product is used directly for the further reaction without additional purification.
Na, N (im) -Dicarbobenzyloxy-L-histidyl-L-phenyl'alanylLnitro-L-arginine methyl ester 16 g (0.042 mol) L-phenyWalanyl-nitro-L-arginine methyl ester in 50 ml acetonitrile are 10 cooled and combined with dea-likewise precooled solution of 19.2 g of dicarbobenzoxy-L-histidine (0.042 mol) in 140 ml of acetonitrile, some of the dissolved substances again separating out. After adding 10 ml of dimethylformamide and shaking it vigorously, the solution is clear again.
The pre-cooled solution of 9.7 g of dicyclohexylcarbodiimide (0.047 mol) is then applied. in 45 ml of acetonitrile and lets react at 0 to +3. After a short time, dicyclohexylurea begins to separate out in addition to the dicarbobenzoxy-dieptide ester. The reaction mixture is diluted 9: 1 with 100 ml of acetonitrile / dimethylformamide and left to stand at 0 overnight. The compact, gelatinous, partly crystalline cake is rubbed well with a further 100 ml of acetonitrile, filtered through a G-2 glass frit and washed well again with two 50 ml of acetonitrile.
0.5 ml of glacial acetic acid is added to the mother liquor, left to react for 15 minutes and then evaporated to dryness. Little of the product contaminated with the starting material remains as a residue and has not been worked up further.
The moist suction filter residue is extracted with a total of 60 ml of dimethylformamide and in this way 9.3 g of insoluble dicyclohexythamea (= 98% of theory) is separated. F. 226-228 from.
The dimethylformamide solution is evaporated to dryness at 40 in a high vacuum and 26.7 g of crude material are obtained.
After recrystallization once from 100 ml of methanol, 23.1 g (= 70% of theory) of dicarbobenzoxy tripeptide ester are obtained.
The analysis preparation crystallizes with 1 mol of crystal methanol, mp 125-128¯. [α] 26D = -19¯ ¯ 15¯ (c = 0.9787 in methanol). The dicarbobenzoxy compounds are extremely sensitive to bases.
L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginine W methyl ester diacetate
16.5 g (20 mmol) of dicarbobenzyloxy-L-histidyl-Ir phenylalanyl-nitro-L-arginine methyl ester are dissolved in 300 ml of abs. Methanol was hydrogenated to saturation with the addition of 4.4 equivalents of methanolic hydrochloric acid and in the presence of 4 g of 10% PaiHadiumkoMe catalyst. The carbon dioxide formed is adsorbed in a second intermediate hydrogen duck with potassium hydroxide. After 10 hours, 2515 ml of the calculated 2700 ml of hydrogen are absorbed, and the hydrogenation is complete.
The solution freed from the catalyst is evaporated at 40 in a vacuum, the residue is dissolved in 20 ml of water and the solution is slowly passed through an ion exchange column of 120 ml? Amberlite IR4-B? (Acetate form) run. Wash with water until the eluates no longer react positively to ninhydrin. It is washed with a total of 360 ml of water.
The aqueous solution is evaporated to dryness at 40 in a vacuum and the well-dried residue with abs. ¯ther precipitated from the Methandl 'solution. The yield is 13.1 g of amorphous tripeptide ester diacetate.
Paper chromatography shows the tripeptide ester in the 2 systems 56 (see p. 6) and sec. Butanol: isopropanol: triethylamine: veronal: water = 100: 10: 0, 8: 1, 8 g: 60 only one ninhydrin-, pauly- and sagaguchi-positive stain. The amorphous product is processed further directly.
N-carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginwin, methyl ester
13.1 g (22 mmol) of L-histidyl-L-phenylalanylLL-arginine methyl ester diacetate are cooled to 10 in 60 ml of dimethylformamide and 6.1 g of carbobenzoxy-L-glutamine azide (20 mmol) are added in portions. The azide immediately goes into solution. The reaction mixture is left to react for 2 days at 0 and the crude tetrapeptide ester is then precipitated with 1 liter of ethyl acetate. The gelatinous precipitate is filtered off and washed with plenty of ethyl acetate and ether.
Single recrystallization from methanol / ethyl acetate yields 11.3 g of carbobenzoxy tetrapeptide methyl ester, pure according to paper chromatography, mp 162-165 (sintering at 155).
After another crystallization of the same solvent mixture, the analysis preparation shows F. 167-169¯.
The partition coefficient for the system 80% methanol: (chloroform: tetrachloride. = 1: 1) = 1: 1 is 5.9; [a] D = -18, 41.6, c = 0.979 in glacial acetic acid. The Rf values in the 3 systems 54, 56 (see p. 6) and methyl ethyl ketone: pyridine: water = 60: 15: 25 are 0.59 and 0.82 or
0.85.
N-carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylÏlanyl-L-arginine 2-, 5 g (3.1 mmol) of carbobenzoxy-tetrapeptide ester are dissolved in 80 with jaithandL water 3: 5 with warming and at room temperature with 6, 5 ml of 1N sodium hydroxide solution were added. After 10 minutes the solution becomes cloudy and gelatinous substance begins to separate out. The pH is 11.5 during the 60-minute polymerization. The solution is neutralized with 6.5 ml of 1N hydrochloric acid and evaporated to dryness at 40.
The gelatinous residue is taken up in 50 ml of hot water, filtered through cotton wool, the solution is concentrated to a volume of 20 ml and left to stand at 0¯ for 16 hours.
The gelatinous precipitate is carefully filtered through a G-2 glass frit, washed with a little ice-cold water and dried over phosphorus pentoxide in vacuo.
The yield is 1.65 g = 75% of theory, F. 167-169 (sintering at 165¯).
The analytical preparation, recrystallized from water, shows, after drying in a high vacuum and subsequent standing in the air, the content of 4 water of crystallization, mp 159-160.
The distribution coefficient for the n-butane AcOH system is 1: 1, is 0.16. [Α] 26D = - 33.6¯ 1, 3 (c = 0.923 in In n hydrochloric acid).
A sample of the pure carbobenzoxy tetrapeptide ester decarbobenzoxylated with 2N hydrogen bromide in glacial acetic acid can be split into the 4 amino acids with leucine aminopeptidase under the standard conditions.
N-carbobenzyloxy-L-glutaminyl1-L-histidyl-L-phenylalanyI-L-arginyl-Ltryptophyl-glycine-nitrobenzyl ester
2.0 g (2.5 mmol) of carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginine. 4Hz0 are dissolved in 45 ml of dimethylformamide with heating, cooled again to room temperature and treated with 1.93 g (4.5 mmol) of L-tryptophylglycine nitrobenzyl ester (cf.
Example 1) offset. The mixture is stirred with a magnetic stirrer for 50 minutes; this removes most of the suspension. The mixture is then cooled to 0 in an ice bath, the precooled solution of 620 mg of dicycalhexylcarbodiimide (13 mmol) in 5 ml of dimethylformamide is added and allowed to react at 0 for 3 days.
The reaction solution is freed from urea (370 mg = 66.0), 3 drops of glacial acetic acid are added and the dimethylformamide is evaporated to a small volume in a high vacuum. The crude reaction product is precipitated with a lot of ethyl acetate, filtered and dried in a high vacuum over phosphorus pentoxide.
The crude yield is 3.1 g. To separate off the exhaust substances, the crude product is divided between n-butanol and 1% acetic acid over 30 stages.
Fractions 0-8 (730 mg) are mainly carbobenzoxy-tetrapeptide, while elements 10-26 contain L-tryptophyl-glycine-nitrobenzyl ester in addition to the carbobenzoxy-hexapeptide nitrobenzyl ester.
For further purification, fractions 10-26 are again distributed between n-butanol and 1% acetic acid over 40 stages and fractions 16-19, 20-23, 24-27 and 28-31 are combined. Fractions 12-15 still contain little carbobenzoxy tetrapeptide, while the others only show carbobenzoxy hexapeptide nitrobenzyl ester in the paper chromatogram.
The yield of the combined fractions is 1.4 g (50% of theory).
The distribution coefficient of the analytically pure compound is l. [α] 25D = -27.3¯ ¯ 1.4¯ (c = 1.064 in dimethylformamide).
N-carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester. hydrochloride a) from Cbo-GluА (NH2) -His-Phe-ArgАOH + H-Try
Gly-OCH3-HCl
5 g (6.25 mmol) of carbobenzoxy tetrapeptide are dissolved in a mixture of 70 ml of dimethylformamide and 15 ml of diethyl phosphate with heating; the solution is cooled back down to room temperature and 3, 7 g (12 mmol) of L-tryphyl glycine methyl ester hydrochloride are added (cf.
Example 1). The mixture is then stirred for 3 hours at room temperature and left to stand at 0c overnight. 1.85 g (9 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide in 10 ml of dimethylformamide are added to the cooled solution and left to react for 77 hours at 0 and 6 hours at room temperature.
The urea which has separated out is filtered off (780 mg = 56%), 0.1 ml of glacial acetic acid is added to the filtrate, the dimethylformamide is evaporated to a few ml and precipitated with a large amount of ethyl acetate. After filtering and drying in a high vacuum, 8.3 g of a mixture of carbobenzoxy-hexapeptide ester and starting material are obtained.
The entire crude product is mixed with n-butanol and 1% acetic acid in a Craig apparatus
100 ml phase volume distributed.
Fractions 11-35 are positive for Pauly's reagent and 15-35 are positive for Ehrlich's reaction. Elements 11-14 and 15--16 mainly contain carbobenzoxy tetrapeptide in addition to a small amount of carbobenzoxy hexapeptide ester, while fractions 19-35 contain pure, protected hexapeptide ester.
The phases of fractions 19-35 are combined, evaporated to dryness and precipitated once from dimethylformamide / ethyl acetate.
The yield of the amorphous carbobenzoxy-hexapeptide ester hydrochloride, which is uniform according to paper chromatography, is 3.8 g. [α] 25D-16.4¯ ¯ 0.3¯ (c = 0.793 in pyridine}. b) from Cbo-Glu- (NH2) -His-OH + H-Phe-Arg-Try Gly-OCHs -HOL
680 mg (0.05 mmol) L-phenylalanyl-L-arginyi-L-tryptophyl-glycine-methyl ester-dihydrochloride, which still contains ammonium chloride from the catalytic hydrogenation of the Cbo-tetrapeptide ester, is dissolved in 4.5 ml dimethylformamide , cools in an ice bath and adds 0.139 ml of triethylamine (1 mmol).
The deposition of triethylamine hydrochloride begins after 20 minutes. The reaction mixture is allowed to react for 50 minutes, the salt which has separated out is then filtered off and the solution, cooled to 0, of 630 mg (1.5 mmol) of carbobenzoxy-L-gl'utaminyl'-L-histidine (cf. Example 1) is added to FIG , 5 ml of dimethylformamide to it. After a further 30 minutes, the dicyclohexylcarbodiimide is added (3–10 mg in 1 ml of dimethylformamide = 1.5 mmol). After standing for 3 days at + 3, the urea is filtered off (260 mg) and then precipitated with a large amount of ethyl acetate.
1.1 g of product still impure with the starting material is obtained. To remove the starting materials, the crude product is treated once with 5 mT, four times with 2 ml of 1N hydrochloric acid and finally twice with 2 ml of water. The product, dried over phosphorus pentoxide, weighs 600 mg = 60% of theory.
The carbobenzoxy-hexapeptide ester is obtained as amorphous dihydrochloride and is slightly pink in color. [a] 25 = -12.5 ¯ 1.7¯ (c = 0.961 in pyridine).
In systems 43, 54 and 56 (see p. 26) the connection shows only one pauly and honestly positive spot and the same Rf values as the product described under a. In this case a distribution according to Craig is not necessary. The protected hexapeptide ester can be saponified directly with sodium hydroxide solution.
N-carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanylLL-arginyl-L-tryptophyl-glycine. acetate 450 mg (0.39 mmol3 carbobenzoxy-hexapeptide nitrobenzyl ester are dissolved in 10 ml 50% dioxane and saponified with 1/2N sodium hydroxide solution for 45 minutes. The sodium hydroxide solution is added in portions so that the pH of the solution is always between 10, 5 and 11. After the addition of the first 3 ml of sodium hydroxide solution, the deposition of gale substance begins. To dilute the solution, another 10 ml of 50% dioxane are added. A total of 7 ml of 1 / 2N caustic soda consumed.
Finally, it is diluted with water, neutralized with In n hydrochloric acid and the solution is adjusted to pH 5.5 with a drop of glacial acetic acid.
The gelatinous product is filtered off, washed with ice-cold water and the filter residue is dried in vacuo over potassium hydroxide and phosphorus pentoxide. The dry product weighs 200 mg, F. (199) 203-205.
Another 150 mg carbobenzoxy-hexapeptide can be isolated from the mother liquor, F. 155 to 163.
In contrast to the fraction with a melting point of 203-205, this fraction is only partially present as acetate, which is clearly evident from the acetyl determinations.
In the paper chromatogram, the two fractions in all 3 systems 43, 54 and 56 show the same Rf values
System 43 Rf = 0.45
System 54 Rf = 0.55
System 56 Rf = 0.62
The distribution coefficients G in the system sec. Butanol: 1% acetic acid 1: 1 are also identical for both fractions. [a] 25D = -15, 9 +1, 1, c = 0.944 in glacial acetic acid.
The product can be converted into the free hexapeptide in the usual way by decarbobenzoxylation, e.g. B. by means of hydrogen bromide in glacial acetic acid (see. Example 1) or by hydrogenation in the presence of 10% palladium-carbon catalyst.
Example 3
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidine methyl ester a) With dicyclohexyl-carbodiimide
15.1 g (0.054 mol) of carbobenzoxy-L-glutamine are dissolved in a mixture of 18 ml of dimethylformamide and 81 ml of acetonitrile, cooled to 0 and mixed with the likewise pre-cooled solution of 9.81 g of L-histide methyl ester (0.058 mol) in 9 ml of dimethylformamide and 36 ml of acetonitrile were added. Part of the dissolved substance is then deposited again.
By adding another 20 yn; l dimethylformamide a clear solution is again obtained. 12.2 g (0.059 mol) of dicydohexylcarbodiimide in 13 ml of dimethylformamide are added and the mixture is left to react at 0 overnight. The carbobenzoxydipeptide ester is deposited as a gelatinous precipitate alongside the urea. The gelatinous partly crystalline deposit is filtered off, washed well with acetonitrile and dried in a high vacuum.
The mixture of carbobenzoxy dipeptide ester and dicyclohexyl urea is suspended in 35 ml of 2N hydrochloric acid, insoluble urea is suctioned off and washed with 11 ml of 2N hydrochloric acid. The hydrochloric acid solution is neutralized with the calculated amount in sodium hydroxide solution; the carbobenzoxydipeptide ester separates out as a thick jelly, so that it has to be diluted with another 150 ml of water. The gelatinous product is kneaded well with the mother liquor and filtered through a G-2 glass frit.
For complete neutralization, the filter residue is combined again with the alkaline mother liquor and again kneaded thoroughly (pH of the mother liquor = 8). After drying, 14.5 g of protected dipeptide ester (63% of theory) F. 167-169¯ are obtained.
The analysis fraction recrystallized from water shows F. 171-174; [a] 24D = -32.4¯ ¯ 0.6 (c = 1.17 in In hydrochloric acid).
A further 2.4 g of carbobenzoxy dipeptide ester with a melting point of 158, pure by paper chromatography, can be obtained from the mother liquor. In contrast, the halogen test is positive for this fraction. b) with N, N'-diimidazoleWcarbonyl
140 ml (0.5 mmol) of carbobenzoxy-L-glutamine (drunk over phosphorus pentoxide) are dissolved in 1.5 ml of freshly distilled dimethylformamide and 97 ml (0.6 mmol) of diimidazole carbonyl are added under exclusion of moisture. As soon as the development of carbon dioxide has ceased, the solution of 85 ml of histidine methyl ester (0.5 mmol) in 1 ml of dimethylformamide is added and allowed to react at 0 overnight.
The protected dipeptide ester is precipitated with a lot of ether. After drying, the yield is 190 mg (= 88% of theory) of carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-histidine methyl ester. F. 17-0-173, 'with decomposition; M = -32.2 1, 1 (c = 1.025 in In hydrochloric acid).
N-carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidine
5.9 g of carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-histidine methyl ester are dissolved in a mixture of 42 ml of methanol and 28 ml of water while warming, cooled again to room temperature and mixed with 35.5 ml of 0.45N barium hydroxide solution. After 5 minutes the barium salt begins to separate out as a thick white precipitate. It is diluted with a further 140 ml of water, stirred with a magnetic stirrer and left to saponify for a total of 45 minutes. With the calculated amount of sulfuric acid (15 ml) the solution is rendered neutral, the barium sulfate is filtered off and the solution is evaporated to dryness.
The gaseous residue is taken up in a little dimethylformamide, the solution is filtered again through a G-4 glass frit and the carbobenzoxy dipeptide is then precipitated with a large amount of ethyl acetate.
After drying in a high vacuum, 5.72 g of amorphous carbobenzoxy dipeptide, pure paper chromatography, are obtained.
Crystallization from methanol gives 5.1 g of carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-histidine, mp 196-197.
The distribution coefficient in the 80% methanol system: (chloroform: carbon tetrachloride = 1: 1) = 1: 1 is 4, 6. p - (? - methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl-L-glutamine (MZ-L-glutamine)
11.7 g (51 mmol) of L-glutamine hydrobromide (obtained by decarbobenzoxylation of the corresponding carbobenzoxy compound) are dissolved in 75 ml of water, then diluted with 200 ml of acetone and 5 g of magnesium oxide (20% excess) are added.
Then 17 g of p- (p'-methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl chloride (56 mmol) are added in small portions over the course of 1 hour, diluted with 200 ml of water and stirred for a further 90 minutes at room temperature. The reaction mixture is rendered Congo acidic with 2N hydrochloric acid, left to stand at room temperature for 2 hours, the residue ready for use is centrifuged off and dried at 50 ° in vacuo.
The crude product crystallized from 500 ml of 95% methanol shows the F. 183-184¯. The yield is 13.48 g.
A further 2.56 g F. 183-184¯ can be isolated from the mother liquor.
The overall yield is accordingly 16.04 g, which corresponds to 76.3% of theory.
The ultraviolet spectrum shows Amax 237 m u (? = 13 100) and 349 my (e = 2600). p- (p'-methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl-
L-glutaminyl-L-histidine methyl ester
2.86 g of MZL-glutamine (6.8 mmol) are dissolved in 10 ml of dimethylformamide and the solution of 1.3 g of L-histidine methyl ester (7.8 mmol) in 15 ml of dimethylformamide is added. The combined solutions are cooled to 0, and 1.6 g (7.8 mmol) of dicydiohexylcarbodiimide in 3 ml of dimethylformamide are added.
The mixture is left to react overnight at 0, the urea is filtered off, the unreacted carbodiimide is treated with 3 drops of glacial acetic acid and the dimethylformamide is evaporated to dryness in vacuo. The residue is triturated with a lot of ethyl acetate and left to stand for 2 days at 0, filtered and the orange-red product is dried at 40 ° in a vacuum.
The yield is 2.8 g of crude product.
For cleaning, 2.5 g of crude product are dissolved in 10 ml of sec-butanol saturated with water and filtered through an aluminum oxide column.
2.3 g of pure MZ dipeptide ester can be eluted, while the unreacted MZ-L-glutamine is retained as an orange-red zone at the beginning of the aluminum oxide column.
From 90% ethanol, the preparation melts at 167-169.
The ultraviolet spectrum shows: max x237 mÁ (? = 12 700), 340 mlt 21200) and Am. ,, 435 mu (? = 2000). p - (? - methoxyphenylazo) -benzyloxy-carbonyl
L-glutaminyl-L-histidine
1.13 g (2 mmol) of MZ dipeptide ester are dissolved in 30 ml of 75% dioxane and saponified with 2.4 ml of 1N sodium hydroxide solution; after 10 minutes, it is diluted with 10 ml of water. After 60 minutes, 30 ml of 10% acetic acid are added while cooling, and the solvent is evaporated off in vacuo. The gelatinous residue is dried sharply at 50 and scratched with 100 ml of water.
The mother liquor is separated off by centrifugation, washed thoroughly with water and then the residue is dried lyophilically. The yield is 750 mg (68%). To remove adhering impurities, the MZ dipeptide is washed with 50% methanol and finally with plenty of ether. There remain 670 mg, F. 207-208.
After a single crystallization from 75% dioxane, the analysis preparation melts at 214-215.
N-carbobenzyloxy-L-phenylalanyl-nitro-L arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester
8 g (0.016 mol 3 carbobenzoxy-L-phenylalanyl-nitro-L-arginine [cf. K. Hofmann et al. J. A. C. S.
Volume 78, 240, (1956)] are dissolved in a mixture of 8 ml of dimethylformamide and 45 ml of acetonitrile with heating, then cooled to 0 and mixed with the pre-cooled solution of 5.71 g (0.02 mol) of L-tryptophyl -glycine methyl ester in 4.5 ml of dimethylformamide and 18 ml of acetonitrile. It is diluted with 45 ml of acetonitrile and stirred for a further 15 minutes. At 0, 4.1 g (0.02 mol) of dicyclohexylcarbodiimide were added to 9 ml of acetonitrile and left to stand at this temperature for 24 hours. The separated urea (3.22 g) is filtered off, 0.5 ml of glacial acetic acid is added to the solution and, after standing for 15 minutes, it is evaporated to dryness.
The oily residue is dissolved in ethyl acetate, the urea which has separated off is filtered off and the organic phases are washed three times with 1N hydrochloric acid, twice with water, then three times with 1N sodium bicarbonate and finally with water until neutral.
When washing with bicarbonate, 1.45 g of gelatinous material separate. The melting point is identical to the carbobenzoxy tetrapeptide ester.
The ethyl acetate phases are dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. After recrystallizing once from a lot of ethyl acetate, 7.97 g of protected tetrapeptide ester, mp 126-130, are obtained.
The total yield is 9.42 g = 78% of theory.
The analysis preparation melts after a further crystallization from ethyl acetate at 126-130.
[a] 28¯D = -18.5¯ ¯ 0.5, c = 1.336 in methanol.
The partition coefficient G in the system is 80% methanol. (Chloroform: carbon tetrachloride = 1: 1) = 1: 1, is 1, 2.
The same substance crystallized from different solvents shows different melting points, e.g. B. from methanol m.p. 136-140.
L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester dihydrochloride
7 g (9.2 mmol) of carbobenzoxy tetrapeptide ester according to Example 1 are dissolved in 180 ml of ethanol with the addition of 5 aq. methanolic hydrochloric acid and hydrogenated to saturation in the presence of 2 g of 10% palladium-carbon catalyst. The formed carbon dioxide is adsorbed in a second hydrogen duck with potassium hydroxide solution. The uptake of hydrogen has ended after 12 hours. A total of 997 ml of hydrogen is consumed (theory: 1035 ml). The catalyst is filtered off and the solvent is evaporated to dryness.
The evaporation residue is taken up in 15 ml of absolute methanol and the product is precipitated again with a lot of abs. Ather off.
The yield of crude dihydrochloride of the tetrapeptide ester is 6.68 g.
This product still contains ammonium chloride, but is sufficiently pure and is used directly for conversion to the carbobenzoxy-hexapeptide ester. p - (? - methoxyphenylazo) -benzyloxy-carbonyl
L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-larginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester, hydrochloride
470 mg (0.85 mmol) of p - (? - Methoxyphenylazo) benzyloxy-carbonyl-L-glutaminyl-L-histidine in 14 ml of dimethylformamide are mixed with the solution of 510 mg (0.84 mmol) of L, -phenylalanyl- L-arginyl-L-tryptophyl - glycine methyl ester hydrochloride (cf.
Example 1) combined in 2 ml of dimethylformamide, cooled to 0 and treated with 210 mg (1 mmol) of dicyclehexylcarbodumide in 2 ml of dimethylformamide. After standing for 3 days at 0¯, allow room temperature to be reached, filter off the urea, decompose the unreacted carbodiinide with 0.1 ml of glacial acetic acid and evaporate to a small volume of liquid. The raw product is precipitated with a lot of ethyl acetate. The crude yield is 760 mg.
For cleaning purposes, 500 mg of the substance are dissolved in 10 ml of 75% dioxane and filtered through an aluminum oxide column (8 g). At the start, the contamination remains as an orange-red zone.
The eluted 420 mg are distributed between n-butanol and 1% acetic acid over 30 levels. The main amount of the MZ hexapeptide ester is found in elements 8-19 (G = 0, 8, 8).
Fractions 1, 0-18 are combined and again distributed between sec-butanol and 1% acetic acid over 40 stages. Fractions 11-19 are recrystallized from 95% methanol. 180 mg of p- (p'-methoxyphenylazo) -benzyloxy-carbonyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-Ltryptophyl-glycine-methylester.hydrochloride, mp 202 to 203.
The ultraviolet spectrum shows:? Max 284 mÁ (? = 9800),? Max 290 mÁ (? = 10 000),? Max 349 mÁ (? = 21,200),? Max 435 mÁ (? = 2000).