Verfahren zur Herstellung neuer Hexapeptide
EMI1.1
worin Ri eine Aminoniederalky'Pgruppe bedeutet, sowie entsprechender Verbindungen, die statt des Glutaminsäurerestes den Rest des Glutamins aufweisen.
Die neuen Verbindungen haben die Wirkung der natürlichen melanocytenstimulierenden Hypophysenhormone (MSH-Wirkung), weisen aber diesen gegen über den Vorteil auf, dass sie viel leichter synthetisiert werden k¯nnen, da sie eine Sequenz von nur 6 Aminosäuren besitzen, während das a-MSH aus 13 und das ssMSH aus 18 Ami, nosäuren aufgebaut ist.
Die neuen Hexapeptide können an Stelle der nat rlichen MSH als Heilmittel oder als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Aminosäuren aufweisen, verwendet werden, insbesondere das L-Glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl- L-arginyl ; L-tryptophyl-glycin und das entsprechende L-Glutaminylpeptid. Als Reste der a- (Amino-nieder- alkyl)-amino-essigsäure sind insbesondere L-Arginyl, L-Ornityl und L-Lysyl zu nennen.
Die neuen Peptide können nach den für die Pep tidherstellung bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man L-Glutaminsäure oder sein γ-Amid, L-Histidin, L-Phenylalanin- L-α-Aminonie- deralkyl-amino-essigsäure, L-Tryptophan und Glycin unter intermediärem Schutz van Amino-bzw. Carboxylgruppen miteinander durch Kondensation ver einigt.
Es werden zweckmϯig alle an der Reaktion nicht beteiligten, freien, funktionellen Gruppen geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxylgruppe vor- zugsweise durch Veresterung, z. B. mit Methanol, Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol, die Amino- gruppe beispielsweise durch Einführung des Tosyloder Tritylrestes oder insbesondere der Carbobenz- oxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p Phenylazo-benzyloxy-carbonylgruppe und der p- (p'- Methoxy-phenylazo)-benzyloxy-carbonylgruppe (MZ).
Zum Schutz der hnidazolgruppe (im) des Histidins verwendet man beispielsweise den Benzylrest und fur die Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Arginins die Niltrogruppe ; die genannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden.
Die Umwandlung ei, ner geschützten NHr oder NH-Gruppe in eine freie Gruppe sowie die Überfüh- rung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Hexapeptide und Zwischenprodukte kann nach an sich bekannten Metho den durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. re- duzierenden Mitteln erfolgen.
Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen.
Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Hexapeptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1
N-Trityl-L-tryptophamnethylester 13 g (0, 051 Mol) L-Tryptophanmethylester- hydrochlorid werden in einem 500-ml-Rundkolben in
180 ml abs. Chioroform aufgeschlämmt, auf 0 ab- gekühlt und mit 15, 7 ml (0, 113 Mol) trockenem Tri äthylamin versetzt. Anschliessend tägt man unter r Umschütteln portionenweise 14, 3 g (0, 051 Mol) Tri tylchlorid in das gekühlte Reaktionsgemisch ein. Man lässt 30 Minuten bei 0 und 6 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren.
Die Chloroformlösung wäscht man mit Wasser, 10 oiger Zitronensäurelösung, ln Na- triumbicarbonatlösung und zum Schluss mit Wasser neutral und trocknet sie über Natriumsulfat. Im Vakuum dampft man auf ein kleines Volumen ein, gibt, zur Vermeidung von allzu starkem SchÏumen, Metha- nol dazu und wiederholt diese Operation noch zwei weitere Male. Durch Lösen des Verdampfungsrück- standes in 10 ml Methanol tritt sponbane Kristallisa- tion ein.
Man isoliert 20, 9 g (88 % der Theorie) N Trityl-tryptophanmethylester, F. 150-152 . Nach einmaligem Kristallisieren aus Methanol zeigt die Substanz F. 156-157 , [α]D = + 45¯ ¯ 1¯ (c = 1, 075 ; Methanol).
N-Trityl-L-tryptophan
14, 8 g (0, 033 Mol) N-Trityl-L-tryptophanmethylester werden in 30 ml Propylenglykol in einem Ílbad bei 200-205 gelöst. Zur heissen L¯sung gibt man 45 ml einer 20 igen Lösung von Kaliumhydroxyd in Propylenglykol ; dabei scheidet sich wieder ein Teil des gelösten Esters ab. Nach 2 Minuten tritt wieder klare Lösung ein. Die Verseifung führt man während 6 Minuten bei einer Badtemperatur von 205 aus, kühlt anschliessend das Hydrolyseprodukt rasch ab und giesst es auf 600 ml Eiswasser. Unter intensivem Rühren und Kühlen bringt man die stark alkalische L¯sung mit 10% iger Zitronensäurelösung auf pH 6 und extrahiert das abgeschiedene Trityl-tryptophan mit viel Chloroform.
Durch Zugabe von mehr Zitronensäurelösung zur abgetrennten wässrigen Phase stellt man auf pH 5 ein und extrahiert noch zwei weitere Male mit frischem Chloroform. Die organischen Phasen wäscht man zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft im Vakuum auf ein kleines Volumen ein. Mit ti'efsiedendem PetrolL äther fällt man die Hauptmenge des N-Trityl-tryptophans aus. Nach dem Trocknen im Hochvakuum erhÏlt man 14, 38 g (98 o der Theorie) amorphes Produkt, das direkt zur weiteren Umsetzung verwendet werden kann.
F. 110-120 ; + 29' l' (c = 1, 397 in Methanol).
N-Trityl-L-tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylester
1, 84 g (8, 75 mMol) Glycin-p-nitrobenzylester in 10 ml trockenem Acetonitril werden auf 0 gekühlt, die L¯sung von 2 g (9, 7 mMol) N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 8 ml Acetonitril dazu gegeben und nach 5 Minuten mit der gekühlten Lösung von 4, 3 g (9, 6 mMol) N-Trityl-L-tryptophan in 10 ml Acetonitril versetzt. Sofort beginnt die Abscheidung von Harnstoff, die nach 2 Stunden beendet ist. Gleichzeitig mit dem Dicyclohexylharnstoff scheidet sich auch der Trityldipeptidester als gallertiges Produkt ab.
Man lϯt 4 Stunden bei 0 reagieren, dampft anschliessend das Lösungsmittel im Vakuum vollständig ab und zerreibt zur Entfernung des nicht umgesetzten N, N'-Dicyclo-hexylcarbodiimids den Verdampfungs rückstand mit viel Petroläther.
Durch wiederholtes Extrahieren des Reaktions- gemisches mit eiskaltem Methylenchlorid und Methy lenchlorid/Ather trennt man 1, 7 g Dicyclohexylharn- stoff ab.
Die Methylenchloridextrakte werden auf ein klei- nes Volumen eingeengt und mit viel tiefsiedendem Petroläther der Trityldipeptidester ausgefällt. Aus 85 ml 95 % igem Methanol kristallisieren 5, 3 g N-Tri tyl-L-tryptophyl-glycin-o-nitrobenzylester als feine Nadeln. F. 169-170¯ ; [α]D = - 10¯ ¯ 1¯(c = 0, 95 in Methanol).
Die Mutterlauge wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Chloroform mit eiskalter 10% iger Zitronensäure, einmal mit eiskalter ln Salzsäure, ln Natriumbicarbonat und zum Schluss mit Wasser neu tral gewaschen. Nach Verdampfen der getrockneten Chloroformphasen hinterbleiben 1, 3 g schaumiges Material, das, aus 95%igem Methanol kristallisiert, noch weitere 500 mg Trityldipeptidester ergibt.
F. 165-167 .
Die Totalausbeute beträgt 4 g (= 74 % der Theorie).
N-Carbobenzyloxy-L-tryptophylwglycin-benzylester
Zur L¯sung von 1 g (3 mMol) Carbobenzoxytryptophan in 20 ml trockenem Essigester gibt man eine L¯sung von 660 mg (4 mMo1) Glycinbenzylester in 5 ml Essigester und zum Schluss 650 mg (3, 15 mMoT) N. N-Dicyclohexyl-carbodiimid. Schon nach 15 Minuten beginnt die Abscheidung von Dicyclo- hexyl-harnstoff. Man lässt 16 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren, filtriert vom auskristallisierten Harnstoff ab und gibt zum Filtrat 0, 1 ml Eisessig.
Nach 15minutigem Stehen wäscht man die Essigesterlösung mit In SalzsÏure, Wasser, 1, 4% iger Ammoniaklösung und wieder mit Wasser neutral. Die organischen Phasen werden auf ein kleines Volumen ein geengt, mit tiefsiedendem Petroläther bis zur schwa chen Trübung versetzt und bei 0 belassen. Der Carbobenzyloxy-dipeptidester scheidet sich als galler- tiges Produkt ab. Durch Zugabe von mehr Petrol- äther und intensives Kratzen unter öfterem Aufwär- men in einem Wasserbad von 40 erhält man ein weisses mikrokristallines Pulver.
Die Ausbeute ist 950 mg (= 66% der Theorie) Carbobenzyl-L-tryptophyl-glycin-benzylester, F. 117 bis 118 ; [α]25D=-19¯ ¯ 1¯ (c = 0, 950 in Methanol). p- ; benzyloxy-carbonyl- L-tryptophyluglycin-benzylester
950 mg (2 mMol) MZ-tryptophan, hergestellt nach Patent Nr. 364 780, werden unter gelindem Erwärmen in 20 ml abs. Essigester gelöst, wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt und mit der L¯sung von 500 mg (3 mMol) Glycinbenzylester in 5 ml abs. Essigester vereinigt. Dazu gibt man 500 mg (2, 1 mMol) 1-Cyclohexyl-3-morpholinylÏthy-carbodiimid in 2 ml Essigester und lässt 16 Stunden bei Zimmertemperatur stehen.
Die Essigesterlösung wÏscht man im Scheidetrichter mit Wasser, 0, 5n Salzsäure, In Natriumbicarbonat und wieder mit Wasser neutral.
Die getrocknete Essigesterlösung dampft man auf ein kleines Volumen ein und fällt den MZ-dipeptidester mit viel Petoläther aus. Nach dem Trocknen im Hochvakuum erhält man 1, 2 g Rohprodukt, das noch mit Ausgangsmaterial verunreinigt ist.
Einmaliges Umkristallisieren aus 30 ml heissem Acetonitril ergeben 610 mg reines Produkt, F. 152 bis 153 ; die Auf arbeitung der Mutterlauge ergibt weitere 170 mg MZ-dipepfidester vom gleichen Schmelz- punkt. Die Gesamtausbeute beträgt 770 mg (= 63 % der Theorie). F. 152-153 . Das Ultraviolettspektrum in Methanol zeigt Maxima bei 240 m// (E = 11 000) und 748 m, u (e = 20 800).
L-Tryptophyl-g ? ycin-p-nitrobenzylester-hydrochlorid
1, 7 g (2, 65 mMol) N-Trityl-L-tryptophyl-glycin p-nitrobenzylester werden in 10 ml Eisessig gelöst und mit 1, 45 ml 2n Salzsäure während 5 Minuten im Wasserbad von 50 detitryliert. Anschliessend dampft man das Lösungsmittel bei 30 im Vakuum ab und trocknet den Rückstand während 2 Stunden im Hochvakuum bei 45 . Das Triphenylcarbinol l¯st man mit viel Ather aus dem kristallinen HCl-Salz des L-Tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylesters.
Die Ausbeute beträgt 100% der Theorie = 1, 15 g.
F. 150-153 .
L-Tryptophyl-glycin-benzylester-hydrobromid
870 mg (2 mMol) Carbobenzoxy-L-tryptophyl glycin-benzylester werden in 2 ml abs. Nitromethan aufgeschlämmt und unter Stickstoffatmosphäre mit 2 ml 4n Bromwasserstoff in Eisessig versetzt. Die L¯sung verfärbt sich dabei sofort violett. Man lässt 1 Stunde bei Zimmertemperatur und unter Lichtausschluss reagieren, dampftanschliessend bei 30 den überschüssigen Bromwasserstoff ab und fällt das Hydrobromid des Dipeptidesters mit viel absolutem Ather aus. Das 6lige Decarbobenzoxylierungsprodukt erstarrt sofort beim Verreiben mit frischem absolutem Ather.
Nach zweimaligem Umfällen aus Aceton/Äther erhält man 300 mg (= 92 % der Theorie) eines körni- gen, leicht grau gefärbten Produktes.
Das Papierchromatogramm (sek. Butanol : 5 % Veronalnatrium : Wasser : Isopropanol = 100 : 10 : 60 : 15) zeigt nur 1 ninhydrinpositiven Fleck.
Das Hydrobromid kann zur weiteren Verarbei- tung direkt verwendet werden.
Es ist in Aceton und Essigester gut, in Wasser dagegen nur teilweise löslich.
N-Carbobenzyloxy-L-phenylalanin-L-arginin methylester-carbonat 1. tuber das gemischte Anhydrid
Zu einer L¯sung von 600 mg (2 mMol) N-Carbo- benzoxy-L-phenylalanin in 10 ml abs. Tetrahydro- furan gibt man bei-10 0, 28 ml (2 mMol) Triäthyl- amin und nach 5 Minuten, bei der gleichen Temperatur, 0, 2 ml (2 mMol) Chlorameisensäureäthylester.
Das Triäthylamihhydrochlörid fÏllt sofort als weisser Niederschlag aus. Zur vollständigen Bildung des ge mischten Anhydrids lässt man noch 10 Minuten bei -10 reagieren und versetzt anschlie¯end mit der ebenfalls auf - 10¯ gek hlten L¯sung von L-Arginin methytester-hydrochlorid, aus SSO mg (2, 2 mMol) Arginin-methylester-dihydrochlorid und 0, 31 (2, 2 mMol) Triäthylamin, in 6 ml N,N-Dimethylformamid.
Es wird 15 Minuten bei-10 und 1 Stunde bei Zimmertemperatur weiter gerührt, die L¯sung vom Triäfthylamin-hydrochlorid befreit (400 mg) und das Lösungsmittel im Vakuum bei 50 verdampft. Den Verdampfungsrückstand wäscht man in Methylen- chlorid mit Wasser und Natriumbicarbonat und dann man Wasser neutral, trocknet das Lösungsmittel über Magnesiumsulfat und dampft zur Trockne ein. Man isoliert 810 mg (85%) rohen Carbobenzoxydipeptidester, der für die Decarbobenzoxylierung genügend rein ist.
Eine Probe des amorphen Carbobenzoxydipeptid- esters mit Pikrinsäure umgesetzt ergibt in quantitati- ver Ausbeute das Pikrat.
Das Analysenpräparat, zweimal aus Methanol Wasser umkristallisiert, schmilzt bei 161-162 .
2. Mittels Dicyclohexyl-carbodiimid
4, 92 g (19 mMol) L-Argininmethylester-dihydro- chlorid werden in 100 ml heissem absolutem Metha nol gelöst, auf-10 abgekühlt und mit 2, 64 ml (19 mMol) Triäthylamin ins Monohydrochlorid übergeführt. Dann gibt man 3, 9 g (19 Mol31 N, N'-Dicyclohexyl-carbodiimid in 15 ml absolutem Methanol dazu und trÏgt zum Schluss bei der genannten Tem peratur unter kräftigem Umschwenken 5, 2 g (17, 1 mMol) N-Carbobenzoxy-L-phenylalanin in Portionen ein. Das Carbobenzoxy-phenylalanin geht sogleich in L¯sung, und nach 5 Minuten beginnt die Kristallisation von Dicyclohexylharnstoff.
Man lässt 16 Stunden bei 0 stehen, filtriert vom Harnstoff (2, 75 g = 71 %) ab, zerstört den Überschuss an Dicyclohexyl- carbodiimid mit wenig Essigsäure und dampft im Vakuum das Methanol ab. Den Verdampfungsrück- stand nimmt man in Methylenchlorid auf, wäscht mit 2n SalzsÏure, 2n Natriumbicarbonatlösung und Wasser neutral.
Zweimaliges Umfällen aus Methylenchlo- rid/Petroläther ergeben 2, 47 g (87 S) amorphen Carbobenzoxy-dipeptidester, der direkt decarbobenzoxyliert wird. p- (p-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonyl-L- phenyManyl-L-arginin-methylester-hydrochlorid
Zu einer L¯sung von 8, 66 g (20 mMol)'MZ-L- phenylalanin (hergestellt nach Patent Nr.
364 780) in 150 ml absolutem Tetrahydrofuran gibt man bei -10 2, 8 ml (20 mMol) Triäthylamin und nach 10 Minuten bei der gleichen Temperatur 2, 0 ml (20 mMol) Chlorameisensäureäthylester. Nach weiteren 15 Minuten versetzt man mit der gekühlten L¯sung von L-Argininmethylester-hydrochlorid, hergestellt aus 5, 8 g (22 mMol) Argininmethylester-dihydrochlorid und 3, 06 ml (22 mMol) Triäthylamin in 30 ml Dimethylformamid. Man lässt 30 Minuten bei-10 und 1 Stunde bei Zimmertemperatur reagieren, filtriert vom Triäthylamin-hydrochlorid ab (5, 2 g) und verdampft das Lösungsmittel bei 50 im Vakuum.
Zum Rückstand gibt man viel Äther, dekantiert ab, trocknet das ölige Produkt im Vakuum und verreibt es mit viel Wasser. Dabei erstarrt die rohe MZ-Ver bi, ndung. Die wässrige Phase wird abzentrifugiert, der Rückstand zweimal mit je 50 ml frischem Wasser durchgeknetet und lyophil getrocknet. Die Rohaus- beute betrÏgt 11, 7 g.
Obige 11, 7 g bringt man, in 70 ml 95% igem Äthanol gelöst, auf eine 23 cm lange Aluminium oxydsäule (° 5 cm) und eluiert mit viel 95%igem Alkohol. Neben einer kl'einen Vorfraktion (110 mg) kristallisieren 5, 05 g MZ-dipeptidester-hydrochlorid aus der alkoholischen L¯sung aus. F. 185-186 .
Aus der Mutterlauge gewinnt man noch weitere 3, 36 g reine Substanz. F. 184-185 . Die Gesamtaus- beute ist 8, 41 g (66% der Theorie).
Das Sulfat F. 145-146 lässt sich durch Zugabe von Schwefelsäure 1 : 1 verdünnt zu einer alkoholi- schen L¯sung von MZ-L-phenylalanyl-L-argnin methylester-hydrochlorid in quantitativer Ausbeute erhalten.
L-Phenylalanyl-L-arginin-methylester-hydro- bromid, hydrochlorid
2, 5 g (3, 9 mMol) MZ-L-phenylalanyl-L-arginin- methylester hydrochlorid werden in 6 ml Nitromethan gelöst und mit 6 ml 4n Bromwasserstoff (24 mMol) in Eisessig versetzt und 90 Minuten bei Zimmertemperatur belassen. Gegen das Ende der Reaktionszeit kri stallisiert das p-(p'-Methoxyphenylazo) ; benzylbromid in prächtig roten Plättchen aus der Reaktionslösung aus. Bromwasserstoff und den grössten Teil des Lösungsmittels dampft man im Vakuum ab und zerreibt den Rückstand dreimal mit absolutem Ather. Anschliessend verteilt man das rohe Decarbobenzoxylie- rungsprodukt zwischen viel Chloroform und Wasser.
Wasser und Chloroformphasen werden noch je einmal mit frischem L¯sungsmittel extrahiert, die wäss- rigen Auszüge vereinigt und im Vakuum bei 40¯ zur Trockne eingedampft.
Das Hydrobromid, Hydrochlorid des Phenylala- nyl-arginin-methylesters fÏllt dabei als leicht rötlich gefärbtes amorphes Produkt an, das direkt zur weiteren Kondensation verwendet wird.
Die Ausbeute ist 1, 4 g (= 80 % der Theorie).
Das Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-argininmethylestercarbonat (Beispiel 8), unter den gleichen Bedingungen decarbobenzoxyliert, ergibt ein Dihydro bromid, das papierchromatographisch identisch mit dem oben beschriebenen Hydrochlorid, Hydrobromid ist.
Na-Carbobenzyloxy-N (im)-benzyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-argininmethylester-carbonat
Zu 5, 32 g (0, 014 Mol) Na-Carbobenzoxy-N (im) benzyl ; L-histidin in 110 ml Dimethylformamid gibt man bei 15 die Lösung von 3, 02 g (0, 0147 Mol) N, N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml Dimethylformamid.
Gleichzeitigwerden 7, 7 g (0, 0154 Mol) L-Phenyl- alanyl-L-argininmethylester-dihydrobromid in 20 ml Dimethylformamid mit 2, 15 ml (0, 0154 Mol) Tri äthylamin ins Monohydrobromid übergeführt, auf 0 abgekühlt und zur Na-Carbobenzoxy-N (im)-benzyl L-histidinlösu, ng gegeben.
Nach 20stündigem Stehen wird vom Dicyclo- hexylbarnstoff (2, 27 g = 74 %} filtriert, zum Filtrat 0, 6 ml Eisessig gegeben und nach 15 Minuten das Lösungsmittel auf ein kleines Volumen eingedampft, nochmals vom auskristallisierten Salz befreit und dann vollständig zur Trockne eingedampft. Den amorphen Rückstand behandelt man mit viel Ather und trocknet anschliessend 4 Stunden bei 50 .
Das pulverige Rohprodukt wird dreimal mit je 40 ml und einmal mit 30 ml 0, 5n Ammoniumhydroxyd in der Kälte zerrieben, die überstehende Flüssigkeit jeweils gut abzentrifugiert und in 100 ml Butanol/Chloroform 1 : 1 aufgenommen. Mit zweimal 20 ml 2n Salzsäure stellt man kongosauer und wÏsch t anschliessend zuerst mit 2n Natriumbicarbonat und dann mit Wasser neutral.
Die getrockneten Extraktionslösungen werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Verdamp fungsrückstand in 135 ml 0, 25n Salzsäure aufgelöst, filtriert und unter Eiskühlung mit 2n Natriumbicarbonat auf pH 7-8 gestellt.
Den abgeschiedenen Carbobenzoxy-tripeptidester nimmt man wieder im Gemisch Butanol/Chloroform 1 : 1 auf, wäscht mit Wasser neutral, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Butanol-Chloroformgemisch auf ein kleines Volumen ein. Zweimaliges Umfällen aus Chloroform-Petroläther ergeben 7, 16 g (70% der Theorie) Nα-Carbobenzoxy-N (im)-benzyl L-histidyl-L-phenylalanyl-L-argininwmethylester-car- bonat.
Das Analysenpräparat zeigt nach zweimaligem Umkristallisieren aus 50% igem Methanol den F. 13j1 bis 135¯. [α]25D=-13¯ ¯ 1¯ (c= 0, 7822 in Methanol).
Nu-Carbobenzyloxy-N (im)-benzyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginin
6, 52 g (8, 9 mMol) Carbobenzoxy-N (im)-benzyl I,-histi, dyl-L-phenylalanyl-L-argininmethylester-car- bonat in 50 ml Methanol werden mit 19, 5 ml In Natronlauge während 1 Stunde bei Zimmertemperatur verseift. Mit In Salzsäure stellt man das pH auf 6 und gibt zum Verseifungsprodukt 300 ml Wasser.
Nach einstündigem Stehen bei 0 filtriert man vom Carbobenzoxytripeptid ab und kristallisiert das noch feuchte Produkt aus 50% igem Methanol um. Ausbeute : 4, 27 g (70%), F. 136-139 . M=-10, 5 0, 9 (c = 1, 062 in Methanol).
Die Mikroanalyse zeigt, dass das Carbobenzoxy- tripeptid mit 1 Mol Wasser kristallisiert.
Na-Carbobenzyloxy-N (im)-benzyl=L-histidyll-L- phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-p nitrobenzylester-carbonat
4, 2 g (6 mMa1) Carbobenzoxy-N (im)-benzyl-L histidyl-Lphenylalanyl-L-arginin und 2, 87 g (6, 6 mMol) L-Tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylester-hydro- chlorid (vgl. Beispiel 6) löst man in 20 ml frisch destilliertem N, N-Dimethylformamid und versetzt unter Eiskühlung mit der L¯sung von 1, 35 g (6 mMol) N, N'-DicyclohexyScarbodiimid in 7 ml Di methylformamid. Das Reaktionsgemisch lässt man 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, filtriert vom Dicyclohexylharnstoff ab (890 mg = 67 %) und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum.
Man erhält 8, 3 g Rohprodukt, das noch mit Dicyclohexyl- harnstoff verunreinigt ist.
6, 3 g Rohprodukt werden zwischen 500 ml Essigester und 50 ml In Natriumbicarbonatlösung verteilt, die Essigesterpbasen mit Wasser, fünfmal mit je 10 ml 10% iger Essigsäurelösung gewaschen, dann wiederholt mit In und 2n Natriumbicarbonat und zum Schluss mit Wasser neutral gewaschen.
Beim Eindampfen der getrockneten Essigesterlösung kristallisiert ein Teil des Produktes aus dem Lösungsmittel aus. Durch Zugabe von tiefsiedendem Petroläther erreicht man eine vollständige Ausfällung des Carbobenzoxypentapeptidesters. Die Ausbeute ist 4, 6 g.
Zur weiteren Reinigung werden 3, 5 g an 100 g Alumihiumoxyd der Aktivität III chromatographiert.
Mit Methanol werden wieder 2, 78 g Carbobenzoxy pentapeptidester eluiert und direkt zur Decarbobenz- oxylierung verwendet.
N (im)-Benzyl-L-histidyl ; L-phenylalanyl-L- arginyl-L-trypophylLglyci, n-p-nitrobenzylester- trihydrobromid
1, 75 g (1, 67 mMol) Carbobenzoxy-N (im) benzyl- L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylester-carbonat werden mit 5 ml 2n Bromwasserstoff in Eisessig wahrend 1 Stunde bei Zimmertemperatur decarbobenzoxyliert. Den überschüssigen Bromwasserstoff saugt man im Vakuum bei Zimmertemperatur ab und verreibt den Rückstand wiederholt mit viel absolutem ¯ther.
Das rohe Decarbobenzoxylierungsprodukt unterwirft man einer multiplikativen Verteilung nach Craig über 85 Stufen mit 0, 3n Ammoniumacetat (pH 7, 1) als untere Phase und n-Butand als Oberphase. Die Hauptmenge der Substanz ist in den Elementen 73 bis 85 verteilt. Die genannten Fraktionen werden vereinigt, von der Unterphase abgetrennt, letztere nochmals mit frischem Butanol extrahiert und die vereinigten Butanolextrakte im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft und der freie Pentapeptidester mit viel Petroläther ausgefÏllt. Nach weiterem UmfÏllen aus Chloroform-Petroläther erhält man 1, 2 g papierchromatographisch reinen N (im)-Benzyl-L- histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl L-tryptophylLgly- p-nitrobenzylester.
N-Ca, rbobenzyloxy-y-benzyl-L-glutamyl-N (im)- benzyl-L-hystidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L- tryptophyl-glycin-p-nitrobenzylester-carbonat
Zu einer L¯sung von 370 mg (1 mMol) N-Carbo- benzoxy-L-glutaminsäure-y-benzylester in 10 ml abs.
Dioxan gibt man bei 10-11 (ein Teil des Dioxans ist immer gefroren) 0, 26 ml (1, 1 mMod) Tributylamin und nach 10 Miinuten bei der gleichen Temperatur 0, 11 ml (1, 1 mMol} Chlorameisensäure-äthylester.
Zur vollständigen Bildung des gemischten Anhydrids lässt man noch 20 Minuten bei der angegebenen Tem peratur reagieren und versetzt dann mit 820 g N (im) Benzyl-pentapeptid-nitrobenzylester in einem Gemisch von Acetonitril-Dioxan (10 ml). Nach 30minutigem Stehen im Eisbad und 60 Minuten bei Zimmertempe- ratur dampft man zur Trockne ein, nimmt den R ckstand in Chloroform auf und wäscht mit eiskalter In Salzsäure, In Natriumbicarbonatlösung und zum Schluss mit Wasser neutral. Das getrocknete Chloroform wird im Vakuum verdampft und der Carbobenz- oxy-heptapeptidester (1 g = 90 %), der noch mit Ausgangsmaterial verunreinigt ist, mit Petroläther umgefällt.
200 mg Rohprodukt werden in abs. Chloroform auf eine Aluminiumoxyd-Säule Aktivität III aufgezogen. Die Hauptmenge (160 mg) lässt sich wieder mit Methanol eluieren. Diese werden nach Craig über 3 ! 0 Stufen zwischen 80 % igem Methanol und Chloro- form/Tetrachlorkohlenstoff 1 : 1 multiplikativ verteilt. G = 4, 65.
Die Hauptmenge der Substanz ist in den Elementen 19-30 verteilt.
Diese Fraktionen werden vereinigt, das Lösungs mittelgemisch verdampft und der Verdampfungsrück- stand weiter umgesetzt.
L-Glutamyl-L-histidyl, L-phenylalanyl-L-arginyl-
L-tryptophyl-glycin 1. 350 mg (0, 37 mMol), durch Aluminiumoxyd gereinigten Carbobenzoxy-hexapeptidester werden mit I, 1 ml 2n Bromwasserstoff in Eisessig während 1 Stunde bei Zimmertemperatur decarbobenzoxyliert.
Den überschüssigen Bromwasserstoff dampft man im Vakuum ab und fällt das Trihydrobromid mit viel absolutem Ather. Wiederholtes Verreiben mit frischem Äther ergibt ein körniges, leicht grau gefärbtes Pulver.
Ausbeute : 550 mg rohes Hexapeptidester-tri- hydrobromid.
Dieses Produkt wird zwischen 0, 3n Ammoniumacetat (pH 7, 5) und n-Butanol über 30 Stufen verteilt, die Fraktionen 25-30 vereinigt und die Unterphasen noch einmal mit frischem Butanol extrahiert. Nach dem Abdampfen des Butanols gewinnt man 280 mg y-Benzyl-L-glutamyl-N (im)-benzyl-L-histidyl-L-phe- nylalanyl-arginyl-L-tryptophyl-glycin-nitrobenzylester.
Dieses Produkt wird in 90 % iger Essigsäure mit 10% igem Palladiumkohlekatalysator hydriert.
Nach 171/2 Stunden kommt die Hydrierung zum Stillstand, nachdem 21 ml Wasserstoff aufgenommen sind. Man befreit die L¯sung vom Katalysator und dampft bei 40 zur Trockne ein. Den Verdampfungs- rückstand nimmt man in wenig 95 % igem Alkohol auf und fällt das hydrierte Produkt mit viel Ather aus.
Ausbeute : 190 mg.
Auf dem Papierchromatogramm lassen sich noch unhydrierte Verbindungen feststellen.
Die 190 mg Glu-(im)-Bz-His-Phe-Arg-Try-Gly gibt man zu 50 ml trockenem frisch kondensiertem Ammoniak. Unter gutem Rühren mit einem Magnetrührer trÏgt man langsam kleine blanke Natriumstück- chen in die Suspension ein. Erst durch Zugabe von Natrium erreicht man eine klare L¯sung. Nach dem Eintragen von 2, 25 mMol Natrium bleibt die L¯sung für längere Zeit dunkelblau gefärbt.
Man trÏgt in kleinen Portionen 3 g Dowex-50 in der Ammoniumform in die Reaktionslösung ein, wobei sofortige Entfärbung stattfindet. Das Ammoniak wird unter kräftigem Rühren und unter Feuchtigkeitsausschluss bei Zimmertemperatur abgedampft.
Die letzte Phase Ammoniak verdampft man im Hochvakuum über Schwefelsäure.
Den Dowexp extrahiert man viermal mit 10 ml Wasser, säuert die farblose wässrige L¯sung (pH 9) mit 0, 5 ml Eisessig an und dampft zur Trockne ein.
Den Rückstand dampft man wiederholt mit abs.
¯thanol ab, l¯st ihn in 5 ml Wasser, filtriert von den Verunreinigungen ab und verdampft wieder zur Trockne.
Das Hexapeptid wird mit 10 ml abs. Alkohol verrieben, die Mutterlauge abzentrifugiert und im Hochvakuum getrocknet.
Man erhält 44 mg Hexapeptid alls wei¯es Pulver.
Im Tierversuch zeigt es MSH-Aktivität.
2. 124 mg (0, 1 mMol) N-Carbobenzoxy-γ-benzyl- L-glutamyl-N (im)-benzyl-L-histidyl-L-phenylalanyl L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-nitrobenzylester werden in 30 ml flüssigem Ammoniak direkt mit 1, 2 mMol Natrium gespalten. Nach der analogen Aufarbeitung, wie oben beschrieben, gewinnt man 25 mg Hexapeptid, das sich papierchromatographisch als identisch mit dem Produkt des 1. Versuches erweist.
Beispiel 2 L-Phenylalanyl-nitro-L-arginin-methylester
25, 14 g (0, 049 Mol) Carbobenzoxy-L-phenylala nyl-nitro-L-arginin-methylester [vgl. K. Hofmann et al. J. A. C. S. Band 78, 240 (1956)] werden in 50 ml Eisessig unter gelindem Erwärmen gelöst und mit 50 ml 4n Bromwasserstoff in Eisessig während 90 Mihuten bei Zimmertemperatur decarbobenzoxyliert.
Die Reaktionslösung dampft man bei 40 im Vakuum auf ein kleines Volumen ein und gibt den siru pösen Rückstand unter starkem Rühren in 1 1 abs.
Äther. Nach l5minutigem Rühren lässt man den flokkigen Niederschlag absitzen und trocknet den Rück stand bei 40 im Vakuum über Phosphorpentoxyd.
Das rohe Hydrobromid nimmt man in 40 ml eiskaltem Wasser auf, stellt die mit Eis gekühlte L¯sung mit 2n Sodalösung phenolphthailemalkalisch und extrahiert zuerst dreimal mit je 100 ml Äther-zur Ent- fernung der Verunreinigungen-und anschliessend mit je 200 ml, 100 ml und 50 ml eines Gemisches von n-ButanolLChloroform 1 : 9. Die Chloroform-Butanol Extrakte werden noch zweimal mit je 10 ml 1/2-gesÏttigter Natriumchloridlösung gewaschen und zum Schlu¯ mit Magnesiumsulfat getrocknet. Im Vakuum dampft man das Chloroform und einen Teil des Butanols bei 40-45¯ ab und fällt hierauf den freien Dipeptidester mit viel Äther aus.
Man filtriert durch eine feine Glasnutsche ab, wÏscht mit viel Äther nach un'd trocknet den Rückstand im Hochvakuum bei 40 .
Die Ausbeute beträgt 16 g amorphen L-Phenyl alanin-nitro-L-arginin-methylester ; dies sind 71 % der Theorie.
Der Dipeptidester zeigt in den 3 folgenden Systemen : 43 : t-Amyqlalkohol : Isopropanol : Wasser = 100 : 40 : 55 ; 54 : sek. Butanol : Isopropanol : Monochloressig säure : Wasser = 70 : 10 : 3 g : 40 ; 56 : sek. Butanol : Isopropanol : 5 % Veronal
Natrium : Wasser = 100 : 15 : 10 : 60 nur einen ninhydrinpositiven Fleck.
Das amorphe Produkt wird f r die weitere Umsetzung ohne zusätzliche Reinigung direkt verwendet.
Na, N (im)-Dicarbobenzyloxy-L-histidyl-L- phenyl'alanylLnitro-L-arginin-methylester 16 g (0, 042 Mol) L-PhenyWalanyl-nitro-L-arginin- methylester in 50 ml Acetonitril werden auf-10 gekühlt und mit dea-ebenfalls vorgekühlten Lösung von 19, 2 g Dicarbobenzoxy-L-histidin (0, 042 Mol) in 140 ml Acetonitril vereinigt, wobei sich wieder ein Teil der gelösten Substanzen ausscheidet. Nach der Zugabe von 10 ml Dimethylformamid und anschlie- ssendem kräftigem Durchschütteln tritt wieder klare L¯sung ein.
Hierauf trÏgt man die vorgekühlte Lösung von 9, 7 g Dicyclohexyl-carbodiimid (0, 047 Mol) ? in 45 ml Acetonitril ein und lässt bei 0 bis + 3 reagieren. Nach kurzer Zeit beginnt die Abscheidung von Dicyclohexylharnstoff neben dem Dicarbobenz- oxy-dieptidester. Das Reaktionsgemisch wird mit 100 ml Acetonitril/Dimethylformamid 9 : 1 verdünnt und über Nacht bei 0 stehengelassen. Den kompak- ten, gallertigen, zum Teil kristallinen Kuchen zerreibt man gut mit weiteren 100 ml Acetonitril, filtriert durch eine Glasfritte G-2 und wÏscht nochmals mit zweimal 50 ml Acetonitril gut nach.
Zur Mutterlauge gibt man 0, 5 ml Eisessig, lässt 15 Minuten reagieren und verdampft anschliessend zur Trockne. Als Rückstand bleibt wenig mit Ausgangsmaterial verunreinigtes Produkt, das nitht weiter aufgearbeitet wurde.
Den feuchten Nutschenrückstand extrahiert man mit total 60 ml Dimethylformamid und trennt auf diese Weise 9, 3 g unlöslichen Dicyclohexythamstoff (= 98 % der Theorie). F. 226-228 ab.
Die Dimethylformamidlösung dampft man bei 40 im Hochvakuum zur Trockne ein und gewinnt 26, 7 g rohes Material.
Nach einmaligem Umkristallisieren aus 100 ml Methanol erhält man 23, 1 g (= 70% der Theorie) Dicarbobenzoxy-tripeptidester.
Das Analysenpräparat kristallisiert mit 1 Mol Kristallmethanol, F. 125-128¯. [α]26D=-19¯ ¯ 15¯ (c = 0, 9787 in Methanol). Die Dicarbobenzoxyver- bindungen sind äusserst empfindlich gegenüber Basen.
L-Histidyl-L-phenylalanyl-L-argininWmethylester- diacetat
16, 5 g (20 mMol) Dicarbobenzyloxy-L-histidyl-Ir phenylalanyl-nitro-L-arginin-methylester werden in 300 ml abs. Methanol unter Zusatz von 4, 4 Aquiva- lenten methanolischer Salzsäure und in Gegenwart von 4 g 10% igem PaiHadiumkoMe-Katalysator bis zur Sättigung hydriert. Das gebildete Kohlendioxyd wird' in einer zweiten dazwischengeschalteten Hydrierente mit Kali'lauge adsorbiert. Nach 10 Stunden sind von den berechneten 2700 ml Wasserstoff 2515 ml Was serstoff aufgenommen, und die Hydrierung ist beendet.
Die vom Katalysator befreite L¯sung dampft man bei 40 im Vakuum ein, löst den Rückstand in 20 ml Wasser und lässt die L¯sung langsam durch eine lonenaustauschersäulc von 120 ml ?Amberlite IR4-B? (Acetatform) laufen. Man wäscht mit Wasser so lange nach, bis die Eluate nicht mehr ninhydrin- positiv reagieren. Es wird mit total 360 ml Wasser nachgewaschen.
Die wässrige Losung wird bei 40 im Vakuum zur Trockne verdampft und der gut getrocknete Rück- stand mit abs. ¯ther aus der Methandl'lösung ausgefällt. Die Ausbeute beträgt 13, 1 g amorphes Tri peptidester-diacetat.
Papierchromatographisch zeigt der Tripeptildester in den 2 Systemen 56 (vgl. S. 6) und sek. Butanol : Isopropanol : TriÏthylamin : Veronal : Wasser = 100 : 10 : 0, 8 : 1, 8 g : 60 nur einen ninhydrin-, pauly-und sagaguchipositiven Fleck. Das amorphe Produkt wird direkt weiter verarbeitet.
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L- phenylal'anyl-L-arginwin-methylester
13, 1 g (22 mMol) L-Histidyl-L-phenylalanylLL- arginin-methylester-diacetat werden in 60 ml Di methylformamid auf-10 gekühlt und portionen weise mit 6, 1 g Carbobenzoxy-L-glutaminazid (20 mMol) versetzt. Dabei geht das Azid sofort in Lö- sung. Man lässt 2 Tage bei 0 reagieren und fällt an schlieSend den rohen Tetrapeptidester mit 1 1 Essig- ester aus. Den gallertigen Niederschlug filtriert man ab und wÏscht mit viel Essigester und Ather.
Einmaliges Umkristallisieren aus Methanol/Essig- ester liefert 11, 3 g papierchromatographisch reinen Carbobenzoxy-tetrapeptid-methylester, F. 162-165 (Sintern bei 155 ).
Das Analysenpräparat zeigt nach einer weiteren KristaMs ation von dem gleichen Lösungsmittelgemisch F. 167-169¯.
Der Verteilungskoeffizient für das System 80% Methanol : (Chloroform : Tetrachlb. = 1 : 1) = 1 : 1 betragt 5, 9 ; [a] D =-18, 4 1, 6 , c = 0, 979 in Eisessig. Die Rf-Werte in den 3 Systemen 54, 56 (vgl. S. 6) und Methyläthylketon : Pyridin : Wasser = 60 : 15 : 25 sind 0, 59 bzw. 0, 82 bzw.
0, 85.
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L- phenylÏlanyl-L-arginin 2-, 5 g (3, 1 mMol) Carbobenzoxy-tetrapeptidester- acetat werden in 80 mit jaithandLWasser 3 : 5 unter Erwärmen gelöst und bei Zimmertemperatur mit 6, 5 ml 1n Natronlauge versetzt. Nach 10 Minuten trübt sich die L¯sung, und es beginnt sich gallertige Substanz abzuscheiden. Das pH beträgt während der 60minutigen Verseifulng 11, 5. Mit 6, 5 ml ln Salz- sÏure wird die L¯sung neutral'gestellt und bei 40 zur Trockne eingedampft.
Den gallertigen Rückstand nimmt man in 50 ml heissem Wasser auf, filtriert durch Watte, engt die L¯sung auf ein Volumen von 20 ml ein und lässt 16 Stunden bei 0¯ stehen.
Die gallertige Ausfällung wird duch eine Glasfritte G-2 vorsichtig filtriert, mit wenig eiskaltem Wasser gewaschen und ber Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet.
Die Ausbeute ist 1, 65 g = 75 % der Theorie, F. 167-169 (Sintern bei 165¯).
Das Analysenpräparat, aus Wasser umkristalli- siert, zeigt nach dem Trocknen im Hochvakuum und anschliessendem Stehenlassen am der Luft den Gehalt von 4 Kristallwasser, F. 159-160 .
Der Verteilungskoeffizient f r das System n-Buta- ne AcOH ist 1 : 1, ist 0, 16. [α]26D=- 33,6¯ 1, 3 (c = 0, 923 in In n SalzsÏure).
Eine Probe des reinen Carbobenzoxy-tetrapeptid- esters mit 2n Bromwasserstoff in Eisessig decarbobenzoxyliert lässt sich mit Leucinaminopeptidase unter den Standardbedingungen in die 4 Aminosäuren aufspalten.
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl1-L-histidyl-L- phenylalanyI-L-arginyl-Ltryptophyl-glycin- nitrobenzylester
2, 0 g (2, 5 mMol) Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L- histidyl-L-phenylalanyl-L-arginin. 4Hz0 werden unter Erhitzen in 45 ml Dimethylformamid gelöst, wieder auf Zimmertemperatur abgekühlt und mit 1, 93 g (4, 5 mMol) L-Tryptophyl-glycin-nitrobenzylester (vgl.
Beispiel 1) versetzt. Das Gemisch rührt man mit einem Magnetrührer während 50 Minuten ; dabei l¯st sich der grösste Teil der Suspension. Anschliessend kühlt man im Eisbad auf 0 ab, gibt die vorgekühlte L¯sung von 620 mg Dicycal'ohexylcarbodiimid (13 mMol) in 5 ml Dimethylformamid dazu und läX3t während 3 Tagen bei 0 reagieren.
Die Reaktionslösung befreit man vom Harnstoff (370 mg = 66, o), versetzt mit 3 Tropfen Eisessig und dampft das Dimethylformamid im Hochvakuum auf ein kleines Volumen ein. Das rohe Reaktionsprodukt fällt man mit viel Essigester aus, filtriert es und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd.
Die Rohausbeute beträgt 3, 1 g. Zur Abtrennung der Ausganasstoffe verteilt man das Rohprodukt zwischen n-Butanol und 1 % Essigsäure über 30 Stufen.
Die Fraktionen 0-8 (730 mg) sind zur Hauptsache Carbobenzoxy-tetrapeptid, während sich in den Elementen 10-26 neben dem Carbobenzoxy-hexa peptid-nitrobenzylester auch noch L-Tryptophyl-gly- cin-nitrobenzylester befindet.
Zur weiteren Reinigung werden die Fraktionen 10-26 nochmals zwischen n-Butanol und 1 % Essigsäure über 40 Stufen verteilt und die Fraktionen 16-19, 20-23, 24-27 und 28-31 vereinigt. Die Fraktionen 12-15 enthalten noch wenig Carbobenzoxy- tetrapeptid, während die übrigen im Papierchromatogramm nur Carbobenzoxy-hexapeptid-nitrobenzyl- ester anzeigen.
Die Ausbeute der vereinigten Fraktionen ist 1, 4 g (50% der Theorie).
Der Verteilungskoeffizient der analytisch reinen Verbindung ist l. [α] 25D=-27,3¯ ¯ 1,4¯ (c = 1, 064 in Dimethylformamid).
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin- methylester. hydrochlorid a) aus Cbo-GluÀ(NH2)-His-Phe-ArgÀOH + H-Try
Gly-OCH3-HCl
5 g (6, 25 mMol) Carbobenzoxy-tetrapeptid werden in einem Gemisch von 70 ml Dimethylformamid und 15 ml Diäthylphosphat unter Erwärmen gelöst ; die L¯sung kühlt man wieder auf Zimmertemperatur ab und versetzt hierauf mit 3,, 7 g (12 mMo1) L-Tryp tophyl-glycin-methylester-hydrochlorid (vgl.
Beispiel 1). Anschlie¯end rührt man 3 Stunden bei Zimmertemperatur und lässt über Nacht bei 0c stehen. Zur gekühlten L¯sung gibt man 1, 85 g (9 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dimethylformamid und lässt 77 Stunden bei 0 und 6 Stunden bei Zim mertemperatur reagieren.
Den abgeschiedenen Harnstoff filtriert man ab (780 mg = 56%), versetzt das Filtrat mit 0, 1 ml Eisessig, dampft das Dimethylformamid auf wenige ml ein und fällt mit viel Essigester aus. Nach dem Filtrieren und Trocknen im Hochvakuum erhält man 8, 3 g Gemisch von Carbobenzoxy-hexapeptidester und Ausgangsmaterial.
Das gesamte Rohprodukt wird zwischen n-Butanol und 1 % Essigsäure in einer Craig-Apparatur mit
100 ml Phasenvolumen verteilt.
Die Fraktionen 11-35 reagieren positiv auf Pauly- Reagens, und 15-35 zeigen positive Ehrlich-Reaktion an. Die Elemente 11-14 und 15--16 enthalten zur Hauptsache Carbobenzoxy-tetrapeptid neben wenig Carbobenzoxy-hexapeptidester, während die Fraktionen 19-35 reinen geschützten Hexapeptidester enthalten.
Die Phasen der Fraktionen 19-35 werden ver einigt, zur Trockne eingedampft und einmal aus Di methylformamid-Essigester ausgefäll't.
Die Ausbeute des amorphen papierchromatogra- phisch einheitlichen Carbobenzoxy-hexapeptidesterhydrochlorids ist 3, 8 g. [α]25D-16,4¯ ¯ 0,3¯ (c = 0, 793 in Pyridin}. b) aus Cbo-Glu- (NH2)-His-OH+H-Phe-Arg-Try Gly-OCHs-HOL
680 mg (0, 05 mMol) L-Phenylalanyl-L-arginyi- L-tryptophyl-glycin-methylester-dihydrochlorid, das noch Ammoniumchlorid von der katalytischen Hy drierung des Cbo-tetrapeptidesters enthält, l¯st man in 4, 5 ml Dimethylformamid, kühlt im Eisbad und gibt 0, 139 ml Triäthylamin (1 mMol) dazu.
Nach 20 Minuten beginnt die Abscheidung von Triäthylamin- hydrochllorid. Man lässt 50 Minuten reagieren, filtriert anschliessend vom abgeschiedenen Salz ab und gibt die auf 0 gekühlte L¯sung von 630 mg (1, 5 mMol) Carbobenzoxy-L-gl'utaminyl'-L-histidin (vgl. Beispiel 1) in 3, 5 ml Dimethylformamid dazu. Nach weiteren 30 Minuten versetzt man mit dem Dicyclohexylcarbo- diimid (3s10 mg in 1 ml Dimethylformamid = 1, 5 mMol). Nach 3tägigem Stehen bei + 3 filtriert man vom Harnstoff ab (260 mg) und fällt anschliessend mit viel'Essigester aus.
Man erhält 1, 1g noch mit Ausgangsmaterial ver unreinigtes Produkt. Zur Entfernung der Ausgangsmaterialien behandelt man das Rohprodukt einmal mit 5 mT, viermal mit 2 ml ln Salzsäure und zum Schluss zweimal mit 2 ml Wasser. Das über Phosphorpentoxyd getrocknete Produkt wiegt 600 mg = 60% der Theorie.
Der Carbobenzoxy-hexapeptidester fällt dabei ah amorphes Dihydrochlorid an und ist leicht rosa gefärbt. [a] 25 =-12, 5 ¯ 1,7¯ (c = 0, 961 in Pyridin).
In den Systemen 43, 54 und 56 (vgl. S. 26) zeigt die Verbindung nur einen pauly-und ehrlichpositiven Fleck und die gleichen Rf-Werte wie das unter a beschriebene Produkt. In diesem Fall ist eine Verteilung nach Craig nicht notwendig. Der geschützte Hexapeptidester kann mit Natronlauge direkt verseift werden.
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidyl-L- phenylalanylLL-arginyl-L-tryptophyl-glycin. acetat 450 mg (0, 39 mMol3 Carbobenzoxy-hexapeptidnitrobenzylester werden in 10 ml 50% igem Dioxan gel¯st und mit l/2n Natronlauge während 45 Minuten verseift. Die Natronlauge gibt man portionenweise dazu, so dass der pH der L¯sung immer zwischen 10, 5 und 11 ist. Nach der Zugabe der ersten 3 ml '/, on Natronlauge beginut die Abscheidung von gal lertiger Substanz. Zur Verdünnung der L¯sung werden nochmals 10 ml 50% iges Dioxan zugegeben. Es werden total 7 ml 1/2n Natronlauge verbraucht.
Zum Schluss verdünnt man mit Wasser, neutralisiert mit In n Salzsäure und stellt die L¯sung mit einem Tropfen Eisessig auf pH 5, 5.
Man filtriert das gallertige Produkt ab, wäscht mit eiskaltem Wasser nach und trocknet den Filterrückstand im Vakuum über Kaliumhydroxyd und Phos phorpentoxyd. Das trockene Produkt wiegt 200 mg, F. (199 ) 203-205 .
Aus der Mutterlauge lassen sich noch weitere 150 mg Carbobenzoxy-hexapeptid isolieren, F. 155 bis 163 .
Diese Fraktion liegt aber, im Gegensatz zur Fraktion mit dem Schmelzpunkt 203-205 , nur teilweise als Acetat vor, was eindeutig aus den Acetylbestim- muhgen hervorgeht.
Im Papierchromatogramm zeigen die beiden Fraktionen in allen 3 Systemen 43, 54 und 56 die gleichen Rf-Werte
System 43 Rf = 0, 45
System 54 Rf = 0, 55
System 56 Rf = 0, 62
Die Verteil'ungskoeffizienten G im System sek. Butanol : 1% EssigsÏure 1 : 1 sind für beide Fraktio- nem ebenfalls identisch. [a] 25D =-15, 9 +1, 1 , c = 0, 944 in Eisessig.
Das Produkt kann in üblicher Weise durch Decarbobenzoxylierung in das freie Hexapeptid über- geführt werden, z. B. mittels Bromwasserstoff in Eisessig (vgl. Beispiel 1) oder durch Hydrierung in Gegenwart von 10% igem Palladiumkohle-Katalysator.
Beispiel 3
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidin methylester a) Mit Dicyclohexyl-carbodiimid
15, 1 g (0, 054 Mol) Carbobenzoxy-L-glutamin werden im Gemisch von 18 ml Dimethylformamid und 81 ml Acetonitril gelöst, auf 0 gekühlt und mit der ebenfalls vorgekühlten L¯sung von 9, 81 g L-Histi- dih-methylester (0, 058 Mol) in 9 ml Dimethylform- amid und 36 ml Acetonitril versetzt. Dabei scheidet sich wieder ein Teil der gelösten Substanz ab.
Durch Zugabe von weiteren 20 yn ; l Dimethylformamid erhält man wiederum eine klare Losung. Dazu gibt man 12, 2 g (0, 059 Mol) Dicydohexyl-carbodiimid in 13 ml Dimethylformamid und lϯt ber Nacht bei 0 reagieren. Dabei scheidet sich der Carbobenzoxy- dipeptidester neben dem Harnstoff als gallertiger Nie derschlag ab. Die gallertige zum Teil kristalline Ab scheidung wird abfiltriert, gut mit Acetonitril gewaschen und im Hochvakuum getrocknet.
Das Gemisch Carbobenzoxy-dipeptidester und Dicyclohexylgharn- stoff schlämmt man in 35 ml 2n Salzsäure auf, nutsch, t vom unlöslichen Harnstoff ab und wäscht noch mit 11 ml 2n Salzsäure nach. Die salzsaure Lösung wird mit der berechneten Menge In Natronlauge neutralisiert ; dabei scheidet sich der Carbobenzoxy- dipeptidester als dicke Gallerte aus, so dass mit weiteren 150 ml Wasser verdünnt werden muss. Das gallertige Produkt wird mit der Mutterlauge gut durchgeknetet und durch eine G-2-Glasfritte filtriert.
Zur r vollständigen Neutralisation vereinigt man den Filter- rückstand nochmals mit der alkalisch reagierenden Mutterlauge und knetet wiederum gut durch (pH der Mutterlauge = 8). Nach dem Trocknen erhÏlt man 14, 5 g geschützten Dipeptidester (63 % der Theorie) F. 167-169¯.
Die Analysenfraktion aus Wasser umkristallisiert zeigt F. 171-174 ; [a] 24D=-32,4¯ ¯ 0, 6 (c = 1, 17 in In Salzsäure).
Aus der Mutterlauge lassen sich noch weitere 2, 4 g papierchromatographisch reinen Carbobenzoxy-dipeptidester vom F. 158 gewinnen. Die Halogenprobe ist bei dieser Fraktion hingegen positiv. b) mit N, N'-DiimidazolWcarbonyl
140 ml (0, 5 mMol) Carbobenzoxy-Lglutamin (über Phosphorpentoxyd getrodknet) werden in 1, 5 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelost und un ter Feuchtigkeitsausschlu¯ mit 97 ml (0, 6 mMol) Di- imidazol-carbonyl versetzt. Sobald die Kohlendioxyd- Entwicklung aufgehört hat, gibt man die L¯sun von 85 ml Histidinmethylester (0, 5 mMol) in 1 ml Dimethylformamid dazu und lässt über Nacht bei 0 reagieren.
Der geschützte Dipeptidester wird mit viel ¯ther ausgefällt. Die Ausbeute beträgt nach dem Trocknen 190 mg (= 88 % der Theorie) Carbobenzoxy-L-glut- aminyl-L-histidin-methylester. F. 17-0-173,'unter Zersetzung ; M =-32, 2 1, 1 (c= 1, 025 in In Salzsäure).
N-Carbobenzyloxy-L-glutaminyl-L-histidin
5, 9 g Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-histidinmethylester werden in einem Gemisch von 42 ml Methanol und 28 ml Wasser unter Erwärmen gelöst, wieder auf Raumtemperatur gekühlt und mit 35, 5 ml 0, 45n Bariumhydroxydlösung versetzt. Nach 5 Minuten beginnt sich das Bariumsalz als dicker weisser Niederschlag abzuscheiden. Man verdünnt mit weiteren 140 ml Wasser, rührt mit einem Magnetrührer und lässt total 45 Minuten verseifen. Mit der berechneten Menge ln Schwefelsäure (15 ml) stellt man die Lö- sung neutral, filtriert vom Bariumsulfat ab und dampft die L¯sung zur Trockne ein.
Den gtasigen Rückstand nimmt man in wenig Dimethylformamid auf, filtriert die L¯sung nochmals durch eine Glasfritte G-4 und fällt hierauf das Carbobenzoxy-dipeptid mit viel Essigester aus.
Nach dem Trocknen im Hochvakuum erhält man 5, 72 g amorphes papierchromatographisch reines Carbobenzoxy-dipeptid.
Die Kristallisation aus Methanol ergibt 5, 1 g Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-histidin, F. 196-197 .
Der Verteilungskoeffizient im System 80 % Mehanol : (Chloroform : Tetrachlorkohlenstoff = 1 : 1) = 1 : 1 ist 4, 6. p-(?-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonyl-L glutamin (MZ-L-Glutamin)
11, 7 g (51 mMol) L-Glutamin-hydrobromid (durch Decarbobenzoxylierung der entsprechenden Carbobenzoxyverbindung gewonnen) werden in 75 ml Wasser gelöst, dann mit 200 ml Aceton verdünnt und 5 g Magnesiumoxyd (20% Überschuss) eingetragen.
Anschliessend gibt man bei 0 17 g p- (p'-Methoxy- phenylazo)-benzyloxycarbonylchlorid (56 mMol) während 1 Stunde in kleinen Portionen dazu, verd nnt mit 200 ml Wasser und rührt weitere 90 Minuten bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch stellt man mit 2n Salzsäure kongosauer, lässt während 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, zentrifu- giert den gaCtertigen Rückstand ab und trocknet bei 50¯ im Vakuum.
Das Rohprodukt aus 500 ml 95 % igem Methanol kristallisiert zeigt den F. 183-184¯. Die Ausbeute betrÏgt 13, 48 g.
Aus der Mutterlauge lassen sich noch weitere 2, 56 g F. 183-184¯ isolieren.
Die Gesamtausbeute beträgt demnach 16, 04 g, was 76, 3 % der Theorie entspricht.
Das Ultraviolett-Spektrum zeigt Amax 237 m u (?=13 100) und 349 my (e = 2600). p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonyl-
L-glutaminyl-L-histidin-methylester
2, 86 g MZL-Glutamin (6, 9 mMo2) lbst man in 10 ml Dimethylformamid und gibt die L¯sung von 1, 3 g L-Histidinmethylester (7, 8 mMol) in 15 ml Dimethylformamid dazu. Die vereinigten Lösungen kühlt man auf 0 ab und versetzt mit 1, 6 g (7, 8 mMol) Dicydiohexylcarbodiimid in 3 ml Dimethylformamid.
Man lässt über Nacht bei 0 reagieren, filtriert vom Harnstoff ab, versetzt das nicht umgesetzte Carbodiimid mit 3 Tropfen Eisessig und dampft das Dimethylformamid im Vakuum zur Trockne ein. Den Rückstand zerreibt man mit viel Essigester und lässt 2 Tage bei 0 stehen, filtriert und trocknet das orangerote Produkt bei 40¯ im Vakuum.
Die Ausbeute ist 2, 8 g Rohprodukt.
Zur Reitnigung löst man 2, 5 g Rohprodukt in 10 ml mit Wasser gesättigtem sek.-Butanol und filtriert durch eine AluminiumoxydsÏule.
Es lassen sich 2, 3 g reinen MZ-Dipeptidester eluieren, während das nicht umgesetzte MZ-L-Glut- amin am Anfang der Aluminiumoxyd-Kolonne als orangerote Zone zurückgehalten wird.
Aus 90 % igem Athanol schmilzt das Präparat bei 167-169 .
Das Ul'traviolett-Spektrum zeigt : max x237 mÁ (?=12 700), 340 mlt 21200) und Am.,, 435 mu u (?=2000). p-(?-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonyl
L-glutaminyl-L-histidin
1, 13 g (2 mMol) MZ-Dipeptidester l¯st man in 30 ml 75 % igem Dioxan und verseift mit 2, 4 ml 1 n Natronlauge; nach 10 Minuten wird noch mit 10 ml Wasser verdünnt. Nach 60 Minuten versetzt man unter Kühlung mit 30 ml 10 % iger Essigsäure und dampft das Lösungsmittel im Vakuum ab. Den gallertigen Rückstand trocknet man scharf bei 50 und zerkratzt ihn mit 100 ml Wasser.
Durch Zentrifugie- ren trennt man von der Mutterlauge ab, wÏscht noch gut mit Wasser nach und trocknet anschliessend den Rückstand lyophil. Die Ausbeute beträgt 750 mg (68%). Zur Entfernung anhaftender Verunreinigungen wäscht man das MZ-Dipeptid mit 50 Methanol und zum Schlu¯ mit viel Ather. Es bleiben 670 mg, F. 207-208 .
Das Analysenpräparat schmilzt nach einmaligem Kristallisieren aus 75% igem Dioxan bei 214-215 .
N-Carbobenzyloxy-L-phenylalanyl-nitro-L arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester
8 g (0, 016 Mol3 Carbobenzoxy-L-phenylalanyl- nitro-L-arginin [vgl. K. Hofmann et al. J. A. C. S.
Band 78, 240, (1956)] werden im Gemisch von 8 ml Dimethylformamid und 45 ml Acetonitril unter Erwärmen gelöst, dann auf 0 gekühlt und mit der vorgek hlten L¯sung von 5,71 g (0,02 Mol) L-Tryptophyl-glycin-methylester in 4,5 ml Dimthylformamid und 18 ml Acetonitril versetzt. Man verd nnt mit 45 ml Acetonitril und rührt während 15 Minuten weiter. Bei 0 wrden 4, 1 g (0, 02 Mol) Dicyclohexyl- carbodiimid in 9 ml Acetonitril eingetragen und 24 Stunden bei dieser Temperatur stehengelassen. Der abgeschiedene Harnstoff (3, 22 g) wird abfiltriert, die L¯sung mit 0, 5 ml Eisessig versetzt und nach 15minu- tigem Stehen zur Trockne verdampft.
Den öligen Rückstand l¯st man in Essigeser, filtriert vom ab geschiedlenen Harnstoff ab und wÏscht die organischen Phasen dreimal mit 1n SalzsÏure, zweimal mit Wasser, dann dreimal mit In Natriumbicarbonat und zum Schluss mit Wasser neutral.
Beim Waschen mit Bicarbonat scheiden sich 1, 45 g gallertiges Material ab. Der Schmelzpunkt ist identisch mit dem Carbobenzoxy-tetrapeptidester.
Die Essigesterphasen werden über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne verdampft. Nach einmali gem Umkristallisieren aus vieQ Essigester erhält man 7, 97 g geschützten Tetrapeptidester, F. 126-130 .
Die Totalausbeute beträgt 9, 42 g = 78 % der Theorie.
Das Analysenpräparat schmilzt nach einer weiteren Krisallisation aus Essigester bei 126-130 .
[a] 28¯D=-18,5¯ ¯ 0, 5 , c = 1, 336 in Methanol.
Der Verteilungskoeffizient G im System 80% Methanol. (Chloroform : Tetrachlorkohlenstoff = 1 : 1) = 1 : 1, ist 1, 2.
Die gleiche Substanz aus verschiedenen Lösungs- mitteln kristallisiert zeigt verschiedene Schmelzpunkte, z. B. aus Methanol F. 136-140 .
L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin- methylester-dihydrochlorid
7 g (9, 2 mMol) Carbobenzoxy-tetrapeptidester gemäss Beispiel 1 werden in 180 ml Athanol unter Zusatz von 5 Aq. methanolischer Sallzsäure und in Gegenwart von 2 g 10 % igem Palladiumkohle-Kataly- sator bis zur Sättigung hydriert. Das gebildete Koh- lendioxyd wird in einer zweiten dazwischen geschalte- ten Hydrierente mit Kalilauge adsorbiert. Nach 12 Stunden ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Total werden 997 ml Wasserstoff verbraucht (Theorie : 1035 ml). Man filtriert vom Katalysator ab und dampft das Losungsmittel zur Trockne ein.
Den Verdampfungsrückstand nimmt man in 15 ml absolutem Methanol auf und fällt das Produkt wieder mit viel abs. Ather aus.
Die Ausbeute an rohem Dihydrochlorid des Tetrapeptidesters ist 6, 68 g.
Dieses Produkt enthält noch Ammoniumchlorid, ist aber genügend rein und wird direkt zur Umsetzung zum Carbobenzoxy-hexapeptidester verwendet. p-(?-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonyl
L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester.hydrochlorid
470 mg (0, 85 mMol) p-(?-Methoxyphenylazo)benzyloxy-carbonyl-L-glutaminyl-L-histidin in 14 ml Dimethylformamid werden mit der L¯sung von 510 mg (0, 84 mMol) L,-Phenylalanyl-L-arginyl-L- tryptophyl - glycin-methylester-hydrochlorid (vgl.
Beispiel 1) in 2 ml Dimethylformamid vereinigt, auf 0 gekühlt und mit 210 mg (1 mMol) Dicyclehexyl- carbodumid in 2 mi Dimethylformamid versetzt. Nach 3tägigem Stehen bei 0¯ lϯt man Zimmertemperatur annehmen, filtriert vom Harnstoff ab, zersetzt das nicht umgesetzte Carbodiiinid mit 0, 1 ml Eisessig und dampft auf ein kleines Flüssigkeitsvolumen ein. Mit viel Essigester fällt man das Rohprodukt aus. Die Rohausbeute beträgt 760 mg.
Zur Reinigung l¯st man 500 mg Substanz in 10 ml 75 % igem Dioxan und filtriert durch eine Alu miniumoxydsäule (8 g). Am Start bleibt die Verunreinigung als orangerote Zone haften.
Die eluierten 420 mg werden zwischen n-Butanol und 1 % iger Essigsäure über 30 Stufen verteilt. Die Hauptmenge des MZ-Hexapeptidesters befindet sich in den Elementen 8-19 (G = 0, 8, 8).
Die Fraktionen 1, 0-18 werden vereinigt und nochmals zwischen sek.-Butanol und 1 % Essigsäure über 40 Stufen verteilt. Die Fraktionen 11-19 werden aus 95 % igem Methanol umkristallisiert. Man erhält 180 mg p- (p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonyl- L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-Ltryptophyl-glycin-methylester.hydrochlorid, F. 202 bis 203 .
Das Ultraviolett-Spektrum zeigt : ?max 284 mÁ(? = 9800), ?max 290 mÁ(? = 10 000), ?max 349 mÁ(? = 21 200), ?max 435 mÁ(? = 2000).