Verfahren zur Herstellung einer anabolisch wirksamen Substanz Wegen der .mit der Aufzucht fleischproduzierender Tiere verbundenen Kosten wurden bereits verschie dene Mittel entwickeln um die Wachstumsgeschwin- digkeit solcher Tiere zu erhöhen. Zahlreiche dieser Mittel, unter ihnen anabolische Östrogene, wie z. B.
Diäthylstilböstrol, haben den Nachteil, toxisch zu sein und unerwünschte Nebeneffekte hervorzurufen; ausserdem 'ist ihre Verabreichung schwierig.
Es, wurde nun gefunden, dass man zu einem an- abolischen östrogenen Mittel, das nicht nur die Wachstumsgeschwindigkeit erhöht, sondern sicher und wirtschaftlich verabreicht werden kann und keine nachteiligen Nebenwirkungen hervorruft, der Formel
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gelangt, indem man erfindungsgemäss den Mikroorga nismus Gibberella zeae (Gordon)
aerob in einem eine Kohlenhydratquelle enthaltenden Nährmedium züch tet. Vorzugsweise ist die Kohlenhydratquelle Mais, Weizen, Gerste oder Hafer.
Eine lebende Kultur dieses Organismus ist un ter der Nr. NRRL-2830 bei der Northern Utilization Research and Development Division des US-Land- wirtschaftsministeriums deponiert.
Der Organismus wurde aus in der Nähe von Delphi, Indiana, ange bautem Mais isoliert; die Kultur wurde durch mehrere Isolationen von Einzelkolonien gereinigt. Im folgen den wird die Morphologie des auf Czapeks Dextrose- agar der in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung gezüchteten Mikroorganismus wiedergegeben:
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<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Czapeks <SEP> Dextrose-agar <SEP> Gramm/Liter
<tb> Natriumnitrat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,0
<tb> Kaliumchloorid <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Eisen(II)-sulfat <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,01
<tb> Kaliumhydrogenphosphat <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Dextrose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 50,0
<tb> Agar <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 15,0
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser
<tb> auffüllen <SEP> bis <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml Der Organismus ist ein rasch wachsender Pilz, der in 4 Tagen bei 22 bis 25 einen Koloniendurch messer von 9 cm erreicht. In diffusem Licht oder in der Dunkelheit entsteht ein üppiges baumwollartiges Luftmycel mit einem dunkelgelb gefärbten Zentrum und rosa bis weissen Randzonen.
Bei einer Beleuch tungsstärke von 4830 Lux bei fluoreszierendem Licht wird die Kolonie dunkler gelb und entwickelt weni ger Luftmycel. Die Unterseite der Kultur ist dunkel rot, was auf die Bildung von wasserunlöslichem Pigment zurückzuführen ist.
Die Bildung von Makronidien ist in der Dunkel heit schwach, unter Licht jedoch üppig. Die Makro nidien entstehen in gallertigen Formen in verschie dener Länge von 7,6 bis 44 Mikron und enthalten 0 bis 5 Septationen und eine gut ausgebildete Fuss zelle. Die Breite ist weniger variabel und liegt zwi schen 2;5 und 5 Mikron, im allgemeinen bei 4,5 Mikron. Die Makronidien sind mit 3 bis 4 Septatio- nen mit einer Länge von 30 bis 40 Mikron gekrümmt.
Chlamydosporen sind zwischengelagert, jedoch nur selten.
Unter normalen Belichtungsbedingungen werden innerhalb drei Wochen Perithecien nur in geringem Mass gebildet. Die Perithecien sind schwarz und ellip tisch und haben einen Durchmesser von 220170 Mikron. Asci im Perithecium sind länglich (Länge 50 bis 60 Mikron, Breite 6,6 Na' ron) und die Asco- sporen sind gerade oder schwach gebogen, durch sichtig und mit 3 Septen versehen.
Die Ascospo- ren sind 19 bis 22 Mikron lang und 2 Mikron breit und am Ende spitz.
Die neue anabolische Substanz wird z. B. in der Weise hergestellt, indem man die Sporen oder das vegetative Mycel des obigen Organismus in einem geeigneten Impfmedium bebrütet und sodann dieses den Mikroorganismus enthaltende Impfmedium in ein Gärmedium, das eine der üblichen Körnerfrüchte als Kohlehydratquelle enthält, einführt.
Bei der folgenden Fermentation kann als Kohle hydratquelle z. B. Mais, Hafer, Weizen, Gerste oder dergleichen verwendet werden, wobei Mais bevor zugt wird. Die Gärtemperatur kann zwischen etwa 22 und 32 liegen und beträgt vorzugsweise etwa 25 bis 28 . Der pH-Wert des Gärmediums sollte im Bereich von etwa 3,5 bis 8,5 gehalten werden. Zur Erzielung maximaler Ausbeuten empfiehlt es sich, von einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 5,6 aus zugehen und bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 7,6 zu enden.
Flüssige Gärmedien sind verwendbar; bevorzugt arbeitet man jedoch mit, wässrigfeuchten, im wesentlichen aber festen Medien. Ferner ist das Arbeiten im Dunkeln vorzuziehen.
Im allgemeinen wird bei den obigen Bedingungen eine befriedigende Ausbeute an der gewünschten Sub stanz im Verlauf von 6 bis 22 Tagen erreicht. Je nach der Vitalität des Mikroorganismus kann diese Periode jedoch auch länger oder kürzer sein.
Die so erhaltene anabolische Substanz kann, so dann Tieren beliebig oral oder parenteral verabreicht werden. Zum Beispiel kann, das Gärmedium nach Ablauf der Fermentationszeit mit dem gewöhnlichen Futter vermischt und .so direkt verfüttert werden. Die anabolische Substanz kann aber auch auf geeig nete Weise isoliert, sodann in einer Injektionsflüssig- keit wie z.
B. Erdnussöl :suspendiert und dann paren- teral injiziert werden.
Um die anabolische Substanz zu isolieren, emp fiehlt es sich, wie folgt vorzugehen: Das Gärmedium wird zuerst mit vorzugsweise 95 % igem Äthanol extra hiert und dann den Extrakt konzentriert.
Das. Kon zentrat wird dann in Chloroform gelöst und mit Natriumcarbonatlösung, vorzugsweise 5%ig, mit einem pH-Wert von 9 bis 12 und vorzugsweise etwa 11,2 extrahiert. Der pH-Wert des natriumcarbonat haltigen Extrakts wird mit Salzsäure auf etwa 6,0 bis 6,5 eingestellt, wobei die feste,
noch unreine anabolische Substanz ausfällt. Die vollständigste Fäl lung wird bei einem pH-Wert von etwa 6,2 erzielt. Der Niederschlag wird sodann mit Äther extrahiert. Nach dem Trocknen erhält man bereits ein als. Fubter- mitbelzusatz geeignetes Material.
Wünscht man einen noch höheren Reinheitsgrad der Substanz, so wird das obige Material einer Mehrfach-Gegenstromver- teilung mit einem geeigneten Lösungsmittelsystem unterworfen und die 'aktive Verbindung nach der Methode von Craig (siehe A. Weissberger, Tech- niques of Organic Chemistry, Band 3, Kap. 4 [2. Aufl., Intersc. Publ. Inc]) isoliert.
Diese Methode besteht im wesentlichen darin, dass man eine bestimmte und stets gleiche Menge eines die untere Phase darstellen den Lösungsmittelsystems I in eine Vielzahl von Röhr chen einfüllt, wobei das erste eine bestimmte Menge des zu trennenden und zu bestimmenden Materials enthält, dann in das erste Röhrchen ein die obere Phase bildendes Lösungsmittel 1I in derselben Menge wie die untere Phase zugibt, die beiden Phasen gut mischt und sich sodann trennen lässt,
die obere Phase entfernt und in ein zweites Röhrchen giesst und die gleiche Menge an frischem Lösungsmittel 1I in das erste Röhrchen<B>gibt.</B> Das Verfahren wird geeig net lange fortgesetzt. Man ermittelt die die grösste Menge an aktivem Material aufweisende Probe und berechnet den Arbeitskoeffizienten K gemäss folgen der Formel:
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in der N die Gesamtzahl an Austauschröhrchen und n die Nummer des Röhrchens, in dem sich die grösste Menge an aktivem Material befindet, bedeuten.
Bei Verwendung des Gegenstrom-Verteilungsver- fahrens zur Reinigung der neuen anabolischen Ver bindung kann jedes Lösungsmittelsysbem verwendet werden, das einen einfachen Verteilungskoeffizienten von nicht weniger als 0,2 und nicht mehr als 0,5 aufweist. Der Verteilungskoeffizient kann als das Ver- hältnis der Substanzmenge, die in der oberen Phase gelöst ist, zu der in der unteren Phase enthaltenen Menge definiert werden. Als im vorliegenden Fall geeignet wurden z.
B. ein System mit einer unteren Phase aus 2 Vol.-Teilen CHCl., und 2 Vol.-Teilen CCl4 und einer oberen Phase aus 3 Vol.-Teilen CH30H und 2 Vol.-Teilen H20 befunden oder ein solches mit einer unteren Phase aus 2 Vol.-Teilen CHC13 und 2 Vol.-Teilen CC14 und einer oberen Phase aus 4 Vol.-Teilen CH30H und 1 Vol:
Teil H20.
Bei Anwendung der Craigschen Methode unter Verwendung von<B>100</B> Röhrchen mit einem Lösungs- mitbelsystem aus 2 Teilen CHC13 und 2 Teilen CC14 als untere Phase und 4 Teilen CH30H und 1 Teil H20 als obere Phase auf die trockene, wie folgt er haltene anabolische Substanz:
Züchtung des Orga nismus Gibberell'a zeae (Gordon) NRRL-2830 auf wässrigfeuchtem Mais-Medium und Isolierung durch Extraktion mit Äthanol, Konzentrieren des Extrakts, Lösen des Konzentrats in Chloroform, Extrahieren mit wässrigem Natriumcarbonat, Einstellen des pH- Wertes mit Salzsäure auf einen Wert, bei dem ein festes Produkt ausfällt,
Extrahieren des Produktes mit Äther und Trocknen - erhält man einen Vertei lungskoeffizienten von 0,40 und einen Arbeitskoef fizienten von 0,54. Die gereinigte Substanz ist leicht löslich in Methyy ;enchlorid, Äthanol, Butylacetat, 1,4-Dioxan und Athyläther; löslich in Methanol, Butanol, Chloroform und Aceton;
wenig löslich in Hexan, Petroläther, Heptan sowie unlöslich in Dimethylformamid und Wasser. Sie gibt getrocknet auf Cellulose einen nega tiven Ninhydrin-Test. Sie wird von Tonerde aus Methylenchloridlösung leicht absorbiert.
In methanolischer Lösung wurde das UV-Spek- trum untersucht. Die Kurve zeigt Maxima bei 236, 274 und 313 mu und Minima bei 255 und 300 mg.
Eine Lösung der Substanz in 2 Vol: Teilen CHC13, 2 Vol.-Teilen CC14, 3 Vol.-Teilen C1-130H und 2 Vol. Teilen H20 vom pH 6 zeigt bei Bestrah lung mit energiereichem UV-Licht eine starke grün liche Fluoreszenz.
Das IR-Spektrum (KBr-Pellet) ist in der Fig.1 wiedergegeben.
Die Substanz schmilzt bei 164 bis 165 . Die opti sche Drehung in Methanol beträgt: [a] -109,5 .
D Die neue, erfindungsgemäss hergestellte Verbin dung ist eine wirksame, wachstumsfördernde Sub stanz. In Tabelle 2 ist die Wachstumsrate von Läm mern (8 Lämmer 28 Tage bei üblichem Futter) wie dergegeben. Die durchschnittliche tägliche Gewichts zunahme betrug 125 g. Die mittlere Futterumwandlung betrug bei dem Tabelle 2 zugrunde liegenden Versuch 4,75 kg Futter pro 0,45 kg Gewichtszunahme, beim Versuch gemäss Tabelle 3 dagegen 3,65 kg pro 0,45 kg Gewichts zunahme.
<I>Beispiel 1</I> Eine Gibberella zeae (Gordon) NRRL-2830 ent haltende Sporenkultur wurde unter aseptischen Bedin gungen in ein steriles Gefäss, das 15 ml Czapeks-Dox- Lösung und etwas Agar enthielt, gegeben. Dieses Medium wurde dann etwa 168 Stunden bei etwa 25 bebrütet.
Nach der Inkubationszeit wurde das Medium mit 5 ml sterilen. entionisiertem Wasser ge waschen und in ein steriles, 45 ml Czapeks-Dox- Lösung enthaltendes Gefäss gegossen.
Nach etwa 98stündigem Bebrüten bei etwa 25 war das Mate rial als Impfgut eines Gärmediums geeignet.
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<I>Tabelle <SEP> 2</I>
<tb> Ausgangsgewicht <SEP> (kg) <SEP> Endgewicht <SEP> (kg)
<tb> (keine <SEP> anabolische <SEP> Substanz) <SEP> nach <SEP> 28 <SEP> Tagen
<tb> 33,3 <SEP> 33,6
<tb> 29,3 <SEP> 32,7
<tb> 27,5 <SEP> 29,8
<tb> 31,1 <SEP> 35,2
<tb> 32,2 <SEP> 37,8
<tb> 32,6 <SEP> 35,6
<tb> 34,3 <SEP> 37,6
<tb> 34,7 <SEP> 39,9
<tb> Mittel: <SEP> 31,9 <SEP> 35,5 Tabelle 3 zeigt die Ergebnisase analoger Unter suchungen, bei denen jedoch die bei Tabelle 2 zu grundeliegende Nahrung durch tägliche subkutane Injektion von 33 Einheiten der anabolischen Sub stanz ergänzt wurde.
Eine Einheit ist die Menge, die benötigt wird, um denselben Effekt wie ein Mikro gramm Diäthylstnlböstrol zu erzielen. Die durch schnittliche tägliche Gewichtszunahme betrug 170 g, das heisst eine Erhöhung gegenüber dem Blindver such um 40 %.
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<I>Tabelle <SEP> 3</I>
<tb> Ausgangsgewicht <SEP> (kg)
<tb> (3 <SEP> Einheiten <SEP> der <SEP> Endgewicht <SEP> (kg)
<tb> anabolischen <SEP> Substanz <SEP> jTag) <SEP> nach <SEP> 28 <SEP> Tagen
<tb> 30,6 <SEP> 33,9
<tb> 29,8 <SEP> 36,4
<tb> 31,4 <SEP> 36,6
<tb> 32,2 <SEP> 36,9
<tb> 33,3 <SEP> 39,0
<tb> 34,7 <SEP> 42,2
<tb> 36,0 <SEP> 37,0
<tb> Mittel: <SEP> 32,4 <SEP> 37,2 <I>Beispiel 2</I> In einen 2-Liter-Kolben mit einem Inhalt von 300 g Maismehl wurden nach dem Sterilisieren 150 ml steriles, entionisiertes Wasser zugesetzt.
Dann wurden 45 ml des in Beispiel 1 hergestellten Inocu- lums zugegeben. Nach gutem Durchmischen wurde das Gemisch etwa 20 Tage bei 25 im Dunkeln in gesättigter Wasserdampfatmosphäre bebrütet.
Beispiel <I>3</I> 300 g des nach Beispiel 2 hergestellten Fermen- tationsproduk@es wurden in 500 ml entionisiertem Wasser aufgeschlämmt und etwa 15 min auf 75 erwärmt. Nach Zugabe von 300 g Filterhilfsmittel wurde filtriert. Das feste, die anabolisch wirksame Substanz enthaltende Material wurde an der Luft getrocknet. 333 g des trockenen Produktes wurden viermal zeit je 500 ml Äthanol extrahiert.
Der Ätha- nolextrakt ergab nach dem Trocknen im Vakuum 6,84 g festes Material. Das letztere wurde in 20 ml Chloroform gelöst und mit 30 ml einer 5 gew. % igen Natriumcarbonatlösung mit einem auf 11,2 einge- stellten pH-Wert extrahiert. Diese Extraktion wurde siebenmal wiederholt.
Der pH-Wert der Na2C03- Lösung wurde mit Salzsäure so dann auf 6,2 einge stellt, wobei man einen die anabolische Substanz enthaltenden Niederschlag erhielt. Sowohl der Nieder schlag als auch der Na2C03-Extrakt wurden viermal mit 75 ml Äther extrahiert. Man erhielt eine hellt- gelbe ätherische Lösung, die beim Trocknen 116 mg der gewünschten Substanz ergab.
Dieses Material wurde sodann einer Mehrfachgegenstromverteilung unter Verwendung von 100 Röhrchen und einem Lösungsmittelsystem aus 2 Vol.-Teilen CHC13 und 2 Vol:
Teilen CC14 als untre Phase und 4 Vol.- Teilen CH30H und 1 Teil Wasser als obere Phase unterworfen. Das Produkt dieser Aufarbeitungsstufe wurde im bekannten Mäusetest (Gebärmutter) auf seine physiologische Wirksamkeit untersucht.
Bei die sem Test wurde die Trockensubstanz aus 5 ml der oberen und 5 ml der unteren Phase der betreffenden Röhrchen in ein. Standardfutter von 75 g für 5 Mäuse und für 5 Tage einverleibt. Nach beendeter Versuchs zeit wurden die Tiere gewogen, der Utrus entfernt und ebenfalls gewogen. Die Fraktionen 30-4.0 er gaben ein positives Ergebnis. Der aus diesen Frak tionen isolierte Feststoff wog 59 mg.